一、逆病毒載體介導(dǎo)的雙耐藥基因在小鼠骨髓細胞的轉(zhuǎn)移（論文文獻綜述）
方佳成[1]（2021）在《泛實體瘤相關(guān)抗原圖譜的構(gòu)建及其在抗體偶聯(lián)藥物和嵌合抗原受體T細胞上的應(yīng)用》文中研究表明癌癥已經(jīng)成為危害人類健康的主要疾病,據(jù)世衛(wèi)組織國際癌癥研究機構(gòu)數(shù)據(jù)顯示,2020年,全球男性和女性將合計出現(xiàn)約1930萬和1000萬的新發(fā)病例和癌癥死亡病例,其中的1800萬例和930萬例將來自實體瘤。然而,對腫瘤治療的系統(tǒng)評估數(shù)據(jù)顯示,歐洲藥物管理局在2009-2013年度批準的大多數(shù)抗癌藥物未能對患者的整體生命質(zhì)量產(chǎn)生重大改善。因此,需要繼續(xù)提高抗腫瘤藥物的臨床療效?？贵w偶聯(lián)藥物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T細胞療法是發(fā)展迅速的腫瘤靶向治療技術(shù),它們通過特異性識別在惡性細胞和正常組織細胞之間差異過表達的靶標抗原,達到辨識腫瘤和消融腫瘤的目的。ADC和CAR-T實現(xiàn)安全性與有效性的關(guān)鍵,在于其所識別的靶標抗原是否具備足夠的腫瘤特異性。因而,鑒別出理想的靶標抗原至關(guān)重要。理想的靶標抗原由惡性細胞特異性表達,然而腫瘤特異性抗原屈指可數(shù)。腫瘤相關(guān)抗原在腫瘤細胞上表達升高,在正常細胞上限制性表達,這一特性使得它們亦能夠作為有效定位惡性腫瘤的靶標分子。目的:以發(fā)現(xiàn)理想的腫瘤相關(guān)抗原為出發(fā)點,著力于打造腫瘤相關(guān)抗原發(fā)現(xiàn)新平臺,構(gòu)建全面的泛實體瘤腫瘤相關(guān)抗原圖譜,為癌癥研究人員和廣泛的科學與醫(yī)藥界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用經(jīng)統(tǒng)一處理的TCGA和GTEx的RNA序列數(shù)據(jù),對19種類型實體瘤中的20242個HUGO基因進行差異分析;通過將閾值設(shè)置為Benjamini-Hochberg adjusted p值為0.01,log2Fold Change為1.0,保留那些在腫瘤細胞群中顯著差異表達的HUGO基因;結(jié)合蛋白質(zhì)亞細胞定位信息,排除不具備胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表達信息和HPA和HPM的蛋白質(zhì)豐度信息的數(shù)據(jù)集,獲取在正常組織中受限表達的蛋白分子;使用公開的Blood Spot平臺,發(fā)現(xiàn)那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表達的蛋白分子。2.將RNA測序的讀段計數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM格式,并將每個基因在其配對適應(yīng)癥和正常組織中的TPM值作為差異表達分析的輸入數(shù)據(jù)。采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗分析,計算并繪制每個候選靶標分子在特定適應(yīng)癥中的表達相比其在各個人體正常組織中的表達的差異表達譜。3.提取并整理TCGA中泛癌表型數(shù)據(jù)中的癌組織學分級,病理分級和TNM分期信息;通過挖掘MC3（“多中心多癌種突變識別”）TCGA MAF（“突變注釋格式”）數(shù)據(jù),確定靶標基因的非沉默體細胞突變（SNP和INDEL）。結(jié)合m RNA表達數(shù)據(jù),匯編用于評價靶標基因的異質(zhì)表達模式的綜合數(shù)據(jù)集。4.從TCGA下載并提取靶標基因組變異數(shù)據(jù),從Onco KB收集致癌或功能性基因組變異信息,注釋并統(tǒng)計靶標基因的變異類型及發(fā)生頻率,確定在臨床上有應(yīng)用價值的攜帶特異性驅(qū)動變異的功能性靶標。5.通過雜交瘤技術(shù)制備CDH17特異性單克隆抗體,進而運用流式細胞術(shù)、過表達共定位分析、結(jié)合親和力檢測、抗體測序和可變區(qū)序列進化關(guān)系分析等,多重表征抗體的各項指標。通過偶聯(lián)mc-Val Cit PABC-MMAE,制備CDH17靶向型ADC。結(jié)合體外殺傷實驗與細胞內(nèi)化評估,完成效應(yīng)分子的初篩驗證。6.通過構(gòu)建KM12SM和COLO205結(jié)腸癌細胞系CDX動物模型,綜合評估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的體內(nèi)抗腫瘤活性。通過制備和人鼠CDH17蛋白交叉反應(yīng)的ADC分子,并對給藥的荷瘤小鼠的心/肺/肝/腎/結(jié)腸/直腸/脾臟進行HE染色,評估CDH17靶向型ADC對小鼠的組織毒性。7.通過慢病毒載體感染CD3+T細胞,制備LYPD3靶向型CAR-T細胞。通過對CAR-T細胞進行分化檢測,確定其向效應(yīng)細胞持續(xù)分化的能力。通過體外細胞殺傷實驗和細胞因子分泌檢測,研究LYPD3靶向型CAR-T細胞對腫瘤細胞的的特異性殺傷作用。通過對荷瘤小鼠循環(huán)血中的CAR-T細胞進行計數(shù)和檢測腫瘤組織中的T細胞浸潤水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T細胞在小鼠體內(nèi)發(fā)揮持久抗腫瘤作用的機制。結(jié)果:1.開發(fā)專門的算法和匯編整合有泛實體瘤和正常組織的大型轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和基因組信息的綜合數(shù)據(jù)集。2.系統(tǒng)地識別腫瘤相關(guān)抗原。通過我們的腫瘤相關(guān)抗原發(fā)現(xiàn)平臺,篩選得到75個潛在的腫瘤相關(guān)抗原分子。特別是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做進一步的臨床前研究。3.基于CDH17蛋白定向開發(fā)的ADC分子可以在體內(nèi)顯著消融KM12SM和COLO205異種移植瘤,并對高表達CDH17蛋白的結(jié)腸癌病人來源的異種移植瘤表現(xiàn)出一定的腫瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在體外對高藥敏度的COLO205顯示高水平的細胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE對COLO205的抑瘤水平相當（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。兩次單藥靜脈注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以劑量依賴性的方式抑制KM12SM在小鼠體內(nèi)的生長,但無法完全清除腫瘤。在COLO205 CDX模型中,按同樣的給藥方式靜注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg劑量的第一針治療可以起到平緩異種移植腫瘤增長的效果,且兩周后的第二針治療亦能繼續(xù)起到溶瘤效果;3 mg/kg的中劑量治療組有部分小鼠的腫瘤在后期出現(xiàn)反彈;6 mg/kg的高劑量治療可以根治異種移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠體內(nèi)具有相對可控的組織毒性。制備了能和人鼠CDH17蛋白交叉反應(yīng)的ADC分子677-MMAE,觀察到在677-MMAE給藥組小鼠的結(jié)直腸的局部組織中有炎癥反應(yīng),聚集了大量的淋巴細胞;但在其它組織中沒有出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。此外,在觀察期內(nèi),小鼠對chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的體內(nèi)耐受良好,用藥期間未有小鼠死亡個例出現(xiàn),亦沒有觀察到10%以上的減重。5.LYPD3靶向型CAR-T細胞能夠在小鼠體內(nèi)對PC9異種移植腫瘤發(fā)揮持久的抗腫瘤作用。且小鼠對LYPD3-CAR-T的耐受良好,在觀察期內(nèi)未有小鼠死亡個例出現(xiàn),亦沒有觀察到10%以上的減重。進一步調(diào)查發(fā)現(xiàn),LYPD3-CAR-T細胞不僅在小鼠外周血中大量存在,還在高響應(yīng)LYPD3-CAR-T治療的PC9異種移植瘤組織中大量浸潤。此外,LYPD3-CAR-T治療組的小鼠脾臟內(nèi)出現(xiàn)大量CD3+T細胞,但在對照組中卻沒有。CAR-T細胞的記憶表型對于激發(fā)持久的免疫應(yīng)答至關(guān)重要。數(shù)據(jù)顯示,LYPD3-CAR-T細胞在輸注前,其中的Tn/Tscm細胞和Tcm細胞比例分別高達52.4%和21.7%,具有良好的向效應(yīng)細胞分化的潛能。結(jié)論:通過開發(fā)腫瘤相關(guān)抗原識別算法和整合來自19種實體瘤和正常組織的大型轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和基因組數(shù)據(jù),完成了泛實體瘤相關(guān)抗原的探索。通過考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T細胞在模型小鼠中的抗腫瘤活性,例證了CDH17和LYPD3蛋白分別作為ADC和CAR-T靶標開發(fā)的可行性。
陳飚[2]（2018）在《SHARPIN上調(diào)TAK1的表達并激活JNKs通路促進蕈樣肉芽腫疾病進展》文中提出背景SHARPIN廣泛表達于人體多種組織,主要定位于細胞質(zhì),也可見于細胞核中。研究表明SHARPIN參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。蕈樣肉芽腫（Mycosis fungoides,MF）的病因和發(fā)病機制尚未明確。早期MF患者與正常對照人群有相似的平均壽命。MF晚期及累及淋巴結(jié)和內(nèi)臟則預(yù)后較差。深入研究MF的發(fā)病機制,對監(jiān)測MF進展和改善晚期MF的治療效果有重要意義。SHARPIN參與多種腫瘤的發(fā)病,然而,SHARPIN在MF發(fā)病中的作用暫未有研究。JNKs在腫瘤發(fā)病中起促癌或抑癌基因的作用,然而JNKs通路在MF的發(fā)病機制中的作用大部分還不清楚;SHARPIN對JNKs通路的調(diào)節(jié)尚未明確。目的1.探討SHARPIN在MF中的表達及其對疾病進展和預(yù)后的影響;2.闡明SHARPIN在MF中調(diào)控JNKs通路的分子機制。方法1.分析GEO數(shù)據(jù)庫的GSE12902數(shù)據(jù)集中SHARPIN在MF的表達及其對預(yù)后的影響;2.檢測MF細胞株MyLa2059細胞與其正常對照CD4+T細胞中SHARPIN的表達及JNKs通路的活性狀態(tài);構(gòu)建SHARPIN過表達和抑制慢病毒載體,分別將其轉(zhuǎn)染MyLa2059細胞,檢測SHARPIN表達變化對MyLa2059細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及MyLa2059細胞中JNKs通路關(guān)鍵分子表達的變化;構(gòu)建SHARPIN表達質(zhì)粒和TAK1-Promoter-Luc質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染293T細胞,使用螢光素酶報告基因試驗檢測SHARPIN是否轉(zhuǎn)錄激活TAK1。結(jié)果1.在GSE12902數(shù)據(jù)集的22例MF樣本中,36%的樣本出現(xiàn)8q24.3拷貝數(shù)增加,引起SHARPIN表達升高,并導(dǎo)致MF患者疾病特異性生存率下降;2.MyLa2059細胞SHARPIN的表達高于CD4+T細胞,JNKs通路呈組成性激活狀態(tài);慢病毒轉(zhuǎn)染SHARPIN過表達組MyLa2059細胞的增殖率升高、凋亡率下降、遷移和侵襲的細胞數(shù)目增多,SHARPIN抑制組則相反;另一方面,MyLa2059細胞慢病毒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)SHARPIN過表達或抑制可引起TAK1等JNKs通路關(guān)鍵分子mRNA表達升高或下降,而且,螢光素酶報告基因試驗提示SHARPIN可轉(zhuǎn)錄激活TAK1。結(jié)論1.MF病灶SHARPIN表達升高,且與MF患者預(yù)后差相關(guān);2.SHARPIN過表達轉(zhuǎn)錄激活TAK1并順序激活JNKs通路,促進MF惡性表型進展。3.SHARPIN可作為監(jiān)測MF病情進展、預(yù)測預(yù)后的生物學標記物及為治療提供一個潛在的靶標。
李東河[3]（2016）在《BCR-ABL誘導(dǎo)急性B淋巴細胞白血病發(fā)病機制研究》文中研究表明BCR-ABL作為血液系統(tǒng)惡性疾病中最常見的融合基因之一,幾乎出現(xiàn)在所有的慢性粒細胞白血?。–ML）,以及部分成人（20%）和兒童（5%）急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）中。ABL/Src酪氨酸激酶抑制劑的出現(xiàn)極大地改善了CML病人的預(yù)后,但仍然存在抗藥性、易復(fù)發(fā)等諸多問題。而單獨使用ABL激酶抑制劑仍不能有效控制BCR-ABL陽性B-ALL,所以B-ALL的發(fā)病機制仍然值得進一步地研究和探索。已有文獻報道癌基因v-Abl的羧基末端區(qū)域（CTR）突變后在小鼠體內(nèi)不再特異性誘發(fā)B-ALL,但CTR在BCR-ABL誘導(dǎo)的B-ALL中的作用并不清楚。在本課題中,我們利用BCR-ABL和BCR-ABLΔC誘導(dǎo)的小鼠B-ALL/CML體內(nèi)模型以及克隆形成、蛋白印記等體外實驗證實了CTR在BCR-ABL誘導(dǎo)的B-ALL中是不可或缺的,但CTR的缺失并不影響B(tài)CR-ABL誘導(dǎo)CML的能力。白血病干細胞是一種被證實存在于多種白血病中的具有自我更新能力和重建疾病的細胞亞群。這與正常造血干細胞的部分功能存在相似性,暗示兩者在細胞起源上可能存在某種聯(lián)系。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)BCR-ABL能夠促進原代CD19+細胞增殖且能在體內(nèi)誘發(fā)B-ALL,但不具有連續(xù)移植能力,然而,同種條件下BCR-ABL轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓細胞引起的B-ALL卻能夠連續(xù)移植且其B-ALL中白血病干細胞的頻率在1/135到1/629之間。我們推測BCR-ABL+的白血病干細胞可能來源于CD19-的造血干祖細胞。
徐曉紅[4]（2010）在《抗腫瘤雙特異免疫導(dǎo)向治療制劑CAtin的表達及其體內(nèi)外抑瘤作用》文中研究說明由抗體介導(dǎo)的免疫靶向治療是腫瘤生物治療的主要組成部分,但其發(fā)展仍面臨諸多挑戰(zhàn),如作為靶向工具的抗體分子量比較大、侵透性差、穩(wěn)定性弱；所應(yīng)用抗體多為鼠源抗體,免疫原性較高；所應(yīng)用抑癌分子特異性較低,存在損傷正常細胞的隱患等。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是一種廣泛存在于結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞表面的高度糖基化癌胚蛋白。人源化的抗CEA單鏈抗體（single chain Fv fragment, scFv） T84.66對CEA具有較高特異性,已普遍應(yīng)用于結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤的診斷和免疫治療,其療效已為臨床Ⅰ期試驗所證實。且scFv T84.66具有結(jié)合活性高、侵透性強、免疫原性低和廓清快等優(yōu)點。scFv T84.66同其它單鏈抗體一樣具有先天缺陷,如較親本抗體親合力有所下降；在體溫條件下穩(wěn)定差較差；特定情況下會出現(xiàn)聚集傾向等,這可能與scFv的輕、重鏈可變區(qū)存在非共價鍵有關(guān),但這種現(xiàn)象會通過引入鏈間二硫鍵而有所改觀,即將scFv改構(gòu)為穩(wěn)定性較高的二硫鍵穩(wěn)定型單鏈抗體（disulfide stabilized single chain Fv fragments, scdsFv）。Apoptin基因來源于雞貧血病毒（chicken anemia virus, CAV）,能夠特異性地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,而對正常細胞無細胞毒作用。另外,腫瘤的放射治療和多數(shù)化學治療藥物通過p53發(fā)揮作用,一旦p53突變即會形成耐藥,而Apoptin的凋亡誘導(dǎo)作用不依賴p53,也不受凋亡抑制分子bcl-2等因素的影響,bcl-2分子的存在反而能夠增強其作用。因此,Apoptin基因已廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療研究領(lǐng)域。本研究通過生物信息學方法設(shè)計scdsFv T84.66,并利用人工合成方法,將Apoptin基因通過柔性肽序列連接至scdsFv T84.66下游,構(gòu)建并表達了具有特異性識別／結(jié)合CEA功能和特異性殺傷腫瘤細胞功能的抗腫瘤雙特異免疫導(dǎo)向治療制劑CAtin,并在體內(nèi)、外對其抑瘤作用進行了分析。
高海德[5]（2007）在《人雙突變的二氫葉酸還原酶與胞苷脫氨基酶基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細胞的實驗研究》文中提出化療是治療惡性腫瘤的重要手段,化學藥物劑量的增加無疑可以最大程度消除腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤負荷及緩解期體內(nèi)微小的腫瘤殘留灶,有助于提高患者的長期無瘤生存率,但其引起的骨髓抑制是造成患者嚴重感染、出血、死亡的主要原因。如何提高骨髓造血細胞對化療的耐受性,一直是人們所關(guān)注的焦點。為此,將耐藥基因?qū)牍撬杓毎怪@得耐藥表型以增加骨髓對化療藥物的耐受性已獲得成功,盡管臨床廣泛應(yīng)用尚存在某些問題,但應(yīng)用潛力很大。其中研究最多的是多藥耐藥基因（mdr1）,它可編碼高度糖基化的跨膜蛋白,將藥物從細胞內(nèi)泵出到細胞外,降低細胞內(nèi)藥物濃度,因而減少細胞毒性,將mdr1轉(zhuǎn)染骨髓造血細胞的化療保護作用在動物實驗得到證實,但臨床應(yīng)用尚不理想,同時轉(zhuǎn)染mdr1的小鼠出現(xiàn)了骨髓增殖綜合癥的報道更令人擔憂。近年多種化療藥物的耐藥基因被發(fā)現(xiàn),如:對環(huán)磷酰胺耐藥的醛脫氫酶基因、對烷化劑耐藥的六氧甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、對5-FU耐藥的胸腺嘧啶合成酶基因、對氨甲喋呤耐藥的二氫葉酸還原酶基因、對阿糖胞苷耐藥的胞苷脫氨基酶基因等。并得出如下結(jié)論:理想的耐藥基因應(yīng)具備多種藥物耐藥而非單一藥物、無免疫原性、治療基因片段較小、耐藥基因耐特異藥不宜毒性過大、基因轉(zhuǎn)染無突變及癌變產(chǎn)生。經(jīng)實驗證實,人突變的二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolate reductase,DHFR）與胞苷脫氨基酶基因（cytidine deaminase,CD）具備上述條件。為解決大劑量化療所引起的骨髓抑制問題,我們將DHFR與DHFR-CD基因通過包裝細胞PA317導(dǎo)入小鼠骨髓細胞后,將轉(zhuǎn)染DHFR-CD基因的小鼠骨髓細胞移植給小鼠,觀察大劑量化療后的小鼠的血象、體重、生存率變化及小鼠骨髓細胞耐藥CFU-GM集落生成情況;同時檢測小鼠骨髓細胞耐藥基因的表達情況。進而評估轉(zhuǎn)染了DHFR-CD基因的小鼠骨髓細胞對大劑量化療的耐受性,以了解所轉(zhuǎn)染基因在小鼠體內(nèi)的化療保護作用,為以后的雙耐藥基因臨床應(yīng)用提供動物實驗?zāi)Ｐ汀７椒ㄒ?、質(zhì)粒擴增感受態(tài)細胞置于離心管中,分別加含質(zhì)粒DHFR、DHFR-CD及普通培養(yǎng)基,搖振后鋪于含抗生素的瓊脂平板表面,液體被吸收后倒置培養(yǎng),其菌落接種于培養(yǎng)液后培養(yǎng)過夜收集菌沉淀,質(zhì)粒提取、純化按試劑說明書進行。二、細胞的培養(yǎng)雙噬性包裝細胞PA317及小鼠成纖維細胞NIH3T3均于10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2的飽和濕度條件下維持細胞生長,PA317供轉(zhuǎn)染;NIH3T3細胞用作病毒上清滴度測定及輔助病毒的檢測。三、細胞轉(zhuǎn)染、克隆篩選及擴增采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒DHFR及DHFR-CD分別轉(zhuǎn)染PA317細胞株后,用不同濃度的氨甲喋呤和阿糖胞苷進行藥物篩選獲得耐藥克隆并擴增耐藥細胞數(shù)量,另設(shè)不加質(zhì)粒的對照轉(zhuǎn)染組。四、小鼠骨髓細胞的制備Balb/c小鼠尾靜脈注射5-Fu,3天后脫頸處死,酒精浸泡,取其股骨和脛骨,收集骨髓細胞制成懸液,淋巴細胞分離液分離出單個核細胞,懸于20%FCSRPMI1640的塑料培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2h,回收懸浮的骨髓單個核細胞。五、小鼠骨髓細胞的感染計數(shù)小鼠骨髓單個核細胞總數(shù),使骨髓單個核細胞和轉(zhuǎn)基因之病毒產(chǎn)生細胞按1:1的比例,置于含20%小牛血清和1%谷氨酰胺的10%WEHI條件培養(yǎng)液中,另設(shè)對照組用不加質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的PA317細胞。兩組在37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)48h后收集骨髓細胞,制成細胞懸液,置PBS平衡液中作CFU-GM培養(yǎng)及小鼠體內(nèi)移植用。六、感染DHFR和DHFR-CD后的小鼠骨髓細胞CFU-GM及耐藥基因的檢測檢測共培養(yǎng)后經(jīng)藥物處理的小鼠骨髓細胞的CFU-GM生成及前病毒基因整合及表達情況,培養(yǎng)分為兩組:實驗組加入化療藥;對照組不加化療藥,培養(yǎng)第12d后計數(shù)集落,進行結(jié)果分析。PCR檢測轉(zhuǎn)染DHFR小鼠骨髓細胞前病毒基因整合（proviral integration）;RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染DHFR-CD小鼠骨髓細胞基因表達,提取其RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、PCR擴增及電泳PCR產(chǎn)物。七、感染DHFR-CD后的小鼠骨髓細胞的小鼠體內(nèi)實驗Balb/c小鼠在致死量鈷60照射后根據(jù)體重隨機分為兩組:實驗組尾靜脈注射感染后的小鼠骨髓細胞,對照組注射同等數(shù)量轉(zhuǎn)染對照組的小鼠骨髓細胞,細胞移植后4周,每只小鼠腹腔注射MTX和Ara-C,連續(xù)4d。觀察小鼠血象、體重及生存率的變化;5周后兩組各處死小鼠1只,取其骨髓細胞做CFU-GM培養(yǎng)及耐藥基因檢測。結(jié)果一、穩(wěn)定的產(chǎn)病毒細胞擴增、純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PA317細胞、經(jīng)藥物篩選后見耐藥克隆生長,擴大培養(yǎng)其耐藥基因檢測陽性;以NIH3T3為靶細胞測定逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度,當病毒原液為0.01 ml時,DHFR和DHFR-CD病毒滴度分別為3.21×104CFU/mL、3.35×104CFU/mL;病毒原液為0.10ml時,DHFR和DHFR-CD病毒滴度分別為1.43×105CFU/L、1.54×105CFU/L;輔助病毒的檢測無復(fù)制活性病毒產(chǎn)生。表明制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒或轉(zhuǎn)染的PA317可供感染細胞用。二、轉(zhuǎn)染DHFR小鼠骨髓細胞的體外實驗1、小鼠骨髓細胞耐藥克隆形成實驗:實驗組、對照組均不加MTX時其耐藥克隆數(shù)分別為287和273,加入時其耐藥克隆數(shù)分別為42（14.6%）和0,兩組克隆出現(xiàn)率比較具有顯著性差異（P＜0.05）,說明轉(zhuǎn)染DHFR的小鼠骨髓細胞對MTX有明顯的耐受性。2、實驗組PCR產(chǎn)物電泳顯示轉(zhuǎn)染基因條帶而對照組未顯示,說明小鼠骨髓細胞已成功轉(zhuǎn)染DHFR基因。三、轉(zhuǎn)染DHFR-CD小鼠骨髓細胞的體外實驗1、小鼠骨髓細胞耐藥克隆形成實驗:實驗組、對照組均不加入MTX和Ara-C,其耐藥克隆數(shù)分別為307和296,加入兩藥其耐藥克隆數(shù)分別為47（15.3%）和0,兩組克隆出現(xiàn)率比較具有顯著性差異（P＜0.05）,說明轉(zhuǎn)染雙耐藥基因的小鼠骨髓細胞對MTX和Ara-C有明顯的耐受性。2、實驗組RT-PCR產(chǎn)物電泳顯示轉(zhuǎn)染基因條帶而對照組未顯示,說明轉(zhuǎn)染的DHFR-CD在分子生物學上有表達。四、轉(zhuǎn)染DHFR-CD小鼠骨髓細胞的體內(nèi)實驗1、轉(zhuǎn)雙耐藥基因小鼠在大劑量MTX和Ara-C注射后,小鼠體重、白細胞開始下降,但較對照組下降幅度小,至第6周其白細胞恢復(fù)正常;其存活率為66.7%而對照組為0,兩組比較具有顯著性差異（P＜0.0 1）。2、小鼠骨髓細胞耐藥克隆形成實驗:實驗組、對照組不加入MTX和Ara-C,兩組耐藥克隆數(shù)分別為167和173,兩組加入兩藥其耐藥克隆數(shù)分別為42（25.1%）和0,兩組比較具有顯著性差異（P＜0.05）,說明轉(zhuǎn)基因小鼠對兩種藥物有一定程度的抗藥性。3、轉(zhuǎn)基因組小鼠骨髓細胞經(jīng)RT-PCR檢測,顯示有耐藥基因條帶而對照組未顯示,說明經(jīng)轉(zhuǎn)染的耐藥基因在小鼠體內(nèi)有表達。結(jié)論1、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒DHFR及DHFR-CD轉(zhuǎn)染入PA317細胞株,可以獲得安全穩(wěn)定的產(chǎn)病毒的細胞系。2、小鼠骨髓細胞與產(chǎn)病毒的細胞共培養(yǎng)可以將耐藥基因轉(zhuǎn)染到小鼠骨髓細胞,且能夠有效的表達并顯示出良好的抗藥性。3、轉(zhuǎn)基因小鼠,其骨髓中可檢測到被轉(zhuǎn)染的耐藥基因且小鼠生存率提高,說明了該基因在小鼠體內(nèi)起到了對小鼠的化療保護作用。
周鑫莉,王季石,顧靜文,林果為[6]（2002）在《逆病毒載體介導(dǎo)的雙耐藥基因在小鼠骨髓細胞的轉(zhuǎn)移》文中認為目的 增強造血細胞對化療藥物的耐受性 ,探討逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率及耐藥基因?qū)朐谠煅毎Ｗo性基因治療中的作用。方法 應(yīng)用電穿孔基因轉(zhuǎn)移法將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體G1Na MGMT IRES MDR1導(dǎo)入病毒包裝細胞GP +E86及PA3 17,以VCR加壓篩選后的陽性克隆上清感染小鼠骨髓細胞 ,應(yīng)用PCR、Southernblot及流式細胞儀檢測耐藥基因MGMT及MDR1在細胞中的轉(zhuǎn)移與表達。結(jié)果 加壓篩選及乒乓效應(yīng)使病毒滴度由 （ 0 .2～ 7.6）× 10 4CFU/mL提高到 （ 1.9～ 5 .7）× 10 6 CFU/mL ,從DNA、RNA及蛋白水平上分別證實了雙耐藥基因在小鼠骨髓細胞中獲得了有效轉(zhuǎn)移和表達 ,而轉(zhuǎn)基因后的小鼠骨髓細胞對VCR、高三尖杉酯堿和BCNU的耐藥性比未轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞分別提高了 5 .7、5 .0和 8.5倍。結(jié)論 雙耐藥基因成功導(dǎo)入小鼠骨髓細胞為腫瘤基因治療的臨床研究提供了實驗基礎(chǔ)。
王季石,孫等軍,林果為,費儉[7]（2001）在《逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)MGMT和MDR1基因增強人臍血CD34+細胞對聯(lián)合化療抗性的研究》文中認為為探討轉(zhuǎn)染六氧甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因（MGMT）和多藥耐藥基因（MDR1）的人臍血CD34+細胞能否同時增強對卡氮芥（BCNU）和MDR1基因靶藥的抗性,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）從人肝組織中獲得編碼六氧甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）cDNA,構(gòu)建雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體G1Na-MGMT-IRES-MDR1,以電穿孔介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法導(dǎo)入GP+E86和PA317病毒包裝細胞,采用含BCNU和長春新堿（VCR）的培養(yǎng)基克隆選擇后收集重組病毒上清于單向型GP+E86與雙嗜型PA317包裝細胞行乒乓交互感染,將含MGMT和MDR1雙耐藥基因重組病毒的上清在細胞生長因子刺激下重復(fù)感染經(jīng)免疫磁珠分離系統(tǒng)（MACS）分離純化后的人臍血CD34+細胞,用PCR,RT-PCR,Southern blot,Northern blot,FACS和MTT等方法檢測外源MGMT與MDR1基因在CD34+細胞中的轉(zhuǎn)移和表達。結(jié)果顯示,DNA測序及酶切鑒定證實MGMTcDNA克隆和雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的正確性,MACS分離純化后的人臍血CD34+細胞純度平均達92%,回收率為75%,含雙耐藥基因重組病毒的上清最高滴度為5.8×105cfu/ml,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的雙耐藥基因已整合入轉(zhuǎn)染靶細胞中基因組并獲得有效表達,同時傳遞不同的耐藥表型,應(yīng)用集落計數(shù)、PCR方法測定基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為18%和20%,巢式PCR及補救分析均未檢測到輔助病毒存在,經(jīng)雙耐藥基因修飾的臍血CD34+細胞對BCNU的IC50較對照組提高4.5倍,對VCR,柔紅霉素（DNR）和秋水仙堿（COL）的IC50較未轉(zhuǎn)染細胞分別高7.8,6.6和5.5倍。本研究對降低聯(lián)合化療骨髓毒性作用的腫瘤臨床研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
王季石,夏學鳴,陳子興,盧大儒,薛京倫,阮長耿[8]（2000）在《逆病毒載體介導(dǎo)雙耐藥基因在臍血CD34+細胞中的表達和抗性研究》文中研究表明為探討轉(zhuǎn)染醛脫氫酶基因（ALDH1）和多藥耐藥基因（MDR1）的人臍血CD34+細胞能否同時增強對活性環(huán)磷酰胺（4-HC）和MDR1基因靶藥的抗性,構(gòu)建了同時含ALDH1和MDR1雙耐藥基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達質(zhì)粒G1Na-ALDH1-IRES-MDR1,經(jīng)Lipofect-AMINE介導(dǎo)轉(zhuǎn)染GP+E86和PA317包裝細胞,采用含長春新堿（VCR）和4-HC的培養(yǎng)基克隆選擇后收集重組病毒上清于單向型GP+E86與雙嗜型PA317包裝細胞行乒乓交互感染,獲得PA317重組病毒生產(chǎn)細胞（最高滴度達5.6×105CFU/ml）,將含ALDH1和MDR1雙耐藥基因重組病毒的上清在細胞生長因子刺激下重復(fù)感染人臍血CD34+細胞,用PCR、RT-PCR、Southern blot、Northern blot、FACS和MTT等方法檢測外源ALDH1與MDR1基因在CD34+細胞中的轉(zhuǎn)移和表達。結(jié)果顯示:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的雙耐藥基因已經(jīng)整合入轉(zhuǎn)染靶細胞基因組并獲得有效表達,同時傳遞不同的耐藥表型。經(jīng)雙耐藥基因修飾的臍血CD34+細胞對4-HC和VCR藥物同時產(chǎn)生抗性,其IC50值分別比未轉(zhuǎn)染細胞高4倍和7.2倍,本研究為開展腫瘤基因治療的臨床研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
崔竹梅[9]（2000）在《絨癌耐藥細胞株的建立及耐藥基因逆轉(zhuǎn)的研究》文中進行了進一步梳理研究目的： 絨癌是發(fā)生于生育年齡婦女的高度惡性腫瘤，對化療敏感，是人類最早可以治愈的實體瘤之一。但仍有20％的患者因治療失敗而死亡，化療是絨癌的主要治療方法，對化療藥物耐受性的產(chǎn)生是治療失敗的主要原因。腫瘤的耐藥可以是先天性的，也可在接受化療后獲得，涉及多種耐藥基因的表達，因此逆轉(zhuǎn)腫瘤業(yè)已形成的多藥耐藥性，是進一步提高絨癌療效的有效途徑。本研究擬應(yīng)用基因工程技術(shù)將細胞因子基因（IL-2）導(dǎo)入已建立的絨癌耐藥細胞株，觀察細胞因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對絨癌細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。 研究內(nèi)容： 一 建立絨癌耐藥細胞株 采用濃度梯度遞增法和間歇誘導(dǎo)的方法，用5-Fu，MTX，VP-16誘導(dǎo)絨癌細胞株JEG-3建立6個耐藥細胞株，JEG-3／Fu1，JEG-3／Fu2，JEG-3／MTX1，JEG-3／MTX2，JEG-3／VP1和JEG-3／VP2，采用MTT法測定耐藥細胞株對5-Fu，MTX，KSM，VP-16和Taxol的耐藥指數(shù)，用RT-PCR測定親本細胞及各耐藥細胞株耐藥相關(guān)基因（LRP，MRP，GST-π，DHFR，MDR-1）的表達，比較各種細胞生長曲線，群體細胞的倍增時間，分泌β-HCG的差異，以了解獲得性耐藥的機理。 結(jié)果：用RT-PCR擴增結(jié)果表明JEG-3細胞株在誘導(dǎo)耐藥前即有LRP，MRP，GST-π，DHFR的共表達，而無MDR-1的表達。用VP-16，5-Fu采用間歇誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)形成的耐藥細胞株MDR-1表達增強，其它耐藥基因的表達無改變。用MTX誘導(dǎo)的耐藥細胞株及用VP-16，5-Fu持續(xù)誘導(dǎo)形成的耐藥細胞株
劉偉[10]（2007）在《Mdr1在腫瘤化療中療效及骨髓保護的實驗研究》文中研究說明目的:克隆多藥耐藥基因1（MDR1）至腺病毒質(zhì)粒載體中并導(dǎo)入包裝細胞,產(chǎn)生表達目的基因的重組腺病毒。方法:PCR法體外克隆出目的基因并將該基因采用定向克隆的方法克隆進入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中,采用同源重組方法將該質(zhì)粒和腺病毒質(zhì)粒Adeasy-1連接,最后通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法導(dǎo)入包裝細胞HEK293中,產(chǎn)生表達目的基因的重組腺病毒。結(jié)果:（1）PCR法克隆出目的基因MDR1,并通過基因測序篩選出正確的克隆,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrack-MDR1;（2）將MDR1基因克隆進入腺病毒質(zhì)粒載體中形成重組腺病毒質(zhì)粒Adeasy-MDR1,并將重組腺病毒質(zhì)粒Adeasy-MDR1導(dǎo)入包裝細胞HEK293中形成表達mdr1的高滴度重組腺病毒Ad5-MDR1。（3）收獲的病毒感染液滴度達8.3×1011pfu/ml結(jié)論:克隆出正確的MDR1基因并重組含有目的基因MDR1的腺病毒,收獲高滴度重組腺病毒Ad5-MDR1,為進一步的研究打下了良好的基礎(chǔ)。目的:建立一套完整、穩(wěn)定、高效的體外基因轉(zhuǎn)染體系將外源性mdr1基因?qū)隒57和Balb/c小鼠骨髓單個核細胞,評價轉(zhuǎn)染后mdr1基因在靶細胞中功能性表達情況,為進一步將轉(zhuǎn)染的骨髓細胞移植保護受體骨髓免受大劑量化療藥物的損傷實驗提供基礎(chǔ)。方法:采用乒乓交互感染收集并濃縮病毒上清,采用濃縮病毒上清轉(zhuǎn)染法將mdr1基因?qū)肽[瘤壞死因子α（TNF-α）預(yù)處理后的C57和Balb/c小鼠骨髓單個核細胞,采用RT-PCR法、Western-blot分別從基因、蛋白質(zhì)水平檢測mdr1基因在小鼠骨髓單個核細胞中的功能性表達,柔紅霉素排出試驗從功能水平檢測mdr1基因在小鼠骨髓單個核細胞中的功能性表達情況,探討轉(zhuǎn)染時間和轉(zhuǎn)染效率、功能之間的關(guān)系。結(jié)果:（1）建立了一套完整、穩(wěn)定、高效的mdr1基因體外轉(zhuǎn)染體系;（2）流式細胞儀測得體外轉(zhuǎn)染率可達到26.26%,（3）柔紅霉素排出試驗證實導(dǎo)入的mdr1基因表達產(chǎn)物P-gp有藥物外排泵功能。（4）RT-PCR法證實外源性mdr1基因有效地在小鼠骨髓單個核細胞基因組表達;（5）Western-blot測得轉(zhuǎn)染后P-糖蛋白（P-glycoprotein P-gp）表達較轉(zhuǎn)染前明顯增高;結(jié)論:通過腺病毒載體可在體外將外源性mdr1基因有效的轉(zhuǎn)入小鼠骨髓單個核細胞中,轉(zhuǎn)染的mdr1基因能有效地在靶細胞基因組中表達,為進一步移植轉(zhuǎn)染細胞保護骨髓免受大劑量化療損傷的體內(nèi)實驗提供基礎(chǔ)。目的:本研究旨在通過mdr1基因轉(zhuǎn)染的骨髓造血細胞移植來提高C57和Balb/c小鼠肺癌和乳腺癌骨髓對化療的耐受性,然后觀察超劑量化療中mdr1基因的骨髓保護及腫瘤治療作用;并監(jiān)測外源性mdr1基因在受體骨髓內(nèi)表達的情況。方法:將小鼠骨髓單個核細胞與含有人全長mdr1 cDNA的腺病毒共培養(yǎng)4日后,將轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)骨髓腔注射移植入經(jīng)60CO放療預(yù)處理的Lewis肺癌和4T1乳腺癌荷瘤小鼠體內(nèi),然后進行超劑量表阿霉素化療實驗,檢測mdr1基因?qū)κ荏w骨髓的保護作用、超劑量化療對腫瘤的治療作用。同時采用RT-PCR法、Western blot法分別從基因、蛋白水平檢測外源性mdr1基因在受體骨髓的表達情況。結(jié)果:（1）采用培養(yǎng)細胞移植法成功建立Lewis肺癌和4T1乳腺癌動物模型;（2）采用骨髓腔內(nèi)注射移植將轉(zhuǎn)染mdr1基因的骨髓單個核細胞回輸入荷瘤小鼠,受體骨髓中有外源性mdr1基因的功能性表達;（3）超劑量化療實驗中,轉(zhuǎn)染mdr1基因的荷瘤小鼠能耐受3倍劑量表阿霉素的化療,外周血白細胞可維持在正常范圍,同時腫瘤能被有效治療,荷瘤動物的生存時間及生存質(zhì)量明顯高于對照組（P﹤0.05）,對照組荷瘤動物死于超劑量化療所造成的嚴重骨髓抑制或腫瘤擴散。結(jié)論:mdr1基因轉(zhuǎn)染的骨髓造血細胞移植后可于受體骨髓中功能性表達;mdr1基因能有效保護骨髓的造血功能,使超劑量化療能更有效殺滅腫瘤。
二、逆病毒載體介導(dǎo)的雙耐藥基因在小鼠骨髓細胞的轉(zhuǎn)移（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細分析其設(shè)計過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關(guān)系。
文獻研究法：通過調(diào)查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學理論和實踐的需要提出設(shè)計。
定性分析法：對研究對象進行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。
跨學科研究法：運用多學科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。
功能分析法：這是社會科學用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、逆病毒載體介導(dǎo)的雙耐藥基因在小鼠骨髓細胞的轉(zhuǎn)移（論文提綱范文）
（1）泛實體瘤相關(guān)抗原圖譜的構(gòu)建及其在抗體偶聯(lián)藥物和嵌合抗原受體T細胞上的應(yīng)用（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略語對照表 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 抗體偶聯(lián)藥物的知識現(xiàn)狀 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC發(fā)展簡史 |
| 1.1.2 獲得監(jiān)管批準的上市ADC |
| 1.1.3 臨床試驗中的在研ADC及其靶標圖譜 |
| 1.1.4 抗體骨架和靶標的選擇 |
| 1.1.5 連接子類型和偶聯(lián)技術(shù) |
| 1.1.6 有效載荷 |
| 1.1.7 ADC在體內(nèi)的工作原理 |
| 1.1.8 ADC對難治性癌癥的治療 |
| 1.1.9 ADC的毒性問題 |
| 1.1.10 ADC耐藥機制 |
| 1.1.11 未來展望 |
| 1.2 嵌合抗原受體T細胞的知識現(xiàn)狀 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T發(fā)展簡史 |
| 1.2.2 CAR-T細胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T細胞受體的結(jié)構(gòu) |
| 1.2.4 獲得監(jiān)管批準的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T細胞療法的毒性 |
| 1.2.6 未來挑戰(zhàn)、機會和應(yīng)用 |
| 1.3 本課題的研究目標 |
| 第二章 基于多組學構(gòu)建泛實體瘤相關(guān)抗原圖譜 |
| 引言 |
| 2.1 數(shù)據(jù)采集與分析方法 |
| 2.1.1 正常組織轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的數(shù)據(jù)采集 |
| 2.1.2 蛋白質(zhì)亞細胞定位數(shù)據(jù)的采集與編譯 |
| 2.1.3 人體組織器官的重排與映射 |
| 2.1.4 正常組織的表達及其分級 |
| 2.1.5 基因在腫瘤及其癌旁組織之間的差異表達分析 |
| 2.1.6 基因在腫瘤與其他正常組織之間的差異表達分析 |
| 2.1.7 腫瘤組織轉(zhuǎn)錄組、基因組和表型數(shù)據(jù)的編譯 |
| 2.1.8 功能相關(guān)突變的注釋 |
| 2.1.9 預(yù)測腫瘤相關(guān)抗原的蛋白過表達率 |
| 2.1.10 腫瘤相關(guān)抗原與癌細胞功能狀態(tài)的相關(guān)性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 臨床試驗的檢索策略 |
| 2.1.13 統(tǒng)計分析 |
| 2.2 分析結(jié)果 |
| 2.2.1 組裝綜合數(shù)據(jù)集并通過算法識別腫瘤相關(guān)抗原 |
| 2.2.2 腫瘤相關(guān)抗原的表達譜與差異表達譜 |
| 2.2.3 腫瘤相關(guān)抗原的異質(zhì)表達譜 |
| 2.2.4 預(yù)測腫瘤相關(guān)抗原的蛋白過表達率 |
| 2.2.5 癌癥驅(qū)動基因變異全景 |
| 2.2.6 候選腫瘤相關(guān)抗原的組合評估 |
| 2.3 討論 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制備及抗結(jié)直腸癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 實驗動物 |
| 3.2 實驗儀器及試劑 |
| 3.3 實驗方法 |
| 3.3.1 TCGA與 GTEx中 CDH17的m RNA數(shù)據(jù)的獲取與分析 |
| 3.3.2 免疫原的設(shè)計與制備 |
| 3.3.3 制備靶向CDH17 的單克隆抗體的免疫方案 |
| 3.3.4 抗體可變區(qū)基因測序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗體的構(gòu)建與表達純化 |
| 3.3.6 抗體結(jié)合親和力的測定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗體偶聯(lián)vc MMAE |
| 3.3.8 細胞內(nèi)吞實驗 |
| 3.3.9 細胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀產(chǎn)物的銀染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印跡 |
| 3.3.13 免疫組化 |
| 3.3.14 免疫熒光 |
| 3.3.15 流式細胞實驗 |
| 3.3.16 體外細胞毒性實驗 |
| 3.3.17 體內(nèi)抑瘤活性實驗 |
| 3.3.18 統(tǒng)計分析 |
| 3.4 實驗結(jié)果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道腫瘤和正常組織中的表達 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗體的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制備與表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在體外的抗腫瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM結(jié)腸癌異種移植模型中的抗腫瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 結(jié)腸癌異種移植模型中的抗腫瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠對CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 討論 |
| 3.6 本章小結(jié) |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T細胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 實驗動物 |
| 4.2 試劑耗材及設(shè)備 |
| 4.3 實驗方法 |
| 4.3.1 TCGA與 GTEx中 LYPD3 m RNA數(shù)據(jù)的獲取與分析 |
| 4.3.2 抗體人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包裝 |
| 4.3.4 CD3+T細胞的復(fù)蘇與激活 |
| 4.3.5 CD3+T細胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T細胞分化與耗竭的檢測 |
| 4.3.7 CAR-T體外細胞殺傷 |
| 4.3.8 CAR-T體內(nèi)活性實驗 |
| 4.3.9 細胞因子的檢測 |
| 4.3.10 統(tǒng)計分析 |
| 4.4 實驗結(jié)果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在腫瘤和正常組織中的表達 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T細胞的體外抗腫瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T細胞在PC9 肺腺癌異種移植模型中抗腫瘤活性 |
| 4.5 討論 |
| 4.6 本章小結(jié) |
| 第五章 全文總結(jié) |
| 參考文獻 |
| 攻讀博士期間取得的科研成果 |
| 致謝 |
（2）SHARPIN上調(diào)TAK1的表達并激活JNKs通路促進蕈樣肉芽腫疾病進展（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 研究背景 |
| 1.1 SHARPIN(SHANK-associated RH domain-interacting protein)研究概述 |
| 1.1.1 SHARPIN蛋白結(jié)構(gòu) |
| 1.1.2 Sharpin基因自發(fā)突變導(dǎo)致慢性增殖性皮炎小鼠(chronicproliferative dermatitis mutant,cpdm)表型出現(xiàn) |
| 1.1.3 SHARPIN是LUBAC復(fù)合體的一個亞單位 |
| 1.1.4 SHARPIN對細胞、組織器官生成、發(fā)育的影響 |
| 1.1.5 SHARPIN對骨骼發(fā)育及內(nèi)穩(wěn)態(tài)的影響 |
| 1.1.6 SHARPIN促進PTEN的泛素化、HOIP的激活和抑制β1-整合素活性 |
| 1.1.7 SHARPIN對細胞增殖、粘附、遷移的影響 |
| 1.1.8 SHARPIN在凋亡及壞死性凋亡中的作用 |
| 1.1.9 SHARPIN與相關(guān)炎性因素的關(guān)系和該關(guān)系對炎癥與免疫反應(yīng)的影響 |
| 1.1.10 SHARPIN參與相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié) |
| 1.1.11 SHARPIN與腫瘤發(fā)病相關(guān)性的研究進展 |
| 1.1.12 SHARPIN在其它疾病中的研究進展 |
| 1.2 MF的研究進展 |
| 1.2.1 MF的流行病學特征 |
| 1.2.2 MF的病因與發(fā)病機制 |
| 1.2.3 MF的臨床表現(xiàn) |
| 1.2.4 MF的組織病理和免疫病理 |
| 1.2.5 MF的診斷 |
| 1.2.6 MF的治療 |
| 1.2.7 疾病進展及預(yù)后的影響因素 |
| 第2章 SHARPIN上調(diào)TAK1的表達并激活JNKs通路促進MF疾病進展 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 主要儀器和耗材 |
| 2.2.3 方法 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.3.1 在MF中SHARPIN表達升高且與患者預(yù)后差有關(guān) |
| 2.3.2 在MyLa2059細胞中通過慢病毒構(gòu)建過表達或抑制SHARPIN |
| 2.3.3 MyLa2059細胞SHARPIN表達升高促進細胞存活 |
| 2.3.4 MyLa2059細胞SHARPIN表達升高抑制細胞凋亡 |
| 2.3.5 體外試驗顯示MyLa2059細胞SHARPIN表達升高促進細胞的遷移 |
| 2.3.6 體外試驗顯示MyLa2059細胞SHARPIN表達升高促進細胞的侵襲 |
| 2.3.7 SHARPIN轉(zhuǎn)錄激活TAK1的表達并激活JNKs通路 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 結(jié)論 |
| 綜述: SHARPIN與腫瘤相關(guān)性的研究進展 |
| 1.SHARPIN的研究進展 |
| 1.1 SHARPIN蛋白的結(jié)構(gòu)及其功能 |
| 1.2 Sharpin表達缺失誘發(fā)cpdm小鼠表型 |
| 1.3 SHARPIN調(diào)控NF-κB信號傳導(dǎo)通路 |
| 2.SHARPIN與腫瘤發(fā)病相關(guān)性的研究進展 |
| 2.1 SHARPIN影響血管生成、細胞遷移和侵襲能力、細胞增殖和凋亡的相關(guān)研究 |
| 2.1.1 SHARPIN與血管生成的相關(guān)研究 |
| 2.1.2 SHARPIN與細胞遷移和侵襲能力的相關(guān)研究 |
| 2.1.3 SHARPIN與細胞增殖、凋亡的相關(guān)研究 |
| 2.2 SHARPIN參與各種腫瘤發(fā)病的相關(guān)研究 |
| 2.2.1 SHARPIN參與多種腫瘤的發(fā)病 |
| 2.2.2 SHARPIN在人類多種腫瘤細胞株中通過抑制PTEN而促進腫瘤形成 |
| 2.2.3 SHARPIN介導(dǎo)的蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5的調(diào)節(jié)調(diào)控黑色素瘤的生成 |
| 2.2.4 SHARPIN-蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5-H3R2mel軸是肺癌細胞侵襲所必須的 |
| 2.2.5 SHARPIN高表達上調(diào)乳腺癌風險 |
| 2.2.6 SHARPIN促進乳腺癌激素療法耐藥 |
| 2.2.7 由SHARPIN基因拷貝數(shù)增加衍生的特性與乳腺癌患者預(yù)后差的相關(guān)性 |
| 2.2.8 SHARPIN在乳腺癌細胞中有助于P53的降解 |
| 2.2.9 SHARPIN穩(wěn)定ERα并促進乳腺癌細胞增殖 |
| 2.2.10 SHARPIN過表達通過NF-KB/ERK/Akt信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)人類前列腺癌細胞株LNCaP、DU145和PC-3細胞腫瘤生成 |
| 2.2.11 SHARPIN通過轉(zhuǎn)錄激活Versican的表達促進肝細胞癌的進展 |
| 3.結(jié)論 |
| 全文小結(jié) |
| 參考文獻 |
| 中英文縮略詞表 |
| 成果 |
| 致謝 |
（3）BCR-ABL誘導(dǎo)急性B淋巴細胞白血病發(fā)病機制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 緒論 |
| 第一部分:BCR-ABL融合蛋白C末端在其誘導(dǎo)急性B細胞白血病中的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 實驗材料與方法 |
| 1.2.1 實驗材料 |
| 1.2.2 實驗方法 |
| 1.3 實驗結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 結(jié)論 |
| 第二部分:BCR-ABL(+)B-ALL的白血病干細胞研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 實驗材料與方法 |
| 2.2.1 實驗材料 |
| 2.2.2 實驗方法 |
| 2.3 實驗結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學位期間已發(fā)表或錄用的論文 |
（4）抗腫瘤雙特異免疫導(dǎo)向治療制劑CAtin的表達及其體內(nèi)外抑瘤作用（論文提綱范文）
| 內(nèi)容提要 |
| 英文縮略詞表 |
| 緒論 |
| 第一篇 文獻綜述 |
| 第1章 消化系統(tǒng)腫瘤的基因治療 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 基因和胃腸道腫瘤 |
| 1.3 腫瘤基因治療基本策略 |
| 1.4 腫瘤基因治療的目的基因 |
| 1.5 基因轉(zhuǎn)移技術(shù) |
| 1.6 腫瘤基因治療的主要途徑 |
| 1.7 基因治療存在的問題 |
| 1.8 基因治療與動物模型、臨床試驗的關(guān)系 |
| 1.9 前景與展望 |
| 1.10 結(jié)論 |
| 第2章 細胞凋亡的研究進展 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 凋亡與細胞 |
| 2.3 凋亡與壞死 |
| 2.4 凋亡的機制 |
| 2.5 凋亡細胞生化特性 |
| 2.6 凋亡途徑 |
| 2.7 凋亡的病理、生理學 |
| 2.8 凋亡的調(diào)節(jié) |
| 2.9 凋亡的檢測 |
| 2.10 程序性細胞死亡的其他形式 |
| 2.11 展望 |
| 2.12 結(jié)論 |
| 第二篇 研究內(nèi)容 |
| 第1章 CAtin序列設(shè)計及原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定 |
| 1.1 材料與方法 |
| 1.2 結(jié)果 |
| 1.3 討論 |
| 1.4 小結(jié) |
| 第2章 CAtin在大腸桿菌中表達、鑒定及純化 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.3 討論 |
| 2.4 小結(jié) |
| 第3章 CAtin的體外抑瘤作用研究 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.3 討論 |
| 3.4 小結(jié) |
| 第4章 CAtin的體內(nèi)抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料與方法 |
| 4.2 結(jié)果 |
| 4.3 討論 |
| 4.4 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文及取得的科研成果 |
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
（5）人雙突變的二氫葉酸還原酶與胞苷脫氨基酶基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細胞的實驗研究（論文提綱范文）
| 一、摘要 |
| 中文論著摘要 |
| 英文論著摘要 |
| 二、英文縮略語 |
| 三、論文 |
| 論文一 |
| 前言 |
| 資料與方法 |
| 結(jié)果(附論文圖片) |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新性的自我評價 |
| 參考文獻 |
| 論文二 |
| 前言 |
| 資料與方法 |
| 結(jié)果(附論文圖片) |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新性的自我評價 |
| 參考文獻 |
| 論文三 |
| 前言 |
| 資料與方法 |
| 結(jié)果(附論文圖片) |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新性的自我評價 |
| 參考文獻 |
| 四、附錄 |
| 綜述 |
| 參考文獻 |
| 在學期間科研成績 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（9）絨癌耐藥細胞株的建立及耐藥基因逆轉(zhuǎn)的研究（論文提綱范文）
| 縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章：絨癌耐藥細胞株的建立及獲得性耐藥機制的探討 |
| 第一節(jié)：實驗材料 |
| 第二節(jié)：實驗方法 |
| 第三節(jié)：實驗結(jié)果 |
| 第四節(jié)：討論 |
| 第五節(jié)：小結(jié) |
| 第二章：IL-2基因轉(zhuǎn)染對絨癌耐藥細胞株JEG-3／VP2耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究 |
| 第一節(jié)：實驗材料 |
| 第二節(jié)：實驗方法 |
| 第三節(jié)：結(jié)果 |
| 第四節(jié)：討論 |
| 第五節(jié)：小結(jié) |
| 參考文獻 |
| 綜述一 |
| 綜述二 |
| 綜述三 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（10）Mdr1在腫瘤化療中療效及骨髓保護的實驗研究（論文提綱范文）
| 英漢縮略語名詞對照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文：MDR1 在腫瘤化療中療效及骨髓保護的實驗研究 |
| 前言 |
| 第一部分 多藥耐藥基因1（MDR1）的克隆及構(gòu)建表達MDR1 的重組腺病毒 |
| 前言 |
| 1. 材料與方法 |
| 2. 結(jié)果 |
| 3. 討論 |
| 4. 結(jié)論 |
| 第二部分 多藥耐藥（MDR1）基因轉(zhuǎn)染C57 和BALB/C 小鼠骨髓單個核細胞的體外實驗研究 |
| 前言 |
| 1. 材料與方法 |
| 2. 結(jié)果 |
| 3. 討論 |
| 4. 結(jié)論 |
| 第三部分 MDR1基因轉(zhuǎn)染骨髓移植聯(lián)合超劑量化療治療LEWIS肺癌和4T1 乳腺癌小鼠的研究 |
| 前言 |
| 1. 材料與方法 |
| 2. 結(jié)果 |
| 3. 討論 |
| 4. 結(jié)論 |
| 全文小結(jié) |
| 附圖 |
| 參考文獻 |
| 文獻綜述 |
| 致謝 |
| 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文 |
四、逆病毒載體介導(dǎo)的雙耐藥基因在小鼠骨髓細胞的轉(zhuǎn)移（論文參考文獻）
- [1]泛實體瘤相關(guān)抗原圖譜的構(gòu)建及其在抗體偶聯(lián)藥物和嵌合抗原受體T細胞上的應(yīng)用[D]. 方佳成. 西北大學, 2021(12)
- [2]SHARPIN上調(diào)TAK1的表達并激活JNKs通路促進蕈樣肉芽腫疾病進展[D]. 陳飚. 南方醫(yī)科大學, 2018(05)
- [3]BCR-ABL誘導(dǎo)急性B淋巴細胞白血病發(fā)病機制研究[D]. 李東河. 上海交通大學, 2016(03)
- [4]抗腫瘤雙特異免疫導(dǎo)向治療制劑CAtin的表達及其體內(nèi)外抑瘤作用[D]. 徐曉紅. 吉林大學, 2010(09)
- [5]人雙突變的二氫葉酸還原酶與胞苷脫氨基酶基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細胞的實驗研究[D]. 高海德. 中國醫(yī)科大學, 2007(07)
- [6]逆病毒載體介導(dǎo)的雙耐藥基因在小鼠骨髓細胞的轉(zhuǎn)移[J]. 周鑫莉,王季石,顧靜文,林果為. 復(fù)旦學報(醫(yī)學版), 2002(01)
- [7]逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)MGMT和MDR1基因增強人臍血CD34+細胞對聯(lián)合化療抗性的研究[J]. 王季石,孫等軍,林果為,費儉. 實驗生物學報, 2001(03)
- [8]逆病毒載體介導(dǎo)雙耐藥基因在臍血CD34+細胞中的表達和抗性研究[J]. 王季石,夏學鳴,陳子興,盧大儒,薛京倫,阮長耿. 實驗生物學報, 2000(04)
- [9]絨癌耐藥細胞株的建立及耐藥基因逆轉(zhuǎn)的研究[D]. 崔竹梅. 中國協(xié)和醫(yī)科大學, 2000(11)
- [10]Mdr1在腫瘤化療中療效及骨髓保護的實驗研究[D]. 劉偉. 重慶醫(yī)科大學, 2007(02)
標簽：腫瘤論文; 骨髓細胞論文; 化療藥物論文; 抗原抗體論文; 細胞轉(zhuǎn)染論文;