一、瑞典科學(xué)家用細(xì)胞移植治療糖尿?。ㄕ撐奈墨I(xiàn)綜述）
李碧欣[1]（2021）在《MAFA、PDX1修飾促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的作用研究》文中認(rèn)為目的:研究MAFA、PDX1修飾促進(jìn)人臍帶華爾通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,Hu MSCs）向胰島素分泌細(xì)胞（insulin-producing cells,IPCs）分化的潛能,為1型糖尿病患兒的干細(xì)胞治療提供新的細(xì)胞來源。方法:（1）用組織貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增Hu MSCs,并用流式細(xì)胞術(shù)鑒定Hu MSCs。（2）構(gòu)建、包裝、濃縮MAFA-PDX1過表達(dá)慢病毒載體。（3）用不同濃度梯度感染復(fù)數(shù)（MOI）的MAFA-PDX1過表達(dá)慢病毒感染Hu MSCs,培養(yǎng)72h后用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測感染效率,選擇最適MOI進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。（4）用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、RT-qPCR法、雙硫腙染色比較三種方案（方案A:單純慢病毒組、方案B:先藥物誘導(dǎo)再加慢病毒組、方案C:慢病毒和藥物誘導(dǎo)同時進(jìn)行組）誘導(dǎo)Hu MSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞的效率和潛能。結(jié)果:（1）從臍帶華爾通膠中成功分離、培養(yǎng)出HuMSCs,流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示Hu MSCs穩(wěn)定高表達(dá)CD73,CD90,CD105,低表達(dá)或者不表達(dá)CD11b,CD19,CD34,CD45,HLA-DR;并擴(kuò)增出足夠多的細(xì)胞滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求;（2）成功構(gòu)建MAFA-PDX1過表達(dá)慢病毒載體,并獲得高濃度的慢病毒原液（HBLV-Zs Green-PURO,濃度滴度結(jié)果為3*10^8TU/m L;HBLV-h-MAFA-PDX1-3xflag-Zs Green-PURO,濃度滴度結(jié)果為1*10^8TU/m L）。（3）當(dāng)MOI=5時,慢病毒感染率為52.6%,MOI為10,20,30時感染率分別為99%,100%,100%;最適MOI是選擇細(xì)胞感染率大于90%同時細(xì)胞狀態(tài)良好情況下的最小MOI值。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇MOI=10的MAFA-PDX1過表達(dá)慢病毒載體感染Hu MSCs。（4）不同方案誘導(dǎo)MAFA-PDX1修飾Hu MSCs向胰島素分泌細(xì)胞分化結(jié)果:（1）細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:經(jīng)三種方案誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生了改變:誘導(dǎo)后細(xì)胞失去典型的成纖維細(xì)胞形狀,開始出現(xiàn)圓形或多角形改變,隨后慢慢出現(xiàn)細(xì)胞聚集成團(tuán),細(xì)胞團(tuán)塊逐漸變大,最后呈胰島狀細(xì)胞改變;三種誘導(dǎo)方案中,方案B（先藥物誘導(dǎo)再加慢病毒組）在第11天的細(xì)胞聚集生長最為明顯,出現(xiàn)聚集生長的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。（2）RT-qPCR檢測胰島相關(guān)基因的表達(dá)差異:方案A（單純慢病毒組）:誘導(dǎo)第5天:MAFA、PDX1、GCG、GLUT2、NKX6.1基因表達(dá)升高（P<0.05）,INS和NEUROG3基因表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異。誘導(dǎo)第11天:MAFA、PDX1、GCG、NKX6.1基因表達(dá)升高（P<0.05）,INS、GLUT2和NEUROG3基因表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異。誘導(dǎo)第5、11天比較:MAFA、PDX1、GCG、NKX6.1基因在誘導(dǎo)第5、11天均表達(dá)升高,誘導(dǎo)第5天表達(dá)量均高于第11天。GLUT2基因在誘導(dǎo)第5天表達(dá)量升高,第11天無明顯變化。方案B（先藥物誘導(dǎo)再加慢病毒組）:誘導(dǎo)第5天:MAFA、GCG、INS、NKX6.1基因表達(dá)升高（P<0.05）;PDX1、GLUT2、NEUROG3基因表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異。誘導(dǎo)第11天:MAFA、PDX1、GCG、INS、GLUT2基因表達(dá)升高（P<0.05）,NKX6.1、NEUROG3基因表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異。誘導(dǎo)第5、11天比較:MAFA、GCG、INS基因在誘導(dǎo)第5、11天均表達(dá)升高,其中MAFA和INS基因第11天表達(dá)量顯著高于第5天,GCG基因第5天表達(dá)量高于第11天。PDX1、GLUT2基因在誘導(dǎo)第5天無明顯表達(dá),第11天表達(dá)量升高。NKX6.1基因在誘導(dǎo)第5天升高,第11天無明顯表達(dá)。方案C（慢病毒和藥物誘導(dǎo)同時進(jìn)行組）:誘導(dǎo)第5天:MAFA、PDX1、GCG、INS基因表達(dá)升高（P<0.05）,GLUT2、NKX6.1、NEUROG3基因表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異。誘導(dǎo)第11天:MAFA、PDX1、INS基因表達(dá)升高,GLUT2基因表達(dá)降低（P<0.05）,GCG、NKX6.1、NEUROG3基因表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異。誘導(dǎo)第5、11天比較:MAFA、PDX1、INS基因在誘導(dǎo)第5、11天均表達(dá)升高,其中MAFA、PDX1基因第5天表達(dá)量高于第11天,INS基因第11天表達(dá)量高于第5天。GCG在誘導(dǎo)第5天表達(dá)升高,第11天無明顯表達(dá)。GLUT2基因在誘導(dǎo)第5天無明顯表達(dá),第11天表達(dá)下降。三種方案誘導(dǎo)后細(xì)胞胰島相關(guān)基因表達(dá)差異:同一誘導(dǎo)時間點(diǎn)三種方案橫向比較,在誘導(dǎo)第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表達(dá)量最高;在誘導(dǎo)第11天,方案B的MAFA和PDX1基因表達(dá)量最高。方案B在誘導(dǎo)第5天GCG基因表達(dá),第11天INS和GLUT2基因表達(dá)是三種方案中最高的。因此,方案B具有向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能。（3）雙硫腙染色鑒定鋅離子:在倒置相差顯微鏡下可觀察到,經(jīng)三種方案誘導(dǎo)第11天的部分細(xì)胞被雙硫腙染成棕紅色,其中方案B中呈小島狀細(xì)胞染色顏色較深（陽性表達(dá)）,而對照組未表達(dá)。結(jié)論:（1）MAFA和PDX1共過表達(dá)可促進(jìn)Hu MSCs向IPCs分化。（2）MAFA-PDX1基因修飾聯(lián)合藥物誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)HuMSCs向IPCs分化優(yōu)于單純基因修飾方案,具有向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能。
于海濱[2]（2020）在《線粒體甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（GPAM）基因沉默對牛乳脂代謝的影響》文中提出隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展和人類生活水平的提高,消費(fèi)者對牛乳品質(zhì)的需求也逐漸增加,對乳品質(zhì)的要求也越來越高。牛乳品質(zhì)性狀是復(fù)雜經(jīng)濟(jì)性狀,多基因共同調(diào)控其表型變化。隨著后基因組學(xué)時代的到來,篩查與挖掘奶牛乳脂性狀相關(guān)且具有重大遺傳效應(yīng)的候選功能基因,成為當(dāng)前奶牛遺傳育種科研工作者的主要挑戰(zhàn)。甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶線粒體（GPAM）基因,屬于GPAT基因家族,該基因定位在牛第26q22號染色體上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反應(yīng)。基于課題組前期組學(xué)分析結(jié)果,GPAM基因可能對牛乳脂代謝具有重要影響。本研究以GPAM為候選基因,在敲除細(xì)胞水平驗(yàn)證目的基因與牛脂質(zhì)代謝的功能,同時在模式動物的基礎(chǔ)上,解析GPAM基因?qū)θ橹x的調(diào)控作用機(jī)制。利用CRISPR-Cas9技術(shù),以牛乳腺上皮細(xì)胞為研究對象,構(gòu)建GPAM基因敲除細(xì)胞系,同時利用本課題組前期構(gòu)建的GPAM基因過表達(dá)和干擾載體,分別檢測目的基因過表達(dá)、干擾和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表達(dá)情況,檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、膽固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技術(shù),在m RNA和蛋白水平上驗(yàn)證GPAM基因?qū)εＨ橹x相關(guān)基因的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明:目的基因敲除后,細(xì)胞內(nèi)GPAM在m RNA和蛋白水平的表達(dá)均降低;GPAM基因敲除細(xì)胞系內(nèi)的甘油三酯和膽固醇的含量相對于野生型細(xì)胞均顯著降低;細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量檢測結(jié)果顯示:GPAM基因過表達(dá)能夠降低細(xì)胞內(nèi)丁酸的含量,沉默GPAM基因能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)丁酸和辛酸含量顯著升高;GPAM基因敲除能夠促進(jìn)辛酸的含量增加;乳脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量的檢測結(jié)果顯示:敲除GPAM基因能夠降低細(xì)胞內(nèi)脂代謝相關(guān)基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控乳脂代謝通路。GPAM基因轉(zhuǎn)錄組測序共獲得360個上調(diào)基因和570個下調(diào)基因;差異基因中的352個基因共富集在3196個GO terms,其中613個GO terms顯著富集,包括402個生物過程的GO terms,72個細(xì)胞成分GO terms和139個分子功能GO terms;差異表達(dá)基因中共富集237個Pathway,其中139個Pathway顯著富集（P<0.05）,下調(diào)基因富集在78個通路中,上調(diào)基因富集在61個通路中。GPAM敲除后信號通路互作關(guān)系預(yù)測分析結(jié)果表明,GPAM敲除后在對糖代謝信號通路的作用,主要是通過影響丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代謝通路,使其表達(dá)水平上調(diào),提示GPAM基因可能對丙酸和丙酮酸起調(diào)控作用,從而對細(xì)胞內(nèi)糖酵解產(chǎn)生一定的影響。同時在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)GPAM基因與細(xì)胞ATP應(yīng)答和質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性的調(diào)節(jié)有關(guān),提示該基因可能參與細(xì)胞線粒體能量代謝和ATP供能。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明;GPAM基因與細(xì)胞ATP應(yīng)答和質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性的調(diào)節(jié)有關(guān),提示該基因可能參與細(xì)胞線粒體能量代謝和ATP供能。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),GPAM基因參與丙酸、丙酮酸代謝進(jìn)程,該基因敲除后細(xì)胞內(nèi)丙酸、丙酮酸代謝發(fā)生了變化,預(yù)測可能對線粒體能量代謝和糖酵解產(chǎn)生影響。同時,GPAM基因作為一種線粒體基因,研究其表達(dá)對細(xì)胞線粒體功能的影響具有重要意義,根據(jù)以上推斷我們展開了敲除細(xì)胞內(nèi)線粒體能量代謝的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮細(xì)胞系為研究對象,研究GPAM基因敲除后細(xì)胞中線粒體數(shù)量、線粒體呼吸能力、線粒體糖酵解速率、細(xì)胞對ATP需求的變化。線粒體能量代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在GPAM基因敲除細(xì)胞系中,細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸能力降低。同時,GPAM敲除后導(dǎo)致線粒體糖酵解所需的重要調(diào)節(jié)酶活性降低,從而最終導(dǎo)致細(xì)胞線粒體糖酵解過程受到顯著抑制。同時影響了細(xì)胞內(nèi)Na+/K+的轉(zhuǎn)運(yùn);敲除GPAM基因后細(xì)胞內(nèi)線粒體含量減少。實(shí)驗(yàn)表明,敲除細(xì)胞中GPAM含量的降低導(dǎo)致了細(xì)胞線粒體氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)過程受到顯著抑制。以上這些結(jié)果都說明,GPAM的敲除能夠影響乳腺上皮細(xì)胞的線粒體能量代謝。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù),建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式動物水平上驗(yàn)證基因表達(dá)調(diào)控作用。結(jié)果表明:GPAM基因敲除小鼠的生長、發(fā)育和繁殖無明顯的變化。血清學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量顯著低于對照組野生型小鼠（p<0.05）,而血清中膽固醇的含量變化并不顯著;組織中甘油三酯和膽固醇的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):敲除小鼠乳腺組織和脂肪組織中甘油三酯、膽固醇的含量均顯著低于對照組野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明顯降低（p<0.05）;組織形態(tài)學(xué)觀察表明,敲除小鼠脂肪組織中脂肪細(xì)胞的胞體直徑略小于野生型小鼠,肌間脂肪含量明顯少于與野生型小鼠,乳腺組織中野生型小鼠的脂肪細(xì)胞的直徑略大于敲除型小鼠,其他組織無明顯形態(tài)學(xué)變化;乳腺組織的脂肪酸含量檢測結(jié)果顯示:敲除小鼠乳腺組織中肉豆蔻酸、棕櫚硬脂酸、花生四烯酸鹽和亞麻酸鹽上顯著高于野生型小鼠。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的基礎(chǔ)上,以GPAM為候選基因,在敲除細(xì)胞系水平上驗(yàn)證GPAM基因?qū)?xì)胞內(nèi)脂肪酸、甘油三酯、膽固醇含量的影響,并對GPAM基因敲除細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,解析該基因敲除后對乳脂代謝相關(guān)基因的分子機(jī)制;同時檢測了敲除GPAM基因乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體活性及能量代謝改變情況,闡明GPAM基因是參與線粒體能量代謝的重要基因,并對糖酵解產(chǎn)生影響;構(gòu)建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式動物水平上進(jìn)一步驗(yàn)證GPAM基因?qū)θ橹x的調(diào)控作用。為奶牛乳脂性狀的改良和新品種的培育提供優(yōu)質(zhì)的基因資源和理論基礎(chǔ)。
楊玉花[3]（2020）在《人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究》文中指出背景:體細(xì)胞重編程可以產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。產(chǎn)生的患者特異性干細(xì)胞不僅能模擬人類疾病過程,研究發(fā)病機(jī)制,還能用于藥物開發(fā)和篩選,以及為個性化再生細(xì)胞療法提供新的機(jī)會。目的:探索一種快速簡便、不損傷細(xì)胞活性、能高效產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）的方法,并評價應(yīng)用該法獲得的iPSCs在體外誘導(dǎo)為皮膚黑素細(xì)胞的可能性,為臨床治療色素性疾病提供研究基礎(chǔ)。方法:1.分離酶消化修剪后包皮,獲得表皮片,一部分做組織培養(yǎng),另一部分進(jìn)一步消化成細(xì)胞懸液培養(yǎng)。健康個體包皮來源的表皮片平鋪在基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)3周,獲得KCs,并進(jìn)行KSCs標(biāo)志物K15免疫熒光染色,證實(shí)表皮中KSCs的存在。胰酶消化表皮獲得表皮KCs懸液,接種在預(yù)先IV型膠原包被的六孔培養(yǎng)板,留取15min內(nèi)貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,采用K15抗體、SOX2和OCT4抗體以及干細(xì)胞活細(xì)胞染料CDy1,進(jìn)行染色。未染色孔的細(xì)胞用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1周,觀察細(xì)胞形態(tài),70%融合后傳代培養(yǎng)。15 min未貼附的細(xì)胞也同步培養(yǎng),作為對照研究。拔取的毛囊放入基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板進(jìn)行體外培養(yǎng),分析毛囊KCs的OCT4和NANOG的DNA甲基化水平,與表皮中的KCs相比較。2.用攜帶OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四種轉(zhuǎn)錄因子混合的慢病毒轉(zhuǎn)染富集的表皮KSCs獲得iPSCs。觀察和記錄產(chǎn)生的克隆的形態(tài)和時間,采用干細(xì)胞標(biāo)記物的相應(yīng)抗體、堿性磷酸酶檢測試劑盒、干細(xì)胞活細(xì)胞CDy1染料進(jìn)行檢測。分析OCT4和NANOG啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平,RT-PCR檢測多潛能基因表達(dá)。采用含有不同因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)iPSCs分別分化成為肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、MCs等。用攜帶4種轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒轉(zhuǎn)染毛囊KCs,觀察iPSCs的形成。將iPSCs種植到SCID小鼠的后肢皮下,觀察畸胎瘤的形成,獲取畸胎瘤后,進(jìn)行組織病理和免疫組化檢測。從畸胎瘤中獲取細(xì)胞,分別在KCs培養(yǎng)基、M254培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察細(xì)胞形態(tài)。3.分離酶消化修剪后包皮獲得表皮片,通過不同培養(yǎng)方法分別獲得KCs、MCs、成纖維細(xì)胞（fibroblasts,FBs）。用攜帶OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四種轉(zhuǎn)錄因子混合的慢病毒分別轉(zhuǎn)染KCs、MCs并獲得相應(yīng)的iPSCs,FBs通過長時間胰酶消化獲得Muse細(xì)胞。透射電鏡觀察人皮膚KCs、MCs及重編程產(chǎn)生的iPSCs和Muse細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1.表皮片貼附在基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板底部,產(chǎn)生外向性生長的KCs,中心區(qū)域細(xì)胞體積小,表皮片外緣的細(xì)胞體積逐漸變大,細(xì)胞呈多邊形。K15抗體染色顯示,皮片中心區(qū)域陽性細(xì)胞密集,周邊區(qū)陽性數(shù)目減少,證實(shí)KSCs的存在和大致分布。用胰酶消化未培養(yǎng)的表皮片,獲得細(xì)胞懸液,這些細(xì)胞接種到IV型膠原包被的培養(yǎng)板后,15 min內(nèi)大約有20～30%的細(xì)胞貼壁?？焖儋N壁的細(xì)胞體積較小。24 h后,細(xì)胞黏附牢固,部分開始增殖,K15染色和干細(xì)胞活細(xì)胞染料CDy1染色,明顯陽性。而針對干性特異性標(biāo)志物SOX2和OCT4的染色呈弱陽性。用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)快速貼壁細(xì)胞1周,可見大小不等的克隆形成。相比之下,同步培養(yǎng)的慢貼壁細(xì)胞也有克隆形成,但比快速貼壁細(xì)胞的克隆小。拔取的毛囊很容易貼附到基質(zhì)膠上,從毛外根鞘處爬出很多KCs,其中許多呈克隆樣生長。傳代培養(yǎng)的毛囊KCs和表皮KCs的SOX2和OCT4的甲基化水平相近。2.獲得的表皮KSCs傳代培養(yǎng)后,進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。最早在第7天出現(xiàn)第一個克隆,在10天可見很多典型的iPSCs。干細(xì)胞特異性標(biāo)記物SOX2、OCT4、NANOG和SSEA3染色陽性。干細(xì)胞活細(xì)胞CDy1染料呈陽性,堿性磷酸酶染色細(xì)胞呈紫紅色。與親本KCs相比,獲得的iPSCs顯示OCT4和NANOG啟動子DNA去甲基化。RTPCR檢測結(jié)果示:iPSCs中SOX2、OCT4、NANOG基因表達(dá)水平高于親本的KCs,而親本KCs的KLF4基因表達(dá)水平高于iPSCs。擬胚體在明膠包被的培養(yǎng)板生長良好,自分化培養(yǎng)可出現(xiàn)外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞。用不同分化培養(yǎng)基,誘導(dǎo)iPSCs逐漸分化成為肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、MCs,特異性染色相應(yīng)為AFP（+）、油紅O染色（+）、βIII-微管蛋白（+）、神經(jīng)絲（+）、HMB45（+）和TYR（+）。用四種因子轉(zhuǎn)染毛囊KCs,同樣可獲得iPSCs。將產(chǎn)生的iPSCs注射到4周齡SCID小鼠后肢皮下,第8周腫瘤長到足夠大小,切取畸胎瘤組織進(jìn)行病理和免疫病理學(xué)檢查。結(jié)果顯示:Vimentin（+）、CK（pan）（+）和KI-67（+）陽性,GFAP和AFP染色為陰性。從畸胎瘤組織獲得的單細(xì)胞,在KCs培養(yǎng)基中生長3周細(xì)胞小而圓體,核漿比大,細(xì)胞熒光仍然很強(qiáng),培養(yǎng)6周后細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞活力好,增殖快速。在DMEM培養(yǎng)基中生長3周時細(xì)胞主要是圓形,部分有突起,培養(yǎng)6周的細(xì)胞,細(xì)胞顯出扁平形,類似纖維細(xì)胞的形態(tài)。在M254培養(yǎng)基中生長3周以細(xì)小圓形細(xì)胞為主,可見部分細(xì)胞有少量突觸樣結(jié)構(gòu),培養(yǎng)6周的細(xì)胞顯示出細(xì)長的樹突,類似MCs的形態(tài)。3.透射電鏡顯示KCs胞體大致呈方形,細(xì)胞核大,有一個核仁。MCs呈橢圓形,并且細(xì)胞核染色質(zhì)聚集性差,胞質(zhì)中可見膜包裹的黑素小體。MCs和KCs重編程產(chǎn)生的iPSCs的超微結(jié)構(gòu)大致相同,細(xì)胞呈圓形,具有多個核仁,細(xì)胞質(zhì)稀少,核漿比高,可見發(fā)育不良的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體。FBs胞體呈梭型或不規(guī)則形,細(xì)胞核呈橢圓形或圓形,染色質(zhì)豐富,細(xì)胞器較多。Muse細(xì)胞核質(zhì)比高,細(xì)胞核有較多突起,核仁體積較大,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較少,相對幼稚。結(jié)論:1.KCs混懸液接種在IV型膠原包被的培養(yǎng)板中,15 min內(nèi)貼壁的細(xì)胞富含KSCs。拔取毛發(fā)可獲得大量的KCs,與表皮來源的KCs類似,包含大量的KSCs。2.用攜帶四種轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒轉(zhuǎn)染表皮KSCs,可高效率和較短時間出現(xiàn)iPSCs。這些細(xì)胞具有多能性,并可被誘導(dǎo)分化成為不同類型細(xì)胞。拔取毛發(fā)獲的KCs可被重編產(chǎn)生iPSCs。iPSCs接種到SCID小鼠皮下,可產(chǎn)生腫瘤?；チ黾?xì)胞在不同培養(yǎng)基中生長呈現(xiàn)不同形態(tài)。3.透射電鏡顯示KCs重編程產(chǎn)生得iPSCs的超微結(jié)構(gòu)與MCs來源的iPSCs超微結(jié)構(gòu)以及Muse細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)近似,核漿比高,多個核仁,細(xì)胞漿中細(xì)胞器較少,且發(fā)育不成熟。
馬曉潔[4]（2020）在《利用基因編輯和干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行人胰腺分化及糖尿病預(yù)防和治療研究》文中研究指明糖尿病是一種世界范圍內(nèi)高發(fā)的代謝性疾病,患者體內(nèi)的胰島β細(xì)胞缺失或功能障礙導(dǎo)致胰島素分泌不足,進(jìn)而誘發(fā)慢性高血糖癥。因此,在體外產(chǎn)生大量有功能的胰島β細(xì)胞對于胰腺發(fā)育學(xué)研究和糖尿病治療至關(guān)重要。近期的研究報道了很多具有前景的研究方案,其中包括由人多能干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞的定向分化法。通過對定向分化體系的優(yōu)化,我們獲得了大量有功能的胰島β細(xì)胞。這些細(xì)胞高表達(dá)胰島β細(xì)胞的標(biāo)志基因、具有胰島素分泌囊泡的亞顯微結(jié)構(gòu)且可以感應(yīng)葡萄糖濃度的變化來分泌胰島素,并且具有一定的體內(nèi)功能,因而在疾病建模、藥物開發(fā)和細(xì)胞治療等方面有廣闊的應(yīng)用前景。精準(zhǔn)的基因編輯有助于高效地構(gòu)建疾病模型。然而,在人多能干細(xì)胞中進(jìn)行精準(zhǔn)的基因編輯仍然非常耗時耗力。CRISPR-Cpf1是新開發(fā)的一種基因編輯工具酶,具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢,包括具有較短的crRNA和低脫靶率等。因此,在人多能干細(xì)胞中開發(fā)基于CRISPR-Cpf1的精準(zhǔn)基因編輯系統(tǒng)具有十分廣闊的應(yīng)用前景。而化學(xué)小分子具有使用簡便、高效以及非整合等特點(diǎn),可以用于提高基因編輯效率。在這里,我們在人多能干細(xì)胞中構(gòu)建了 CRISPR-Cpf1基因編輯體系,并且開發(fā)了一種無偏好的藥物篩選平臺。利用該系統(tǒng),我們在人多能干細(xì)胞中進(jìn)行了高通量藥物篩選,并且最終發(fā)現(xiàn)了兩個小分子VE-822和AZD-7762,可以顯著提高CRISPR-Cpf1介導(dǎo)的基因編輯效率。CRISPR-Cpf1體系與化學(xué)小分子相結(jié)合,為精準(zhǔn)高效的基因編輯提供了簡單有效的方法。本研究中,我們將人多能干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞定向分化體系與CRISPR-Cpf1基因編輯體系相結(jié)合,構(gòu)建了 CLEC16A敲除的糖尿病疾病模型,發(fā)現(xiàn)CLEC16A參與了人胰腺分化的過程,并且對胰島β細(xì)胞的功能具有一定的影響。這些結(jié)果為深入研究CLEC16A對人胰島β細(xì)胞分化調(diào)控及分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,干細(xì)胞技術(shù)、基因編輯、生物醫(yī)學(xué)工程、高通量遺傳和化學(xué)篩選以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展,將極大促進(jìn)疾病建模、藥物開發(fā)和細(xì)胞治療的進(jìn)展,幫助解決基本生物學(xué)問題并推進(jìn)臨床應(yīng)用的發(fā)展。
王超煒[5]（2020）在《褪黑素通過調(diào)控成骨/破骨分化平衡延緩骨質(zhì)疏松癥進(jìn)程的機(jī)制研究》文中提出研究背景褪黑素是一種神經(jīng)激素,參與調(diào)節(jié)多種生理活動,尤其是骨穩(wěn)態(tài)的維持。骨質(zhì)疏松癥作為常見的骨代謝疾病,主要表現(xiàn)為骨生成與骨吸收維持的骨穩(wěn)態(tài)失衡而導(dǎo)致的骨量下降和骨結(jié)構(gòu)紊亂,患者骨脆性和骨折發(fā)生率增加,而口腔頜面的骨質(zhì)疏松不利于頜面部骨缺損修復(fù)和口腔種植治療。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充褪黑素可以有效延緩絕經(jīng)婦女骨質(zhì)疏松疾病進(jìn)程。但是,褪黑素如何調(diào)節(jié)骨重建、骨生成骨吸收平衡,以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）在其中的作用和具體機(jī)制仍不明確。研究目的本課題擬在去勢雌性小鼠骨質(zhì)疏松模型的基礎(chǔ)上,以骨生成與骨吸收平衡作為切入點(diǎn),研究:1.褪黑素對骨質(zhì)疏松的治療效果;2.褪黑素對BMMSCs成骨分化能力的影響及其分子機(jī)制;3.褪黑素對BMMSCs介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化功能的影響及其作用機(jī)制。研究方法1.建立C57BL/6J背景去勢雌性小鼠骨質(zhì)疏松模型,給予褪黑素治療,通過μCT和H&E染色觀察骨骼微結(jié)構(gòu)改變,通過q RT-PCR、免疫組化和ELISA檢測各個成骨、破骨和炎癥相關(guān)指標(biāo)在骨組織及血清中的表達(dá)水平。2.使用搭載sh RNA的慢病毒敲減細(xì)胞內(nèi)褪黑素受體（melatonin receptor,MT受體）后,通過ALP染色、茜素紅染色、q RT-PCR、ELISA和western blot明確褪黑素及其受體對BMMSCs成骨分化能力的影響,探索褪黑素、MT受體、NF-κB通路之間的關(guān)系,并用NF-κB抑制劑JSH-23驗(yàn)證該通路在其中的作用。3.分別建立直接接觸、非直接接觸共培養(yǎng)體系,研究BMMSCs與破骨前體細(xì)胞之間相互作用的模式,通過TRAP染色、western blot評估破骨細(xì)胞分化成熟的水平,并探討褪黑素在整個過程中的作用。研究結(jié)果1.褪黑素顯著提高了骨組織、血清中成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的翻譯水平,明顯抑制了破骨相關(guān)蛋白及炎癥因子的表達(dá),有效緩解了骨質(zhì)疏松小鼠的骨流失,改善了紊亂的骨微結(jié)構(gòu)。2.近生理濃度的褪黑素（10-100n M）有效提高了BMMSCs的成骨分化能力,在表象上表現(xiàn)為BMMSCs的ALP水平、鈣化結(jié)節(jié)明顯增加,在分子水平上表現(xiàn)為Runx2、Osterix、OCN顯著升高,但Col-I水平不受影響。3.褪黑素主要通過MT2受體調(diào)節(jié)BMMSCs的成骨分化能力。敲減BMMSCs的MT2受體后,褪黑素提高其成骨分化能力（表現(xiàn)為ALP、Runx2、Osterix和OCN表達(dá)水平升高,礦化結(jié)節(jié)生成增加）的作用被顯著削弱;而當(dāng)MT1受體被敲減后,BMMSCs的成骨分化能力無顯著變化。4.褪黑素通過抑制MT2受體-NF-κB通路提高BMMSCs的成骨分化能力。褪黑素處理BMMSCs后,細(xì)胞內(nèi)IκBα、p65、IKKα/β的磷酸化水平明顯降低,提示NF-κB通路被顯著抑制;敲減MT2受體后,褪黑素誘導(dǎo)的NF-κB通路的抑制狀態(tài)被緩解,而敲減MT1受體無此作用;此外,抑制NF-κB通路具有協(xié)同褪黑素促進(jìn)BMMSCs成骨分化的作用。5.褪黑素不直接影響破骨細(xì)胞分化,但可以通過MT2受體-NF-κB通路抑制BMMSCs中RANKL的產(chǎn)生,并提高opg/rankl比值。6.褪黑素通過MT2受體-NF-κB通路調(diào)節(jié)BMMSCs的旁分泌功能,繼而間接抑制破骨細(xì)胞分化。在BMMSCs與破骨前體細(xì)胞非直接接觸共培養(yǎng)體系中,我們發(fā)現(xiàn)褪黑素間接抑制了破骨細(xì)胞分化;但在直接接觸共培養(yǎng)體系中,未觀察到該現(xiàn)象。另外,與BMMSCs中RANKL的產(chǎn)生規(guī)律一致的是,抑制NF-κB通路能促進(jìn)褪黑素的破骨抑制作用,MT1受體敲減對該過程無任何影響,而MT2受體敲減卻顯著減弱了褪黑素的破骨抑制作用。結(jié)論本研究證實(shí),褪黑素在延緩骨質(zhì)疏松進(jìn)展中有效地發(fā)揮了維持骨穩(wěn)態(tài)及抗炎的雙重作用,極有可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在藥物。此外,我們首次發(fā)現(xiàn)MT2受體-NF-κB通路積極地參與了褪黑素促進(jìn)成骨及抑制破骨的作用過程。值得注意的是,褪黑素是通過干預(yù)BMMSCs的旁分泌間接發(fā)揮破骨抑制作用,而RANKL/RANK極可能是BMMSCs和破骨細(xì)胞分化之間重要的信號軸?？偟膩碚f,我們充分證實(shí)了褪黑素在生理濃度下能夠通過抑制MT2受體-NF-κB通路提高BMMSCs的成骨分化并抑制BMMSCs介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,從而延緩骨質(zhì)疏松癥的疾病進(jìn)程。
陳亞[6]（2019）在《初步探討P-糖蛋白過表達(dá)對胰島β細(xì)胞生物表型影響的機(jī)制》文中研究說明目的:課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-gp（P-glycoprotein,P-gp）過表達(dá)能增加大鼠胰島β細(xì)胞株（INS-1）高糖刺激下胰島素的分泌,并不影響胰島素的生物合成,但其中的具體機(jī)制尚不清楚。本研究在進(jìn)一步探討P-gp過表達(dá)促進(jìn)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的機(jī)制的同時,通過構(gòu)建大鼠胰島β細(xì)胞特異性P-gp過表達(dá)模型,觀察體內(nèi)環(huán)境中P-gp過表達(dá)對胰島β細(xì)胞分泌、分化、增殖以及凋亡的影響。方法:（1）實(shí)驗(yàn)對象為INS-1細(xì)胞和SD大鼠胰島;（2）INS-1細(xì)胞:將Ad-abcb1b腺病毒和陰性對照病毒以濃度50×106/m L在無血清培養(yǎng)基中感染INS-1細(xì)胞4小時后,換成正常含有胎牛血清的培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育44小時;（3）用弱RIPA萃取細(xì)胞總蛋白,胞漿/胞膜蛋白提取試劑盒萃取細(xì)胞膜蛋白和漿蛋白,Western Blot法檢測P-gp、L型鈣離子通道蛋白（Cav1.2）、小窩蛋白-1（CAV1）、PKA、CREB、SNAP25、STX1A、SYT1、p-CREB、GAPDH、Tublin等相關(guān)蛋白的表達(dá);（4）應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀（Ch IP）方法檢測CREB與Cav1.2啟動子之間是否有結(jié)合,并通過實(shí)時定量熒光PCR（q PCR）判斷其結(jié)合的強(qiáng)度;（5）通過免疫共沉淀（Co-IP）方法檢測P-gp與CAV1、SNAP25之間的相互作用關(guān)系;（6）通過荒漠區(qū)基因隨機(jī)插入法（Ins2-Abcb1b）在大鼠體內(nèi)構(gòu)建胰島P-gp過表達(dá)動物模型;（7）用膠原酶體外消化胰腺法人工挑取大鼠胰島,培養(yǎng)過夜后進(jìn)行葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）實(shí)驗(yàn),并通過ELISA方法測定胰島素分泌量;（8）提取細(xì)胞和胰島組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成c DNA后進(jìn)行實(shí)時定量熒光PCR檢測與β細(xì)胞分化相關(guān)基因Pdx1、Ins1、Ins2、Ngn3、Mafb、Nkx6.1、Nkx2.2、Neurod1、Mafa、Pax6等的表達(dá)情況;（9）取大鼠新鮮的胰腺組織,經(jīng)4%多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片,用免疫組織化學(xué)法檢測胰島組織P-gp、caspase3、caspase8、caspase9、BCL-2、Ki67等相關(guān)蛋白的表達(dá),用TUNEL法檢測胰島組織內(nèi)細(xì)胞凋亡。結(jié)果:（1）INS-1細(xì)胞中,與對照組（Ad-control）相比,P-gp過表達(dá)組（Ad-abcb1b）細(xì)胞膜、細(xì)胞漿Cav1.2表達(dá)增加,但是細(xì)胞膜/細(xì)胞漿比值未增加（P>0.05）;（2）與對照組相比,P-gp過表達(dá)組p-CREB、PKA定量增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;（3）Ch IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明INS-1細(xì)胞內(nèi)CREB與Cav1.2有結(jié)合,且P-gp過表達(dá)后CREB與Cav1.2結(jié)合增加（P<0.05）;（4）Western Blot結(jié)果顯示:與對照組相比,P-gp過表達(dá)組CAV1、SNAP25表達(dá)增加（P<0.05）,STX1A和SYT表達(dá)未見明顯差異（P>0.05）;P-gp與CAV1、SNAP25具有相互作用,與STX1A無相互作用;隨著P-gp表達(dá)的增加,P-gp與CAV1相互作用增加（P<0.05）、與SNAP25的相互作用減少（P<0.05）;（5）與對照組相比,P-gp過表達(dá)后,INS-1細(xì)胞Ngn3、Mafb轉(zhuǎn)錄水平升高（P<0.05）,Mafa轉(zhuǎn)錄水平降低（P<0.05）,Pdx1、Ins1、Ins2、Nkx6.1、Nkx2.2、Neurod1、Pax6等基因的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;在野生型和轉(zhuǎn)基因大鼠胰島組織中,各基因轉(zhuǎn)錄水平均無明顯差異（P>0.05）;（6）與野生型大鼠相比,過表達(dá)P-gp的轉(zhuǎn)基因大鼠胰島GSIS水平無明顯變化（P>0.05）;（7）免疫組化結(jié)果:與野生型大鼠相比,轉(zhuǎn)基因大鼠胰島組織caspase3、caspase8、caspase9、BCL-2、Ki67等的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;（8）TUNEL結(jié)果:與野生型大鼠相比,轉(zhuǎn)基因大鼠胰島組織凋亡水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)初步表明P-gp過表達(dá)對胰島β細(xì)胞表型的影響包括:1.P-gp通過增加Cav1.2的表達(dá)促進(jìn)INS-1細(xì)胞胰島素分泌,與Cav1.2的膜轉(zhuǎn)位無關(guān);P-gp可能通過PKA/CREB途徑調(diào)節(jié)Cav1.2的表達(dá)。2.P-gp過表達(dá)增加CAV1、SNAP25的表達(dá);P-gp與CAV1和SNAP25具有相互作用;P-gp與CAV1相互作用的增加導(dǎo)致P-gp與SNAP25之間的相互作用減少,以釋放更多的SNAP25參與INS-1細(xì)胞的胰島素分泌。3.P-gp過表達(dá)可能使INS-1細(xì)胞去分化,而對胰島β細(xì)胞的分化無明顯影響。4.大鼠胰島P-gp過表達(dá)對胰島β細(xì)胞的GSIS、凋亡、增殖無明顯影響。
馬雙羽[7]（2018）在《利用β細(xì)胞體外分化與CRISPR技術(shù)模擬和修復(fù)人糖尿病的研究》文中研究指明糖尿病是目前影響數(shù)億人群的一類代謝性疾病。隨著人類生活水平的不斷提高,糖尿病在全世界的發(fā)病率逐年上升。常見的糖尿病可分為Ⅰ型和Ⅱ型糖尿?。═ype 1 diabetes mellitus,T1DM;Type 2 diabetes mellitus,T2DM）,其最終都是由于β細(xì)胞損失或功能異常導(dǎo)致。因此,揭示β細(xì)胞如何通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)自身的分子機(jī)制響應(yīng)外界因素（如葡萄糖、脂肪酸、免疫細(xì)胞因子等）的刺激成為糖尿病研究的新熱門。由于遺傳性的永久性新生兒發(fā)病型糖尿?。≒ermanent neonatal diabetes mellitus,PNDM）屬于單基因型疾病,受外界因素影響較小,而且致病基因主要通過影響β細(xì)胞自身功能而導(dǎo)致糖尿病,因此PNDM模型逐漸成為科學(xué)家研究糖尿病中β細(xì)胞損失與功能異常（如胰島素分泌受損）機(jī)制的有力工具。近年來,對于PNDM的深入研究極大地促進(jìn)了科學(xué)家對T2DM和其他復(fù)雜型糖尿病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。目前,對人糖尿病研究和治療具有重大推動作用的干細(xì)胞胰腺定向分化技術(shù)正在興起,這項(xiàng)技術(shù)使得研究人員可以從病人或健康人多能性干細(xì)胞中獲得大量分化的β細(xì)胞用于疾病研究,甚至進(jìn)行β細(xì)胞移植治療。由于此技術(shù)針對人的β細(xì)胞進(jìn)行研究,因此在一定程度解決了動物模型與人生理功能先天性差異而導(dǎo)致的研究結(jié)果轉(zhuǎn)化性差的難題。作為導(dǎo)致PNDM的致病基因,PERK是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因,突變后產(chǎn)生以嚴(yán)重的糖尿病、骨骺發(fā)育異常和智力發(fā)育遲緩為特征的Wolcott-Rallison綜合征（WRS）,本研究將WRS病人體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）,測序發(fā)現(xiàn)該病人在PERK基因第9號外顯子上存在GAAA四個堿基的缺失,隨后利用CRISPR/Cas9技術(shù)將該病人特異性突變引入正常的人胚胎干細(xì)胞系Mell后,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該移碼突變導(dǎo)致PERK蛋白翻譯失敗。接著將PERK野生型與突變型多能性干細(xì)胞定向分化為胰腺β細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PERK突變并不影響β細(xì)胞的發(fā)育形成,但是,與野生型β細(xì)胞相比,PERK突變細(xì)胞的胰島素（Insulin,INS）總量下降、胰島素前體蛋白（Pro-insulin,Pro-INS）與成熟胰島素比例升高以及β細(xì)胞分泌能力下降,這在一定程度預(yù)示了PERK基因突變通過影響β細(xì)胞的胰島素正常合成和分泌過程導(dǎo)致糖尿病。為了理解PERK突變對β細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄組的影響,對野生型和突變型β細(xì)胞進(jìn)行了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)檢測和轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果顯示以剪切XBP1（XBP1s）為代表的一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因表達(dá)急劇升高以及PERK靶基因EIF2α失去PERK的抑制而持續(xù)激活,與以上結(jié)果相一致,轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)幫助蛋白質(zhì)翻譯后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的輔助因子在PERK突變后顯著上調(diào)并富集。這些發(fā)現(xiàn)為揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)對β細(xì)胞損失和功能的影響研究奠定了基礎(chǔ)和提供了重要線索。β細(xì)胞移植治療糖尿病一直受到科學(xué)家的關(guān)注,直到近年來才逐步取得了一些重大進(jìn)展。本研究通過結(jié)合人多能性干細(xì)胞胰腺定向分化技術(shù)和CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)探索治療單基因型糖尿病（尤其是PNDM）的可能性。首先通過獲取PNDM病人的體細(xì)胞,重編程為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞,測序鑒定了該病人在INS基因起始密碼子處存在單堿基突變,利用CRISPR/Cas9技術(shù)糾正該突變后,將突變和修復(fù)的干細(xì)胞定向分化為β細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)突變的β細(xì)胞無法產(chǎn)生胰島素蛋白和C肽（C-PEP）,但是修復(fù)的β細(xì)胞恢復(fù)了胰島素蛋白的翻譯,進(jìn)一步通過糖尿病小鼠模型的體外分化β細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)證明,只有INS修復(fù)的β細(xì)胞能夠拯救小鼠的糖尿病表型,表明了該基因修復(fù)和體外分化的β細(xì)胞移植方法有望治療單基因型糖尿病。綜上所述,本研究利用人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞技術(shù)、干細(xì)胞胰腺定向分化技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了PERK基因突變導(dǎo)致的PNDM模型,初步解析了PERK突變對人β細(xì)胞功能的影響;同時,鑒定了一個新的PNDM糖尿病的胰島素基因突變,并成功通過CRISPR/Cas9技術(shù)糾正該突變并修復(fù)突變的β細(xì)胞功能。為利用干細(xì)胞分化的β細(xì)胞移植方法治療糖尿病奠定了基礎(chǔ)以及提供了新的證據(jù),展示了誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的胰腺定向分化技術(shù)在人類疾病模擬與細(xì)胞治療領(lǐng)域的巨大應(yīng)用價值。
吳曉麗[8]（2016）在《2015年生命科學(xué)熱點(diǎn)回眸》文中研究說明2015年無疑在生命科學(xué)歷史畫卷上寫下了濃墨重彩的一筆。站在新起點(diǎn),本文盤點(diǎn)2015年生命科學(xué)領(lǐng)域取得的重大研究進(jìn)展,回顧基因組編輯技術(shù)、圖譜、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、干細(xì)胞、埃博拉、艾滋病、癌癥、糖尿病等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)突破。
趙貴英,張樹庸[9]（2011）在《2010年下半年生命科學(xué)、生物技術(shù)研究動態(tài)（國外篇）》文中研究表明筆者僅就2010年下半年生命科學(xué)、生物技術(shù)國外相關(guān)研究動態(tài),以信息形式加以總結(jié),供讀者參考。1脂肪細(xì)胞經(jīng)再編程可形成iPS新出版的《細(xì)胞移植》雜志報道,澳大利亞科學(xué)家成功地對成年實(shí)驗(yàn)鼠脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行"再編程"（reprogramming）,從而獲得了能夠分化成各種各樣細(xì)胞的多能干細(xì)胞。這些稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）的細(xì)胞與自然形成的多能干細(xì)胞（如胚胎干細(xì)胞）十分接近。
張樹庸,趙貴英[10]（2009）在《2008年國內(nèi)外生物技術(shù)研究進(jìn)展（上）——干細(xì)胞、人造生命、器官移植》文中研究指明2008年國內(nèi)外生物技術(shù)領(lǐng)域研究發(fā)展迅速:干細(xì)胞研究有了新突破,可以避開倫理學(xué)的限制開展廣泛研究;人工合成生命有了新進(jìn)展,表現(xiàn)出了巨大的生命力和廣闊的應(yīng)用前景;基因組快速測序技術(shù)的出現(xiàn),使人類個性化醫(yī)療向前邁出了重要的一步;對癌基因進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)了更多的致癌基因和器官移植的成功實(shí)例,使人們看到了治療疑難病的希望……
二、瑞典科學(xué)家用細(xì)胞移植治療糖尿?。ㄕ撐拈_題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會科學(xué)用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、瑞典科學(xué)家用細(xì)胞移植治療糖尿?。ㄕ撐奶峋V范文）
（1）MAFA、PDX1修飾促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的作用研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要縮略語中英文對照表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3 統(tǒng)計學(xué)分析 |
| 第3章 結(jié)果 |
| 3.1 HuMSCs原代培養(yǎng)和傳代 |
| 3.2 HuMSCs表面生物學(xué)標(biāo)志物檢測與鑒定 |
| 3.3 h-MAFA-PDX1過表達(dá)慢病毒載體成功構(gòu)建 |
| 3.4 h-MAFA-PDX1過表達(dá)慢病毒感染HuMSCs的MOI摸索 |
| 3.5 MAFA-PDX1修飾的HuMSCs向IPCs分化 |
| 3.6 雙硫腙染色 |
| 第4章 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 綜述 基因編程干細(xì)胞療法治療糖尿病的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 個人簡歷 |
（2）線粒體甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（GPAM）基因沉默對牛乳脂代謝的影響（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文縮寫詞表 |
| 引言 |
| 第一篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一章 GPAM基因的研究進(jìn)展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物學(xué)作用 |
| 1.3 線粒體GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表達(dá) |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的調(diào)控作用 |
| 1.6 結(jié)語 |
| 第二章 影響乳品質(zhì)的重要因素及乳脂代謝通路的研究進(jìn)展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品質(zhì)評價中意義 |
| 2.2 哺乳動物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代謝相關(guān)基因的簡介 |
| 2.4 多不飽和脂肪酸在乳脂中的調(diào)控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表達(dá) |
| 2.6 結(jié)語 |
| 第三章 線粒體基因及線粒體能量代謝的研究進(jìn)展 |
| 3.1 線粒體的主要功能 |
| 3.2 線粒體在生命活動中的重要意義 |
| 3.3 線粒體在細(xì)胞死亡過程中的作用 |
| 3.4 線粒體能量代謝 |
| 3.5 結(jié)語 |
| 第四章 基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展 |
| 4.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)概況 |
| 4.2 精原干細(xì)胞技術(shù) |
| 4.3 原始生殖細(xì)胞技術(shù) |
| 4.4 胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù) |
| 4.5 條件基因靶向技術(shù) |
| 4.6 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù) |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技術(shù) |
| 4.8 結(jié)語 |
| 第二篇 研究內(nèi)容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮細(xì)胞系的建立及其對細(xì)胞內(nèi)乳脂代謝的影響 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 |
| 1.1.2 主要儀器 |
| 1.1.3 實(shí)驗(yàn)用酶 |
| 1.1.4 其他藥品及試劑 |
| 1.1.5 試劑的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的支原體檢測 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外顯子的克隆及鑒定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位點(diǎn)的設(shè)定以及sg RNA的設(shè)計 |
| 1.2.4 gRNA的體外篩選 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 |
| 1.2.7 敲除載體的的轉(zhuǎn)染 |
| 1.2.8 細(xì)胞內(nèi)編輯效率驗(yàn)證 |
| 1.2.9 敲除細(xì)胞的篩選、培養(yǎng)及鑒定 |
| 1.2.10 實(shí)時熒光定量PCR和 Western Blot檢測候選基因的表達(dá) |
| 1.2.11 GPAM基因表達(dá)載體與干擾載體鑒定 |
| 1.2.12 細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇含量檢測 |
| 1.2.13 細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量的測定 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.3.1 乳腺上皮細(xì)胞系的支原體檢測 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外顯子的克隆和鑒定 |
| 1.3.3 gRNA濃度的測定 |
| 1.3.4 gRNA的體外篩選結(jié)果 |
| 1.3.5 敲除載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 |
| 1.3.6 細(xì)胞內(nèi)敲除效率驗(yàn)證 |
| 1.3.7 陽性細(xì)胞測序驗(yàn)證 |
| 1.3.8 GPAM過表達(dá)和干擾載體鑒定與檢測結(jié)果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后細(xì)胞內(nèi)m RNA和蛋白表達(dá)的檢測 |
| 1.3.10 GPAM基因表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響 |
| 1.3.11 GPAM基因表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響 |
| 1.3.12 GPAM基因表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量的影響 |
| 1.3.13 GPAM敲除對脂代謝相關(guān)基因的影響 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組測序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 |
| 2.1.2 主要儀器 |
| 2.1.3 其他藥品及試劑 |
| 2.1.4 試劑的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測 |
| 2.2.2 文庫建立及測序 |
| 2.2.3 原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 |
| 2.2.4 Mapping結(jié)果統(tǒng)計及基因結(jié)構(gòu)分析 |
| 2.2.5 差異基因表達(dá)分析 |
| 2.2.6 差異基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差異基因表達(dá)水平驗(yàn)證 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.3.1 細(xì)胞總RNA提取及檢測 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選及分析 |
| 2.3.3 差異表達(dá)基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差異基因蛋白互作預(yù)測分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信號通路互作關(guān)系預(yù)測分析 |
| 2.3.7 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系預(yù)測分析 |
| 2.3.8 差異基因的表達(dá)水平驗(yàn)證 |
| 2.3.9 GPAM基因?qū)Ω视腿ズ铣上嚓P(guān)基因的調(diào)控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因?qū)χ舅岷铣上嚓P(guān)基因的調(diào)控作用 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第三章 牛GPAM基因?qū)θ橄偕掀ぜ?xì)胞線粒體能量代謝的影響 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 |
| 3.1.2 主要儀器設(shè)備 |
| 3.1.3 其他藥品及試劑 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析軟件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 細(xì)胞線粒體的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮細(xì)胞系線粒體呼吸的檢測 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮細(xì)胞系線粒體線粒體糖酵解速率測定 |
| 3.2.4 敲除細(xì)胞對ATP需求的影響 |
| 3.2.5 敲除細(xì)胞對ATP 需求的影響 |
| 3.2.6 細(xì)胞線粒體數(shù)量的測定 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 敲除細(xì)胞中線粒體呼吸的檢測 |
| 3.3.2 敲除細(xì)胞中線粒體糖酵解速率測定 |
| 3.3.3 敲除細(xì)胞對ATP需求的影響 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量的改變 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后細(xì)胞內(nèi)線粒體中三羧酸循環(huán)檢測分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后細(xì)胞內(nèi)線粒體中氧化磷酸化檢測分析 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第四章 基于敲除小鼠模型驗(yàn)證GPAM基因?qū)χ敬x的調(diào)控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 |
| 4.1.2 主要儀器設(shè)備 |
| 4.1.3 其他藥品及試劑 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析軟件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制備 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的擴(kuò)繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鑒定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的檢測 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相關(guān)生長性狀的測定 |
| 4.2.6 組織形態(tài)學(xué)的檢測 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)的檢測 |
| 4.2.8 敲除小鼠組織中甘油三酯和膽固醇含量的檢測 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的檢測 |
| 4.2.10 敲除小鼠組織中脂肪酸成分及含量的檢測 |
| 4.3 結(jié)果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的陽性鑒定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的檢測 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相關(guān)生長性狀測定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各組織形態(tài)學(xué)分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的測定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中膽固醇含量的測定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺組織和脂肪組織甘油三酯和膽固醇含量的測定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的測定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的測定 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 導(dǎo)師簡介 |
| 作者簡介 |
| 在讀期間發(fā)表的文章及專利 |
| 致謝 |
（3）人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第一章 富含干細(xì)胞的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的獲取 |
| 一、試劑和材料 |
| 二、方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二章 人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞重編程產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 |
| 一、試劑、材料和使用設(shè)備 |
| 二、方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三章 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的對比研究 |
| 一、試劑材料和儀器 |
| 二、方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 總結(jié)和展望 |
| 第四章 綜述 |
| 綜述 1 表皮干細(xì)胞增殖和分化機(jī)制研究 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 2 皮膚干細(xì)胞在皮膚再生及創(chuàng)傷修復(fù)中的作用 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 3 人皮膚源性多潛能干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 負(fù)責(zé)科研項(xiàng)目 |
| 參與科研項(xiàng)目 |
| 讀博期間發(fā)表的論文 |
| 縮寫詞表 |
| 致謝 |
（4）利用基因編輯和干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行人胰腺分化及糖尿病預(yù)防和治療研究（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 1 引言 |
| 1.1 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展與應(yīng)用 |
| 1.1.1 基因編輯技術(shù)的早期發(fā)展 |
| 1.1.2 CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng) |
| 1.1.3 CRISPR-Cpf1基因編輯系統(tǒng) |
| 1.1.4 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的近期發(fā)展 |
| 1.1.5 CRISPR基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用 |
| 1.2 人胰腺的基本介紹 |
| 1.3 糖尿病的相關(guān)介紹 |
| 1.4 體外獲得胰島β細(xì)胞的方法 |
| 1.4.1 人多能干細(xì)胞研究的發(fā)展 |
| 1.4.2 人多能干細(xì)胞定向分化為胰島β細(xì)胞 |
| 1.4.3 胰島β細(xì)胞的體細(xì)胞重編程法 |
| 1.4.4 促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖的方法 |
| 1.5 人胰島β細(xì)胞的應(yīng)用 |
| 1.5.1 分化的人胰島β細(xì)胞在疾病模型中的應(yīng)用 |
| 1.5.2 體外獲得的胰島β細(xì)胞在藥物篩選中的應(yīng)用 |
| 1.6 CLEC16A的研究背景與現(xiàn)狀 |
| 1.7 本課題的研究方向及內(nèi)容 |
| 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法 |
| 2.1 主要儀器及設(shè)備 |
| 2.2 主要試劑及耗材 |
| 2.3 細(xì)胞系及菌株 |
| 2.4 質(zhì)粒 |
| 2.5 小鼠品系及飼養(yǎng) |
| 2.6 實(shí)驗(yàn)常用細(xì)胞培養(yǎng)基及試劑溶液 |
| 2.6.1 MEF培養(yǎng)基 |
| 2.6.2 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基 |
| 2.6.3 干細(xì)胞定向分化的培養(yǎng)基 |
| 2.6.4 胰島前體細(xì)胞培養(yǎng)基 |
| 2.6.5 胰島β細(xì)胞分化培養(yǎng)基 |
| 2.6.6 50× TAE溶液 |
| 2.6.7 10×磷酸緩沖液(PBS) |
| 2.6.8 PBST溶液 |
| 2.6.9 免疫熒光染色封閉液 |
| 2.6.10 4%多聚甲醛溶液 |
| 2.6.11 液體LB培養(yǎng)基 |
| 2.6.12 固體LB培養(yǎng)基 |
| 2.6.13 瓊脂糖電泳膠 |
| 2.6.14 5×KRB溶液 |
| 2.6.15 1 M HEPES溶液 |
| 2.6.16 KRBH溶液 |
| 2.7 實(shí)驗(yàn)方法及操作 |
| 2.7.1 細(xì)胞基因組提取 |
| 2.7.2 PCR實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.3 PCR產(chǎn)物割膠回收 |
| 2.7.4 crRNA的設(shè)計與構(gòu)建 |
| 2.7.5 基因組片段和質(zhì)粒的酶切 |
| 2.7.6 目的片段與載體連接實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.7 大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.8 質(zhì)粒擴(kuò)增及抽提實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.9 T7EI實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.10 RFLP實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.11 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.12 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.13 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.14 FACS流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.15 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) |
| 2.7.16 細(xì)胞傳代與凍存 |
| 2.7.17 人多能干細(xì)胞定向分化實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.18 細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.19 普通細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.20 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.21 NHEJ報告實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.22 透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌囊泡 |
| 2.7.23 GSIS葡萄糖應(yīng)激實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.24 小鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.25 組織包埋和冰凍切片染色實(shí)驗(yàn) |
| 2.7.26 統(tǒng)計學(xué)分析 |
| 2.7.27 基因編輯脫靶率分析 |
| 2.7.28 RNA-seq分析 |
| 2.7.29 全基因組測序分析 |
| 2.8 課題中使用的各種核苷酸序列 |
| 2.8.1 構(gòu)建crRNA表達(dá)載體的核苷酸序列 |
| 2.8.2 構(gòu)建質(zhì)粒載體相關(guān)的引物 |
| 2.8.3 基因型鑒定相關(guān)引物 |
| 2.8.4 T7EI實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物 |
| 2.8.5 RFLP實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物 |
| 2.8.6 脫靶位點(diǎn)分析相關(guān)引物 |
| 2.8.7 潛在脫靶位點(diǎn)信息 |
| 2.8.8 qPCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.1 CRISPR-Cpf1系統(tǒng)在人多能干細(xì)胞中的應(yīng)用 |
| 3.1.1 CRISPR-Cpf1基因編輯體系的建立 |
| 3.1.2 CRISPR-Cpf1在人多能干細(xì)胞中的作用 |
| 3.1.3 構(gòu)建基因敲除的人多能干細(xì)胞系 |
| 3.1.4 基因編輯的脫靶率分析 |
| 3.1.5 基因敲入的人多能干細(xì)胞系的構(gòu)建 |
| 3.1.6 促進(jìn)CRISPR-Cpf1基因編輯的化學(xué)小分子篩選 |
| 3.1.7 VE-822和AZD-7762的功能鑒定 |
| 3.1.8 VE-822和AZD-7762在構(gòu)建報告細(xì)胞系中的作用 |
| 3.1.9 VE-822和AZD-7762在構(gòu)建點(diǎn)突變細(xì)胞系中的作用 |
| 3.1.10 VE-822和AZD-7762在構(gòu)建雙基因敲入細(xì)胞系中的作用 |
| 3.1.11 VE-822和AZD-7762的分子作用機(jī)制 |
| 3.1.12 VE-822和AZD-7762的細(xì)胞毒性分析 |
| 3.2 人多能干細(xì)胞向胰島β細(xì)胞高效分化體系的建立 |
| 3.2.1 人多能干細(xì)胞向胰島前體細(xì)胞定向分化體系的建立 |
| 3.2.2 胰島前體細(xì)胞向胰島β細(xì)胞分化體系的建立 |
| 3.2.3 PBE1的功能鑒定 |
| 3.2.4 人胰島β細(xì)胞定向分化過程的RNA-seq分析 |
| 3.2.5 分化的胰島β細(xì)胞的體外功能鑒定 |
| 3.2.6 分化的胰島β細(xì)胞的體內(nèi)功能鑒定 |
| 3.3 CLEC16A在胰腺分化過程中的功能 |
| 3.3.1 CLEC16A敲除的人多能干細(xì)胞系的構(gòu)建 |
| 3.3.2 CLEC16A在人胰島β細(xì)胞分化中的作用 |
| 4 結(jié)論 |
| 5 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡歷 |
（5）褪黑素通過調(diào)控成骨/破骨分化平衡延緩骨質(zhì)疏松癥進(jìn)程的機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 縮略詞表 |
| 前言 |
| 第一部分 褪黑素在骨質(zhì)疏松癥中的作用 |
| 引言 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 結(jié)果 |
| 1.3 討論 |
| 1.4 結(jié)論 |
| 第二部分 褪黑素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響及機(jī)制研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.3 討論 |
| 2.4 結(jié)論 |
| 第三部分 褪黑素對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化的影響及機(jī)制研究 |
| 引言 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.3 討論 |
| 3.4 小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 間充質(zhì)干細(xì)胞臨床治療的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果 |
（6）初步探討P-糖蛋白過表達(dá)對胰島β細(xì)胞生物表型影響的機(jī)制（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 縮略語/符號說明 |
| 前言 |
| 研究現(xiàn)狀、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、P-糖蛋白過表達(dá)促進(jìn)INS-1 細(xì)胞分泌的機(jī)制研究 |
| 1.1 對象和方法 |
| 1.1.1 研究對象 |
| 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 |
| 1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.2 結(jié)果 |
| 1.2.1 P-gp過表達(dá)對Cav1.2 表達(dá)的影響 |
| 1.2.2 P-gp過表達(dá)對CAV1、SNAP25 及其之間的相互作用的影響 |
| 1.3 討論 |
| 1.3.1 P-gp過表達(dá)對INS-1 細(xì)胞Cav1.2 及胰島素分泌的影響 |
| 1.3.2 P-gp調(diào)節(jié)Cav1.2 表達(dá)的機(jī)制 |
| 1.3.3 P-gp通過CAV1、SNAP25 及其之間的相互作用調(diào)節(jié)INS-1 細(xì)胞胰島素的分泌 |
| 1.4 小結(jié) |
| 二、P-糖蛋白過表達(dá)對INS-1 和胰島β細(xì)胞分化的影響 |
| 2.1 對象和方法 |
| 2.1.1 研究對象 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.2.1 轉(zhuǎn)基因大鼠基因鑒定結(jié)果 |
| 2.2.2 P-gp過表達(dá)對INS-1 細(xì)胞分化的影響 |
| 2.2.3 P-gp過表達(dá)對胰島β細(xì)胞分化的影響 |
| 2.3 討論 |
| 2.4 小結(jié) |
| 三、P-糖蛋白過表達(dá)對大鼠胰島增殖、凋亡、分泌的影響 |
| 3.1 對象和方法 |
| 3.1.1 研究對象 |
| 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 |
| 3.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.2.1 P-gp過表達(dá)對大鼠胰島素分泌的影響 |
| 3.2.2 P-gp過表達(dá)對大鼠胰島素增殖、凋亡的影響 |
| 3.3 討論 |
| 3.4 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 發(fā)表論文和參加科研情況說明 |
| 綜述 |
| 綜述參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（7）利用β細(xì)胞體外分化與CRISPR技術(shù)模擬和修復(fù)人糖尿病的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略詞表 |
| 第一章 前言 |
| 引言 |
| 1.1 胰島素和胰腺的研究背景 |
| 1.1.1 胰島素的介紹 |
| 1.1.2 胰腺的結(jié)構(gòu)及其生理功能 |
| 1.1.3 β細(xì)胞分泌胰島素的分子機(jī)制 |
| 1.2 糖尿病分類和致病基因的研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 Ⅰ型糖尿病(T1DM) |
| 1.2.2 Ⅱ型糖尿病(T2DM) |
| 1.2.3 單基因型糖尿病(Monogenic diabetes) |
| 1.2.4 單基因型糖尿病研究對理解Ⅱ型糖尿病和其他復(fù)雜型糖尿病的意義 |
| 1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病中的作用研究 |
| 1.3.1 非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)簡介 |
| 1.3.2 人PERK基因突變導(dǎo)致的Wolcott-Rallison綜合征 |
| 1.3.3 Perk基因敲除小鼠的研究 |
| 1.4 小鼠與人胰腺發(fā)育生物學(xué)研究進(jìn)展 |
| 1.5 胰腺細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與定向分化技術(shù)研究進(jìn)展 |
| 1.5.1 胰腺細(xì)胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)研究進(jìn)展 |
| 1.5.2 胰腺細(xì)胞定向分化技術(shù)研究進(jìn)展 |
| 1.6 CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展 |
| 1.6.1 細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的抗噬菌體感染的機(jī)制 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在真核生物基因組編輯中的應(yīng)用 |
| 1.7 本研究的目的與意義 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 菌株、質(zhì)粒 |
| 2.1.2 細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動物 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器和耗材 |
| 2.1.4 分子生物學(xué)常用試劑及抗體 |
| 2.1.5 細(xì)胞生物學(xué)常用試劑 |
| 2.1.6 常用溶液及培養(yǎng)基配制 |
| 2.1.7 實(shí)驗(yàn)分析軟件和網(wǎng)站 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 細(xì)胞基因組快速提取 |
| 2.2.2 微量細(xì)胞及多量細(xì)胞RNA提取 |
| 2.2.3 細(xì)胞蛋白質(zhì)提取 |
| 2.2.4 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及單克隆挑取 |
| 2.2.5 PCR反應(yīng)條件、體系及電泳條件 |
| 2.2.6 PCR產(chǎn)物純化及濃縮 |
| 2.2.7 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系、膠回收及連接反應(yīng) |
| 2.2.8 質(zhì)粒DNA小量及大量提取 |
| 2.2.9 反轉(zhuǎn)錄及熒光實(shí)時定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.2.10 蛋白質(zhì)濃度測定及Western Blot |
| 2.2.11 多能性干細(xì)胞體外培養(yǎng) |
| 2.2.12 多能性干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染及流式細(xì)胞分析分選 |
| 2.2.13 免疫熒光染色 |
| 2.2.14 人β細(xì)胞體外分化及聚合實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.15 KCl刺激的Insulin分泌及細(xì)胞內(nèi)總Insulin收集實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.16 酶聯(lián)免疫吸附分析 |
| 2.2.17 人β細(xì)胞小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) |
| 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 |
| 3.1 利用多能性干細(xì)胞和定向分化技術(shù)制備病人特異性胰腺祖細(xì)胞和β細(xì)胞 |
| 3.1.1 病人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的建系與培養(yǎng) |
| 3.1.2 構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯與定點(diǎn)修飾質(zhì)粒 |
| 3.1.3 構(gòu)建多能性干細(xì)胞定向分化制備胰腺祖細(xì)胞和β細(xì)胞技術(shù) |
| 3.2 利用人多能性干細(xì)胞定向分化技術(shù)構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的糖尿病模型 |
| 3.2.1 構(gòu)建病人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞系及其遺傳性PERK基因突變的鑒定 |
| 3.2.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)修復(fù)PERK遺傳突變 |
| 3.2.3 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建PERK突變的胚胎干細(xì)胞系 |
| 3.2.4 PERK野生與突變型細(xì)胞分化能力比較分析 |
| 3.2.5 PERK野生型與突變型的β細(xì)胞的功能比較分析 |
| 3.2.6 PERK野生型與突變型的β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組比較分析 |
| 3.3 利用人多能性干細(xì)胞定向分化技術(shù)和基因編輯技術(shù)修復(fù)單基因型糖尿病 |
| 3.3.1 病人多能性干細(xì)胞中INS基因突變鑒定 |
| 3.3.2 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)修復(fù)病人iPSCs的INS遺傳突變 |
| 3.3.3 利用多能性干細(xì)胞胰腺定向分化技術(shù)比較突變與修復(fù)細(xì)胞的分化能力 |
| 3.3.4 INS突變與修復(fù)的β細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的比較分析 |
| 3.3.5 INS突變與修復(fù)的β細(xì)胞體外功能的比較分析 |
| 3.3.6 INS突變與修復(fù)的β細(xì)胞在小鼠體內(nèi)功能的比較分析 |
| 第四章 討論與展望 |
| 4.1 制備人遺傳性異常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的糖尿病模型 |
| 4.2 利用CRISPR/Cas9技術(shù)糾正新發(fā)現(xiàn)的INS突變并修復(fù)糖尿病表型 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 附錄 |
| 附錄一 實(shí)驗(yàn)所用引物序列 |
| 附錄二 CRISPR/Cas9系統(tǒng)gRNA及ssDNA |
| 附錄三 抗體稀釋比例 |
| 附錄四 基因序列 |
| 個人簡介 |
四、瑞典科學(xué)家用細(xì)胞移植治療糖尿?。ㄕ撐膮⒖嘉墨I(xiàn)）
- [1]MAFA、PDX1修飾促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的作用研究[D]. 李碧欣. 汕頭大學(xué), 2021(02)
- [2]線粒體甘油-3-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（GPAM）基因沉默對牛乳脂代謝的影響[D]. 于海濱. 吉林大學(xué), 2020
- [3]人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究[D]. 楊玉花. 蘇州大學(xué), 2020(06)
- [4]利用基因編輯和干細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行人胰腺分化及糖尿病預(yù)防和治療研究[D]. 馬曉潔. 浙江大學(xué), 2020(08)
- [5]褪黑素通過調(diào)控成骨/破骨分化平衡延緩骨質(zhì)疏松癥進(jìn)程的機(jī)制研究[D]. 王超煒. 浙江大學(xué), 2020(01)
- [6]初步探討P-糖蛋白過表達(dá)對胰島β細(xì)胞生物表型影響的機(jī)制[D]. 陳亞. 天津醫(yī)科大學(xué), 2019(02)
- [7]利用β細(xì)胞體外分化與CRISPR技術(shù)模擬和修復(fù)人糖尿病的研究[D]. 馬雙羽. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018(02)
- [8]2015年生命科學(xué)熱點(diǎn)回眸[J]. 吳曉麗. 科技導(dǎo)報, 2016(01)
- [9]2010年下半年生命科學(xué)、生物技術(shù)研究動態(tài)（國外篇）[J]. 趙貴英,張樹庸. 生物產(chǎn)業(yè)技術(shù), 2011(03)
- [10]2008年國內(nèi)外生物技術(shù)研究進(jìn)展（上）——干細(xì)胞、人造生命、器官移植[J]. 張樹庸,趙貴英. 生物產(chǎn)業(yè)技術(shù), 2009(03)
標(biāo)簽：線粒體論文; 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞論文; 細(xì)胞分化論文; 基因敲除技術(shù)論文; 糖尿病論文;