一、In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases（論文文獻(xiàn)綜述）
Muhammad Umer[1]（2021）在《葡萄座腔菌內(nèi)一種新環(huán)狀RNA的鑒定與特性分析》文中研究指明葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）是世界范圍內(nèi)梨果實(shí)輪紋病、莖腐病和莖瘤病的病原真菌,引起梨的產(chǎn)量和品質(zhì)降低,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中,根據(jù)對黃冠梨枝條的致病力測定,確定B.dothidea菌株MAO-2為強(qiáng)致病力菌株而XA-3為弱致病力菌株。轉(zhuǎn)錄組分析顯示XA-3是環(huán)狀RNA（circRNAs）的天然宿主。然而,circRNAs對宿主的生物學(xué)影響尚不清楚。本研究旨在探討B(tài).dothidea與circRNAs的關(guān)系及其在致病力方面的作用。主要研究結(jié)果如下:通過RT-PCR從XA-3中初步鑒定出1條單鏈（ss）circRNA（307 nt）,命名為葡萄座腔菌環(huán)狀RNA12944（B.dothidea circRNA,BdCR12944）。利用軟件CLC Main Workbench v.21.0.4預(yù)測BdCR12944的二級(jí)結(jié)構(gòu),顯示其為復(fù)雜的多分支鏈結(jié)構(gòu)。BdCR12944包含72個(gè)腺嘌呤、55個(gè)尿嘧啶、78個(gè)鳥嘌呤和102個(gè)胞嘧啶堿基,其中鳥嘌呤和胞嘧啶的含量分別為58.6%和58.6%。BLASTn分析顯示BdCR12944與其他生物的RNA序列無同源性,表明它是一種新的外源環(huán)狀RNA。將單體cDNA以兩種不同的方向克隆到pGEM-T-easy載體上,用限制性內(nèi)切酶獲取線性化片段后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,得到地高辛標(biāo)記的探針。利用地高辛標(biāo)記的探針,通過Northern blot檢測BdCR12944的積累量,確定了BdCR12944的正負(fù)極性:前者比后者在菌株XA-3中的積累量要高。雙向電泳結(jié)合Northern blot顯示BdCR12944遷移速率比真菌RNA在聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）上的遷移速率慢,進(jìn)一步證實(shí)了BdCR12944的環(huán)狀性質(zhì)。將BdCR12944的二聚體cDNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,通過聚乙二醇介導(dǎo)轉(zhuǎn)化MAO-2原生質(zhì)體細(xì)胞。用RT-PCR和斑點(diǎn)雜交鑒定了24個(gè)原生質(zhì)體長出的菌落,顯示11個(gè)再生亞株轉(zhuǎn)染后呈陽性。而通過RT-qPCR定性鑒定,轉(zhuǎn)化子12的BdCR12944效價(jià)最高（6.88E+04 copies/μL）。利用斑點(diǎn)雜交和絕對RT-qPCR檢測BdCR12944在第1代和第10代亞株之間的滴度變化,以分析其從親本到后代的遺傳能力。結(jié)果顯示,BdCR12944在真菌內(nèi)的滴度具有一定的波動(dòng)性,但對比的兩代之間沒有明顯差異,表明BdCR12944可以穩(wěn)定地從親本真菌遺傳到后代。將轉(zhuǎn)染的MAO-2亞株與對照菌株（XA-3和MAO-2）放在PDA或添加了細(xì)胞脅迫成分[包括細(xì)胞壁破壞成分（0.04%SDS）、氧化脅迫成分（0.05%H2O2）和滲透脅迫成分（1.5 M/L Na Cl、1 M/L KCl、0.5 M/L CaCl2和1 M/L葡萄糖）]的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),分析BdCR12944對宿主真菌的生物學(xué)效應(yīng)。在PDA培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)化子的生長速率和生物量與MAO-2相比顯著降低（9.38%±0.209至11.44±0.096 mm/d vs 12.52±0.127 mm/d,0.164±0.004 g/d～0.262±0.007 g/d vs 0.286±0.010 g/d）;除轉(zhuǎn)化子12與XA-3相似外,其余轉(zhuǎn)化子的形態(tài)無明顯改變。在添加有不同細(xì)胞脅迫成分的PDA上,葡萄糖和H2O2促進(jìn)它們的生長,Na Cl降低了它們的生長速度,而其余化學(xué)物質(zhì)（KCl、CaCl2和SDS）對它們的生長沒有明顯的影響。分別在接種后第4天和第10天測定了它們對黃冠梨果實(shí)和枝條的致病力。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)化子對枝條不致病,而MAO-2引起枝條的病斑大小為28.42±14.67 mm;轉(zhuǎn)化子在果實(shí)上引起的病斑大小為24.85±11.14 mm～37.71±16.78 mm,與XA-3相似,但明顯弱于MAO-2。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染BdCR12944后,轉(zhuǎn)化子分別喪失對梨枝的致病性及減弱了對果實(shí)的致病力,表明BdCR12944侵染MAO-2后可以使其致病力減弱。為了驗(yàn)證BdCR12944是否能夠侵染其他真菌,將BdCR12944二聚體cDNA體外轉(zhuǎn)錄得到的二聚體RNA轉(zhuǎn)染Diaporthe eres（DK-362）、Alternaria alternata（GS-18）Colletotrichum fructicola（ZGTL）的原生質(zhì)體,通過斑點(diǎn)雜交和RT-PCR進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,BdCR12944能夠侵染D.eres（DK-362）和A.alternata（GS-18）,侵染率分別為29.1%和20.83%,而不侵染C.fructicola（ZGTL）。此外,為了檢測BdCR12944是否能侵染煙草或從菌絲體向植物中傳播,我們將其二聚體RNA和陽性轉(zhuǎn)化子12分別接種到本氏煙植株上,并用Northern blot進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,無論是從接種的RNA還是從菌絲體中,BdCR12944都能擴(kuò)散到新發(fā)育的煙草葉片中并在其中復(fù)制。反之亦然,即接種本氏煙幼苗后,BdCR12944能從本氏煙傳播到MAO-2中。為檢測BdCR12944是否調(diào)控宿主代謝過程,將轉(zhuǎn)化子12與MAO-2進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)存在754個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）,其中有311個(gè)下調(diào)和443個(gè)上調(diào)基因。其中,在GO數(shù)據(jù)庫中注釋到了311個(gè)DEGs,包含25個(gè)細(xì)胞成分相關(guān)基因、98個(gè)生物過程相關(guān)基因和92個(gè)分子功能相關(guān)基因。在肽酶活性途徑中表達(dá)下調(diào)的基因顯著富集,其表達(dá)趨勢（10個(gè)下調(diào)的DEGs）通過qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述,本研究在B.dothidea菌絲中發(fā)現(xiàn)了一種新的環(huán)狀RNA,命名為BdCR12944,并證明其能夠獨(dú)立復(fù)制和轉(zhuǎn)染其它真菌甚至植物。BdCR12944對宿主真菌的形態(tài)、生長速度和毒力等生物學(xué)特性具有調(diào)控作用,為深入了解真菌中的環(huán)狀RNA奠定了基礎(chǔ)。
李妍[2]（2021）在《S100A10調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移和增殖的機(jī)制研究》文中研究說明研究背景:胃癌是世界上發(fā)病率最高的癌癥之一,胃癌的復(fù)發(fā)率高,預(yù)后較差。近年來,隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)和內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展,早期胃癌的診斷率大大提高。沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期胃癌患者可通過內(nèi)鏡下切除達(dá)到治愈性治療,而胃癌一旦發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,則只能通過外科手術(shù)進(jìn)行切除,病人的預(yù)后和生存質(zhì)量均較差。胃癌發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的前提條件是胃癌細(xì)胞不斷增殖突破基底膜限制,向下浸潤性生長,誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至腫瘤細(xì)胞周圍,形成新的毛細(xì)淋巴管,然后胃癌細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞緊密黏附,侵入淋巴管腔,到達(dá)淋巴結(jié),進(jìn)而形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,深入揭示胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,鑒定新的治療靶點(diǎn),是當(dāng)前轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。胃癌作為一種實(shí)體腫瘤,隨著瘤體的不斷增大,為了滿足自身快速增殖的需求,腫瘤細(xì)胞常改變其能量代謝方式,由正常的氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跆墙徒?。糖酵解的中間產(chǎn)物也為腫瘤細(xì)胞快速合成腺苷酸和脂質(zhì)等生物大分子提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無限增殖。此外,糖酵解產(chǎn)生的大量乳酸能夠促使腫瘤微環(huán)境酸化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移和免疫逃逸。深入了解腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解的調(diào)控機(jī)制,選取合適的靶點(diǎn)進(jìn)行新藥開發(fā),具有深遠(yuǎn)的應(yīng)用背景。近年來,隨著人類基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的不斷發(fā)展,很多異常表達(dá)的癌基因被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對胃癌早期發(fā)生發(fā)展過程中的某些異常表達(dá)的分子進(jìn)行挖掘,進(jìn)而開發(fā)新的具有重要臨床價(jià)值的分子標(biāo)志物,是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。S100A10,作為鈣結(jié)合蛋白家族S100的一員,參與體內(nèi)多種生理病理過程,例如胞吞胞吐、纖溶酶生成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖等。近來也有研究表明S100A10的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如胰腺癌、卵巢癌和肝癌等。在胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中,S100A10也存在異常高表達(dá)。但是它在胃癌淋巴轉(zhuǎn)移和惡性增殖中的具體作用及調(diào)控機(jī)制尚無詳細(xì)研究。因此,本研究分為三個(gè)部分,對S100A10在早期胃癌組織中的異常表達(dá)、S100A10促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及S100A10通過調(diào)控糖酵解促進(jìn)胃癌增殖的機(jī)制進(jìn)行研究。第一部分S100A10在早期胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義研究目的:1.分析S100A10在Oncomine、TCGA數(shù)據(jù)庫以及臨床收集的樣本組織中的表達(dá)情況。2.分析S100A10在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況。3.分析S100A10與早期胃癌臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。研究方法:1.通過Oncomine數(shù)據(jù)庫、TCGA數(shù)據(jù)庫、UALCAN網(wǎng)站分析S100A10在大規(guī)模癌癥樣本組織中的表達(dá)情況,并通過Kaplan-Meierplotter數(shù)據(jù)庫分析S100A10在胃癌中的預(yù)后價(jià)值。2.使用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）檢測S100A10在17例正常胃粘膜組織、23例萎縮性胃炎組織、17例早期胃癌組織以及24例進(jìn)展期胃癌組織中的表達(dá)情況。3.使用免疫組化檢測S100A10在92例早期胃癌組織石蠟切片的表達(dá)情況,并收集患者的臨床病理資料,分析S100A10與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。研究結(jié)果:1.生物信息學(xué)分析顯示S100A10在胃癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常胃黏膜組織。Kaplan-Meierplotter數(shù)據(jù)庫顯示S100A10高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后不良。2.RT-qPCR結(jié)果顯示S100A10在胃癌組織中的表達(dá)量顯著高于其在正常胃黏膜組織和萎縮性胃炎組織中的表達(dá)量,而S100A10在早期胃癌組織和進(jìn)展期胃癌組織中的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.免疫組化結(jié)果顯示,S100A10在正常胃黏膜組織、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期胃癌組織、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期胃癌組織中呈遞增式表達(dá)。S100A10與早期胃癌的腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和脈管浸潤密切相關(guān)。結(jié)論:S100A10在早期胃癌組織中即存在著較高水平的表達(dá),尤其是在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早癌組織。S100A10的高表達(dá)與早期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑和腫瘤分期等密切相關(guān)。S100A10是一個(gè)有價(jià)值的生物標(biāo)志物,對預(yù)測早期胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有重要的提示作用。第二部分S100A10促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究研究目的:1.探究S100A10在胃癌中的生物學(xué)功能。2.探究S100A10上游調(diào)控機(jī)制。3.探究S100A10參與調(diào)控的下游信號(hào)通路。4.探究體內(nèi)條件下靶向抑制S100A10的表達(dá)對胃癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。研究方法:1.S100A10在胃癌中的生物學(xué)功能在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)或敲低S100A10后,利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測S100A10對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤能力的影響,并利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測S100A10對胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影響;利用CCK8、EdU和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測S100A10對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測S100A10對胃癌細(xì)胞凋亡能力的影響。收集細(xì)胞上清培養(yǎng)人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（human lymphatic vessel endothelial cell,HLEC）,觀察S100A10對HLEC小管形成能力和轉(zhuǎn)移能力的影響,并通過Western blot實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測細(xì)胞上清中人血管生成因子C（VEGF C）的蛋白表達(dá)及分泌水平;通過內(nèi)皮細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測S100A10對胃癌細(xì)胞與HLEC黏附能力的影響。2.S100A10的上游調(diào)控機(jī)制研究（1）為研究S100A10的上游調(diào)控機(jī)制,利用Ensembl數(shù)據(jù)庫查詢S100A10轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的啟動(dòng)子區(qū)域序列,并通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)確定核心啟動(dòng)子區(qū)。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測可能與S100A10核心啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,并通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子對S100A10的調(diào)控作用。（2）通過Transwell實(shí)驗(yàn)和CCK8實(shí)驗(yàn)檢測c-Jun過表達(dá)對胃癌細(xì)胞遷移浸潤和增殖能力的影響,免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測胃癌組織中c-Jun的表達(dá)情況。3.S100A10的下游調(diào)控信號(hào)通路的研究（1）Western blot實(shí)驗(yàn)檢測S100A10對下游信號(hào)通路Src/ANXA2/AKT/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控作用,以及對下游效應(yīng)分子VEGF C、E-Cadherin和c-Jun的影響。（2）在過表達(dá)S100A10的胃癌細(xì)胞中,加入AKT通路抑制劑MK-2206,觀察MK-2206是否能逆轉(zhuǎn)S100A10介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的惡性表型。4.靶向抑制S100A10的表達(dá)對胃癌細(xì)胞在體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移的影響（1）將胃癌細(xì)胞種植到裸鼠皮下,隨后定期向瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射干擾慢病毒LV-shS100A10及對照慢病毒LV-NC,定期記錄瘤體的生長曲線以及實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)瘤體重量的差異。（2）提取瘤體組織的蛋白,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測S100A10下游信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況。（3）利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建S100A10穩(wěn)定敲低細(xì)胞系,進(jìn)行尾靜脈注射,觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶的形成。研究結(jié)果:1.S100A10促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為胃癌細(xì)胞過表達(dá)S100A10后,胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤、增殖能力明顯提高,細(xì)胞凋亡能力被抑制,誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。而干擾S100A10表達(dá)后,胃癌細(xì)胞的遷移、浸潤、增殖能力明顯下降,細(xì)胞凋亡數(shù)增多。過表達(dá)S100A10的胃癌細(xì)胞通過誘導(dǎo)VEGF C的分泌,從而促進(jìn)HLEC的遷移和淋巴管新生。過表達(dá)S100A10的胃癌細(xì)胞與HLEC的黏附能力也增強(qiáng)。2.c-Jun與S100A10的核心啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并激活S100A10轉(zhuǎn)錄雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)錄因子c-Jun可與S100A10的核心啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,并促進(jìn)S100A10的轉(zhuǎn)錄。胃癌細(xì)胞過表達(dá)c-Jun后,細(xì)胞的遷移、浸潤和增殖能力明顯增強(qiáng)。3.S100A10通過激活Src/ANXA2/AKT/c-Jun正反饋環(huán)路發(fā)揮作用（1）S100A10的異常高表達(dá)會(huì)激活Src激酶,誘導(dǎo)ANXA2磷酸化,進(jìn)而激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路,c-Jun作為AKT信號(hào)通路的下游分子促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移浸潤,由此構(gòu)成正反饋環(huán)路加速胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。（2）AKT通路抑制劑MK-2206可以逆轉(zhuǎn)S100A10介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的惡性表型,抵消S100A10對胃癌細(xì)胞遷移、浸潤和增殖的促進(jìn)作用。4.靶向抑制S100A10的表達(dá)阻礙胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移（1）裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射LV-shS100A10慢病毒抑制Src/ANXA2/AKT信號(hào)通路的激活,進(jìn)而抑制瘤體的生長和局部浸潤。（2）S100A10穩(wěn)定敲低組裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量及大小均顯著低于對照組。結(jié)論:C-Jun可激活S100A10轉(zhuǎn)錄,從而上調(diào)S100A10在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。S100A10激活Src/ANXA2/AKT/mTOR信號(hào)通路,促進(jìn)下游c-Jun和VEGF C表達(dá),形成正反饋環(huán)路誘導(dǎo)胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移。第三部分S100A10通過調(diào)控糖酵解促進(jìn)胃癌增殖的機(jī)制研究研究目的:1.探究S100A10對胃癌細(xì)胞有氧糖酵解的調(diào)控作用。2.探究S100A10調(diào)控胃癌細(xì)胞有氧糖酵解的分子機(jī)制。研究方法:1.S100A10對胃癌細(xì)胞有氧糖酵解的調(diào)控作用（1）通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測S100A10對糖酵解相關(guān)分子表達(dá)水平的影響。（2）有氧糖酵解測定包括:檢測葡萄糖消耗量和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的表達(dá);檢測乳酸生成量和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性及表達(dá)水平;檢測腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）的生成量;檢測細(xì)胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）。2.S100A10調(diào)控糖酵解參與的信號(hào)通路研究利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測S100A10過表達(dá)或敲低后mTOR信號(hào)通路的變化。并進(jìn)一步檢測加入mTOR通路抑制劑雷帕霉素和LDHA抑制劑GSK-2837808A是否可以阻斷S100A10介導(dǎo)的糖酵解惡性表型。3.體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過表達(dá)S100A10對于胃癌細(xì)胞生長的影響以及雷帕霉素的抑制作用構(gòu)建S100A10過表達(dá)及空白對照的胃癌穩(wěn)篩細(xì)胞系并注射到裸鼠腋窩皮下,待瘤體長出后,定期注射雷帕霉素或PBS,記錄腫瘤大小變化。剝離瘤體提取蛋白,Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證瘤體組織中S100A10及下游信號(hào)通路相關(guān)分子的蛋白表達(dá)情況。研究結(jié)果:1.GEPIA分析及RT-qPCR結(jié)果顯示S100A10的表達(dá)與糖酵解關(guān)鍵分子的表達(dá)密切相關(guān)。2.S100A10促進(jìn)GLUT1的表達(dá)從而增加葡萄糖消耗,并能增加乳酸脫氫酶的活性和LDHA的表達(dá)從而促進(jìn)乳酸的生成。干擾S100A10的表達(dá)能恢復(fù)氧化磷酸化從而增加ATP的生成。3.S100A10通過激活mTOR通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞糖酵解,在S100A10過表達(dá)的胃癌細(xì)胞中加入雷帕霉素和GSK-2837808A,胃癌細(xì)胞的增殖能力下降,葡萄糖消耗和乳酸生成量明顯降低,ATP生成增多。4.皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)證明S100A10過表達(dá)組的腫瘤體積和瘤體重量高于對照組,而定期注射雷帕霉素可以有效抑制S100A10介導(dǎo)的胃癌惡性生長。結(jié)論:S100A10通過激活mTOR通路促進(jìn)有氧糖酵解,加速胃癌細(xì)胞的快速增殖,這一促進(jìn)作用可被雷帕霉素抑制,從而阻礙胃癌細(xì)胞的惡性增殖。
Muhammad Tahir[3]（2020）在《IGF2BP2（IMP2）是小鼠早期合子基因組激活的關(guān)鍵調(diào)控因子》文中研究指明背景:哺乳動(dòng)物配子受精前,其基因組處于無轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài);經(jīng)過減數(shù)分裂形成的卵子和精子在受精過程后相互識(shí)別并結(jié)合,遺傳物質(zhì)融合并形成合子,進(jìn)一步發(fā)育成新的個(gè)體。受精卵基因表達(dá)受到合子基因組激活（ZGA）的調(diào)控,此前轉(zhuǎn)錄沉默的基因組進(jìn)行重編程,建立其特有的全能性,并進(jìn)一步激活早期胚胎發(fā)育所需的基因表達(dá)。ZGA是細(xì)胞核重編程的過程,可使合子基因組從受精時(shí)的轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楹笃诘募せ顮顟B(tài),合子基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠逐漸替代卵母細(xì)胞中貯存的母源因子維持早期胚胎發(fā)育,是哺乳動(dòng)物及其他脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵階段。不同物種ZGA的發(fā)生時(shí)間不同,在小鼠中ZGA開始于2細(xì)胞期,而人類則為4-8細(xì)胞期。這個(gè)合子發(fā)育過程中基因表達(dá)模式的劇變均發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,基因組激活的差異可能導(dǎo)致的不同結(jié)果,并對哺乳動(dòng)物的妊娠結(jié)局產(chǎn)生一定影響。根據(jù)功能和轉(zhuǎn)錄活性可將ZGA分為次要和主要兩個(gè)階段:起始階段即次要ZGA,發(fā)生在1細(xì)胞胚胎期的S相到2細(xì)胞期的G1相,為緩慢發(fā)育階段;而主要ZGA發(fā)生在2細(xì)胞晚期,大量轉(zhuǎn)錄過程快速發(fā)生,基因調(diào)控機(jī)制開始運(yùn)行。兩個(gè)階段的正確激活和調(diào)節(jié)對于基因的表達(dá)至關(guān)重要,并在細(xì)胞增殖和早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于次要ZGA階段產(chǎn)物中轉(zhuǎn)錄活性相對較低,并存在大量的無效剪切,而且其在2細(xì)胞期后的胚胎發(fā)育過程中的作用仍需要進(jìn)一步研究;相反,主要ZGA在2細(xì)胞期后胚胎發(fā)育中所發(fā)揮的作用較為明確,其功能異?？蓪?dǎo)致胚胎發(fā)育停滯于2細(xì)胞期。因此,ZGA異常不僅會(huì)影響基因表達(dá),還可導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育停滯。主要ZGA階段發(fā)生的基因表達(dá)重編程對于后續(xù)的早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要,異?？芍屡c早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)數(shù)目下調(diào),胚胎質(zhì)量受損以及不孕的發(fā)生?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與ZGA相關(guān)的基因及母源蛋白,主要有YAP1、TLE6、BTG4、MED13和OCT4等,但小鼠體內(nèi)與ZGA直接相關(guān)的RNA結(jié)合母源因子的作用尚不明確。本文中我們主要的研究對象是母源RNA結(jié)合蛋白,胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2（IGF2BP2,又稱IMP2）。IMP2屬于RNA結(jié)合蛋白家族,在小鼠和其他動(dòng)物的卵母細(xì)胞、胚胎和性腺中大量表達(dá),已有研究證實(shí)其在癌細(xì)胞、2型糖尿病等疾病或細(xì)胞代謝、翻譯起始等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用,但是尚無有關(guān)IMP2在小鼠ZGA及早期胚胎發(fā)育中作用的研究。在過去的40多年中,人類輔助生殖技術(shù)（ART）廣泛應(yīng)用,但如何提高胚胎種植率和妊娠率仍是較大挑戰(zhàn),因此越來越多的研究旨在完善胚胎培養(yǎng)策略（尤其是受精到移植的階段）。由于體外胚胎培養(yǎng)與胚胎的早期發(fā)育及其種植率密切相關(guān),因此優(yōu)化體外培養(yǎng)方案是改善輔助生殖技術(shù)妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素之一。胚胎體內(nèi)和體外培養(yǎng)之間發(fā)育潛能有差異的主要原因可能是體外培養(yǎng)缺乏特定的卵母細(xì)胞及胚胎相關(guān)的生長因子。盡管與女性生殖有關(guān)的生長因子已得到廣泛研究,但是臨床應(yīng)用時(shí)體外胚胎培養(yǎng)液中并未添加充足的胚胎發(fā)育所必需的生長因子,可能進(jìn)一步導(dǎo)致早期胚胎生長發(fā)育受限、胚胎種植失敗等,最終致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。胰島素樣生長因子2（IGF2）是所有已知生殖相關(guān)生長因子中最為復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子,并可能是人類卵泡中的存在的主要生長因子,已有研究表明其在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟中具有促進(jìn)作用,但是IGF2在早期胚胎發(fā)育中的作用及機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。方法:Imp2基因敲除小鼠的構(gòu)建及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山東大學(xué)倫理委員會(huì)對動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)要求和規(guī)定,本研究所使用的小鼠為ICR和C57BL/6J雜交遺傳背景的Imp2敲除小鼠。首先,為構(gòu)建Imp2基因敲除小鼠,將loxP位點(diǎn)引入Imp2的第3個(gè)和第4個(gè)外顯子兩側(cè),后將Imp2flox/flox小鼠與Vasa-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交以獲得Imp2flox/+,再次雜交獲得敲除Imp2的小鼠,其中Vasa-Cre小鼠也稱為Ddx4-Cre小鼠,是生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的工具鼠。基因敲除小鼠模型構(gòu)建成功后,向24-28日齡對照組野生型雌性小鼠和Imp2基因敲除的雌性小鼠體內(nèi)注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）及人絨毛膜促性腺激素（hCG）進(jìn)行超數(shù)排卵,分別收集兩組小鼠的卵母細(xì)胞和胚胎,在M16培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng),以觀察其胚胎的早期發(fā)育能力;并評估Imp2基因敲除小鼠及對照組小鼠在6個(gè)月內(nèi)的產(chǎn)仔總數(shù),以測試Imp2基因敲除小鼠生育力。借助RNA測序和定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析,觀察比較Imp2基因敲除小鼠與對照組小鼠2細(xì)胞期胚胎的基因表達(dá)情況;運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)、免疫組化和共聚焦顯微鏡成像等技術(shù)分析比較Imp2敲除小鼠及對照組小鼠卵母細(xì)胞和胚胎中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)分析Imp2基因敲除小鼠卵母細(xì)胞和胚胎中下調(diào)基因的基因表達(dá)情況。運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和熒光素酶測定法等探究IMP2與IGF2的關(guān)系以及樣本中下調(diào)的IMP2結(jié)合基因的表達(dá)情況,并研究對照組和Imp2敲除小鼠的2細(xì)胞期胚胎翻譯和轉(zhuǎn)錄差異的機(jī)制。除此之外,我們將對照組和Imp2敲除小鼠卵母細(xì)胞取出后進(jìn)行體外受精及培養(yǎng),并向受精后的胚胎培養(yǎng)液中添加濃度為50nM的IGF2,以探究其對早期胚胎發(fā)育的影響;隨后將IGF2處理及對照組胚胎移植入假孕雌鼠體內(nèi),用以研究IGF2處理對胚胎體內(nèi)發(fā)育情況的影響。結(jié)果:通過對卵母細(xì)胞及胚胎中IMP2表達(dá)情況檢測我們發(fā)現(xiàn),IMP2在不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞和胚胎中均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異。小鼠胚胎中Imp2對于卵泡形成、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟及胚胎發(fā)育必不可少。在體外培養(yǎng)環(huán)境中,Imp2敲除小鼠的卵母細(xì)胞受精后大多數(shù)受精卵停滯在2細(xì)胞期,只有少數(shù)胚胎（6%）發(fā)育到4細(xì)胞階段。對小鼠2細(xì)胞期胚胎進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示,IMP2的缺失下調(diào)了 RNA結(jié)合及蛋白質(zhì)結(jié)合的相關(guān)基因,而這些基因?qū)υ缙谂咛グl(fā)育的至關(guān)重要。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明,Imp2基因敲除小鼠的2細(xì)胞期胚胎中,前述下調(diào)的基因表達(dá)量確有所降低。根據(jù)相關(guān)下調(diào)基因的mRNA表達(dá)情況以及熒光素酶活性測定結(jié)果,我們確定了Imp2的兩個(gè)靶基因,Ccar1和Rps14。Ccar1及Rps14均為早期胚胎發(fā)育所必需,在野生型小鼠胚胎中Ccar1和Rps14缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯在不同階段,主要停在2細(xì)胞期胚胎,且胚胎的發(fā)生也有一定程度的損傷。同時(shí),Imp2敲除小鼠早期胚胎中基因轉(zhuǎn)錄及翻譯受損,與對照組胚胎相比,Imp2敲除小鼠中獲得的2細(xì)胞期胚胎的總RNA和總蛋白質(zhì)合成減少了 2倍。此外,IGF2是IMP2的靶分子,向野生型胚胎的培養(yǎng)液中添加50 nM IGF2后,可使其囊胚率由對照組的29%提高至65%;然而向Imp2基因敲除胚胎的培養(yǎng)液中添加50 nM IGF2則對其早期發(fā)育無影響,大部分胚胎仍停滯在2細(xì)胞期。胚胎移植結(jié)果表明,向假孕小鼠體內(nèi)移植經(jīng)過50nM IGF2處理的早期胚胎,與移植對照組胚胎的小鼠相比,妊娠率及產(chǎn)仔數(shù)量均明顯升高。螢光素酶測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,IMP2可與IGF2的5’端的非翻譯區(qū)結(jié)合,通過添加IGF2可以提高下調(diào)基因的翻譯活性,作用呈劑量依賴性。用ELISA法測定卵母細(xì)胞、胚胎及其培養(yǎng)液中的IGF2含量結(jié)果顯示,Imp2敲除小鼠與對照小鼠相比IGF2水平降低2倍。最后,我們還收集了臨床廢棄的未成熟捐贈(zèng)GV期卵母細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)及受精,將正常受精的雙原核（2PN）受精卵隨機(jī)分為處理組與對照組,向處理組培養(yǎng)液中添加50nM IGF2,結(jié)果顯示處理組的囊胚率較對照組有明顯升高。此外,我們還發(fā)現(xiàn)與對照組相比,IGF2處理組胚胎評分也有顯著提高。結(jié)論:通過研究,我們發(fā)現(xiàn)并證明了小鼠體內(nèi)RNA結(jié)合蛋白IMP2在合子基因組激活及胚胎植入前的早期胚胎發(fā)育過程中有重要作用。IMP2可以上調(diào)合子基因組激活時(shí)重要相關(guān)基因的表達(dá),缺失時(shí)主要導(dǎo)致胚胎停滯在2細(xì)胞期,最終可導(dǎo)致小鼠的胚胎異常,進(jìn)一步影響妊娠結(jié)局。此外,我們的研究結(jié)果還揭示了生長因子IGF2在胚胎發(fā)育及動(dòng)物生物技術(shù)和人類輔助生殖技術(shù)等方面的應(yīng)用價(jià)值及前景。
SANAD ABDALBAGE MOHAMMED ABDALSADEG（薩那德）[4]（2018）在《乳腺癌血清腫瘤標(biāo)志物適配體的篩選及其檢測》文中研究說明自20世紀(jì)70年代末,全球乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢。乳腺癌已成為當(dāng)前社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問題。提高乳腺癌的早期診斷,實(shí)現(xiàn)有效篩查,結(jié)合腺癌綜合治療,可提高乳腺癌治療療效。癌癥病例中,許多蛋白質(zhì)作為信號(hào)蛋白參與細(xì)胞分化和細(xì)胞生長等多種功能,同時(shí)可作為致癌基因并動(dòng)員細(xì)胞轉(zhuǎn)化。認(rèn)為這些蛋白分子是癌癥檢測和治療領(lǐng)域的一個(gè)有吸引力的靶向蛋白,因此,這一靶向蛋白現(xiàn)在引起進(jìn)行廣泛的研究和調(diào)查。將適體定義為小核酸分子,由一個(gè)命名為SELEX的程序的組合庫分離提供。適體可以通過在目標(biāo)分子中嵌入特定數(shù)目的特定的、特定的和特定的接觸點(diǎn)來限制結(jié)合。研究目的:利用靶標(biāo)替換消減SELEX技術(shù)從乳腺癌血清中篩選腫瘤標(biāo)志物核酸適配基。研究內(nèi)容:利用乙腈法去除血清中高豐度蛋白;用羧基瓊脂磁珠作為載體結(jié)合乳腺癌血清蛋白;再利用靶標(biāo)替換消減SELEX技術(shù),經(jīng)過9輪篩選,獲得了乳腺癌血清特異核酸配體的二級(jí)文庫。結(jié)果:獲得了乳腺癌血清特異性核酸配體的ssDNA二級(jí)文庫。這一ssDNA文庫能夠特異性結(jié)合乳腺癌血清靶向蛋白。在每一輪的選擇過程,數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測目標(biāo)DNA的濃度和規(guī)范,直到目標(biāo)ssDNA富集達(dá)到最高點(diǎn)。到目前為止,篩選完畢。
王小茜[5]（2016）在《新型細(xì)胞因子IL-39（IL-23p19/Ebi3）的鑒定及其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的功能研究》文中指出背景：IL-12家族成員不僅在感染及炎癥過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,而且與腦脊髓炎、多發(fā)性硬化癥、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)病和治療密切相關(guān)。白細(xì)胞介素-12（Interleukin-12,IL-12）家族已發(fā)現(xiàn)4個(gè)：IL-12、IL-23、IL-27及其新成員IL-35。該家族每個(gè)成員均是由一個(gè)α亞基（p19,p28或p35）和一個(gè)β亞基（p40或Ebi3）組成異源二聚體,這樣,IL-12家族成員在結(jié)構(gòu)上相互交叉重疊（如下圖所示）。根據(jù)IL-12家族成員分子異源二聚體構(gòu)成特點(diǎn),我們和其他研究者推測p28和p40,或者p19和Ebi3也能組成新的分子（如圖所示）。雖然有研究已經(jīng)顯示p28和P40能構(gòu)成新分子并具有抑制免疫反應(yīng)的功能,但是研究者沒能發(fā)現(xiàn)體內(nèi)存在p28/p40復(fù)合物。因此,我們的研究重點(diǎn)為p19能否與Ebi3結(jié)合成新的細(xì)胞因子?如果能夠結(jié)合,那么這種新型細(xì)胞因子在自身免疫性疾病中功能是什么?這樣,我們就圍繞新型細(xì)胞因子p19/Ebi3（我們命名為IL-39）的鑒定及在自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用和可能機(jī)制做了初步探究,力圖為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的致病機(jī)理提供依據(jù)、為該病的治療提供新的可行性思路。目的：鑒定新型細(xì)胞因子IL-39 （p19/Ebi3）是否天然存在,探究其在自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用和機(jī)制。方法與結(jié)果：一、鑒定新型細(xì)胞因子IL-39及其受體、信號(hào)通路1.細(xì)胞因子IL-39 （p19/Ebi3）的鑒定：為了驗(yàn)證IL-12家族分子亞基p19與Ebi3是否能夠相互結(jié)合形成復(fù)合物,我們通過蛋白表達(dá)、純化等實(shí)驗(yàn)手段,結(jié)合PCR、免疫共沉淀、雙抗夾心ELISA等方法檢測不同細(xì)胞亞群是否表達(dá)p19/Ebi3復(fù)合物,,得出以下結(jié)果：（1）通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),人源和鼠源的p19、Ebi3均可以互相結(jié)合,構(gòu)建表達(dá)載體并純化p19/Ebi3復(fù)合物,經(jīng)鑒定,p19/Ebi3復(fù)合物是54kD的異源二聚體,我們命名該復(fù)合物為IL-39；（2）通過PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),RAW264.7細(xì)胞系、骨髓來源的樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞存在p19、Ebi3共表達(dá)現(xiàn)象；（3）通過雙抗夾心ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn),RAW264.7細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在天然形式的IL-39 （P19/Ebi3）;（4）通過雙抗夾心ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS活化的B細(xì)胞可分泌天然形式的IL-39 （p19/Ebi3）;2、IL-39信號(hào)通路的鑒定：為了鑒定IL-39發(fā)揮生物學(xué)功能的信號(hào)通路,我們結(jié)合IL-12家族受體分子亞基配對規(guī)律,應(yīng)用受體敲低、蛋白質(zhì)印跡法、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測IL-39的受體及其誘導(dǎo)STAT家族成員磷酸化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）B細(xì)胞中表達(dá)IL-12家族的受體；隨著LPS刺激時(shí)間增加,B細(xì)胞表面受體IL-23R、gp130的表達(dá)量增多；（2）IL-39可以促進(jìn)B細(xì)胞中STAT1及ATAT3的磷酸化,而對其他STAT家族成員如STAT4、STAT5等無影響；當(dāng)敲低IL-23R或gp130后,IL-39不能誘導(dǎo)STAT1和STAT3磷酸化。二、鑒定分泌IL-39的B細(xì)胞前面的研究已經(jīng)顯示抗原提呈細(xì)胞如DC、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞都有表達(dá)IL-39的能力。成熟或LPS活化的DC、巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-39水平降低,而只有B細(xì)胞是活化后增強(qiáng)IL-39,顯示了活化的B細(xì)胞分泌IL-39可能有病理意義而不成熟DC、巨噬細(xì)胞表達(dá)的IL-39可能有生理意義。我們認(rèn)為研究IL-39的病理意義更大,因此詳細(xì)地分析分泌IL-39的B細(xì)胞,我們設(shè)計(jì)了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)：1)體外分離小鼠脾臟B細(xì)胞,用LPS刺激B細(xì)胞活化,通過PCR、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA等不同方法研究活化B細(xì)胞表達(dá)IL-12家族5亞基的情況,同時(shí)抑制B細(xì)胞活化觀察其表達(dá)情況；2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)引用了B細(xì)胞異常活化的系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型,通過流式細(xì)胞術(shù)、PCR等方法觀察脾臟B細(xì)胞中IL-39的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要有：（1）體外研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS活化的B細(xì)胞（如GL7+B細(xì)胞）主要表達(dá)p19與Ebi3,雙抗夾心ELISA法結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了活化的B細(xì)胞可以分泌天然形式存在的IL-39；當(dāng)用IFN-γ、Bcl-6抑制劑等抑制B細(xì)胞活化后,IL-39的表達(dá)量明顯下降。（2）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠發(fā)病后脾臟B細(xì)胞異?；罨?與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,體內(nèi)異?；罨腉L7+B細(xì)胞是產(chǎn)生IL-39的主要來源。三、鑒定IL-39在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用為了探究IL-39在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用,通過流式分選的方法的得到GL7+B細(xì)胞,然后用shRNA慢病毒感染的方法在GL7+B細(xì)胞中分別敲低IL-12家族的5個(gè)亞基,最后回輸給未發(fā)病的系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型鼠和CD19cre小鼠體內(nèi)觀察對病情發(fā)生發(fā)展的影響；另外,制備了抗IL-39多克隆抗體對系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病鼠進(jìn)行治療，通過尿蛋白、抗體產(chǎn)生、腎臟病理等指標(biāo)檢測治療效果。研究發(fā)現(xiàn)：（1）GL7+B細(xì)胞可誘導(dǎo)系統(tǒng)性紅斑狼瘡,出現(xiàn)尿蛋白升高、脾臟腫大、脾重增加、脾臟B細(xì)胞異?；罨?而給予敲低p19或Ebi3的GL7+B細(xì)胞的小鼠發(fā)病明顯降低；（2）將抗1L-39多克隆抗體給予系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病鼠后,病情緩解,出現(xiàn)皮膚潰瘍緩解、尿蛋白下降、脾腫大減輕、脾臟異?；罨腂細(xì)胞數(shù)目減少、抗體分泌減少、腎臟病理炎癥程度下降等。四、分析1L-39在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用機(jī)制為了探究IL-39在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中促炎作用的可能機(jī)制。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察IL-39對T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞亞群的影響,并在方法三的疾病模型中進(jìn)行反向驗(yàn)證。研究結(jié)果如下：（1）體內(nèi)外研究表明IL-39可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的分化發(fā)育；（2）敲低p19、Ebi3或抗體阻斷IL-39后,中性粒細(xì)胞數(shù)目降低：（3）系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的中性粒細(xì)胞分泌致病因子BAFF;（4）通過體外實(shí)驗(yàn),證明了IL-39可能通過IL-39-BAFF正反饋環(huán)促進(jìn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠中性粒細(xì)胞比例上升。結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)了IL-12家族亞基p19與Ebi3能組成新的復(fù)合物并命名為IL-39。系統(tǒng)性紅斑狼瘡樣小鼠異?；罨腉L7+B細(xì)胞可分泌高水平的IL-39。IL-39可以通過受體IL-23R/gp130誘導(dǎo)STAT1、STAT3磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)功能。IL-39通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞分泌B細(xì)胞活化因子（BAFF）等機(jī)制介導(dǎo)狼瘡樣小鼠炎癥反應(yīng),而應(yīng)用抗IL-39抗體等方法阻斷IL-39的效應(yīng)能有效地減輕狼瘡樣小鼠炎癥反應(yīng)和自身免疫癥狀?？傊?在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的IL-12家族新分子IL-39。隨著深入研究IL-39在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用及機(jī)制,也許能為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療提供了新的思路和潛在應(yīng)用價(jià)值。
Prince Amoah Barnie[6]（2015）在《HMGB1參與EAM心肌纖維化的機(jī)制及對固有免疫細(xì)胞功能的影響》文中研究指明背景高遷移率族蛋白l（HMGB1）,是一種重要的炎癥介質(zhì),可由免疫細(xì)胞和一些非免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌,或受損及壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放。HMGB1與許多炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系,諸如：超敏反應(yīng)、自身免疫性疾病、感染性疾病等。本實(shí)驗(yàn)室已有的研究數(shù)據(jù)表明,HMGB1在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎（EAM）小鼠心臟組織或血清中表達(dá)上調(diào)；封閉HMGB1可以改善EAM后期的心肌纖維化。然而,迄今為止,沒有數(shù)據(jù)能夠直接表明HMGB1與心肌纖維化的關(guān)系。據(jù)此,本研究旨在探討：①上調(diào)HMGB1有無可能直接導(dǎo)致EAM的心肌纖維化；②在EAM,心肌成纖維細(xì)胞／肌纖維母細(xì)胞能否分泌HMGB1,可否作為另一高水平]HMGB1源頭；③HMGB1阻斷能否有效地防止EAM后期的心肌纖維化。此外,對可能參與自身免疫性心肌炎的免疫失調(diào)因素進(jìn)行了初步探討,包括Toll樣受體（TLR）及Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（Runx3）/CpG ODN對細(xì)胞增殖的影響,及其與IMGB1分泌或釋放的關(guān)系；妊娠相關(guān)疾病患者血清HMGB1的水平及作用。方法本研究所采用的試驗(yàn)方法包括：流式細(xì)胞分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)、Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、細(xì)胞培養(yǎng)和增殖試驗(yàn)（MTT）、細(xì)胞遷移試驗(yàn)以及組織病理學(xué)分析等。1.實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎小鼠模型的建立BALB/c小鼠,6-8周齡,由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買并在江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。本研究使用的所有動(dòng)物試驗(yàn)過程,均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理使用指南（美國國立衛(wèi)生研究院出版no.85-23,1996修訂）操作。小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎模型的誘導(dǎo)方法簡介如下：于0天和7天接種含有100ggMyHC-α（MyHC-α614-629; Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH）的1:1PBS/CFA乳化物。在接種的第54天,誘模小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后頸椎脫位處死,并取相關(guān)檢材進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)均獲江蘇大學(xué)研究與教學(xué)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。2.流式細(xì)胞儀分析研究選用了十五例慢性糖尿病患者、十四例妊娠糖尿病患者和十七例先兆子癇患者,年齡從19歲到41歲不等。經(jīng)免疫熒光染色后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析計(jì)數(shù)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中Thl7細(xì)胞的比率。3.熒光定量]PCR （qRT-PCR）應(yīng)用RT-qPCR方法,分別檢鋇TLR2、TLR4、TLR9、RAGE、HMGB1、Ⅰ/Ⅲ膠原（Col1/3）、骨橋蛋白（OPN）、Hlx、Runx3、MMP1和TIMP1/2的mRNA表達(dá)水平。4.免疫印跡Western blot檢測心肌成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞中膠原I、膠原]Ⅲ、P-PKC-β、p-EIK-1/2、f-erk-1/2和HMGB1的蛋白表達(dá)水平；同法檢測有或無CpG ODN誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中Runx3的蛋白表達(dá)水平。5. ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用于定量檢測慢性糖尿病患者、妊娠糖尿病和先兆子癇患者血漿中的干擾素γ、IL-17、IL-1β和高遷移率族蛋白l（HMGB1）的水平。6.細(xì)胞培養(yǎng)與增殖試驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)[31,32],取1-2周齡BALB/c小鼠,分離心臟成纖維細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM（含10%胎牛血清）被用于培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞。用MTT法檢測心肌成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞的增殖。同時(shí),MTT法也用于分析CpG ODN對Runx3基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長的影響。7.遷移試驗(yàn)遷移試驗(yàn)選用6孑LTranswell板與8-1m-pore-size聚碳酸酯過濾器。在有或無外源性HMGB1存在的條件下,分析心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的遷移作用。8.組織病理學(xué)分析HE染色方法用于觀察實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎模型的組織病理學(xué)改變；用Sirius red染色法檢測心肌纖維化；免疫熒光染色分析在脂多糖刺激下,心肌成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞分泌HMGB1的能力。9.統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)均顯示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。Student’s test或雙向方差分析用于評價(jià)組間差異的顯著性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5和／或SPSS11.5軟件,P值<0.05被認(rèn)為有意義。結(jié)果我們的研究結(jié)果表明：1.HMGB1可能直接導(dǎo)致心肌膠原沉積,這與PKCβ/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)；此外,在外部應(yīng)力下,心肌成纖維細(xì)胞／肌纖維母細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1;心臟成纖維細(xì)胞／肌纖維母細(xì)胞分泌的HMGB1,可通過PKCβ激活以自分泌方式導(dǎo)致心肌纖維化。在EAM小鼠,阻斷HMGB1能有效地改善心臟的纖維化。2.在外部壓力下,HMGB1可從心臟成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核穿梭至胞質(zhì)。本研究還表明,除免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和壞死細(xì)胞外,同樣作為心臟重要組成的心臟成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞,是否在EAM時(shí)也充當(dāng)HMGB1的重要來源。3.在妊娠相關(guān)疾病,升高的血漿HMGB1水平很有可能導(dǎo)致ILC的分化和隨后生產(chǎn)的IL-17。此外,在包括先兆子癇和妊娠糖尿病在內(nèi)的妊娠相關(guān)性疾病中,增高的IL-17表達(dá)水平可能產(chǎn)生于ILC3,并在失控性炎癥應(yīng)答時(shí)構(gòu)成胎兒流產(chǎn)的威脅。4. CpG ODN可顯著抑制A549細(xì)胞的增殖。在CpG ODN刺激A549細(xì)胞,Runx3的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均增多。CpG ODN對A549細(xì)胞增殖的抑制能力,在]Runx3基因siRNA轉(zhuǎn)染后受到明顯地控制。這一結(jié)果表明,TLR9活化和Runx3基因表達(dá)之間存在著密切的關(guān)系,也可能與HMGB1分泌有關(guān),需要進(jìn)一步證實(shí)。結(jié)論本研究表明,HMGB1可通過PKCβ/ERK1/2-依賴的信號(hào)通路直接導(dǎo)致心肌膠原沉積；在外界應(yīng)力下,心肌成纖維細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞分泌的HMGB1,通過激活PKCβ以自分泌的方式導(dǎo)致心臟的纖維化；封閉HMGB1都能有效地改善EAM小鼠的心肌纖維化。此外,在妊娠相關(guān)疾病的血漿中,HMGB1增高并可導(dǎo)致ILC的分化和隨后產(chǎn)生IL-17、TLR9活化與RUNX3基因表達(dá),參與某些細(xì)胞的生長調(diào)控,并推測可能與IMGB1的分泌相關(guān)。
Jieliang Chen,Min Wu,Kuancheng Liu,Wen Zhang,Yaming Li,Xiaohui Zhou,Lu Bai,Zhenghong Yuan[7]（2015）在《New insights into hepatitis B virus biology and implications for novel antiviral strategies》文中提出Hepatitis B virus（HBV）, a small DNA virus with a unique replication mode, can cause chronic hepatitis（CHB）, which is characterized by the persistence of the viral covalently closed circular DNA that serves as the template for HBV replication and the production of large amounts of secreted HBV surface antigen（HBs Ag） that is present in excess of the levels of infectious virus. Despite the success of currently approved antiviral treatments for CHB patients, including interferon and nucleotide analogs, which suppress HBV replication and reduce the risk of CHB-related liver diseases, these therapies fail to eradicate the virus in most of the patients. With the development of the cell and animal models for HBV study, a beter understanding of the HBV life cycle has been achieved and a series of novel antiviral strategies that target diferent stages of HBV replication have been designed to overcome the viral factors that contribute to HBV persistence. Such basic HBV research advancements and therapeutic developments are the subject of this review.
Si-Xue Liu,Zhong-Sheng Xia,Ying-Qiang Zhong[8]（2014）在《Gene therapy in pancreatic cancer》文中研究指明Pancreatic cancer（PC） is a highly lethal disease and notoriously difficult to treat. Only a small proportion of PC patients are eligible for surgical resection, whilst conventional chemoradiotherapy only has a modest effect with substantial toxicity. Gene therapy has become a new widely investigated therapeutic approach for PC.This article reviews the basic rationale, gene delivery methods, therapeutic targets and developments of laboratory research and clinical trials in gene therapy of PC by searching the literature published in English using the PubMed database and analyzing clinical trials registered on the Gene Therapy Clinical Trials Worldwide website（http://www. wiley.co.uk/genmed/ clinical）. Viral vectors are main gene delivery tools in gene therapy of cancer, and especially, oncolytic virus shows brighter prospect due to its tumor-targeting property.Efficient therapeutic targets for gene therapy include tumor suppressor gene p53, mutant oncogene K-ras,anti-angiogenesis gene VEGFR, suicide gene HSK-TK,cytosine deaminase and cytochrome p450, multiple cytokine genes and so on. Combining different targets or combination strategies with traditional chemoradiother-apy may be a more effective approach to improve the efficacy of cancer gene therapy. Cancer gene therapy is not yet applied in clinical practice, but basic and clinical studies have demonstrated its safety and clinical benefits. Gene therapy will be a new and promising field for the treatment of PC.
李芳芳[9]（2014）在《單鏈抗體融合人血清白蛋白的制備及對重癥肌無力患者血清的抑制作用》文中研究說明重癥肌無力（myasthenia gravis, MG）是累及神經(jīng)肌肉接頭處的某些成分而導(dǎo)致突觸后膜信號(hào)傳導(dǎo)障礙的一種自身免疫病,以反復(fù)出現(xiàn)的肌肉收縮無力,用力時(shí)惡化,休息后緩解為特征。在80%～85%的MG患者中,其主要的靶抗原是肌肉的乙酰膽堿受體（muscle acetylcholine receptor, AChR）。單鏈抗體（single-chain fragment variable, scFv）是由免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)（variable region of heavy chain, VH）和輕鏈可變區(qū)（variable region of light chain, VL）經(jīng)一條柔軟可彎曲的肽鏈連接而成。scFv完整的保留了抗原結(jié)合的能力,由于它沒有抗體的Fc段,因此不能激活補(bǔ)體。然而,scFv小分子的生理特點(diǎn)決定了它可以從體內(nèi)經(jīng)腎臟快速清除。scFv637是MG抗原特異性scFv,由人AChR a亞單位上67～76位氨基酸（即主要免疫原區(qū),main immunogenic region, MIR）組成。它可以結(jié)合MG患者血清中的抗MIR的自身抗體,從而保護(hù)人AChR,這使它有可能成為一種MG特異性免疫抑制治療劑。與scFv一樣,scFv637具有快速從血液中清除的缺點(diǎn)。因此,在本項(xiàng)研究中,我們將scFv637基因與半壽期較長的人血漿白蛋白（human serum albumin, HSA）基因連接,以延長scFv637的半壽期,增加其在血中的穩(wěn)定性。這使得scFv有可能成為MG的一種特異性免疫抑制劑。目的：制備單鏈抗體融合人血清白蛋白,以延長單鏈抗體的半壽期并增加其在血中的穩(wěn)定性,為重癥肌無力的免疫治療奠定基礎(chǔ)。方法：將scFv637與HSA基因連接后轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌（Pichia pastoris）中表達(dá)出融合蛋白scFv637-HSA。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)確定其分子量；通過免疫熒光試驗(yàn)檢測融合蛋白scFv637-HSA與人肋間肌AChR的結(jié)合情況；經(jīng)競爭性ELISA檢測融合蛋白抑制MG患者血清中的自身抗體與AChR的結(jié)合能力,以及融合蛋白在健康血清中的穩(wěn)定性。結(jié)果：融合蛋白在畢赤酵母菌中成功表達(dá),其分子量約為89kD；免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示,融合蛋白可以與人肋間肌神經(jīng)肌肉接頭處的AChR結(jié)合；經(jīng)12例MG患者血清檢測發(fā)現(xiàn),融合蛋白對AChR的抑制率為2%～77.4%；融合蛋白在靜態(tài)健康血清中可以維持大約3天。結(jié)論：成功制備出scFv-HSA融合蛋白,并且其保留了保護(hù)AChR的能力。這使得scFv-HSA融合蛋白有望成為一種特異性免疫抑制治療MG的手段。
王麗娟[10]（2014）在《薯蕷皂苷逆轉(zhuǎn)阿霉素多藥耐藥、增加甲氨蝶呤吸收的分子藥理學(xué)機(jī)制》文中研究說明多藥耐藥是癌癥化療成功的主要障礙,而癌細(xì)胞能對結(jié)構(gòu)各異機(jī)制不相關(guān)的藥物產(chǎn)生耐藥性,一個(gè)主要的原因就是多藥耐藥（multidrug resistance,MDR）,多藥耐藥和藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1（multidrug resistance 1,MDR1）過表達(dá)相關(guān)。MDR1是一個(gè)被多藥耐藥1基因編碼的170KD的膜糖蛋白,是ATP依賴的具有藥物外排功能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在腫瘤細(xì)胞中,MDR1泵出抗癌藥物導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性,NF-κB（nuclear factor κ-B,NF-κB）是作為轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)MDR1導(dǎo)致耐藥的蛋白復(fù)合物。NF-κB的激活需要IκB-α的磷酸化,即p-IκB-α（phosphorylation of inhibitor κB-α,p-IκB-α）顯著的增加導(dǎo)致 NF-κB 激活?？朔﨧DR1介導(dǎo)的耐藥性可以通過阻礙外排泵的功能和抑制它的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。因此,抑制MDR1介導(dǎo)的藥物外排將引起化療藥治療的多藥耐藥癌細(xì)胞的復(fù)敏,可以被認(rèn)為是對具有多藥耐藥癌癥患者的有效治療方法。目前,臨床上的一些抗癌藥如生物堿、蒽環(huán)類抗生素和表鬼臼毒素很容易產(chǎn)生多藥耐藥,因此急需開發(fā)有效的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。另外,大劑量甲氨蝶呤可以達(dá)到常規(guī)化療劑量、化療方案作用不到的盲區(qū)部位,從而提高化療的效果,但甲氨蝶呤具有潛在的細(xì)胞毒性,且劑量越大,出現(xiàn)不良反應(yīng)的機(jī)會(huì)越大,會(huì)引起胃腸道黏膜損傷,表現(xiàn)出惡心、脹氣、嘔吐、厭食、腹瀉和腹痛等癥狀,導(dǎo)致患者的體重下降和營養(yǎng)不良。甲氨蝶呤是MDR1的底物,尋找一種多藥耐藥的抑制劑,抑制MDR1,在降低甲氨蝶呤的劑量的同時(shí)提高甲氨蝶吟的小腸吸收,可以有效減輕甲氨蝶呤致消化道黏膜炎。薯蕷皂苷是一個(gè)天然藥物的有效成分,廣泛存在于一些藥用植物中,如穿龍薯蕷、盾葉薯蕷和山藥中,藥理學(xué)研究已證實(shí)這個(gè)化合物具有抗氧化、降脂、抗癌、保肝的作用,而且是合成甾體激素類藥物的重要原料,因此含此類成分生藥的應(yīng)用前景十分廣闊。多藥耐藥機(jī)制的研究依賴于對經(jīng)過選擇的且對廣譜抗癌藥存在交叉反應(yīng)性的癌細(xì)胞系的分析。已有研究結(jié)果證實(shí),薯蕷皂苷能逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞HepG2對阿霉素（adriamycin,ADR）的耐藥性,其在白血病和乳腺癌中對阿霉素的耐藥和甲氨蝶呤吸收的影響還未見報(bào)道。我們利用了一個(gè)阿霉素敏感的白血病細(xì)胞系（Human doxorubicin-sensitive erythroleukemic cells,K562 cells）、來源親本細(xì)胞 K562 的阿霉素耐藥的細(xì)胞系（Human doxorubicin-res的磷酸化抑制了 NF-κB的活性進(jìn)而下調(diào)了 MDR1的表達(dá)。istant erythroleukemic cells,K562/ADR cells）、表達(dá)分化的小腸細(xì)胞特征的細(xì)胞系（human colon adenocarcinoma cells,Caco-2 cells）、一個(gè)阿霉素敏感乳腺癌細(xì)胞系（human adriamycin-sensitive breast cancer cells,MCF-7 cells）、來源親本細(xì)胞MCF-7的阿霉素耐藥的細(xì)胞系（human adriamycin-resistant breast cancer cells,MCF-7/ADR cells）等腫瘤細(xì)胞模型和大鼠小腸來研究薯蕷皂苷對阿霉素耐藥和甲氨蝶呤吸收的影響,旨在闡明此效果及其分子藥理學(xué)機(jī)制即薯蕷皂苷對MDR1表達(dá)的影響及MDR1的表達(dá)和NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系。第一部分 薯蕷皂苷對人白血病細(xì)胞K562/ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)效果及分子藥理學(xué)機(jī)制目的:研究薯蕷皂苷對白血病細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)效果,探討薯蕷皂苷逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞多藥耐藥的分子藥理學(xué)機(jī)制。方法:以人紅白血病細(xì)胞系K562及其阿霉素耐藥細(xì)胞系K562/ADR為研究對象,采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍(lán)）（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphe-nyltetrazolium bromide,MTT）法檢測細(xì)胞毒性作用;以流式細(xì)胞術(shù)測定兩種細(xì)胞系內(nèi)薯蕷皂苷對阿霉素細(xì)胞內(nèi)蓄積的影響來反映薯蕷皂苷對MDR1外排功能的影響;Western Blotting檢測MDR1、phospho-IκB-α的蛋白表達(dá)水平;Quantitative PCR法檢測MDR1的mRNA表達(dá)水平;雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測MDR1和NF-κB啟動(dòng)子活性。結(jié)果:與K562細(xì)胞系相比,K562/ADR耐藥細(xì)胞系中MDR1的mRNA和蛋白均高表達(dá),且耐藥細(xì)胞中的阿霉素細(xì)胞內(nèi)潴留減少。薯蕷皂苷對K562和K562/ADR表達(dá)出大致相同的細(xì)胞毒性,由此計(jì)算出薯蕷皂苷無毒性的濃度即IC10（10%inhibiting concentration,IC10）為0.3 μM。此濃度的薯蕷皂苷顯著增加了阿霉素在耐藥細(xì)胞中的蓄積,導(dǎo)致阿霉素在耐藥細(xì)胞中的IC50（50%inhibiting concentration,IC50）值由42.4±2.6 μM減少到2.4±0.1 μM,即薯蕷皂苷顯著增加了阿霉素的細(xì)胞毒性,表明薯蕷皂苷通過增加阿霉素在耐藥細(xì)胞內(nèi)的蓄積增加了阿霉素的細(xì)胞毒性。而且,薯蕷皂苷呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性抑制了 K562/ADR細(xì)胞的MDR1的mRNA和蛋白的表達(dá),表明薯蕷皂苷通過抑制MDR1的表達(dá)增加了阿霉素的細(xì)胞內(nèi)蓄積進(jìn)而逆轉(zhuǎn)了阿霉素的耐藥。另外,薯蕷皂苷抑制了 MDR1和核因子NF-κB的啟動(dòng)子活性以及IκB-α的磷酸化,表明薯蕷皂苷通過抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB的活性進(jìn)而下調(diào)了 MDR1的表達(dá)。結(jié)論:薯蕷皂苷在白血病細(xì)胞K562/ADR中通過抑制NF-κB信號(hào)通路抑制了MDR1轉(zhuǎn)運(yùn)體,恢復(fù)阿霉素的敏感性,逆轉(zhuǎn)了白血病細(xì)胞的耐藥,表明薯蕷皂苷和阿霉素合用能有效提高白血病的治療效果,薯蕷皂苷可能是一個(gè)新的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑和潛在的腫瘤化療輔助劑。第二部分 薯蕷皂苷對甲氨蝶呤吸收的影響及其分子藥理學(xué)機(jī)制目的:研究薯蕷皂苷在體內(nèi)外對甲氨蝶呤吸收的增強(qiáng)效果,探討其分子藥理學(xué)機(jī)制。方法:利用MTT法分析薯蕷皂苷在Caco-2細(xì)胞對甲氨蝶呤細(xì)胞毒性的影響,Caco-2細(xì)胞雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)分析薯蕷皂苷對甲氨蝶呤轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,體外翻轉(zhuǎn)腸和原位腸灌注實(shí)驗(yàn)考察薯蕷皂苷對甲氨蝶吟體內(nèi)外吸收的影響,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（chromatography andem mass spectrometry,LC-MS/MS）方法測定生物樣品中甲氨蝶呤的濃度,大鼠小腸切片病理學(xué)檢查考察薯蕷皂苷對甲氨蝶呤誘導(dǎo)的腸道粘膜損傷的影響,Western blotting、Quantitative RT-PCR（Quantitive Real Time-polymerase chain reaction,Quantitative RT-PCR）、雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)等分子生物學(xué)技術(shù)考察薯蕷皂苷對甲氨蝶呤吸收影響的分子藥理學(xué)機(jī)制。結(jié)果:薯蕷皂苷在Caco-2細(xì)胞中72小時(shí)細(xì)胞毒性作用最明顯,72小時(shí)作為整個(gè)試驗(yàn)的檢測時(shí)間。用甲氨蝶呤和薯蕷皂苷處理72小時(shí)后,僅有甲氨蝶呤和薯蕷皂苷+甲氨蝶呤的IC50值分別是19.5±0.9 μM和7.7±0.1μM,也就是合用薯蕷皂苷減少了甲氨蝶呤的IC50值,表明薯蕷皂苷增加了甲氨蝶呤在Caco-2細(xì)胞的毒性。薯蕷皂苷還增加了甲氨蝶吟在吸收方向的轉(zhuǎn)運(yùn),減少了甲氨蝶吟在分泌方向的轉(zhuǎn)運(yùn),顯著抑制了 Caco-2細(xì)胞中MDR1的mRNA和蛋白的表達(dá),表明薯蕷皂苷通過抑制Caco-2細(xì)胞中MDR1的表達(dá),增加了甲氨蝶呤的吸收方向的轉(zhuǎn)運(yùn)。而且,薯蕷皂苷抑制了 MDR1和NF-κB啟動(dòng)子的活性以及IκB-α的磷酸化,表明薯蕷皂苷通過抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB信號(hào)通路,進(jìn)而下調(diào)了 MDR1的表達(dá),增加了甲氨蝶呤的轉(zhuǎn)運(yùn)。薯蕷皂苷體內(nèi)外通過下調(diào)MDR1的表達(dá)增加了甲氨蝶呤的小腸吸收。另外,盡管甲氨蝶呤吸收進(jìn)入了腸細(xì)胞,但沒有觀察到毒性的增加,而且,事實(shí)上,觀察到毒性減少了。結(jié)論:薯蕷皂苷通過抑制NF-κB信號(hào)通路抑制Caco-2細(xì)胞MDR1轉(zhuǎn)運(yùn)體,增加甲氨蝶吟吸收方向上的轉(zhuǎn)運(yùn),在大鼠中薯蕷皂苷通過抑制MDR1轉(zhuǎn)運(yùn)體,體內(nèi)外增加了甲氨蝶呤的小腸吸收,但沒有增加甲氨蝶呤誘導(dǎo)的腸道粘膜損傷,表明薯蕷皂苷在降低甲氨蝶呤劑量的同時(shí)可能提高其治療效果,其可能作為甲氨蝶呤吸收的多藥耐藥調(diào)節(jié)劑。第三部分 薯蕷皂苷對乳腺癌細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞的增敏效果及其分子藥理學(xué)機(jī)制目的:研究薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中對阿霉素活性的增敏效果及其分子藥理學(xué)機(jī)制。方法:利用MTT分析在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7及其耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR薯蕷皂苷本身的毒性及薯蕷皂苷對阿霉素活性的影響,Western blotting、Quantitative RT-PCR、雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)等分子生物學(xué)方法來檢測其分子藥理學(xué)機(jī)制。結(jié)果:薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50分別是6.5±0.4μM和7.3±0.2μM,即薯蕷皂苷對藥物敏感的親本乳腺癌細(xì)胞和多藥耐藥乳腺癌細(xì)胞具有大致相同的抗性,由此得出薯蕷皂苷對MCF-7/ADR和MCF-7細(xì)胞沒有毒性的濃度,即IC10,均為0.4±0.1μM。0.4μM的薯蕷皂苷分別將MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中IC50 值由 1.5±0.1μM 和 34.7±1.1μM 減少到 0.4±0.1 和 0.7±0.1μM,表明薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞均有增加阿霉素細(xì)胞毒性的效果。薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞均呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性抑制了 MDR1的mRNA和蛋白的表達(dá),表明薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞均是通過抑制MDR1增加阿霉素細(xì)胞內(nèi)的毒性。而且,薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞均抑制了 MDR1和NF-κB啟動(dòng)子的活性和IκB-α的磷酸化,表明薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞均通過抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而下調(diào)了 MDR1的表達(dá)增加了阿霉素細(xì)胞內(nèi)的毒性。結(jié)論:薯蕷皂苷通過抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體MDR1的表達(dá),增加了 MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中阿霉素的化學(xué)敏感性,表明薯蕷皂苷和阿霉素合用能有效提高乳腺癌的治療效果,這一發(fā)現(xiàn)為薯蕷皂苷作為化療輔助劑進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了又一有力的證據(jù)。
二、In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases（論文提綱范文）
（1）葡萄座腔菌內(nèi)一種新環(huán)狀RNA的鑒定與特性分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| LIST OF ABBREVIATIONS |
| CHAPTER 1 LITERATURE REVIEW |
| 1.1 Pear and fungal pathogens |
| 1.1.1 Pear is an important fruit in the world as well in china |
| 1.1.2 Botryosphaeria dothidea is a major fungal pathogen that infects pear and other fruit trees |
| 1.1.3 Mechanism of pathogenesis |
| 1.1.4 Management strategies for plant diseases |
| 1.2 Research progress in the field of circular RNAs |
| 1.2.1 Classification of circRNAs |
| 1.2.1.1 Endogenous circRNAs |
| 1.2.1.1.1 Discovery of endogenous circRNAs |
| 1.2.1.1.2 Identification of endogenous circRNAs |
| 1.2.1.1.3 Functions of endogenous circRNAs |
| 1.2.1.1.3.1 Specific functions related to a developmental stage |
| 1.2.1.1.3.2 Acting biomarkers |
| 1.2.1.1.3.3 Transporting functions |
| 1.2.1.1.3.4 Functions of circRNAs under the influence of biotic and abiotic stresses |
| 1.2.1.2 Viroids belongs to a class of exogenous circRNAs |
| 1.2.1.2.1 Discovery of viroids |
| 1.2.1.2.2 Structure of viroids |
| 1.2.1.2.3 Classification of viroids |
| 1.2.1.2.4 Replication strategy of viroids |
| 1.2.1.2.5 Biological functions of viroids |
| 1.2.1.2.5.1 Viroid infection influenced on the expression of host proteins |
| 1.2.1.2.5.2 Viroid infection role in gene silencing |
| 1.2.1.2.5.3 Potential targets of viroid-derived s RNAs |
| 1.3 Detection techniques |
| 1.4 Fungi modulated by mycoviruses and circRNAs |
| 1.5 Objectives of the study |
| CHAPTER 2 SCREENING,IDENTIFICATION,AND VALIDATION OF BDCR12944 |
| 2.1 Introduction |
| 2.2 Materials and methods |
| 2.2.1 Fungal strains,cultural conditions,and virulence assays |
| 2.2.2 RNA extraction and synthesis of cDNA |
| 2.2.3 RNA sequencing data analysis of XA-3 for the diversity of hypothetical circRNAs |
| 2.2.4 Designing and synthesis of primers |
| 2.2.5 Amplification of cDNA,cloning,and sequencing |
| 2.2.6 Cloning in pGEM-T vector and sequencing |
| 2.2.7 In vitro transcription of monomer BdCR12944 RNAs and chemical labeling of RNA probes |
| 2.2.8 Enzymatic treatment of BdCR12944 to confirm nature of RNA |
| 2.2.9 Prediction of BdCR12944 secondary structure |
| 2.2.10 Northern blot hybridization to confirm in vivo replication of BdCR12944 |
| 2.2.11 Two-dimensional gel combined northern blot hybridization analysis to confirm the circular nature of BdCR12944 |
| 2.2.12 Statistical analysis |
| 2.3 Results |
| 2.3.1 Fungal strains morphology and virulence |
| 2.3.2 RNA sequencing data analysis of XA-3 for the diversity of hypothetical circRNAs |
| 2.3.3 Screening and detection of circRNAs |
| 2.3.4 In vitro transcription of monomer BdCR12944 RNAs and chemical labeling of RNA probes |
| 2.3.5 Enzymatic treatment of BdCR12944 to confirm nature of RNA |
| 2.3.6 Prediction of BdCR12944 secondary structure |
| 2.3.7 Confirmation and validation of the in vivo self-replication and circularity of BdCR12944 in natural host XA-3 |
| 2.4 Discussion |
| CHAPTER 3 IMPACT OF BDCR12944 ON THE BIOLOGICAL TRAITS OF TRANSFECTED FUNGAL ISOLATES |
| 3.1 Introduction |
| 3.2 Materials and methods |
| 3.2.1 Fungal strains and growing conditions |
| 3.2.2 RNA extraction and cDNA synthesis |
| 3.2.3 Synthesis of chemical labeled RNA probes and infectious dimer RNA of BdCR12944 |
| 3.2.4 Protoplasts preparation |
| 3.2.5 In vitro transfected fungal protoplasts with in vitro dimerized and transcribed BdCR12944 by PEG-mediated transformation |
| 3.2.6 Identification and confirmation of in vitro transfected isolates |
| 3.2.6.1 RT-PCR analysis for the detection of transfected isolates |
| 3.2.6.2 Dot blot hybridization analysis for the detection of transfected isolates |
| 3.2.6.3 RT-qPCR analysis for the titer of BdCR12944 in transfectants |
| 3.2.7 Biological characterization of BdCR12944 transfected isolates of MAO-2 |
| 3.2.8 Assessment of autonomous replication of BdCR12944 |
| 3.2.9 Statistical analysis |
| 3.3 Results |
| 3.3.1 Synthesis of infectious RNA of BdCR12944 |
| 3.3.2 Confirmation of BdCR12944 infectious RNA transfection in MAO-2 |
| 3.3.2.1 Dot blot hybridization for the detection of successful transfection |
| 3.3.2.2 RT-qPCR analysis for the titer of BdCR12944 in transfectants |
| 3.3.3 Impact of BdCR12944 on phenotype,growth rate,and biomass production |
| 3.3.4 Effect of the chemical stressors on phenotype and growth rate of transfectants |
| 3.3.4.1 Response of transfectants against cell wall disruption with0.04%SDS |
| 3.3.4.2 Response of transfectants against osmotic stress with0.5 M/L CaCl_2 |
| 3.3.4.3 Response of transfectants against osmotic stress with1 M/L glucose |
| 3.3.4.4 Response of transfectants against osmotic stress with1.5 M/L NaCl |
| 3.3.4.5 Response of transfectants against osmotic stress with1 M/L KCl |
| 3.3.4.6 Response of transfectants against oxidative stress with 0.05% H_2O_2 |
| 3.3.5 Impact of BdCR12944 on virulence |
| 3.3.6 Assessment of autonomous replication of BdCR12944 |
| 3.3.6.1 Dot blot hybridization for the detection of autonomous replication of BdCR12944 |
| 3.3.6.2 RT-qPCR analysis for the titer of BdCR12944 in sub-isolates |
| 3.4 Discussion |
| CHAPTER 4 BDCR12944 CAN INFECT NON-HOST PHYTOPATHOGENIC FUNGI AND PLANTS |
| 4.1 Introduction |
| 4.2 Materials and methods |
| 4.2.1 Fungal strains,plant materials,and growing conditions |
| 4.2.2 RNA extraction |
| 4.2.3 Synthesis of chemical labeled RNA probes and infectious dimer RNA of BdCR12944 |
| 4.2.4 Protoplasts preparation |
| 4.2.5 In vitro transfected fungal protoplasts with in vitro dimerized and transcribed BdCR12944 by PEG-mediated transformation |
| 4.2.6 In vitro inoculation of MAO-2,transfectant-12 and BdCR12944 infectious RNA on N.benthamiana plants |
| 4.2.6.1 Horizontal transformation of BdCR12944 from infected N.benthamiana plants to pathogenic fungi |
| 4.3 Results |
| 4.3.1 BdCR12944 can infect non-host fungi |
| 4.3.2 BdCR12944 can infect model plant N.benthamiana |
| 4.3.2.1 Horizontal transformation of BdCR12944 from infected N.benthamiana plants to pathogenic fungi |
| 4.4 Discussion |
| CHAPTER 5 TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF TRANSFECTED STRAIN WITH BDCR12944 |
| 5.1 Introduction |
| 5.2 Materials and methods |
| 5.2.1 Fungal strains and growing conditions |
| 5.2.2 RNA extraction,quantification,and qualification |
| 5.2.3 Library preparation for transcriptome sequencing |
| 5.2.4 Clustering and sequencing |
| 5.2.5 Transcriptomic raw data analysis |
| 5.2.5.1 Quality control |
| 5.2.5.2 Read mapping to the reference genome |
| 5.2.5.3 Novel genes prediction |
| 5.2.5.4 Quantification of gene expression level |
| 5.2.5.5 Differential expression analysis |
| 5.2.5.6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes |
| 5.2.5.7 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes |
| 5.2.5.8 RT-qPCR validation of down-regulated differentially expressed genes |
| 5.2.6 Statistical analysis |
| 5.3 Results |
| 5.3.1 Quality control |
| 5.3.2 Read mapping to the reference genome |
| 5.3.3 Differentially expressed genes |
| 5.3.4 Differentially expressed genes and their pathways |
| 5.3.5 RT-qPCR validation of down-regulated differentially expressed genes |
| 5.4 Discussion |
| CHAPTER 6 SUMMARY,CONCLUDING REMARKS AND FUTURE PROSPECTS |
| 6.1 Summary |
| 6.2 Advantages or achievements and shortcomings of the study |
| 6.2.1 Advantages or achievements |
| 6.2.2 Limitation or shortcomings |
| 6.3 Concluding remarks and future prospects |
| REFERENCES |
| APPENDIX |
| Appendix-Ⅰ.Preparation of reagents used in this study |
| Appendix-Ⅱ.Primer sets used in this study |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
| LIST OF PUBLICATION |
（2）S100A10調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移和增殖的機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符號(hào)說明 |
| 第一部分 S100A10在早期胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 第二部分 S100A10促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 第三部分 S100A10通過調(diào)控糖酵解促進(jìn)胃癌增殖的機(jī)制研究 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 S100A10與惡性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄 |
| 學(xué)位論文評閱及答辯情況表 |
| 英語論文1 |
| 英語論文2 |
（3）IGF2BP2（IMP2）是小鼠早期合子基因組激活的關(guān)鍵調(diào)控因子（論文提綱范文）
| Abstract in Chinese |
| Abstract in English |
| Symbol description |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| Conclusion |
| References |
| Acknowledgements |
| Catalogue of Publications |
| 學(xué)位論文評閱及答辯情況表 |
| 附件 |
（4）乳腺癌血清腫瘤標(biāo)志物適配體的篩選及其檢測（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| List of Abbreviations |
| CHAPTER 1 INTRODUCTION |
| 1.1 BACKGROUND AND MOTIVATION |
| CHAPTER 2 LITERATURE REVIEW |
| 2.1 BREAST CANCER FACTS: |
| 2.2 BREAST CANCER OCCURRENCE |
| 2.3 SYMPTOMS |
| 2.4 SCREENING: |
| 2.5 SERUM TUMOR MARKERS AND APTAMER SENSING DETECTION |
| 2.6 SELEX TECHNOLOGY TO GENERATE NUCLEIC ACID APTAMERS |
| 2.7 HISTORY AND THEORETICAL BACKGROUND |
| 2.7.1 In Vitro Selection of Functional Oligonucleotides and the Origins of Biochemical Activity |
| 2.7.2 A Brief History of In Vitro Selection |
| 2.7.3 Lessons from the Aptamers, Ribozymes, Deoxy ribozymes Generated by In Vitro Selection |
| 2.7.4 Synthetic Approaches to Understanding the Natural Origins of Function |
| 2.8 SOME NON-CLASSICAL APPROACHES OF APTAMERS SELECTION |
| 2.9 THE RECENT PROGRESS OF SOME MODERN-APPROACHES OF APTAMERS SELECTION |
| 2.9.1 Libraries Optimization for Aptamer Selection |
| 2.9.2 Primer sites reduction |
| 2.9.3 The methods of in-vitro selection |
| 2.9.4 SELEX-on-a-chip |
| 2.9.5 Other Optional separation methods |
| 2.10 A NEW ASSAY FOR APTAMER DETERMINATION BY USING NGS |
| 2.10.1 Determination of high quality of resolution |
| 2.10.2 Determination in Precocious selection round |
| 2.10.3 Aptamer and Sequence Clustering Assays |
| 2.11 APTAMERS: CURRENT CHALLENGES AND FUTURE PROSPECTS |
| CHAPTER 3 MATERIALS AND METHODS |
| 3.1. MATERIALS |
| 3.2 METHODS |
| 3.2.1 Serum collection and processing |
| 3.2.2 Brest cancer serum-magnetic beads combination and combined serum-magnetic beads treatment |
| 3.2.3 Brest cancer serum proteins screening aptamers |
| 3.2.4 Ds DNA library Preparation |
| 3.2.5 Ss DNA library Preparation |
| 3.2.5.1 Quantitive real time PCR for ssDNA production: |
| 3.2.5.2 Polyacrylamide Gel electrophoresis for ssDNA library Preparation and ss DNA purification |
| 3.2.6 SsDNA library concentration detection |
| 3.2.7 Specificity detection for the ss DNA combined to target protein |
| 3.2.7.1 Gel electrophoresis (PAGE) test |
| 3.2.7.2 Real time quantitative PCR method |
| CHAPTER 4 RESULTS, DISCUSSION AND CONCLUSION |
| 4.1 RESULTS |
| 4.1.1 Brest cancer serum proteins-aptamer screening results |
| 4.1.1.1 Quantitive Real time PCR Result for First and second Rounds of Screening |
| 4.1.1.2 Quantitive Real time PCR Result for Fourth Round of Screening |
| 4.1.1.3 Quantitive Real time PCR Result for 5th Round of Screening |
| 4.1.1.4 Quantitive Real time PCR Result for 9th Round of Screening |
| 4.1.2 SsDNA secondary library preparation |
| 4.1.3 Sequencing |
| 4.2 DISCUSSION |
| 4.3 CONCLUSION AND FUTURE WORK |
| REFERENCES |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
| LIST OF PUBLICATIONS |
（5）新型細(xì)胞因子IL-39（IL-23p19/Ebi3）的鑒定及其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的功能研究（論文提綱范文）
| 縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 IL-39(p19/E-bi3)的鑒定及信號(hào)通路的研究 |
| (一) 材料與方法 |
| (二) 結(jié)果 |
| (三) 小結(jié) |
| (四) 討論 |
| 第二部分 分泌IL-39的B細(xì)胞鑒定 |
| (一) 材料與方法 |
| (二) 結(jié)果 |
| (三) 小結(jié) |
| (四) 討論 |
| 第三部分 IL-39在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的功能研究 |
| (一) 材料與方法 |
| (二) 結(jié)果 |
| (三) 小結(jié) |
| (四) 討論 |
| 第四部分 IL-39在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中促炎作用的機(jī)制分析 |
| (一) 材料與方法 |
| (二) 結(jié)果 |
| (三) 小結(jié) |
| (四) 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 |
| 附錄 |
| 附發(fā)表論文 |
| 個(gè)人簡介 |
| 致謝 |
（6）HMGB1參與EAM心肌纖維化的機(jī)制及對固有免疫細(xì)胞功能的影響（論文提綱范文）
| ABSTRACT |
| 摘要 |
| CHAPTER 1 GENERAL REVIEW(BACKGROUND) |
| 1.1 MYOCARDITIS:THE DISEASE |
| 1.1.1 Causes and Epidemiology of Myocarditis |
| 1.1.2 The structure of the Human Heart |
| 1.1.3 Cells of the Heart |
| 1.1.3.1 Cardiac fibroblast cells |
| 1.1.3.1.1 Origin and organization of Cardiac fibroblast |
| 1.1.3.1.2 Proteins expressed on Cardiac fibroblast cells |
| 1.1.3.1.2.1 FSP1 |
| 1.1.3.1.2.2 α-SMA |
| 1.1.3.1.2.3 DDR1 and DDR2 |
| 1.1.3.1.2.4 Periostin |
| 1.1.3.2 Cardiomyocytes |
| 1.1.3.3 Cardiac Endothelial cells |
| 1.2. ANIMAL MODEL:EXPERIMENTAL AUTOIMMUNE MYOCARDITIS |
| 1.2.1 Suppressor Cellular Therapies in Myocarditis |
| 1.3 IMMUNE RESPONSES |
| 1.3.1 Innate Immunity |
| 1.3.1.1 Dendritic cells |
| 1.3.1.2 Macrophages |
| 1.3.1.3 Neutrophils |
| 1.3.2 Adaptive Immunity |
| 1.3.2.1 Th1 & Th2 |
| 1.3.2.2 Th17 |
| 1.3.2.3 Th22 |
| 1.3.2.4 T regulatory Cells |
| 1.3.2.5 B cells |
| 1.3.3 Cardiac fibroblast cells,dendritic cells,macrophages and CD4+T cells in myocarditis |
| 1.4 MYELOID-DERIVED SUPPRESSOR CELLS |
| 1.4.1 Origin and subsets of MDSCs |
| 1.4.2 Transcription factors relating to MDSC |
| 1.4.3 MDSC Activation and Expansion |
| 1.4.4 Suppressive Activity of MDSC |
| 1.4.5 MDSC in Experimental Autoimmune myocarditis |
| 1.5 STATEMENT OF PROBLEM,HYPOTHESIS AND EXPERIMENTAL DESIGN |
| 1.6 OBJECTIVES OF THE STUDY |
| 1.6.1 Specific Aim 1 |
| 1.6.2 Specific Aim 2 |
| 1.6.3 Specific Aim 3 |
| CHAPTER 2 UP-REGULATED HIGH MOBILITY GROUP BOX-1 IN EXPERIMENTAL AUTOIMMUNEMYOCARDITIS(EAM)DIRECTLY LED TO COLLAGEN DEPOSITION BY A PKCB/ERK1/2-DEPENDENT PATHWAY |
| 2.1 Introduction |
| 2.2 MATERIALS AND METHODS |
| 2.2.1 Experimental apparatus and materials |
| 2.2.2 Methods |
| 2.2.2.1 Cardiac fibroblasts isolation,culture and treatment |
| 2.2.2.2 RT-qPCR Assay |
| 2.2.2.3 Western blot analysis |
| 2.2.2.4 Histopathology |
| 2.2.2.5 Migration experiments |
| 2.2.2.6 MTT assay |
| 2.2.2.7 Statistical analysis |
| 2.3 RESULTS |
| 2.3.1 HMGB1 could directly lead to cardiac collagen deposition of cardiac fibroblasts/myofibroblasts by a PKCβ/Erk1/2-dependent signalling pathway |
| 2.3.2 Cardiac collagens deposition accompanying HMGB1 up-regulation and HMGB1 blockade ameliorated cardiac fibrosis in EAM mice |
| 2.4 DISCUSSION |
| CHAPTER 3 CARDIAC FIBROBLAST/MYOFIBROBLAST MIGHT BE ANOTHER SOURCE OF HMGB1 |
| 3.1 INTRODUCTION |
| 3.2 MATERIALS AND METHODS |
| 3.2.1 Mice |
| 3.2.2 Experimental methods |
| 3.2.2.1 Cardiac fibroblasts isolation,culture and treatment |
| 3.2.2.2 RT-qPCR Assay |
| 3.2.2.3 Western blot analysis |
| 3.2.2.4 Migration experiments |
| 3.2.2.5 MTT assay |
| 3.2.2.6 siRNA experiment in cardiac fibroblasts/myofibroblasts |
| 3.2.2.7 Statistical analysis |
| 3.3 RESULTS |
| 3.3.1 External stress could up-regulate HMGB1 expression of cardiac fibroblasts/myofibroblasts |
| 3.3.2 HMGB 1,secreted by cardiac fibroblast/myofibroblast under external stress,up-regulated Col1,Col3 and OPN expression via PKCβ activation by autocrine means |
| 3.4 DISCUSSION |
| CHAPTER 4 CPG-OLIGODEOXYNUCLEOTIDES SUPPRESS THE PROLIFERATION OF A549 LUNGADENOCARCINOMA CELLS VIA TOLL-LIKE RECEPTOR 9 SIGNALING ANDUPREGULATION OF RUNT-RELATED TRANSCRIPTION FACTOR 3 EXPRESSION |
| 4.1 INTRODUCTION |
| 4.2 MATERIALS AND METHODS |
| 4.2.1 Experimental apparatus and materials |
| 4.2.2 Expeiimental methods |
| 4.2.2.1 Cell culture |
| 4.2.2.2 Reverse transcription-PCR(RT-PCR) and quantitative PCR(qPCR) |
| 4.2.2.3 Western blot analysis |
| 4.2.2.4 Design of Runx3 siRNA |
| 4.2.2.5 Transfection of Runx3 siRNA |
| 4.2.2.6 Proliferation assay |
| 4.2.2.7 Statistical analysis |
| 4.3 RESULTS |
| 4.3.1 EXPRESSION OF RUNX3 IN CPG-ODN-INDUCED A549 CELLS |
| 4.3.2 INHIBITORY EFFECT OF SIRNA ON RUNX3 EXPRESSION IN A549 CELLS |
| 4.3.3 Effect of Runx3 siRNA transfection on the proliferation of A549 cells stimulated by CpG-ODN |
| 4.4 DISCUSSION |
| CHAPTER 5 IL-17 PRODUCING INNATE LYMPHOID CELLS 3(ILC3)BUT NOT TH17 CELLS MIGHTBE THE POTENTIAL DANGER FACTOR FOR PREECLAMPSIA AND OTHER PREGNANCYASSOCIATED DISEASES |
| 5.1 INTRODUCTION |
| 5.2 MATERIALS AND METHODS |
| 5.2.1 Experimental apparatus and materials |
| 5.2.2 Patients |
| 5.2.3 Experimental methods |
| 5.2.3.1 Cell preparation |
| 5.2.3.2 Flow cytometry |
| 5.2.3.3 Lymphocyte cell counts |
| 5.2.3.4 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) |
| 5.3 RE-SULTS |
| 5.3.1 Characteristics of Pregnant women enrolled for the study |
| 5.3.2 Elevated Lymphocyte counts among the PE,CD and GD patients |
| 5.3.3 Increased IFN-γ,IL-17,IL-1β and HMGB1 in plasma from PE,CD and GD patients |
| 5.3.4 IL-17 producing ILCs 3 not Th17 cells might be a potential danger factor for PE,CD and GD patients |
| 5.4 DISCUSSION |
| CHAPTER 6 |
| 6.1 MAIN CONCLUSIONS |
| 6.2 MAIN INNOVATIONS |
| 6.3 RESEARCH PROSPECTS |
| REFERENCES |
| PUBLICATIONS |
| LIST OF ABBREVIATIONS |
| LIST OF FIGURES |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
（8）Gene therapy in pancreatic cancer（論文提綱范文）
| INTRODUCTION |
| STRATEGIES FOR GENE THERAPY |
| Gene replacement |
| Gene modification |
| Gene augmentation |
| Gene blockade |
| METHODS FOR GENE DELIVERY |
| Ex vivo delivery |
| In vivo delivery |
| VECTOR SYSTEMS FOR GENE DELIVERY |
| Non-viral vector systems |
| Physical delivery |
| Chemical vectors |
| Biological vectors |
| Viral vector systems |
| Target genes and efficacy |
| Tumor suppressor genes |
| Drug sensitivity genes/suicide genes |
| HSV-TK/ganciclovir |
| CD/5-fluorocytosine (5-FC) |
| Nitroreductase/CB1954 |
| Cytochrome P450/cyclophosphamide |
| ANTI-ANGIOGENESIS GENES |
| Soluble VEGFR |
| Soluble fibroblast growth-factor receptors (FGFRs) |
| Endostatin (ES) , thrombospondin-1 (TSP-1) , angiostatin (AS) and vasostatin |
| NK4 |
| Matrix metalloproteinase (MMP) inhibitors |
| Somatostatin (SST) receptors (SSTRs) |
| IMMUNE RELATED GENES |
| MHC molecules and co-stimulatory molecules |
| Inflammatory cytokines |
| Tumor antigens |
| APOPTOSIS RELATED GENES |
| ONCOGENES |
| K-ras |
| LSM1 |
| HER-2/Erb B-2 |
| MULTIDRUG RESISTANCE GENES |
| PROLIFERATION RELATED GENES |
| VEGF |
| Human telomerase reverse transcriptase |
| COX-2 |
| Clinical research of gene therapy |
| Conclusions and prospects |
（9）單鏈抗體融合人血清白蛋白的制備及對重癥肌無力患者血清的抑制作用（論文提綱范文）
| Abbreviations |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| Chapter 1 Introduction |
| 1.1 Myasthenia gravis |
| 1.2 Acetylcholine receptor |
| 1.3 Single-chain fragment variable |
| 1.3.1 Constrction of scFv |
| 1.3.2 Expression of scFv |
| 1.3.3 Application of scFv |
| 1.4 Single-chain fragment variable 637 |
| Chapter 2 Materials |
| 2.1. Bacteria and yeast strains |
| 2.2 Vector |
| 2.3 Others |
| 2.4 Reagents |
| 2.5 Instruments |
| 2.6 Culture media |
| 2.7 Solutions |
| Chapter 3 Methods |
| 3.1 Construction of recombination plasmid |
| 3.1.1 Construction of plasmid pHEN2-scFv637-HSA |
| 3.1.2 Construction of plasmid pPIC9K-scFv637-HSA |
| 3.2 Expression of plasmid pPIC9K-scFv637-HSA in Pichia pastoris |
| 3.2.1 Electroporation |
| 3.2.2 PCR analysis of positive transformants |
| 3.2.3 Selection of positive transformants |
| 3.3 Expression and screening of scFv637-HSA |
| 3.3.1 Expression of scFv637-HSA |
| 3.3.2 Screening of scFv637-HSA |
| 3.4 Immunofluorescence staining of scFv637-HSA in human intercostal muscle |
| 3.4.1 Preparation of frozen section |
| 3.4.2 Immunofluorescence staining |
| 3.5 Inhibition of scFv637-HSA on the binding of MG patient sera to hAChR |
| 3.6 Stability of scFv637-HSA in static heathy sera |
| 3.7 Statistical analysis |
| Chapter 4 Results |
| 4.1 Construction of scFv637-HSA |
| 4.2 Determination of scFv637-HSA |
| 4.3 Selection of multicopy strains by G418 |
| 4.4 Expression of fusion protein |
| 4.5 Detection of fusion protein |
| 4.6 Binding of scFv637-HSA to AChR in human intercostal muscle |
| 4.7 Inhibition of scFv637-HSA in MG patient sera |
| 4.8 Stability of scFv637-HSA in static healthy sera |
| 附圖 |
| Chapter 5 Discussion |
| Conclusions |
| References |
| 致謝 |
| 攻讀博士學(xué)位期間的科研業(yè)績 |
| 綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
（10）薯蕷皂苷逆轉(zhuǎn)阿霉素多藥耐藥、增加甲氨蝶呤吸收的分子藥理學(xué)機(jī)制（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分: 薯蕷皂苷對人白血病細(xì)胞K562/ADR多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)效果及分子藥理學(xué)機(jī)制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 藥品與試劑 |
| 1.2 儀器 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.3 細(xì)胞活性的測定 |
| 2.4 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.5 Western Blotting |
| 2.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性分析 |
| 2.7 薯蕷皂苷對阿霉素細(xì)胞內(nèi)蓄積的影響 |
| 2.8 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 結(jié)果 |
| 3.1 K562和K562/ADR細(xì)胞的特征 |
| 3.2 薯蕷皂苷的細(xì)胞毒性 |
| 3.3 薯蕷皂苷對阿霉素細(xì)胞毒性的影響 |
| 3.4 薯蕷皂苷對K562/ADR細(xì)胞MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 |
| 3.5 薯蕷皂苷對阿霉素細(xì)胞內(nèi)積累的影響 |
| 3.6 薯蕷皂苷對NF-κB信號(hào)通路的影響 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 第二部分: 薯蕷皂苷體對甲氨蝶呤吸收的影響及其分子藥理學(xué)機(jī)制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 藥品與試劑 |
| 1.2 儀器 |
| 1.3 動(dòng)物及細(xì)胞 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.3 細(xì)胞活性測定 |
| 2.4 經(jīng)上皮轉(zhuǎn)運(yùn)研究 |
| 2.5 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.6 Western Blotting |
| 2.7 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性分析 |
| 2.8 大鼠空腸和回腸翻轉(zhuǎn)液囊的制備 |
| 2.9 組織學(xué)檢查 |
| 2.10 原位腸灌注研究 |
| 2.11 LC-MS/MS分析 |
| 2.12 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 結(jié)果 |
| 3.1 薯蕷皂苷對甲氨蝶呤Caco-2細(xì)胞毒性的影響 |
| 3.2 薯蕷皂苷對甲氨蝶吟經(jīng)Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)影響 |
| 3.3 薯蕷皂苷對Caco-2的MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 |
| 3.4 薯蕷皂苷對Caco-2細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路的影響 |
| 3.5 薯蕷皂苷在大鼠翻轉(zhuǎn)腸中對甲氨蝶呤吸收的影響 |
| 3.6 薯蕷皂苷對大鼠小腸的MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 |
| 3.7 小腸組織病理學(xué) |
| 3.8 原位腸灌注中薯蕷皂苷對甲氨蝶呤吸收的影響 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 第三部分: 薯蕷皂苷對乳腺癌細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞的增敏效果及其分子藥理學(xué)機(jī)制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 藥品與試劑 |
| 1.2 儀器 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.3 細(xì)胞活性的測定 |
| 2.4 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.5 Western Blotting |
| 2.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性分析 |
| 2.7 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 結(jié)果 |
| 3.1 薯蕷皂苷對MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞毒性的影響 |
| 3.2 薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞對阿霉素毒性的影響 |
| 3.3 薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞對MDR1基因和蛋白表達(dá)的影響 |
| 3.4 薯蕷皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞對NF-κB信號(hào)通路的影響 |
| 3.5 薯蕷皂苷對MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中NF-kIB信號(hào)通路的影響 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 個(gè)人簡介 |
| 致謝 |
四、In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]葡萄座腔菌內(nèi)一種新環(huán)狀RNA的鑒定與特性分析[D]. Muhammad Umer. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2021(02)
- [2]S100A10調(diào)控胃癌轉(zhuǎn)移和增殖的機(jī)制研究[D]. 李妍. 山東大學(xué), 2021(11)
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