一、精細突變小鼠模型的研究進展（論文文獻綜述）
楊韌[1]（2021）在《MERS-CoV與SARS-CoV-2亞單位疫苗與核酸疫苗研究》文中研究說明冠狀病毒（Coronavirus）是一類含包膜結構的單股正鏈非節(jié)段的RNA病毒,廣泛分布于多種哺乳動物宿主中,具有跨種傳播能力。目前已知感染人類的冠狀病毒有7種,其中嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）與 201 9 新型冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三種高致病人感染冠狀病毒,在不同地區(qū)國家都曾造成嚴重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中東地區(qū)發(fā)現(xiàn),2015年曾在韓國引發(fā)嚴重疫情,而至今依舊在部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)偶發(fā)病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依舊沒有得到有效的控制。然而,針對幾種高危冠狀病毒,目前尚無特效治療性藥物。因此,開發(fā)安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亞單位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生產(chǎn)制備研發(fā)等良好特點。本文基于前期的研究結果,使用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)制備了基于MERS-CoV S蛋白RBD結構域的亞單位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠體內評價了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重組RBD蛋白設計制備了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗與自擴增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠體內對兩種RNA疫苗的免疫原性進行初步的評價。COVID-19疫情早期,我們設計了密碼子優(yōu)化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗與mRNA疫苗,其中mRNA疫苗與上海斯微公司合作研制。兩種核酸疫苗在不同品系小鼠內進行免疫應答研究,并進行攻毒保護實驗,探究疫苗的保護性。具體研究內容如下:1.MERS-CoV RBD重組亞單位疫苗和mRNA疫苗的設計與免疫原性研究MERS-CoVRBD偶聯(lián)不同三聚體基序在CHO細胞表達制備的蛋白具有不同的聚集傾向,偶聯(lián)T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚體為主二聚體為輔的高聚集態(tài)。重組蛋白RBD-T4f配合鋁佐劑或鋁佐劑聯(lián)合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠內誘導高滴度中和活性的抗體,不同佐劑的使用在細胞免疫水平表現(xiàn)有所差異。重組蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐劑滴鼻免疫可以有效誘導系統(tǒng)性及呼吸道局部免疫應答,在血液及呼吸道黏膜均可檢測到高滴度的中和活性抗體,并可在肺組織局部檢測到的高水平特異性細胞免疫應答。重組抗原RBD-T4f序列插入體外轉錄載體,通過酶促反應制備了重組抗原的mRNA與saRNA疫苗。研究同時對SFV4骨架saRNA的體外轉錄反應進行優(yōu)化,成功制備了完整專一的長鏈saRNA分子,優(yōu)化后的saRNA進入小鼠體內后可以持續(xù)表達目的蛋白至少11天。使用LPP技術包裹的重組抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以誘導抗原特異性IgM應答,兩次免疫可以誘導特異性IFN-γ分泌細胞,高劑量三次免疫可以誘導一定水平的中和活性抗體產(chǎn)生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫兩次后可誘導高水平的細胞免疫應答,但難以誘導產(chǎn)生體液免疫應答。2.SARS-CoV-2 DNA與mRNA核酸疫苗免疫原性與保護效果研究研究對SARS-CoV-2 S蛋白序列進行人源細胞密碼子優(yōu)化,基于該序列設計制備了 DNA疫苗與化學修飾的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附電穿孔免疫部署后,可以有效誘導具有中和活性的特異性體液免疫應答,并誘導高水平Th1偏向的特異性細胞免疫。高劑量兩次免疫后可產(chǎn)生攻毒保護效果。mRNA使用LPP技術包裹后物理穩(wěn)定性良好,該方法生產(chǎn)的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可誘導產(chǎn)生高滴度的中和抗體,且具有一定的廣譜中和性,可中和多種突變株病毒。高劑量兩次免疫后,高水平的中和抗體與Th1偏向的細胞免疫記憶可保持13周。SARS-CoV-2攻擊后,高劑量單次與兩次免疫的C57BL/6小鼠肺組織病毒滴度顯著降低,并有效緩解炎癥病變;高或低劑量兩次免疫的BALB/c小鼠也表現(xiàn)出相似良好的攻毒保護效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表現(xiàn)出良好的免疫原性,誘導高滴度廣譜中和抗體,并產(chǎn)生攻毒保護效果。綜上所述,本研究使用CHO制備的MERS-CoVRBD-T4f重組抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以誘導高滴度的中和抗體,配合合適的佐劑可以用于傳統(tǒng)疫苗及黏膜疫苗的制備?；谥亟M抗原RBD-T4f設計的mRNA與saRNA疫苗誘導體液免疫能力相對有限,但可以誘導高水平的特異性細胞免疫應答?；赟ARS-CoV-2 S蛋白優(yōu)化序列的DNA疫苗與含化學修飾的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可誘導高滴度的中和抗體及高水平的Th1型細胞免疫應答。合適的免疫劑量與方案可以誘導足夠強的免疫應答,產(chǎn)生攻毒保護效果。這些研究為冠狀病毒的疫苗研發(fā)及應用奠定了理論基礎。
李晶文[2]（2021）在《EPHA4敲除對大鼠心臟形態(tài)和功能的影響及其機制的初步探索》文中研究表明目的:EPHA4是受體酪氨酸激酶EPH家族中最為特別的成員之一,可以與包括A類和B類在內的幾乎所有的ephrin配體相互作用,在不同的組織和細胞類型中激活不同的下游信號通路,進而發(fā)揮不同的生物學作用。EPHA4主要在胚胎和成年時期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）表達,參與調控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及多種神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展。但近年的研究發(fā)現(xiàn),EPHA4在外周組織中也有一定程度的表達,并參與調控血管、腎、胸腺、甲狀腺等組織器官的發(fā)育,激素分泌、單核細胞黏附等生理病理過程,以及多種癌癥的發(fā)生、轉移和預后等。為了探究EPHA4在外周組織中是否存在未發(fā)現(xiàn)的特殊表達及作用,我們的課題旨在（1）構建一種可以報告EphA4基因在組織中精確表達位置的大鼠模型,并同時通過插入報告基因取代EphA4的表達實現(xiàn)大鼠體內EPHA4蛋白的敲除;（2）利用大鼠模型EphA4基因表達示蹤的功能,觀察EPHA4是否在外周組織中存在之前未發(fā)現(xiàn)的特異性表達;（3）利用大鼠模型既可以報告EPHA4表達譜又可以實現(xiàn)基因敲除的特點,研究EPHA4在特異表達的組織中發(fā)揮的作用以及可能的機制。方法:通過在Sprague Dawley（SD）大鼠EphA4啟動子后插入紅色熒光蛋白mCherry的基因盒,取代EphA4的第一外顯子,使得mCherry自發(fā)熒光可以報告EPHA4在大鼠體內的表達譜,同時實現(xiàn)大鼠體內EPHA4蛋白敲除。通過活體觀察評價EphA4基因敲除大鼠（SD.EPHA4（TM-mCherry）-GC/ILAS,以下簡寫為EphA4-/-）的生存率、體重以及運動步態(tài)等表型;通過冰凍切片熒光掃描觀察mCherry在EphA4-/-大鼠不同組織中的表達譜。在對mCherry存在特異表達的心臟組織的探索中,通過超聲心動描記、磁共振成像、血流動力學檢測等技術檢測EphA4-/-大鼠心臟的形態(tài)和功能;通過心電圖描記評價EphA4-/-大鼠心電傳導功能;通過組織學染色分析EphA 4-/-大鼠心臟在組織水平上的改變;通過PCR、蛋白免疫印跡以及轉錄組測序等技術探究EPHA4敲除后分子水平的改變。結果:本課題成功構建了含有mCherry報告基因盒的EphA4基因敲除大鼠EphA4-/-,該大鼠與同窩陰性對照大鼠（EphA4+/+）相比表現(xiàn)出明顯的發(fā)育遲緩、袋鼠式跳躍步態(tài)以及生存率下降。通過冰凍切片掃描,我們在EphA 4-/-大鼠不同組織中觀察到精確至細胞水平的自發(fā)紅色熒光表達,示蹤EPHA4的自然表達譜。本文首次發(fā)現(xiàn)EPHA4在成年大鼠心臟組織中特異性地高表達于心房組織而非心室;并且,這種特異性表達在成人心房組織中同樣存在。EPHA4敲除誘導大鼠自2月齡起出現(xiàn)心房擴張和漸進性肥厚,心房射血分數(shù)降低,中心靜脈壓升高;心室功能略有下降,但心室形態(tài)幾乎沒有改變。值得注意的是,EPHA4敲除誘導大鼠在更早的時間點產(chǎn)生異常的心電信號,表現(xiàn)為p波消失、QRS波寬大畸形以及QT間期延長。組織學染色顯示,EphA4-/-大鼠心房肌細胞橫截面積顯著增加,膠原纖維表達量趨向增多,竇房結區(qū)域細胞組分發(fā)生改變。RNA測序顯示,EPHA4敲除改變了轉錄和翻譯調控、離子結合、代謝和細胞粘附相關的多個基因的轉錄。EphA4-/-大鼠心房離子通道的mRNA表達發(fā)生改變,并且EPHA4的缺失還降低了大鼠心房胰島素樣生長因子1（IGF1）mRNA和蛋白的表達;這些改變可能與EphA4-/-大鼠中心房結構和功能的重構有關。結論:本課題中我們成功構建了帶有報告基因的EPHA4敲除大鼠模型,在不同組織中直觀展示EPHA4表達譜,并可精確到特定細胞群。本課題首次發(fā)現(xiàn)EPHA4在成年大鼠心房組織中特異性高表達,并且EPHA4的缺失會導致大鼠心房功能障礙以及心電異常信號。EPHA4敲除引起大鼠心房組織中IGF1表達降低。另外,與心房重塑和心律失常相關的多條信號通路的轉錄組也發(fā)生改變。這些結果提示EPHA4在心電傳導過程中扮演重要角色,并可能在與心房重構相關的多種疾病如心肌病、房顫及高血壓中發(fā)揮生物學作用。
張小川[3]（2021）在《高精度高內涵小鼠全腦圖譜構建及其在阿爾茲海默癥小鼠中的應用》文中認為在全腦范圍同時獲取多種結構的高分辨圖譜對于深入揭示腦功能及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制具有重要意義。目前已有的成像技術和方法在實現(xiàn)大尺度、高分辨率的多種腦結構元素同步成像方面面臨著巨大的挑戰(zhàn)。作為嚴重威脅人類生命健康的神經(jīng)退行性疾病之一,阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease,AD）常伴隨廣泛的腦組織學和病理學變化:一方面,腦血管結構和功能異常在AD發(fā)生發(fā)展中的重要性日益得到認可,在全腦尺度介觀水平上,腦血管特別是毛細血管在AD病理中的形態(tài)和解剖學改變仍有待闡明;另一方面,已有多種成像手段揭示了 Aβ斑塊的結構和分布特征,也有多通道熒光標記等方法觀察到Aβ斑塊對腦結構的影響,然而依然缺乏在全腦范圍內針對Aβ斑塊及其周圍環(huán)境三維構筑的高精度、跨尺度研究。針對上述問題,本文發(fā)展了一種全腦成像策略,并采用此策略構建了 AD小鼠多種腦結構的高精度圖譜。本文第一部分進行了小鼠全腦成像技術的平臺搭建及后續(xù)圖像處理分析,以完成全腦高精度圖譜繪制方法的建立。為了實現(xiàn)全腦高分辨率成像以及成像后海量復雜數(shù)據(jù)的處理與解讀,本文首先開展顯微光學切片斷層成像（Micro-Optical Sectioning Tomography,MOST）技術的應用以及構建高效數(shù)據(jù)分析流程,主要包含樣本制備、數(shù)據(jù)采集、圖像預處理與優(yōu)化、海馬分割、三維可視化重建與定量分析、虛擬內窺等環(huán)節(jié),解決了低信噪比圖像增強、噪聲圖像質量優(yōu)化、高空間復雜度三維數(shù)據(jù)的快速渲染和量化分析等在數(shù)據(jù)處理方面依然面臨諸多挑戰(zhàn)的難題。對C57BL/6小鼠的全腦血管網(wǎng)絡精細可視化顯示了皮層、丘腦和海馬等區(qū)域具有各自獨特血管模式,其中海馬的平均血管直徑、血管長度密度、血管體積分數(shù)均最低。完整海馬的高精度重建揭示了其“耙”式血管分布模式,齒狀回（DG-ml）分子層的主要血管在直徑和分支角度上均發(fā)生突變,呈現(xiàn)出獨特的梳狀毛細血管分布模式。對單枝海馬血管的虛擬內窺從獨特的視角觀察血管腔的內表面形態(tài)、平滑度以及分岔模式,可以提供常規(guī)可視化手段不能涉及的血管腔內信息。本文第二部分對APP/PS1轉基因小鼠的全腦血管系統(tǒng)進行了高分辨的可視化重建和定量分析,首次在亞微米級別分辨率上系統(tǒng)性地描述了 AD病理相關的海馬血管分布和形態(tài)模式的變化。運用已建立的MOST技術平臺及數(shù)據(jù)分析路線率先獲得了 APP/PS1轉基因AD小鼠及其野生型對照的Nissl染色全腦數(shù)據(jù)集,構建了包含從直徑幾十微米的大血管到小于2微米的毛細血管的完整小鼠全腦跨尺度三維血管圖譜。通過系統(tǒng)定量分析野生型與APP/PS1小鼠的腦血管網(wǎng)絡,發(fā)現(xiàn)APP/PS1小鼠海馬血管的平均血管直徑、血管體積分數(shù)均顯著降低。進一步對海馬不同亞區(qū)的比較分析揭示了齒狀回分子層（DG-ml）的平均血管直徑、血管長度密度及血管體積分數(shù)的降低程度最為顯著。對單枝血管分支模式的量化分析結果表明,APP/PS1小鼠血管分支角度顯著變小,導致單枝海馬血管的血液灌注面積減少。最后虛擬血管內窺檢查揭示了 APP/PS1小鼠與野生型小鼠在血管管腔內壁粗糙度、分支節(jié)點平滑度上均有顯著差異。上述結果證明了對小鼠腦血管的高分辨率跨尺度評估的能力,并系統(tǒng)揭示了海馬微循環(huán)尤其是齒狀回在AD病理中的損傷。本文第三部分對5×FAD轉基因AD小鼠全腦Nissl染色數(shù)據(jù)集進行高精度的三維重建,首次實現(xiàn)基于Nissl染色的小鼠全腦Aβ斑塊分布可視化,首次在同一小鼠全腦中構建了 Aβ斑塊及其周圍胞體、神經(jīng)樹突、神經(jīng)束和血管的高精度全景圖。針對高通量明場圖像背景復雜、灰度異質性導致的高難度信號提取和圖像處理問題,設計了包含“虛擬通道分割”和“特征融合”的多種結構信號提取和同步可視化方法,并據(jù)此開展多種結構的高精度跨尺度的全腦構筑研究。全腦Aβ斑塊密度最大區(qū)域及大尺寸斑塊分布最密集區(qū)域均為內嗅皮層和鄰近的海馬腹側下托區(qū)域,提示Aβ病理可能最早出現(xiàn)在這些最密集的區(qū)域。在全腦范圍,Aβ斑塊分布較密集的區(qū)域通常具有相對較多的胞體且處于血管遠端,而神經(jīng)纖維束在Aβ斑塊相對稀疏的區(qū)域較為密集;在局部腦區(qū),皮層區(qū)域可視化和定量分析均顯示Aβ斑塊密集區(qū)靠近胞體豐富的深部區(qū)域,而海馬內的Aβ斑塊成層狀分布在錐體細胞層和顆粒細胞層附近;在亞微米分辨水平,海馬輻射層內Aβ斑塊周圍的神經(jīng)樹突顯示出明顯的彎曲或截斷,海馬下托的毛細血管穿過斑塊內部或附近,也呈現(xiàn)一定程度截斷或變形且表面粗糙度高。此外,本文最后選取了可能影響血管的舒尼替尼、西地那非和可替寧進行給藥實驗及行為學測試,然后選取行為學變化趨勢最明顯的可替寧給藥小鼠進行多結構同步可視化方法,發(fā)現(xiàn)給藥后皮層Aβ斑塊數(shù)量呈下降趨勢,而海馬區(qū)域無明顯變化;垂直于腦表面的較粗的皮層血管在給藥后呈增多趨勢,且皮層血管體積分數(shù)顯著增加,而海馬區(qū)域給藥后血管形態(tài)參數(shù)無明顯變化。這些結果顯示了基于MOST技術的三維可視化方法可能用于研究藥物效應。本文提供了一種針對高通量灰度圖像進行信息提取和可視化重建的方法,從而完成了對全腦范圍內多種結構元素的高精度同步可視化。對全腦范圍內多種結構信息的清晰展示為深入理解AD相關病理狀態(tài)下的大腦解剖結構特征提供了新思路。本文對正常小鼠全腦血管網(wǎng)絡尤其是海馬血管分布模式的清晰描繪、對AD小鼠腦血管的系統(tǒng)評估和Aβ斑塊及其周圍多結構的同步可視化,不但促進了在介觀水平對正常以及AD病理狀態(tài)下的小鼠腦基本結構的深入認識,也可能為AD相關藥物臨床前開發(fā)提供新參考。
呂靜薇[4]（2021）在《人參皂苷Rg1和Rb1改善航天失重效應與睡眠干擾所致認知功能減退作用及機制研究》文中指出長期航天飛行中,航天失重、節(jié)律紊亂等因素引起的認知功能減退,嚴重影響航天員作業(yè)能力和航天飛行任務的完成。開展該條件下的認知損傷機制研究,尋找有效的防護措施,是國際航天醫(yī)學領域重點關注的問題。航天特因環(huán)境應激所誘導的認知功能損傷,是正常健康人群在特因環(huán)境下,面臨遠超本底作業(yè)強度的任務時,誘發(fā)的認知功能減退。功能性損傷沒有明確的病變部位,靶點不明確,現(xiàn)代醫(yī)學難以發(fā)揮作用。中醫(yī)藥強調從整體出發(fā),辨證施治,通過調節(jié)人體對外源性傷害性刺激的抵抗力發(fā)揮健康維護的作用,對于應激所致認知功能性損傷的防護具有獨特優(yōu)勢。長期臨床實踐表明傳統(tǒng)中藥人參等具有延緩衰老、抗疲勞、促進學習記憶等作用。藥理研究表明所含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1是其主要活性成分,并可以改善多種應激引起的認知損傷。本論文將采用兩種常見的航天應激動物模型（模擬失重模型、睡眠干擾模型）,在建立操作任務下學習記憶能力評價方法的基礎上,結合多種行為學評價方法,研究航天模擬動物模型的學習記憶能力改變的特征、損傷強度;研究人參皂苷Rg1、Rb1的改善作用和作用特點,并探討其作用機制。全文研究內容和結果如下:1.失重效應對學習記憶能力特征的影響研究（1）基于自發(fā)活動原理（物體認知、Y迷宮）:Y迷宮實驗中,經(jīng)歷兩周和四周模擬失重的動物自發(fā)交替百分率未發(fā)生顯著性改變,動物的工作記憶能力在模擬失重兩周至四周誘導后未受影響,而在物體認知實驗中,兩周模型動物辨別指數(shù)顯著降低,提示新物體識別能力在兩周時即顯著損傷。（2）基于懲罰原理（跳臺、避暗、穿梭、水迷宮）:跳臺實驗中,獲得階段:兩周和四周模型動物登臺潛伏期顯著延長,安全區(qū)時間顯著縮短,表現(xiàn)出對躲避電擊的學習能力較差。鞏固階段,兩周和四周模型動物從臺上跳下的潛伏期顯著縮短,安全區(qū)時間顯著縮短,表現(xiàn)出對安全區(qū)域的記憶較差。避暗實驗中,兩周及四周模型動物可能因動物嗜暗驅動力不足,避暗不適用于此模型評價。穿梭實驗中,經(jīng)過兩周的模擬失重后動物主動穿梭次數(shù)減少,逃避失敗次數(shù)顯著增加,安全區(qū)時間顯著縮短,提示模型動物聯(lián)想學習記憶能力減退。水迷宮實驗中,兩周及四周模擬失重模型動物潛伏期顯著升高,目標象限游程比和目標象限時間比顯著降低,顯示出空間記憶能力受損。（3）基于獎賞原理:首次設置踏板操作-多重顏色信號辨識-獎賞獲取一體化聯(lián)動的獎賞操作任務,對模擬失重動物執(zhí)行操作任務時的決策、信號辯識等學習記憶行為進行檢測。本研究表明,模擬失重四周后,模擬失重大鼠在單次操作條件反射模式中鼻觸次數(shù)、踏板次數(shù)顯著減少,完成時間、操作潛伏期延長,在信號辨識模式中辨別指數(shù)顯著降低,模擬失重效應對動物復雜操作能力、注意力,決策能力,信號辨識能力等均有一定影響。2.人參皂苷Rg1和Rb1及其苷元PPT、PPD對模擬失重效應模型的空間和聯(lián)想式學習記憶能力改善作用及作用機制研究通過兩種行為學實驗表明不同劑量的人參皂苷Rg1（30,60μmol/kg）和Rb1（30,60μmol/kg）及其苷元PPT、PPD（30,60μmol/kg）灌胃給藥兩周后對模擬失重所致認知障礙均具有一定的改善作用。采用液質聯(lián)用法和免疫印跡實驗分別測定海馬組織中神經(jīng)遞質變化和蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1和Rb1對模擬失重所引起的學習記憶障礙的改善作用可能與調控線粒體分裂融合平衡,抑制細胞凋亡進程,增強突觸可塑性,調節(jié)Ach、DA、5-HT、Glu等神經(jīng)遞質水平有關。3.人參皂苷Rg1和Rb1對航天特因環(huán)境所致復雜操作任務時學習記憶能力下降的改善作用及作用機制在訓練動物學會單次操作條件反射后,篩選達標動物,經(jīng)過四周的模擬失重效應誘導之后再進行獎賞操作條件反射實驗（包括單次操作條件反射、逆轉操作、視覺信號辨識三個模式）。實驗結果表明,灌胃給藥人參皂苷Rg1（30,60μmol/kg）和Rb1（30,60μmol/kg）、石杉堿甲（0.1mg/kg）兩周可在一定程度上改善動物的探索興趣、注意力、操作執(zhí)行力等,其中以人參皂苷Rg1的改善效果更為顯著。通過HE染色、液質聯(lián)用法和免疫印跡實驗等對動物執(zhí)行功能的重要腦區(qū)前額葉皮層區(qū)組織的進一步檢測顯示,人參皂苷Rg1和Rb1改善動物復雜操作任務能力可能與調節(jié)線粒體氧化磷酸化功能,改善氧化應激,介導BDNF-TrkB/PI3K-AKT通路抑制細胞凋亡,從而調節(jié)突觸可塑性相關。同時,在BDNF-TrkB/PI3K-AKT信號通路上,Rg1的調控作用優(yōu)于Rb1,可能是Rg1發(fā)揮較好操作任務能力改善作用的原因之一。4.人參皂苷Rg1和Rb1對睡眠干擾所致認知功能減退的改善作用及機制研究通過兩周的滾筒法睡眠干擾誘導動物認知功能改變,以灌胃方式給予兩周的人參皂苷Rg1和Rb1（30,60μmol/kg）,提高了模型動物在Y迷宮實驗中自發(fā)交替百分率（工作記憶能力）,縮短水迷宮實驗中尋臺潛伏期（空間記憶能力）,同時升高了物體認知實驗中的辨別指數(shù)（物體辨識能力）。采用液質聯(lián)用法和免疫印跡實驗分別測定海馬組織神經(jīng)遞質和蛋白水平改變發(fā)現(xiàn),睡眠干擾會誘導動物海馬組織GABA水平升高,干擾PI3K-AKT信號通路,影響突觸可塑性,并可能誘導細胞凋亡增加。人參皂苷Rg1和Rb1給藥后逆轉以上睡眠干擾所致海馬組織損傷。綜上所述,本課題利用三類不同原理（自發(fā)、懲罰、獎賞）的7種行為學實驗方法對模擬失重模型認知損傷進行了系統(tǒng)、全面的分析評價。明確了模擬失重誘導的學習記憶能力改變的特征、損傷強度,其中建立的動物執(zhí)行復雜操作任務時學習記憶能力評價技術為國內外首次報道。證實了人參皂苷Rg1和Rb1能夠改善不同類型應激致認知功能損傷,尤其是能夠改善應激狀態(tài)下執(zhí)行復雜操作任務時學習記憶能力。聚焦線粒體結構和功能研究,發(fā)現(xiàn)其改善作用與調節(jié)神經(jīng)遞質水平,調控線粒體分裂融合平衡,調節(jié)線粒體氧化磷酸化功能,抑制線粒體損傷引發(fā)的細胞凋亡進程,增強突觸可塑性等相關。本論文為航天在軌飛行應激所致認知功能損傷評價提供了一種與臨床表觀、結構、預測效度高度相似的實驗技術,為航天特因環(huán)境下腦功能增強提供了有效的候選藥物品種,為各種應激所致認知功能損傷及防護研究從實驗方法及防護品種提供了重大戰(zhàn)略儲備。
陶攀峰[5]（2021）在《RIPK1切割位點變異導致新型自身炎癥性疾病的分子機制研究》文中進行了進一步梳理自身炎癥性疾病是指在沒有高滴度自身抗體或抗原特異性T細胞參與的情況下,機體發(fā)生非誘發(fā)炎癥的一類遺傳疾病,例如家族性地中海熱,主要臨床表現(xiàn)包括周期性發(fā)熱、皮疹、CRP升高、淋巴結腫大、肝脾腫大、關節(jié)炎、炎癥性腸病、血管炎、結節(jié)性多動脈炎、基底節(jié)鈣化或肺間質病等多種形式的系統(tǒng)性炎癥。發(fā)現(xiàn)新致病基因并深入研究致病機制對患者的精準治療和研究基因的生理功能都有重要意義。RIPK1在死亡受體或模式識別受體介導的細胞凋亡、程序性壞死和炎癥信號通路的激活與轉換中發(fā)揮著關鍵作用。腫瘤壞死因子TNF與受體TNFR1結合后,招募接頭蛋白TRADD和RIPK1等形成復合體I,介導NF-κB通路的級聯(lián)激活,起始促炎基因和促細胞存活基因的轉錄。在此過程中,RIPK1起著重要的支架作用,激酶活性受到泛素化和磷酸化修飾的限制。去泛素化或去磷酸化可以激活RIPK1,促進與FADD和caspase-8等蛋白組成復合物IIa,啟動RIPK1依賴的細胞凋亡。若caspase-8酶活被抑制,激活的RIPK1會招募RIPK3和MLKL形成復合體IIb導致程序性壞死、細胞內容物泄露和炎癥的發(fā)生。在小鼠模型中,Fadd敲除導致過度的細胞壞死和小鼠胚胎期死亡,通過敲除Ripk1可以挽救。Casp8敲除同樣導致小鼠胚胎期死亡,通過敲除Ripk3或者Mlkl可以挽救。這提示FADD-caspase-8的激活可以抑制RIPK1/RIPK3/MLKL依賴的程序性壞死來保證小鼠胚胎發(fā)育,但具體的分子機制及在人類疾病中的生理意義尚不清楚。RIPK1第324位天冬氨酸是潛在的被caspase-8切割的位點,我們從未診斷的自身炎癥性疾病病例中發(fā)現(xiàn)兩個患病家系,分別攜帶新發(fā)的RIPK1雜合變異p.Asp324Val和p.Asp324His,患者主要表現(xiàn)出周期性發(fā)熱和淋巴結腫大等癥狀?；颊哐逯醒装Y細胞因子和趨化因子水平升高,外周血單個核細胞（PBMCs）中炎癥信號通路相關基因的轉錄水平升高。在機制的研究中,RIPK1切割位點變異促進了小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）中TNF誘導的RIPK1激活及其介導的細胞凋亡、程序性壞死和促炎細胞因子IL-6的產(chǎn)生。同樣的,切割位點變異也促進了患者PBMCs中TNF誘導的細胞凋亡、程序性壞死和IL-6轉錄水平的升高,且都依賴于RIPK1的激酶活性。與PBMCs相反,患者的成纖維細胞（Fibroblasts）中RIPK1、TNFR1等蛋白的表達水平和胞內活性氧水平降低,表現(xiàn)出對TNF誘導的細胞壞死和對erastin和RSL3誘導的鐵死亡的抵抗。基于RIPK1切割位點變異能引起細胞因子IL-6的顯著變化,我們建議患者用IL-6受體抑制劑進行治療,取得了很好的療效。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)caspase-8在RIPK1 D324位點的切割負調控了RIPK1的激活及其介導的細胞程序性死亡,而切割位點的變異導致患者PBMCs中RIPK1的過度激活及其介導的細胞凋亡、程序性壞死和炎癥信號通路激活水平的升高,最終導致了患者表現(xiàn)出反復發(fā)熱和淋巴結腫大等癥狀。而患者fibroblasts發(fā)展出了多種補償機制,使其可以抵抗不同的死亡刺激,這也可能使患者沒有皮膚受累或病變。
呂子超[6]（2021）在《肺動脈高壓遺傳圖譜繪制與遺傳性肺動脈高壓動物模型構建》文中認為背景:肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension,PAH）是指由于肺動脈結構重塑和進行性狹窄導致肺動脈阻力持續(xù)增高的惡性血管疾病。PAH的血管病理改變是進行性的,主要表現(xiàn)為肺小動脈內膜損傷、中層平滑肌肥大,肥大的平滑肌延伸到肺小動脈使其異常肌化。編碼骨形成蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor2,BMPR2）基因是PAH最常見的遺傳危險因素。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了BMPR2基因上600多個與肺動脈高壓有關的變異。然而,與PAH相關的BMPR2罕見變異的特征卻尚不清楚。我們認為PAH患者所攜帶的BMPR2罕見變異與健康人群所攜帶的罕見變異之間的對比可以突出PAH患者BMPR2基因突變的特征。方法:對670名PAH患者進行Sanger測序或全外顯子組測序,篩選符合致病性變異判定標準的BMPR2基因變異。之后采用同樣的致病性變異判定標準,在包含8,624名參考人群基因序列的GnomAD數(shù)據(jù)庫,以及1,884名參考人群基因序列的諾禾致源-中華基因組數(shù)據(jù)庫進行比對。結果:與參考人群相比,PAH患者中BMPR2基因罕見變異的比例顯著升高（21.5%,144/670 vs 0.87%,91/10,508,p=1.3×10-118）。在 PAH 患者中,51%的 BMPR2 罕見變異屬于錯義突變,而在參考人群中,99%的BMPR2罕見變異屬于錯義突變。在參考人群中沒有發(fā)現(xiàn)Arg491位點的突變,然而在PAH患者中屬于熱點突變,其攜帶率高達14.6%（21/144）。在PAH相關的BMPR2基因錯義突變更傾向于分布在胞外配體結合域（ECD,29.7%vs 11.1%,p<0.001）,此外,與非PAH相關BMPR2罕見變異相比,PAH相關錯義突變會干擾所編碼氨基酸電荷狀態(tài)（51.4%v.s.23.3%,p<0.001）。結論:因此,位于BMPR2胞外配體結合域,或者干擾所編碼氨基酸電荷狀態(tài)的BMPR2錯義突變,致病性更高。背景:為了研究遺傳性肺動脈高壓（Heritable pulmonary arterial hypertension,HPAH）的發(fā)病機制,世界各地的研究人員建立了多種BMPR2基因功能缺失的轉基因小鼠模型。然而,目前所報道的小鼠模型不能完全模擬臨床上PAH患者的病理改變。為了更好的了解BMPR2突變在HPAH發(fā)生發(fā)展中的作用,我們構建了一種新的BMPR2熱點突變大鼠模型,并對其血流動力學等表型進行了檢測。方法:通過前期的研究基礎,我們對670例特發(fā)性PAH以及家族性PAH患者進行BMPR2基因突變篩選,找到了熱點突變Arg491。之后用CRISPR/Cas9技術構建了攜帶雜合子熱點突變的SD（Sprague Dawley）大鼠模型——Bmpr2R491w大鼠。通過大鼠心臟超聲、右心導管以及病理實驗,檢測Bmpr2R491W大鼠與野生型大鼠在基線水平和暴露于低壓低氧（50Kpa,10%O2）環(huán)境中3周的表型特征。結果:Bmpr2R491W大鼠在基線時表型無異常,沒有出現(xiàn)自發(fā)性肺動脈高壓的病理表現(xiàn)。然而,經(jīng)過低壓低氧處理后,Bmpr2R491W大鼠肺血管重構表現(xiàn)更為嚴重,右室肥大。Bmpr2R491W大鼠RVSP和RV/（LV+S）分別比野生型高12%和21%。超聲心動圖顯示Bmpr2R491W大鼠右室游離壁厚度是野生型大鼠的1.23倍,三尖瓣瓣環(huán)收縮期位移和右室流出道心輸出量分別降低31%和37%。Bmpr2R491W大鼠全肌化動脈比例和肌化肺動脈壁厚（直徑<75μm）均較大。結論:我們首次嘗試構建了與PAH相關的熱點錯義突變的Bmpr2轉基因大鼠模型Bmpr2R491W大鼠。Bmpr2R491W大鼠較野生型更易發(fā)生肺血管重構,是研究HPAH分子機制的理想嚙齒動物模型。背景:肺動脈高壓（PAH）是一種威脅生命的疾病,其發(fā)病過程易受遺傳因子素的影響。PAH確定是一種遺傳異質性疾病,有一部分特發(fā)性PAH患者表現(xiàn)出遺傳傾向?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)21個PAH易感基因。BMPR2基因突變是特發(fā)性PAH患者最主要的遺傳危險因素,攜帶BMPR2突變的患者血液動力學指標更差,死亡風險增加。在特發(fā)性PAH患者中,除BMPR2以外的易感基因罕見變異的相對分布和影響尚不明確。因此,更全面的詮釋特發(fā)性PAH患者的遺傳背景有助于對臨床中患者管理進行更加清晰和精準的分型,為實現(xiàn)精細化管理和精準醫(yī)學提供有力幫助。方法:對421名特發(fā)性PAH患者進行全外顯子組測序,分析了 21種已知的PAH易感基因中的罕見變異。并進一步分析患者臨床表型,包括心臟功能、血流動力學參數(shù)以及遠期預后,并將這些臨床表型與患者的遺傳表型進行關聯(lián)分析。結果:高達53.7%的特發(fā)性PAH患者攜帶易感基因罕見變異。其中BMPR2的突變頻率最高（18.5%）,其次是 GDF2（5.2%）和ACVRL1（5.0%）。除了 BMP通路相關基因的變異,還有11.4%的患者攜帶非BMP信號通路的變異,包括RNF213（3.3%）,TBX4（2.4%）和ATP13A3（1.9%）等。與非攜帶者相比,攜帶罕見變異的患者在診斷時更年輕,而且平均肺動脈壓以及肺血管阻力更高,此外男性患者中攜帶者比例更高。攜帶BMP通路相關基因突變患者與非BMP通路相關基因變異的患者,臨床表型沒有顯著差異。通過隨訪,從遠期來看,攜帶BMPR2突變的患者預后與非攜帶者無顯著差異,而男性患者遠期預后更差;與單藥治療相比,給予聯(lián)合藥物治療能夠顯著緩解患者的預后。結論:在臨床明確診斷的特發(fā)性PAH患者隊列中評估21種已知PAH易感基因的分布,以及和患者臨床表型的關聯(lián),能夠進一步提高了對中國特發(fā)性PAH患者遺傳背景的認識。我們通過證明突變攜帶者的發(fā)病年齡更小且臨床表現(xiàn)較差,證實了有害遺傳變異在特發(fā)性PAH疾病進展中的作用。我們還通過隨訪發(fā)現(xiàn),早期診斷和聯(lián)合藥物治療可以緩解由遺傳性危險因素導致的疾病進展。
楊辰[7]（2021）在《視網(wǎng)膜色素變性致病基因的鑒定及基因治療研究》文中指出背景:視網(wǎng)膜色素變性（RP）是一種遺傳性疾病,涉及眼睛視網(wǎng)膜細胞的退化和死亡,會導致視力進行性下降,并最終導致失明。其在全球的發(fā)病率約為1/3000-1/7000,是單基因致盲性眼病最主要的原因。目前已經(jīng)報道大約90個基因與視網(wǎng)膜色素變性發(fā)生相關,這些基因突變能解釋約60%的RP病例,篩選RP致病基因的有效方法是全外顯子組測序技術。突變基因鑒定之后則需進一步研究相關基因致病機制及尋找合適的治療方式,基因治療遺傳性疾病是大勢所趨,是將來用于治療單基因疾病的重要手段,特別是對于遺傳性RP疾病來說尤為關鍵。本課題在利用醫(yī)學遺傳學、生物信息學等手段篩選RP致病基因突變的同時,還進行了基因治療的初步研究,為未來應用該技術在臨床上治療RP提供技術支撐。對象與方法:本文以收集到的兩個常染色體隱性遺傳視網(wǎng)膜色素變性家系（RP-2373和RP-2370）作為研究對象。所有家庭成員均進行了全面的臨床眼科檢查,利用全外顯子組技術進行測序,并通過Sanger直接測序對候選基因突變位點進行驗證。之后構建了RP相關基因缺陷小鼠模型Rpe65基因自發(fā)點突變小鼠,并初步建立了基因治療的體系。結果:通過全外顯子組測序技術,在家系RP-2373中的RP患者（I:2,I:3和I:5）和家系RP-2370中的RP患者（001）中分別篩選出了基因CDHR1的一個新的純合致病突變位點c.1231C>T（p.Q411X）和基因CYP4V2的新的復合雜合致病突變位點c.958C>T（p.R320X）和c.1355G>A（p.R452H）,這些變異位點在正常家庭成員以及2010名健康對照中均未發(fā)現(xiàn)。同時在基因治療體系的初步建立方面,構建了RP相關基因缺陷小鼠模型Rpe65基因自發(fā)點突變小鼠,擴增了小鼠基因Rpe65全長開放閱讀框,將其克隆于p AAV-IRES-hr GFP載體,雙酶切和DNA測序鑒定重組病毒載體,并將該質粒與腺相關病毒包裝質粒（p AAV-RC2）、腺相關病毒輔助質粒（p AAV-Helper）共轉染AAV-293細胞,通過包裝得到重組腺相關病毒并回收病毒原液,測定重組腺相關病毒的滴度高于1012copies/m L,成功構建了表達Rpe65基因的重組腺相關病毒載體,注射了21天的Rpe65自發(fā)點突變小鼠的右眼視網(wǎng)膜下腔發(fā)現(xiàn),病毒在其視網(wǎng)膜光感受細胞層中高度表達,與沒有注射病毒的左眼相比,延緩了視網(wǎng)膜光感受細胞的凋亡,視網(wǎng)膜電生理結果也進一步證實了這一結論,注射了病毒后的右眼視功能有較為明顯的改善。結論:我們鑒定出了CDHR1基因的一個新的純合致病突變位點c.1231C>T（p.Q411X）和CYP4V2基因新的復合雜合致病突變位點c.958C>T（p.R320X）和c.1355G>A（p.R452H）,擴展了中國人群CDHR1和CYP4V2基因突變譜,為RP的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)。并且初步建立起了基因治療的整個流程和體系,為將來的基因治療RP的廣泛應用奠定基礎。
朱雄[8]（2020）在《EMC3基因視網(wǎng)膜和小腦神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的功能研究》文中研究表明神經(jīng)退行性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一類以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（神經(jīng)元）和（或）外周神經(jīng)系統(tǒng)（髓鞘）的變性、凋亡所導致的結構和功能的進行性退化為特征的異質性疾病。隨著人口老齡化問題日益突出,神經(jīng)退行性疾病已成為世界范圍內危害人類健康最嚴重的疾病之一。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機理極其復雜,至今尚不能被完全解釋清楚,到目前為止缺少有效的診斷和治療方法。目的:在神經(jīng)退行性疾病中,腦和視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變是目前研究的熱點。此類疾病引起損害的病理是神經(jīng)元細胞的不可逆性損傷,目前臨床上對此缺乏行之有效的治療手段。視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良（Retinal dystrophy）是一類因光感受器功能喪失而引起的異質性遺傳性疾病。在全球尤其是工業(yè)化國家中,視網(wǎng)膜變性疾病是致盲的重要原因之一。這些疾病的臨床表型復雜性和等位基因的異質性給疾病的正確診斷帶來困難。內質網(wǎng)膜蛋白復合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）首先在釀酒酵母中被鑒定為內質網(wǎng)中蛋白質折疊所需的6亞單位跨膜蛋白復合物。EMC亞基的丟失會導致錯誤折疊的膜蛋白的積累和未折疊蛋白反應（UPR）的誘導。有研究報道,EMC1基因突變與視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良及小腦發(fā)育退化綜合征相關。在真核生物中,d Pob/EMC3定位于內質網(wǎng),并與EMC1和鈣連蛋白（calnexin）結合并相互作用。此外,內質網(wǎng)膜蛋白復合物（EMC）是其他多通道跨膜蛋白的穩(wěn)定表達所必需的,如視紫紅質和Na+K+-ATP酶等。另外,d Pob/EMC3缺失會導致果蠅單眼細胞的變性。這些結果共同表明,EMC是包括視紫紅質1在內的多通道跨膜蛋白生物發(fā)生過程中的一個關鍵因素,其缺失會導致視網(wǎng)膜變性。EMC1和EMC3組成復合物參與內質網(wǎng)相關降解（ERAD）途徑,表明EMC與ERAD途徑之間存在密切聯(lián)系。內質網(wǎng)結構和功能的紊亂在神經(jīng)退行性疾病中已被廣泛觀察到,但內質網(wǎng)功能障礙是神經(jīng)退行性疾病病變的原因,還是僅僅是神經(jīng)元死亡的表現(xiàn),目前尚不清楚。本論文重點研究EMC3在小腦和視網(wǎng)膜中的功能。方法:構建EMC3、EMC1等表達質粒載體（包括野生型和突變型）,分別進行細胞轉染,結合免疫組化等方法,通過高分辨激光共聚焦顯微鏡、熒光共定位等分析其在細胞中的表達及定位情況,分析EMC1突變是否引起細胞中定位發(fā)生變化。研究EMC3與EMC其他亞基的表達及定位分析。在前期工作中,本研究發(fā)現(xiàn)小鼠Emc3基因胚胎敲除導致早期胚胎死亡。因此使用Pcp2-cre轉基因小鼠和Emc3條件性敲除小鼠建立了一個在小腦浦肯野神經(jīng)細胞和視網(wǎng)膜雙極細胞中特異敲除Emc3基因的動物模型。本論文綜合運用分子生物學,細胞生物學和免疫組化等方法,詳細研究Emc3在雙極細胞和小腦浦肯野細胞中的功能。利用雙極細胞和小腦浦肯野細胞中特異蛋白標志物,對Emc3缺失的小鼠視網(wǎng)膜和小腦冰凍切片進行免疫染色,使用高分辨率激光共聚焦顯微鏡,詳細分析這些關鍵蛋白的運輸和定位。結果:EMC3由小鼠Tmem111基因編碼,是高度保守的內質網(wǎng)膜蛋白復合物（EMC）的一個亞基。本研究發(fā)現(xiàn)Emc3的靶向缺失導致了小鼠嚴重的神經(jīng)病變表型。同時Emc3lox P/lox P;Pcp2-Cre小鼠是可以長期存活并是可育的,但行為學上表現(xiàn)出類似于小腦共濟失調的表型。與野生型小鼠相比較,三月齡的成年Emc3突變小鼠小腦中浦肯野細胞的樹突發(fā)育有明顯減少。本研究進一步發(fā)現(xiàn),浦肯野細胞中Emc3的選擇性缺失導致內質網(wǎng)錯誤折疊的膜蛋白的積累,阻礙了浦肯野細胞的分泌運輸,并導致了樹突萎縮。這些表型表現(xiàn)為小腦體積變小和浦肯野細胞數(shù)量減少,導致共濟失調。浦肯野細胞丟失和共濟失調最初出現(xiàn)在出生后兩個星期左右,但隨著年齡的增長逐漸惡化。Emc3的缺失導致浦肯野細胞缺失區(qū)域神經(jīng)膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達增加和星形膠質細胞增生。C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78/BIP）表達水平升高表明浦肯野細胞在可見細胞丟失之前存在內質網(wǎng)應激（ER Stress）。TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）分析表明,小腦浦肯野細胞出現(xiàn)細胞凋亡。本文的數(shù)據(jù)表明,浦肯野細胞中Emc3的缺失導致蛋白質折疊和運輸缺陷,樹突密度顯著降低,星形膠質細胞增生和浦肯野細胞死亡。此外,本研究發(fā)現(xiàn)Emc3突變小鼠視網(wǎng)膜中視桿雙極細胞與野生型小鼠相比有進行性病變,這表明Emc3在小鼠的視網(wǎng)膜結構和功能維持發(fā)揮重要作用。結論:研究結果表明了Emc3在小鼠浦肯野細胞和視網(wǎng)膜雙極細胞的發(fā)育和功能維持發(fā)揮重要作用。本文的研究揭示了EMC3蛋白在小腦浦肯野細胞和視網(wǎng)膜中的重要作用,為研究小腦共濟失調和視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病提供了新方向與思路。
肖銳[9]（2020）在《小腦異常神經(jīng)發(fā)生參與自閉癥模型小鼠運動障礙及其相關機制研究》文中研究說明研究背景:自閉癥（Autism Spectrum Disorder,ASD）是一類以社會交互能力損害,興趣狹窄和限制與重復刻板樣行為為主要特點的臨床征候群,發(fā)病率逐年升高。運動障礙是自閉癥患者中最常見的合并癥之一,包括震顫、共濟失調、運動失能、肌張力障礙等。對于社會交流與社會適應能力已經(jīng)受損的自閉癥患者,運動障礙進一步限制了其生活獨立性及生活質量。另外,運動影響高級認知行為,在語言交流、情感控制、執(zhí)行能力、運動行為控制等方面發(fā)揮重要的作用,因此運動障礙可能參與自閉癥行為的發(fā)生。小腦位于大腦半球后方,是相對獨立的神經(jīng)中樞,同時也是調節(jié)運動功能的重要腦區(qū)。小腦結構異常及其引起的功能障礙在臨床自閉癥患者和模型小鼠中得到廣泛證實,因此,小腦亦是自閉癥病理發(fā)生機制研究的一個重要腦區(qū)。研究小腦發(fā)育異常引起運動障礙發(fā)生發(fā)展的病理過程,有助于從運動障礙的角度理解自閉癥的病理發(fā)生機制。小腦具有典型的三層板層樣結構,包括分子層（Molecular Layer,ML）、蒲肯野細胞層（Purkinje Cell Layer,PCL）以及內顆粒層（Inner Granule Layer,IGL）。小腦的發(fā)育主要在生后早期完成,人類小腦發(fā)育在兩歲內逐步完善,而小鼠則在2周內基本完成小腦的發(fā)育。小腦發(fā)育過程中,數(shù)十億計的顆粒神經(jīng)元由小腦外顆粒層（External Granule Layer,EGL）中的顆粒神經(jīng)元前體細胞（Granule Cell Precursors,GCPs）增殖產(chǎn)生,隨后沿著伯格曼細胞的放射狀纖維向內遷移,到達IGL后形成成熟顆粒神經(jīng)元。在此過程中,顆粒神經(jīng)元發(fā)出平行于小腦皮層的“T形”纖維,穿行于分子層中,并與蒲肯野細胞向上生長到達ML中的樹突形成突觸聯(lián)系。蒲肯野細胞的胞體則向下發(fā)出軸突聯(lián)系至小腦深部的核團,并經(jīng)此中轉投射至更廣泛的大腦區(qū)域。當所有的顆粒神經(jīng)元完成遷移后,EGL消失,蒲肯野細胞也基本發(fā)育完善,由此形成小腦的三層板層結構。板層結構形成的過程中,小腦皮層特定部位顆粒神經(jīng)元增殖速度變快,并通過蒲肯野神經(jīng)元軸突的錨定向內牽引,小腦皮層在該部位形成向內的凹陷。隨著小腦皮層向外地發(fā)育,逐漸形成了小腦的葉片狀結構。在小腦發(fā)育的關鍵期,關鍵細胞學事件發(fā)生異常會導致小腦葉片和板層結構發(fā)育異常,進而引起神經(jīng)網(wǎng)絡形成的受阻及神經(jīng)活動的異常。蒲肯野細胞是小腦內唯一的傳出神經(jīng)元,研究者在自閉癥患者和模型小鼠中發(fā)現(xiàn)蒲肯野細胞的病理學改變和功能異常,并且這與自閉癥患者中運動障礙行為的出現(xiàn)高度關聯(lián),然而其潛在的機制目前仍不明確。BTBR T+Itpr3tf/J（BTBR）小鼠是目前應用非常廣泛的一種特發(fā)性自閉癥模型小鼠,攜帶了Disc1del、T+、Itpr3tf、Cox7a2ll突變基因,從而表現(xiàn)出自閉癥的一系列癥狀,包括社交功能障礙、重復刻板樣行為等核心癥狀。近期的研究發(fā)現(xiàn)BTBR小鼠同時表現(xiàn)出感覺運動異常及空間感知異常,并且傾向于過度活躍及沖動行為。此外,在BTBR小鼠中亦觀察到小腦中免疫、氧化應激等相關改變,而Haijie Yang在研究中發(fā)現(xiàn)BTBR小鼠小腦葉片異常增多。然而BTBR小鼠運動功能障礙是如何發(fā)展并影響自閉癥行為,小腦發(fā)育參與運動功能障礙的途徑和細胞學機制均需進一步闡明。在本研究中,我們進一步探索并明確了BTBR小鼠的肌張力障礙樣行為和注意力缺失樣行為。同時,我們發(fā)現(xiàn)BTBR小鼠生后小腦神經(jīng)發(fā)生異常,并影響了葉片形成和蒲肯野細胞發(fā)育,這些發(fā)育關鍵期出現(xiàn)的細胞學事件異?？赡芘c其運動障礙行為相關。研究方法:小鼠出生后3天（Postnatal day 3,P3）至P150通過懸尾實驗連續(xù)觀察比較BTBR小鼠及野生型（Wild Type,WT）小鼠肌張力障礙樣行為。P14至P150通過金屬網(wǎng)格懸掛實驗觀察比較BTBR小鼠及WT小鼠肢體協(xié)調能力及抓握能力。小鼠成年后（8周）通過水平爬梯實驗、加速轉棒實驗及曠場實驗觀察比較BTBR小鼠及WT小鼠精細運動能力、運動學習能力、運動協(xié)調能力及整體運動性。分別收集P3、P7、P14及成年期（3月齡）BTBR小鼠及WT小鼠小腦標本,通過比較BTBR小鼠及WT小鼠小腦HE染色結果,觀察BTBR小鼠小腦大體形態(tài)改變及其發(fā)育進程。通過BrdU及Ki67免疫熒光染色觀察P3、P7時BTBR與WT小鼠GCPs增殖情況,NeuN免疫熒光染色、尼氏染色及HE染色觀察顆粒神經(jīng)元遷移進程及成熟顆粒神經(jīng)元異位情況,GFAP及S100β免疫熒光染色觀察P7時BTBR小鼠及WT小鼠伯格曼膠質細胞發(fā)育情況,CB免疫熒光染色及免疫蛋白印跡觀察P14時BTBR小鼠及WT小鼠蒲肯野細胞的發(fā)育。通過高爾基染色觀察P14時BTBR小鼠及WT小鼠蒲肯野細胞樹突形態(tài)、樹突棘數(shù)量及分型。通過GAD67及vGlut1免疫熒光染色及免疫蛋白印跡觀察成年期BTBR小鼠及WT小鼠小腦興奮性及抑制性神經(jīng)遞質表達情況。最后,在P14時收集BTBR小鼠及WT小鼠新鮮小腦樣本,通過全轉錄組測序及實時熒光定量PCR技術,比較BTBR小鼠和WT小鼠小腦差異表達基因,并通過通路富集及蛋白互作分析以深入探索BTBR小鼠小腦異常發(fā)育及成年期BTBR小鼠運動障礙及異常行為表型的可能機制。研究結果:1、BTBR小鼠的運動障礙表型（1）懸尾實驗中,成年期BTBR小鼠出現(xiàn)嚴重的肌張力障礙樣行為,與WT小鼠相比較,BTBR小鼠后肢明顯屈曲過度、雙后爪及前后爪異常交錯握爪、軀干過度扭轉以及過度伸展。（2）懸尾實驗追蹤觀察,BTBR小鼠肌張力障礙樣行為出現(xiàn)在P10,隨后其發(fā)病率逐漸上升,P14時90%的BTBR小鼠均出現(xiàn)肌張力障礙樣行為,之后一直維持在該水平持續(xù)至成年期。（3）金屬網(wǎng)絡抓握實驗中,在P21時,與WT小鼠相比較,BTBR小鼠抓握時間即掉落潛伏期明顯縮短,之后至P150 BTBR小鼠掉落潛伏期持續(xù)下降并一直顯著低于WT小鼠。（4）爬梯實驗中,與WT小鼠相比較,成年期BTBR小鼠在規(guī)則模式及不規(guī)則模式其爪掉落總次數(shù)均顯著增加,爬梯穿越時間則顯著減少。（5）曠場實驗中,與WT小鼠相比較,成年期BTBR小鼠其總運動路程及中央運動路程均顯著增加,平均運動速度在第一個5分鐘階段顯著增加。（6）加速轉棒實驗中,成年期WT小鼠第二天掉落潛伏期則相比第一天出現(xiàn)顯著提升,之后三天提升更加明顯,而成年期BTBR小鼠直至第五天時才相比第一天出現(xiàn)顯著差異,BTBR小鼠與WT小鼠相比較,其運動學習能力顯著更差,同時BTBR小鼠轉棒運動學習過程中出現(xiàn)注意力缺失樣行為。2、BTBR小鼠生后發(fā)育關鍵期小腦的異常神經(jīng)發(fā)生（1）成年期小腦組織切片DAPI染色結果顯示:BTBR小鼠小腦矢狀切面面積較WT小鼠顯著增大,主要為內顆粒層及分子層面積增大,BTBR小鼠小腦葉片平均數(shù)量較WT小鼠顯著增多。P14時,BTBR小鼠小腦的重量較WT小鼠顯著增加,且BTBR小鼠P14時小腦占大腦的質量百分比較WT小鼠明顯增加。生后小腦發(fā)育關鍵期HE染色結果顯示:BTBR小鼠與WT小鼠小腦葉片數(shù)量在P3時無明顯差異,P7及P14時顯著增多;BTBR小鼠小腦矢狀切面面積較WT小鼠在P3、P7及P14時均顯著增大,BTBR小鼠小腦矢狀切面周長較WT小鼠在P3、P7及P14時均顯著增加。（2）生后一周,小腦GCPs快速增殖并分化為顆粒神經(jīng)元,BrdU和Ki67免疫熒光染色用于分析GCPs的增殖。在P3時,小腦BrdU免疫熒光染色結果顯示:BTBR小鼠外顆粒層厚度較WT小鼠顯著增厚,外顆粒層中BrdU密度、總數(shù)量及其占總細胞百分比均顯著增加。Ki67免疫熒光染色結果顯示:BTBR小鼠小腦外顆粒層Ki67免疫反應陽性細胞較WT小鼠在P3與P7時均顯著增加。（3）P7時Neu N免疫熒光染色結果顯示:NeuN標記的成熟顆粒神經(jīng)元主要位于內顆粒細胞層,BTBR與WT小鼠小腦的外顆粒細胞層與分子層中均未觀察到NeuN標記的異位神經(jīng)元,DAPI染色顯示兩組間外顆粒層厚度無顯著差異。HE染色中,分子層中梭形核可以標識遷移的顆粒神經(jīng)元,我們發(fā)現(xiàn)P7時,BTBR小鼠分子層中梭形核數(shù)量較WT小鼠顯著增加,但其百分比即遷移率無明顯差異。小腦中的伯格曼膠質細胞胞體主要位于蒲肯野細胞層,伯格曼膠質纖維引導顆粒神經(jīng)元的遷移,其胞體和放射狀纖維可以用S100β和GFAP分別進行特異性標識。P7時S100β及GFAP免疫熒光染色結果顯示:BTBR小鼠與WT小鼠相比較,小腦伯格曼細胞胞體數(shù)量及纖維密度均無明顯差異。成年期小腦尼氏染色顯示:BTBR小鼠分子層及顆粒層中成熟顆粒神經(jīng)元數(shù)量及分布較WT小鼠無明顯區(qū)別。以上結果提示BTBR小鼠小腦顆粒神經(jīng)元的遷移以及伯格曼膠質細胞的發(fā)育均未受顯著影響。（4）P14時,BTBR及WT小鼠小腦CB免疫熒光染色標記的蒲肯野細胞其胞體呈單層排布,樹突位于分子層。BTBR小鼠小腦各葉片蒲肯野神經(jīng)元密度與WT小鼠相比較無明顯差異,而在葉片Ⅳ/Ⅴ、Ⅵ/Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ中蒲肯野神經(jīng)元胞體橫截面積較WT小鼠顯著變小。蛋白印跡分析結果顯示P14時BTBR小鼠小腦CB蛋白相對表達量較WT小鼠顯著減少。成年期小腦CB免疫熒光染色結果顯示:BTBR小鼠小腦葉片Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ中蒲肯野細胞密度較WT小鼠顯著降低。（5）高爾基染色結果顯示:P14時BTBR小鼠小腦內蒲肯野細胞樹突覆蓋面積、主樹突長度及樹突復雜程度sholl分析與WT小鼠相比較無明顯差異,但是BTBR小鼠蒲肯野細胞樹突棘密度較WT小鼠顯著增加。根據(jù)樹突棘的形態(tài)進行亞型分析,我們進一步發(fā)現(xiàn)BTBR小鼠蒲肯野細胞樹突棘細長未成熟型較WT小鼠顯著增多,而中間短粗型樹突棘及成熟蘑菇狀樹突棘則較WT小鼠顯著減少。（6）小鼠成年期,GAD67與CB免疫熒光雙標染色結果顯示:GAD67主要分布于蒲肯野神經(jīng)元的胞質中,少量存在于樹突底部,GAD67與CB間存在明顯的雙標重合,且WB檢測進一步證實成年期BTBR小鼠小腦內GAD67蛋白表達較WT小鼠顯著降低。vGlut1與CB免疫熒光雙標染色結果顯示:vGlut1大部分存在于分子層中的平行纖維,圍繞蒲肯野神經(jīng)元的樹突,以及顆粒細胞層中的顆粒神經(jīng)元中,并且vGlut1蛋白表達檢測后發(fā)現(xiàn),BTBR小鼠小腦中vGlut1蛋白表達較WT小鼠顯著增加。3、BTBR小鼠生后發(fā)育關鍵期小腦的基因表達調控（1）P14時BTBR小鼠及WT小鼠小腦新鮮送檢樣本質檢結果均較好,組內樣本相關性較好,且組間基因表達模式存在一定差異。（2）P14小腦全轉錄組測序結果顯示,BTBR小鼠與WT小鼠相比較共有3992個差異表達基因,其中1858個為上調表達基因,2134個為下調表達基因。（3）差異表達基因KEGG通路富集分析中,BTBR小鼠與WT小鼠相比較共有23條改變通路,其中涉及谷氨酸能、膽堿能、多巴胺能、γ-氨基丁酸能、5-羥色胺能等各類突觸遞質相關通路。（4）差異表達基因GO通路富集分析中,BTBR小鼠與WT小鼠相比較在生物過程水平共有16條改變通路,其中多數(shù)涉及神經(jīng)發(fā)生,包括神經(jīng)元分化負性調節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育負性調節(jié)、神經(jīng)發(fā)生負性調節(jié)、細胞生長分化調節(jié)、細胞發(fā)育負性調節(jié)等,而在細胞成分水平則共有50條改變通路,其中涉及很多與突觸膜、軸突、突觸前、突觸后、樹突、樹突棘等突觸成分相關通路。（5）蛋白互作分析中,改變較大及互作聯(lián)系較多的基因主要為下調基因Dynlt1b、Draxin、Rbpj及上調基因Nog、Trpc6、Bdnf,經(jīng)實時熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)BTBR小鼠較WT小鼠這些基因均有顯著改變且與測序結果一致。其中Trpc家族在小腦發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,而BTBR小鼠較WT小鼠Trpc家族相關Trpc4基因及Trpc6下游CamkⅣ基因表達顯著上調,Trpc3基因表達顯著下調。研究結論:BTBR小鼠有明顯的肌張力障礙樣行為、注意力缺陷樣行為、多動樣行為、運動協(xié)調能力下降、精細運動損害及運動學習能力下降等運動障礙,這些運動障礙可能與BTBR小鼠小腦發(fā)育關鍵期異常的小腦神經(jīng)發(fā)生相關,包括葉片形成異常、顆粒神經(jīng)元前體細胞異常增殖、蒲肯野神經(jīng)元發(fā)育異常及突觸聯(lián)系異常,而究其原因可能是發(fā)育期BTBR小鼠基因表達調控模式的改變,在發(fā)育關鍵期影響了小腦的神經(jīng)發(fā)生。
莊燕[10]（2020）在《神經(jīng)遺傳疾病及認知障礙相關基因的RNA選擇性剪接調控機制研究》文中指出RNA選擇性剪接（AS）是基因產(chǎn)生轉錄組、蛋白質組復雜性和多樣性的關鍵機制,并在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與正常功能維持中廣泛存在。既有大量研究顯示,AS的錯誤調控與人類神經(jīng)退行性和認知疾病如阿爾茨海默癥（Alzheimers disease,AD）、肌萎縮側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）、強直性肌營養(yǎng)不良（Myotonic dystrophy,DM）以及神經(jīng)發(fā)育疾病自閉癥（Autism spectrum disorder,ASD）等相關。但是,在眾多已經(jīng)檢測到的AS事件中,究竟哪些事件提供了重要的生物學功能并未完全探明。因此,系統(tǒng)探索和定義AS在疾病背景下的作用,對了解人類遺傳性神經(jīng)疾病的發(fā)生、發(fā)展的分子基礎具有重要意義。針對RNA選擇性剪接與神經(jīng)精神疾病發(fā)生相關聯(lián)的機制,本項研究工作分為以下兩部分:一、探究RNA剪接因子HNRNPA1在神經(jīng)退行性疾病中的新作用。我們的研究揭示了RNA剪接因子HNRNPA1是1型強直性肌營養(yǎng)不良（Myotonic dystrophy type 1,DM1）的一個新致病因子。它在DM1中的作用與CELF1（已經(jīng)被證明的DM1致病明星分子）相類似。HNRNPA1蛋白水平在正常發(fā)育過程中會逐漸下調,但在DM1患者中卻表現(xiàn)出明顯的上調,同時也可以促進DM1相關基因剪接形式由成年向胚胎形式的轉變。但是HNRNPA1與CELF1作用的DM1靶位點池并不完全重疊。我們的研究結果證明DM1疾病特別是選擇性剪接異常的發(fā)生是MBNLs功能喪失,CELF1和HNRNPA1異常上調所致的綜合作用結果;二、探索認知障礙基因即ASD相關基因Neurexins（Nrxns）選擇性剪接調控的機制及生理意義。我們的研究結果表明,Nrxns小外顯子AS3、AS6的AS可受神經(jīng)特異性RNA剪接因子SRRM3、SRRM4調控,其選擇性剪接依賴于神經(jīng)活性的變化。并且,我們的實驗結果還表明,Nrxns小外顯子AS3、AS6的AS會影響Nrxns對突觸后標記分子PSD95和Gephyrin的募集,提示AS3、AS6的選擇性剪接可能也參與調控興奮性與抑制性突觸的平衡。但是對于Nrxns小外顯子AS與高級神經(jīng)活動更為相關的潛在生理學意義,目前還缺乏研究證據(jù),仍需要進一步探索。
二、精細突變小鼠模型的研究進展（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結構并詳細分析其設計過程。在該MMU結構中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結構映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉換過程,TLB結構組織等。該MMU結構將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關信息。
實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關系。
文獻研究法：通過調查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學理論和實踐的需要提出設計。
定性分析法：對研究對象進行“質”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。
跨學科研究法：運用多學科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。
功能分析法：這是社會科學用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、精細突變小鼠模型的研究進展（論文提綱范文）
（1）MERS-CoV與SARS-CoV-2亞單位疫苗與核酸疫苗研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略詞 |
| 引言 |
| 1. 冠狀病毒概述 |
| 1.1 冠狀病毒結構 |
| 1.2 冠狀病毒的感染與復制 |
| 1.3 人類冠狀病毒 |
| 2. 冠狀病毒動物模型研究進展 |
| 3. MERS-CoV與SARS-CoV-2疫苗研究進展 |
| 3.1 滅活病毒疫苗 |
| 3.2 亞單位疫苗與病毒樣顆粒疫苗 |
| 3.3 重組病毒載體疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景與目的 |
| 實驗材料與方法 |
| 1. 實驗材料 |
| 1.1 生物學材料 |
| 1.2 試劑 |
| 1.3 主要儀器設備 |
| 2. 實驗方法 |
| 2.1 質粒構建 |
| 2.2 疫苗制備 |
| 2.3 抗原檢測及表達驗證 |
| 2.4 動物免疫與分組 |
| 2.5 免疫學檢測 |
| 2.6 攻毒保護實驗 |
| 2.7 統(tǒng)計學分析 |
| 結果 |
| 第一部分 MERS-CoV重組亞單位疫苗與mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重組RBD抗原亞單位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重組蛋白設計與制備 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重組抗原設計與構建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重組抗原蛋白的制備與鑒定 |
| 2. 重組抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重組蛋白RBD-T4f誘導高水平的中和抗體 |
| 2.2 重組蛋白RBD-T4f可以誘導特異性細胞免疫應答 |
| 3. 重組抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫應用研究 |
| 3.1 重組蛋白RBD-T4f配合黏膜佐劑誘導系統(tǒng)性體液免疫應答 |
| 3.2 重組蛋白RBD-T4f配合黏膜佐劑誘導呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重組蛋白RBD-T4f配合黏膜佐劑誘導肺組織細胞免疫應答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自擴增mRNA疫苗制備優(yōu)化與體內表達研究 |
| 1.1 自擴增mRNA分子體外轉錄制備優(yōu)化 |
| 1.2 自擴增mRNA疫苗分子可在小鼠體內持續(xù)表達目的蛋白 |
| 2. 基于重組三聚體靶抗原RBD-T4f的兩種mRNA疫苗的設計與構建 |
| 2.1 重組抗原mRNA與自擴增mRNA疫苗設計 |
| 2.2 重組抗原mRNA與自擴增mRNA的表達驗證 |
| 3. 重組抗原RBD-T4f的兩種mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重組抗原mRNA疫苗可誘導有限的體液免疫應答 |
| 3.2 重組抗原mRNA疫苗與自擴增mRNA疫苗誘導較強的細胞免疫應答 |
| 討論 |
| 小結 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性與保護性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗構建與表達鑒定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以誘導中和活性抗體 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗誘導Th1型細胞免疫應答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可產(chǎn)生攻毒保護效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性與保護性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性狀與表達鑒定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗誘導高中和活性且較為持久的體液免疫應答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗誘導廣譜中和活性抗體 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以誘導高水平Th1型細胞免疫應答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可產(chǎn)生持久的保護性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗與DNA疫苗免疫效果比較 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保護效果評價 |
| 討論 |
| 小結 |
| 全文總結 |
| 展望 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（2）EPHA4敲除對大鼠心臟形態(tài)和功能的影響及其機制的初步探索（論文提綱范文）
| 英文縮略詞表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料與方法 |
| 1. 實驗材料 |
| 1.1. 實驗動物 |
| 1.2. 人組織樣品 |
| 1.3. 實驗儀器 |
| 1.4. 實驗試劑 |
| 1.5. 主要試劑配制 |
| 1.6. 聚丙烯酰胺凝膠配制 |
| 1.7. 引物序列 |
| 2. 實驗方法 |
| 2.1. EphA4基因敲除大鼠模型建立 |
| 2.2. 基因組DNA提取與鑒定 |
| 2.2.1 DNA提取 |
| 2.2.2. 聚合酶鏈式反應(PCR) |
| 2.2.3. 瓊脂糖凝膠電泳 |
| 2.3. 生存率分析 |
| 2.4. 組織準備 |
| 2.4.1. 大鼠主要臟器冰凍切片準備 |
| 2.4.2. 大鼠主要臟器凍存組織準備 |
| 2.4.3. 大鼠心臟石蠟切片準備 |
| 2.4.4. 大鼠竇房結石蠟切片準備 |
| 2.4.5. 人心臟石蠟切片準備 |
| 2.5. mCherry熒光觀察 |
| 2.6. H&E染色 |
| 2.7. Masson染色 |
| 2.8. 免疫熒光染色 |
| 2.9. 細胞凋亡原位檢測(Tunel染色) |
| 2.10. 超聲心動描記 |
| 2.11. 磁共振成像 |
| 2.12. 心臟血流動力學檢測 |
| 2.13. 心電描記 |
| 2.14. 心率變異性分析 |
| 2.15. 逆轉錄PCR與實時定量PCR |
| 2.15.1. 逆轉錄PCR |
| 2.15.1.1. 總RNA提取 |
| 2.15.1.2. 去除基因組DNA |
| 2.15.1.3. 逆轉錄合成cDNA |
| 2.15.2. 實時定量PCR |
| 2.16. 蛋白印跡(western blot) |
| 2.16.1. 蛋白質提取 |
| 2.16.2. BCA法測定蛋白濃度 |
| 2.16.3. 蛋白樣品準備 |
| 2.16.4. 蛋白免疫印跡 |
| 2.16.5. 曝光 |
| 2.17. RNA測序 |
| 3. 統(tǒng)計分析 |
| 第三章 結果 |
| 1. EPHA4敲除大鼠的建立 |
| 2. EPHA4敲除大鼠基本表型分析 |
| 3. mCherry在EPHA4敲除大鼠不同組織中的表達模式 |
| 4. EPHA4在大鼠心臟組織中的表達 |
| 5. EPHA4在人心臟組織中的表達 |
| 6. EPHA4敲除引起大鼠心臟重構 |
| 6.1. EPHA4敲除引起大鼠心房重量增加 |
| 6.2. EPHA4敲除引起大鼠心房擴張 |
| 6.3. EPHA4敲除降低大鼠左心室功能但幾乎不影響左心室形態(tài) |
| 6.4. EPHA4敲除改變大鼠心房容積并降低心房射血分數(shù) |
| 6.5. EPHA4敲除降低大鼠中心靜脈壓 |
| 6.6. EPHA4敲除誘導大鼠心電p波消失以及多項心電參數(shù)異常 |
| 6.7. EPHA4敲除引起大鼠心率變異性時域參數(shù)和頻域參數(shù)改變 |
| 7. EPHA4敲除引起大鼠心臟組織學改變 |
| 7.1. EPHA4敲除引起大鼠心房心肌細胞肥厚 |
| 7.2. EPHA4敲除誘導大鼠膠原纖維表達呈升高趨勢 |
| 7.3. EPHA4敲除對大鼠心房細胞凋亡沒有明顯影響 |
| 7.4. EPHA4敲除引起大鼠竇房結組織學改變 |
| 8. EPHA4敲除誘導大鼠心房結構和功能重塑的潛在分子機制 |
| 8.1. 配體ephrinA1和B2在野生大鼠心房組織中高表達 |
| 8.2. EPHA4敲除引起大鼠心房離子通道相關基因改變 |
| 8.3. EPHA4敲除誘導大鼠心房組織中IGF1表達量下降 |
| 9. EPHA4敲除引起大鼠心房組織轉錄組改變 |
| 9.1. EphA4基因敲除組與對照組大鼠心房差異表達基因GO分類 |
| 9.2. EphA4基因敲除組與對照組大鼠心房中Eph家族成員表達情況 |
| 9.3. EphA4基因敲除組與對照組大鼠心房差異基因功能和信號通路富集 |
| 第四章 討論 |
| 1. EPHA4敲除大鼠動物模型 |
| 2. 成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中EPHA4的表達 |
| 3. 成年大鼠外周組織中EPHA4的表達與作用 |
| 4. EPH家族成員在心臟組織中的表達及功能 |
| 5. EPHA4敲除誘導大鼠心房重塑的潛在機制 |
| 第五章 結論 |
| 參考文獻 |
| 基金資助 |
| 已發(fā)表與學位論文相關的英文論文 |
| 文獻綜述 EPHA4在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用 |
| 1. 前言 |
| 2. EphA4與神經(jīng)退行性疾病 |
| 2.1. 阿爾茲海默癥 |
| 2.2. 肌萎縮性側索硬化癥(漸凍癥) |
| 2.3. EPHA4與多發(fā)性硬化癥 |
| 3. EPHA4與中樞神經(jīng)損傷 |
| 3.1. 腦外傷與脊髓損傷 |
| 3.2. 腦卒中/中風 |
| 4. EPHA4與癲癇 |
| 5. EPHA4與抑郁癥 |
| 6. 小結 |
| 綜述參考文獻 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（3）高精度高內涵小鼠全腦圖譜構建及其在阿爾茲海默癥小鼠中的應用（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 全腦尺度成像和標記技術的發(fā)展 |
| 1.2 顯微光學切片斷層成像技術用于全腦高分辨成像 |
| 1.3 AD相關的腦血管研究 |
| 1.3.1 AD相關腦血流變化 |
| 1.3.2 AD相關腦血管結構性變化 |
| 1.3.2.1 腦血管細胞病理變化 |
| 1.3.2.2 腦血管基底膜病理變化 |
| 1.3.3 全腦血管成像技術簡述 |
| 1.3.3.1 腦血流變化的檢測 |
| 1.3.3.2 全腦尺度血管構筑成像 |
| 1.4 淀粉樣斑塊及其周圍多種結構的研究 |
| 1.4.1 Aβ斑塊成像方法研究 |
| 1.4.2 Aβ斑塊形態(tài)特征及分布 |
| 1.4.3 Aβ斑塊對神經(jīng)結構的影響 |
| 1.5 本文立題依據(jù) |
| 1.6 本文研究內容 |
| 1.6.1 MOST技術應用平臺與高通量圖像數(shù)據(jù)分析流程搭建 |
| 1.6.2 獲取高分辨全腦血管圖譜跨尺度研究AD病理中腦血管的變化 |
| 1.6.3 全腦尺度多種結構信息的同步可視化 |
| 1.6.4 其他工作 |
| 第2章 MOST技術應用拓展與高通量數(shù)據(jù)分析流程搭建 |
| 2.1 實驗動物 |
| 2.2 材料與試劑配制 |
| 2.3 實驗方法 |
| 2.3.1 Nissl染色小鼠全腦樣本制備方法 |
| 2.3.2 小鼠全腦樣本數(shù)據(jù)采集 |
| 2.3.3 圖像預處理與優(yōu)化 |
| 2.3.4 海馬結構的手動分割 |
| 2.3.5 血管網(wǎng)絡的可視化 |
| 2.3.6 血管網(wǎng)絡的定量分析 |
| 2.3.7 統(tǒng)計分析 |
| 2.4 實驗結果 |
| 2.4.1 MOST系統(tǒng)整體工作流程 |
| 2.4.2 MOST圖像預處理與優(yōu)化處理 |
| 2.4.3 冠狀面厚切片的直接體繪制與MIP渲染 |
| 2.4.4 海馬結構手動分割及信息提取 |
| 2.4.5 海馬內血管分布模式分析 |
| 2.5 本章小結 |
| 第3章 AD模型小鼠全腦血管構筑研究 |
| 3.1 實驗動物 |
| 3.2 實驗方法 |
| 3.2.1 WT與APP/PS1小鼠海馬血管網(wǎng)絡的系列可視化與比較分析流程 |
| 3.2.2 統(tǒng)計分析 |
| 3.3 實驗結果 |
| 3.3.1 APP/PS1小鼠海馬血管系統(tǒng)異常 |
| 3.3.2 APP/PS1小鼠海馬血管灌注面積降低 |
| 3.3.3 APP/PS1小鼠虛擬血管內窺影像分析 |
| 3.4 本章小結 |
| 第4章 全腦Aβ斑塊及其周圍多結構同步可視化 |
| 4.1 實驗動物 |
| 4.2 實驗方法 |
| 4.2.1 5×FAD小鼠全腦Nissl染色樣本的制備與采集 |
| 4.2.2 熒光標記方法驗證全腦Nissl染色方法顯示Aβ斑塊的正確性 |
| 4.2.3 石蠟切片常規(guī)Nissl染色 |
| 4.2.4 全腦多種結構信息的同步可視化 |
| 4.2.5 5×FAD小鼠灌胃給藥實驗及后續(xù)圖像分析 |
| 4.3 實驗結果 |
| 4.3.1 MOST結合小鼠全腦Nissl染色獲得多結構信號的同步顯示 |
| 4.3.2 不同灰度分布的多結構信號的同步可視化方法 |
| 4.3.3 Aβ斑塊分布的全腦可視化 |
| 4.3.4 全腦Aβ斑塊及其周圍胞體、神經(jīng)束、血管的同步可視化 |
| 4.3.5 皮層和海馬局部區(qū)域Aβ斑塊、胞體及血管的空間分布關聯(lián)性 |
| 4.3.6 Aβ斑塊周圍神經(jīng)樹突的結構異常 |
| 4.3.7 Aβ斑塊相關的血管損傷 |
| 4.3.8 全腦多種結構同步可視化評價可替寧對AD小鼠的影響 |
| 4.4 本章小結 |
| 第5章 結論與展望 |
| 5.1 主要內容總結 |
| 5.2 主要創(chuàng)新點 |
| 5.3 研究意義 |
| 5.4 展望 |
| 第6章 其他工作:MOST/FMOST技術應用于肺臟研究 |
| 6.1 材料與試劑配制 |
| 6.2 實驗方法 |
| 6.2.1 小鼠全肺Nissl染色樣本的制備與采集 |
| 6.2.2 小鼠全肺熒光樣本的制備與采集 |
| 6.2.3 全肺數(shù)據(jù)集的處理與可視化 |
| 6.3 實驗結果 |
| 6.3.1 MOST結合全肺Nissl染色實現(xiàn)小鼠全肺氣道和血管系統(tǒng)的高精度重建 |
| 6.3.2 小鼠氣道和血管系統(tǒng)的三維形態(tài)特征分析 |
| 6.3.3 全肺尺度可吸入制劑顆粒分布的高精度分析 |
| 6.3.4 局部區(qū)域呼吸道內表面聚集的可吸入顆粒分析 |
| 6.4 總結與討論 |
| 參考文獻 |
| 已發(fā)表論文或授權專利 |
| 致謝 |
| 附錄Ⅰ 英文縮寫詞表 |
（4）人參皂苷Rg1和Rb1改善航天失重效應與睡眠干擾所致認知功能減退作用及機制研究（論文提綱范文）
| 縮略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 文獻綜述 線粒體與認知功能障礙關系的研究進展 |
| 參考文獻 |
| 前言 |
| 第一章 模擬航天失重模型的建立與評價 |
| 第一節(jié) 模擬失重模型的建立 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 第二節(jié) 基于自發(fā)活動原理的認知行為改變的研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 第三節(jié) 基于懲罰原理的認知行為改變的研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 第四節(jié) 基于獎賞操作方法的認知行為改變的研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 本章小結 |
| 第二章 基于空間及聯(lián)想記憶的人參皂苷Rg1和Rb1改善模擬失重所致認知減退作用及機制研究 |
| 第一節(jié) 人參皂苷Rg1和Rb1改善模擬失重所致認知功能減退藥效學研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 第二節(jié) 人參皂苷Rg1和Rb1改善模擬失重所致認知功能減退作用機制研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 本章小結 |
| 第三章 基于復雜操作任務的人參皂苷Rg1和Rb1改善模擬失重所致認知減退作用及機制研究 |
| 第一節(jié) 人參皂苷Rg1和Rb1改善模擬失重所致復雜操作能力下降的藥效學研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 第二節(jié) 人參皂苷Rg1和Rb1改善模擬失重所致復雜操作能力下降的機制研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 本章小結 |
| 第四章 人參皂苷Rg1、Rb1改善慢性睡眠干擾所致認知功能減退的作用及機制研究 |
| 第一節(jié) 人參皂苷Rg1、Rb1改善慢性睡眠干擾所致認知功能減退的藥效學研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 第二節(jié) 人參皂苷Rg1、Rb1改善慢性睡眠干擾所致認知功能減退的作用機制研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 統(tǒng)計分析 |
| 4 實驗結果 |
| 5 討論 |
| 本章小結 |
| 全文總結 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 個人簡介 |
（5）RIPK1切割位點變異導致新型自身炎癥性疾病的分子機制研究（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 1 緒論 |
| 1.1 自身炎癥性疾病 |
| 1.1.1 自身炎癥性疾病概述 |
| 1.1.2 炎性小體激活和白介素依賴的自身炎癥性疾病 |
| 1.1.3 NF-κB信號通路激活依賴的自身炎癥性疾病 |
| 1.1.4 I型干擾素信號通路激活依賴的自身炎癥性疾病 |
| 1.1.5 補體途徑依賴的自身炎癥性疾病 |
| 1.1.6 其他自身炎癥性疾病 |
| 1.2 程序性細胞死亡 |
| 1.2.1 細胞凋亡 |
| 1.2.2 程序性壞死 |
| 1.2.3 細胞焦亡 |
| 1.2.4 其他形式的程序性細胞死亡 |
| 1.2.5 程序性細胞死亡與自身炎癥性疾病 |
| 1.3 RIPK1及其參與的信號通路 |
| 1.3.1 RIP激酶家族概述 |
| 1.3.2 TNFR1 誘導的炎癥和細胞死亡信號通路 |
| 1.3.3 TLR3和TLR4 信號通路 |
| 1.3.4 RLRs信號通路 |
| 1.3.5 RIPK1的促細胞存活功能 |
| 1.3.6 RIPK1激活依賴的炎癥反應 |
| 1.3.7 靶向RIPK1的人類疾病研究 |
| 1.4 課題研究目的與意義 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 實驗材料 |
| 2.1.1 臨床樣本和資料 |
| 2.1.2 細胞系、質粒和菌株 |
| 2.1.3 實驗試劑、耗材及設備 |
| 2.2 實驗方法 |
| 2.2.1 臨床樣本的收集和處理 |
| 2.2.2 質粒構建與制備 |
| 2.2.3 細胞的培養(yǎng)、凍存和復蘇 |
| 2.2.4 細胞轉染 |
| 2.2.5 基因敲除細胞系構建 |
| 2.2.6 熒光素酶報告基因檢測 |
| 2.2.7 多重液相蛋白定量 |
| 2.2.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗 |
| 2.2.9 細胞總RNA提取和反轉錄 |
| 2.2.10 實時熒光定量PCR |
| 2.2.11 蛋白免疫印跡 |
| 2.2.12 細胞存活和死亡檢測 |
| 2.2.13 流式細胞術 |
| 2.2.14 細胞內活性氧測定 |
| 2.2.15 RIPK1體外切割實驗 |
| 2.2.16 轉錄組測序及數(shù)據(jù)分析 |
| 2.2.17 基因變異位點分析與預測 |
| 2.2.18 數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計學分析 |
| 3 實驗結果 |
| 3.1 自身炎癥性疾病患者攜帶新發(fā)的RIPK1切割位點變異 |
| 3.1.1 患者臨床特征和遺傳分析 |
| 3.1.2 RIPK1第324 位天冬氨酸的保守性和變異致病性分析 |
| 3.1.3 RIPK1第324 位天冬氨酸變異不影響其蛋白穩(wěn)定性和蛋白互作 |
| 3.1.4 RIPK1第324 位天冬氨酸變異導致其不能被caspase-8 蛋白酶切割 |
| 3.2 攜帶RIPK1切割位點變異的患者細胞中炎癥信號過度激活 |
| 3.2.1 患者體內炎性細胞因子水平升高 |
| 3.2.2 患者PBMCs中細胞因子水平升高 |
| 3.2.3 患者PBMCs中 MAPK和 IL-6/JAK/STAT3 信號通路激活水平升高 |
| 3.2.4 患者PBMCs中炎癥信號通路激活水平升高 |
| 3.3 RIPK1切割位點變異促進小鼠MEFs中程序性壞死和細胞凋亡 |
| 3.3.1 RIPK1切割位點變異促進TNF誘導的細胞死亡 |
| 3.3.2 RIPK1切割位點變異促進復合體II的形成 |
| 3.3.3 RIPK1切割位點變異促進細胞死亡依賴其激酶活性 |
| 3.3.4 RIPK1切割位點變異促進TNF誘導的細胞凋亡 |
| 3.3.5 RIPK1切割位點變異促進其他死亡受體誘導的細胞死亡 |
| 3.4 RIPK1切割位點變異促進患者PBMCs中程序性壞死和細胞凋亡 |
| 3.4.1 患者PBMCs中細胞死亡相關基因的轉錄水平升高 |
| 3.4.2 RIPK1切割位點變異促進PBMCs中TNF誘導的細胞死亡 |
| 3.4.3 患者體內細胞壞死激活水平升高 |
| 3.4.4 患者PBMCs中細胞壞死依賴的IL6轉錄水平升高 |
| 3.5 攜帶RIPK1切割位點變異的患者fibroblasts抵抗細胞死亡誘導 |
| 3.5.1 患者fibroblasts抵抗TNF誘導的細胞壞死 |
| 3.5.2 患者fibroblasts抵抗細胞壞死的補償機制 |
| 3.5.3 患者fibroblasts抵抗氧化應激誘導的鐵死亡 |
| 3.6 RIPK1切割位點變異促進RIPK1激活依賴的炎癥反應 |
| 3.6.1 TNF誘導患者PBMCs中RIPK1激活依賴的炎癥反應 |
| 3.6.2 TNF誘導小鼠MEFs中RIPK1激活依賴的炎癥反應 |
| 3.6.3 攜帶RIPK1切割位點變異的患者響應IL-6 受體抑制劑治療 |
| 3.7 RIPK1切割位點變異不促進NF-κB信號通路激活 |
| 3.7.1 切割位點變異減弱了HEK293T細胞中RIPK1促進的NF-κB激活 |
| 3.7.2 RIPK1切割位點變異不影響MEFs中TRAIL誘導的NF-κB激活 |
| 3.7.3 RIPK1切割位點變異不影響fibroblasts中TNF誘導的NF-κB激活 |
| 4 結論 |
| 5 討論和展望 |
| 5.1 RIPK1變異導致免疫缺陷或者自身炎癥性疾病 |
| 5.2 RIPK1變異導致細胞程序性死亡的調節(jié)異常 |
| 5.3 RIPK1變異導致炎癥信號通路的調節(jié)異常 |
| 5.4 針對RIPK1變異患者的臨床治療 |
| 6 參考文獻 |
| 7 附錄 |
| 7.1 實驗抗體和試劑列表 |
| 7.2 實驗耗材和設備列表 |
| 7.3 主要溶液及配制方法 |
| 作者簡歷及在讀期間取得的科研成果 |
| 答辯決議書 |
（6）肺動脈高壓遺傳圖譜繪制與遺傳性肺動脈高壓動物模型構建（論文提綱范文）
| 第一部分 中國肺動脈高壓患者BMPR2基因突變圖譜繪制 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 研究隊列與方法 |
| 2.1 研究隊列 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 統(tǒng)計分析 |
| 3. 研究結果 |
| 3.1 BMPR2罕見變異的特征 |
| 3.2 Arg491是BMPR2基因的熱點突變 |
| 4. 討論 |
| 參考文獻 |
| 第二部分 遺傳性肺動脈高壓大鼠模型構建 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 研究對象與方法 |
| 2.1 研究對象 |
| 2.2 實驗材料及儀器 |
| 2.3 實驗方法 |
| 2.4 統(tǒng)計分析 |
| 3. 研究結果 |
| 3.1 構建Bmpr2 p.R491W突變定點敲入大鼠模型 |
| 3.2 Bmpr2~(+/R491W)大鼠低氧誘導的肺動脈高壓表型更惡劣 |
| 3.3 Bmpr2~(+/R491W)大鼠BMPR2蛋白及其下游信號通路標記物表達量 |
| 3.4 Bmpr2~(+/R491W)大鼠出現(xiàn)明顯肺血管重構 |
| 3.5 轉錄組學篩選下游靶點 |
| 4. 討論 |
| 參考文獻 |
| 第三部分 特發(fā)性肺動脈高壓患者遺傳圖譜繪制 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 研究隊列與研究方法 |
| 2.1 研究隊列 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 統(tǒng)計分析 |
| 3. 結果 |
| 3.1 患者隊列的描述 |
| 3.2 21個PAH易感基因罕見變異的分布 |
| 3.3 易感基因罕見變異攜帶者臨床表型更差 |
| 3.4 兒童和成人特發(fā)性PAH患者易感基因罕見變異情況 |
| 3.5 男性和女性特發(fā)性PAH患者易感基因變異情況 |
| 3.6 易感基因罕見變異與長期預后的關聯(lián) |
| 4. 討論 |
| 參考文獻 |
| 綜述1 肺動脈高壓的分子遺傳學基礎 |
| 參考文獻 |
| 綜述2 肺動脈高壓的主要動物模型特點 |
| 參考文獻 |
| 總結 |
| 英漢縮略語名詞對照 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
| 1. 基本信息 |
| 2. 教育背景 |
| 3. 學術會議發(fā)言 |
| 4. 在讀期間發(fā)表論文 |
（7）視網(wǎng)膜色素變性致病基因的鑒定及基因治療研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 視網(wǎng)膜色素變性致病基因研究 |
| 1.1.1 視網(wǎng)膜色素變性的臨床特征 |
| 1.1.2 視網(wǎng)膜色素變性基因研究現(xiàn)狀 |
| 1.2 全外顯子組測序技術是篩選遺傳性疾病致病基因的有效方法 |
| 1.3 視網(wǎng)膜色素變性基因治療研究 |
| 1.3.1 基因治療研究現(xiàn)狀 |
| 1.3.2 視網(wǎng)膜色素變性基因治療研究的必要性及科學意義 |
| 1.4 本文的主要創(chuàng)新及結構安排 |
| 1.4.1 本文的主要創(chuàng)新 |
| 1.4.2 本文的結構安排 |
| 第二章 研究對象與實驗材料及研究方法 |
| 2.1 研究對象與實驗材料 |
| 2.1.1 兩個視網(wǎng)膜色素變性家系 |
| 2.1.2 主要實驗儀器和試劑耗材 |
| 2.1.3 實驗質粒載體菌種和細胞系 |
| 2.1.4 實驗小鼠 |
| 2.1.5 實驗所用引物列表 |
| 2.1.6 實驗所用抗體列表 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 全外顯子組測序 |
| 2.2.2 Sanger測序驗證 |
| 2.2.3 小鼠基因分型 |
| 2.2.4 小鼠視網(wǎng)膜蛋白免疫印跡實驗 |
| 2.2.5 小鼠視網(wǎng)膜組織免疫組化實驗 |
| 2.2.6 小鼠視網(wǎng)膜電生理 |
| 2.2.7 腺相關病毒質粒載體的構建 |
| 2.2.8 細胞培養(yǎng)及三元載體轉染 |
| 2.2.9 病毒收集純化濃縮 |
| 2.2.10 病毒滴度dd PCR定量及侵染能力檢測 |
| 2.2.11 病毒注射 |
| 2.3 本章小結 |
| 第三章 兩個視網(wǎng)膜色素變性家系實驗結果與討論 |
| 3.1 臨床信息與全外顯子組測序結果 |
| 3.1.1 臨床信息 |
| 3.1.2 全外顯子組測序結果 |
| 3.2 Sanger測序驗證結果及突變位點生物信息學分析結果 |
| 3.2.1 Sanger測序驗證結果 |
| 3.2.2 突變位點生物信息學分析結果 |
| 3.3 相關基因研究與討論 |
| 3.4 本章小結 |
| 第四章 基因治療流程初步建立相關結果與討論 |
| 4.1 Rpe65 基因自發(fā)點突變小鼠突變位點及表型鑒定結果 |
| 4.2 腺相關病毒質粒構建結果 |
| 4.3 三元載體轉染細胞結果 |
| 4.4 病毒質量及體外侵染能力檢測結果 |
| 4.5 體內評價病毒效果 |
| 4.6 初步研究結果與討論 |
| 4.7 本章小結 |
| 第五章 總結與展望 |
| 5.1 本文工作總結 |
| 5.2 未來展望 |
| 致謝 |
| 參考文獻 |
| 碩士期間所取得的學術成果 |
（8）EMC3基因視網(wǎng)膜和小腦神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的功能研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 研究工作的背景與意義 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意義 |
| 1.2 神經(jīng)退行性疾病國內外研究歷史與現(xiàn)狀 |
| 1.2.1 Emc3基因研究歷史與現(xiàn)狀 |
| 1.2.2 神經(jīng)退行性疾病發(fā)病種類和機制研究進展 |
| 1.3 本文的主要貢獻與創(chuàng)新 |
| 1.3.1 主要貢獻 |
| 1.3.2 創(chuàng)新 |
| 1.4 論文結構安排 |
| 1.5 結語 |
| 第二章 EMC3基因在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的功能研究 |
| 2.1 課題背景 |
| 2.1.1 腦神經(jīng)元病變 |
| 2.1.2 視網(wǎng)膜神經(jīng)元病變 |
| 2.2 選題依據(jù) |
| 2.2.1 EMC1基因突變導致腦和視網(wǎng)膜退行性疾病 |
| 2.2.2 EMC3是果蠅感光細胞合成視紫紅質和多通道膜蛋白所必需 |
| 2.2.3 EMC3和EMC1 是以復合物形式存在 |
| 2.3 研究背景 |
| 2.3.1 內質網(wǎng)相關蛋白的合成和降解途徑 |
| 2.3.2 內質網(wǎng)應激介導的非折疊蛋白應答途徑 |
| 2.4 研究流程和關鍵技術 |
| 2.5 前期研究 |
| 2.5.1 已經(jīng)報道的EMC1突變進行WB分析 |
| 2.5.2 EMC3在COS7 細胞內與EMC其他亞基的表達及定位分析 |
| 2.5.3 EMC5在COS7 細胞內與EMC其他亞基的表達及定位分析 |
| 2.5.4 內質網(wǎng)膜蛋白復合物亞基免疫共沉淀及WB檢測 |
| 2.6 展望未來 |
| 2.7 本章小結 |
| 第三章 Emc3缺失導致小腦共濟失調和浦肯野細胞變性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 實驗技術原理 |
| 3.2.2 實驗所用材料 |
| 3.2.3 實驗所用方法 |
| 3.3 實驗結果 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9-lox P系統(tǒng)構建Emc3 基因敲除小鼠模型 |
| 3.3.2 利用PCR技術對Emc3 CKO小鼠DNA進行基因分型 |
| 3.3.3 Emc3 CKO條件性敲除小鼠生長發(fā)育異常 |
| 3.3.4 Emc3 CKO條件敲除型小鼠小腦發(fā)育異常 |
| 3.3.5 Emc3 CKO條件敲除型小鼠行為學異常 |
| 3.3.6 Emc3 CKO條件型敲除小鼠的磁共振成像 |
| 3.3.7 Emc3 CKO條件型敲除小鼠進行性小腦萎縮和浦肯野細胞丟失 |
| 3.3.8 Emc3 CKO條件敲除型小鼠浦肯野細胞變性和星形膠質細胞增生 |
| 3.3.9 Emc3 CKO小鼠浦肯野細胞中Emc3 的缺失導致內質網(wǎng)應激 |
| 3.4 討論 |
| 3.4.1 浦肯野細胞Emc3缺失影響小鼠的運動協(xié)調能力 |
| 3.4.2 星形膠質細胞激活與浦肯野細胞死亡的關系 |
| 3.4.3 浦肯野細胞Emc3缺失怎樣激發(fā)內質網(wǎng)應激 |
| 3.5 本章小結 |
| 第四章 Emc3的丟失導致視網(wǎng)膜桿狀雙極細胞變性 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 實驗材料和方法 |
| 4.3.1 實驗技術原理 |
| 4.3.2 實驗所用材料 |
| 4.3.3 實驗所用方法 |
| 4.4 結果 |
| 4.4.1 Emc3在視網(wǎng)膜上的表達定位 |
| 4.4.2 Emc3 CKO小鼠Emc3 表達水平降低 |
| 4.4.3 Emc3 CKO小鼠視網(wǎng)膜的生理功能分析 |
| 4.4.4 PKCα抗體對小鼠視網(wǎng)膜冰凍切片進行免疫染色 |
| 4.4.5 感光細胞抗體對小鼠視網(wǎng)膜冰凍切片進行免疫染色 |
| 4.4.6 免疫組化和H&E染色結果 |
| 4.4.7 Emc3缺失損害視桿細胞和視桿雙極細胞之間的突觸傳遞 |
| 4.4.8 Emc3 CKO視網(wǎng)膜中的反應性神經(jīng)膠質增生 |
| 4.5 討論 |
| 4.6 本章小結 |
| 第五章 玻璃體視網(wǎng)膜病變FZD4和NDP基因突變研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料與方法 |
| 5.2.1 倫理聲明 |
| 5.2.2 全外顯子組測序和變異確認 |
| 5.2.3 表達質粒的構建 |
| 5.2.4 熒光素酶報告分析 |
| 5.2.5 FZD4在細胞中的表達研究 |
| 5.3 結果 |
| 5.3.1 測序結果分析 |
| 5.3.2 突變FZD4 蛋白介導的Norrin信號缺陷 |
| 5.4 討論 |
| 5.5 本章小結 |
| 第六章 全文總結與展望 |
| 6.1 全文總結 |
| 6.2 后續(xù)工作展望 |
| 致謝 |
| 參考文獻 |
| 附錄 中英文縮寫表 |
| 攻讀博士學位期間取得的成果 |
（9）小腦異常神經(jīng)發(fā)生參與自閉癥模型小鼠運動障礙及其相關機制研究（論文提綱范文）
| 英文縮寫覽表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 BTBR小鼠的運動障礙表型 |
| 1.1 材料與方法 |
| 1.2 實驗結果 |
| 1.3 討論 |
| 1.4 小結 |
| 第二部分 BTBR小鼠生后發(fā)育關鍵期小腦的異常神經(jīng)發(fā)生 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.2 實驗結果 |
| 2.3 討論 |
| 2.4 小結 |
| 第三部分 BTBR小鼠生后發(fā)育關鍵期小腦的基因表達調控 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.2 實驗結果 |
| 3.3 討論 |
| 3.4 小結 |
| 全文總結 |
| 參考文獻 |
| 文獻綜述 自閉癥與運動功能障礙相關研究進展 |
| 參考文獻 |
| 博士研究期間科研成果 |
| 致謝 |
（10）神經(jīng)遺傳疾病及認知障礙相關基因的RNA選擇性剪接調控機制研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要縮略詞表 |
| 緒論 |
| 第一章 文獻綜述 |
| 1.1 選擇性剪接機制 |
| 1.2 選擇性剪接模式 |
| 1.3 神經(jīng)系統(tǒng)中的RNA選擇性剪接調節(jié)因子 |
| 1.3.1 神經(jīng)特異性剪接調控因子SRRM4(nSR100)和SRRM3 |
| 1.3.1.1 SRRM4(nSR100) |
| 1.3.1.2 SRRM3 |
| 1.3.2 PTBP在神經(jīng)發(fā)生中的作用 |
| 1.3.3 Nova蛋白 |
| 1.3.4 Rbfox家族 |
| 1.3.5 KHDRBSs(含KH結構域RNA結合信號轉導相關蛋白) |
| 1.3.6 Hu/ELAV(神經(jīng)元特異性哺乳動物胚胎致死異常視覺樣蛋白) |
| 1.3.7 HNRNPA1 |
| 1.3.8 CELF1( CUGBP1) |
| 1.3.9 MBNL(類肌盲蛋白) |
| 1.4 選擇性剪接與神經(jīng)疾病的關系 |
| 1.4.1 選擇性剪接與神經(jīng)退行性疾病 |
| 1.4.1.1 Alzheimers disease(AD)阿爾茨海默癥 |
| 1.4.1.2 Parkinson’s disease(PD)帕金森氏癥 |
| 1.4.1.3 Amyotrophic Lateral Sclerosis-Frontotemporal Dementia肌萎縮側索硬化癥與額顳部癡呆 |
| 1.4.1.4 Myotonicdystrophy( DM)強直性肌營養(yǎng)不良 |
| 1.4.2 選擇性剪接與神經(jīng)發(fā)育疾病 |
| 1.5 Neurexins的選擇性剪接 |
| 1.5.1 Neurexins的結構 |
| 1.5.2 Neurexins基因選擇性剪接的調控 |
| 1.5.3 Neurexins的功能 |
| 1.6 展望 |
| 第二章 實驗材料與方法 |
| 2.1 小鼠品系與飼養(yǎng) |
| 2.2 重組質粒制備 |
| 2.3 細胞培養(yǎng) |
| 2.3.1 常規(guī)細胞系培養(yǎng)、轉染 |
| 2.3.2 神經(jīng)元細胞的原代培養(yǎng)和共培養(yǎng) |
| 2.3.3 小鼠成肌細胞的原代培養(yǎng)及慢病毒感染 |
| 2.4 免疫熒光染色 |
| 2.5 免疫印記 |
| 2.6 RNA提取及real-time RT-PCR |
| 2.7 小鼠腦組織原位雜交 |
| 2.7.1 腦組織冷凍切片的制備 |
| 2.7.2 原位雜交 |
| 2.8 圖像采集與統(tǒng)計分析 |
| 第三章 結果與討論 |
| 第一節(jié) HNRNPA1在DM1 疾病中的作用 |
| 3.1 在DM1 小鼠模型中全身性過表達HNRNPA1 |
| 3.2 在DM1 小鼠模型中過表達HNRNPA1 會誘導DM1 表型和肌肉病理改變 |
| 3.2.1 全身性過表達HNRNPA1 誘導DM1 表型的產(chǎn)生及縮短HSA~(LR)小鼠的壽命 |
| 3.2.2 全身性過表達HNRNPA1 誘導HSA~(LR)小鼠產(chǎn)生DM1相關肌肉病理改變 |
| 3.3 HNRNPA1在HSA~(LR)小鼠中誘導DM1 靶基因的錯誤剪接 |
| 3.3.1 HNRNPA1全身性過表達導致DM1靶基因剪接異常 |
| 3.3.2 HNRNPA1 肌肉過表達導致DM1 靶位點剪接異常 |
| 3.4 體外過表達HNRNPA1 導致DM1 靶基因剪接異常 |
| 3.4.1 成肌細胞體外分化體系的建立及內源性DM1 靶基因在該體系中的剪接變化 |
| 3.4.2 體外過表達HNRNPA1 導致內源DM1 靶基因剪接異常 |
| 3.5 HNRNPA1 直接結合DM1 靶基因進行剪接調控 |
| 3.6 HNRNPA1 直接與MBNL1 調控的外顯子側翼內含子上游結合拮抗MBNL1 的作用 |
| 3.7 HNRNPA1 主要在發(fā)育早期發(fā)揮作用 |
| 3.7.1 HNRNPA1 及相關RNA結合蛋白在肌肉發(fā)育過程中的表達譜系 |
| 3.7.2 肌肉再生實驗進一步證明HNRNPA1 主要在發(fā)育早期發(fā)揮作用 |
| 3.8 HNRNPA1在DM1 活檢肌肉樣本中轉錄水平及蛋白質表達量均增加 |
| 3.9 DM1 發(fā)病機制中RNA結合蛋白共失調模型 |
| 3.10 討論 |
| 3.10.1 HNRNPA1在DM1 中的作用 |
| 3.10.2 DM1 致病機制模型對其他非穩(wěn)定微衛(wèi)星疾病病理機制的意義 |
| 3.10.3 DM1 的潛在治療途徑 |
| 第二節(jié) RNA剪接調控因子對Nrxns選擇性剪接的調控 |
| 3.1 體外篩選調控Nrxns選擇性剪接的RNA剪接調控因子 |
| 3.1.1 候選RNA剪接因子的篩選與構建 |
| 3.1.2 Nrxns的 mini-gene報告載體的構建 |
| 3.2 體外驗證SRRM4與SRRM3對Nrxns的剪接調控作用 |
| 3.2.1 SRRM4對Nrxns選擇性剪接位點的調控更廣泛 |
| 3.2.2 SRRM3對Nrxns選擇性剪接的調控作用 |
| 3.2.3 Nrxns AS6 的選擇性剪接調控具有神經(jīng)特異性 |
| 3.3 在原代神經(jīng)元中過表達SRRM3和SRRM4 促進Nrxns小外顯子的包含 |
| 3.4 SRRM4和SRRM3 在成年鼠中腦亞區(qū)的分布 |
| 3.5 SRRM3和SRRM4 干擾序列的篩選 |
| 3.6 在小鼠大腦亞區(qū)-海馬體敲降SRRM3 抑制Nrxn1/3 小外顯子(AS6)的包含效應 |
| 3.7 在小鼠大腦亞區(qū)-海馬體敲降SRRM4抑制Nrxn1/3小外顯子(AS6)的包含效應 |
| 3.8 不同Nrxns剪接產(chǎn)物對突觸后配體的募集效應 |
| 3.8.1 構建包含特定剪接位點的Nrxns蛋白 |
| 3.8.2 Nrxns對興奮性突觸后骨架分子PSD95 的募集 |
| 3.8.3 Nrxns對抑制性突觸后骨架分子Gephyrin的募集 |
| 3.9 Nrxns的選擇性剪接依賴神經(jīng)活性 |
| 3.10 SRRM4和SRRM3 的表達依賴神經(jīng)活性 |
| 3.11 工作計劃及展望 |
| 3.12 討論 |
| 3.12.1 SRRM4 介導的神經(jīng)小外顯子的選擇性剪接與ASD相關 |
| 3.12.2 SRRM4 調控Nrxns神經(jīng)小外顯子的選擇性剪接 |
| 3.12.3 SRRM3與SRRM4 功能的冗余 |
| 3.12.4 Nrxns的選擇性剪接調控是神經(jīng)元活性依賴的 |
| 3.12.5 研究Nrxns基因小外顯子選擇性剪接的意義 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 作者簡介 |
四、精細突變小鼠模型的研究進展（論文參考文獻）
- [1]MERS-CoV與SARS-CoV-2亞單位疫苗與核酸疫苗研究[D]. 楊韌. 中國疾病預防控制中心, 2021(02)
- [2]EPHA4敲除對大鼠心臟形態(tài)和功能的影響及其機制的初步探索[D]. 李晶文. 北京協(xié)和醫(yī)學院, 2021
- [3]高精度高內涵小鼠全腦圖譜構建及其在阿爾茲海默癥小鼠中的應用[D]. 張小川. 華東理工大學, 2021(08)
- [4]人參皂苷Rg1和Rb1改善航天失重效應與睡眠干擾所致認知功能減退作用及機制研究[D]. 呂靜薇. 北京協(xié)和醫(yī)學院, 2021(02)
- [5]RIPK1切割位點變異導致新型自身炎癥性疾病的分子機制研究[D]. 陶攀峰. 浙江大學, 2021(01)
- [6]肺動脈高壓遺傳圖譜繪制與遺傳性肺動脈高壓動物模型構建[D]. 呂子超. 北京協(xié)和醫(yī)學院, 2021(02)
- [7]視網(wǎng)膜色素變性致病基因的鑒定及基因治療研究[D]. 楊辰. 電子科技大學, 2021(01)
- [8]EMC3基因視網(wǎng)膜和小腦神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的功能研究[D]. 朱雄. 電子科技大學, 2020(03)
- [9]小腦異常神經(jīng)發(fā)生參與自閉癥模型小鼠運動障礙及其相關機制研究[D]. 肖銳. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學, 2020(01)
- [10]神經(jīng)遺傳疾病及認知障礙相關基因的RNA選擇性剪接調控機制研究[D]. 莊燕. 東南大學, 2020