一、新進奶牛巴貝斯焦蟲病的診治（論文文獻綜述）

簡子健^[1]（2009）在《建立牛梨形蟲病血清學診斷方法及新疆流行病學調(diào)查》文中研究表明牛梨形蟲?。╬iroplasmosis）主要是由巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲和環(huán)形泰勒蟲引起的一種蜱傳性血液原蟲病,多種動物可感染,尤其是反芻動物,有時也可感染人。本病共同的臨診特征是發(fā)熱、貧血、血紅蛋白尿,嚴重者可死亡。按照病程,可將牛的梨形蟲病分為急性型和慢性型；按感染類型,可將其分為顯性、亞臨診性以及持續(xù)性感染。傳統(tǒng)的檢測和鑒定主要依靠顯微鏡檢查,主要用于急性臨診感染的診斷,但難以進行梨形蟲蟲種鑒定。在持續(xù)性感染的動物中,由于末梢血液中的原蟲數(shù)量少,容易漏診。血清學檢測可診斷亞臨診性感染和持續(xù)性帶蟲感染,所用的方法主要包括補體結(jié)合試驗（Complement Fixation Test,CFT）、間接血凝試驗（Indirect Hemagglutination Test, IHA）、乳膠凝集試驗（Latex Agglutination Test, LAT）、間接熒光抗體試驗（Indirect Fluorescent Antibody test, IFAT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISA）等,但所使用的診斷抗原大多是粗制的自然抗原,難以克服抗原種間的交叉反應(yīng)。分子生物學診斷方法例如DNA探針、rRNA探針和PCR方法因輻射、需要專業(yè)人員和特殊的實驗室材料與儀器等原因僅限于實驗室內(nèi)使用。因此,提高血清學方法的特異性是診斷和鑒定牛梨形蟲病的關(guān)鍵所在。目前發(fā)現(xiàn)牛巴貝斯蟲的裂殖子表面抗原2c （MSA-2c）.牛雙芽巴貝斯蟲的熱休克蛋白20（HSP20）,牛環(huán)形泰勒蟲裂殖子表面抗原1（Tams1）的共同特點是保守性好、免疫原性和反應(yīng)原性強、特異性高,不僅可以作為檢測牛梨形蟲病的診斷抗原,也可作為預防這些疾病的亞單位疫苗或核酸疫苗的候選者。我國尚未見相關(guān)的研究報道。本研究的目的是選擇MSA-2C基因、HSP20基因以及Tamsl基因進行克隆與表達,通過優(yōu)化基因表達獲得相應(yīng)的重組蛋白,初步建立牛梨形蟲病的新型血清學診斷方法,并對新疆牛梨形蟲病的流行病學進行調(diào)查,為制定新疆牛梨形蟲病的防治計劃提供了第一手資料。通過實驗研究得到如下結(jié)果：1.通過分別設(shè)計MSA-2c基因、HSP20基因以及Tams1基因序列的特異性引物,經(jīng)PCR擴增,從血液原蟲病患牛的全血樣品的基因組DNA中克隆到MSA-2c基因、HSP20基因和Tams1基因片段。又通過設(shè)計特異性引物,經(jīng)RT-PCR擴增,從血液原蟲病患牛的全血樣品的總RNA中,獲得HSP20外顯子基因片段。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)：（1）克隆出的MSA-2c基因全長798bp,有完整的開放閱讀框,與國際標準蟲株（德克薩斯株AY052538）的同源性高達99.90%,與其他14個不同國家和地區(qū)分離株的MSA-2c基因序列有97.7%的同源性；（2）克隆到HSP20基因和HSP20基因外顯子,全長分別為699bp和534bp,與國際標準蟲株（墨西哥株）的同源性分別為99.43%和99.63%。（3）克隆的Tams1基因全長846bp,有一個完整的開放閱讀框,編碼281個氨基酸,與國外蟲株的同源性為99.36%～99.80%。系統(tǒng)進化樹分析顯示,新疆牛環(huán)形泰勒蟲Tams1基因與印度株、毛利塔里亞株、土耳其、北非共和國株進化途徑一致?？乖瓫Q定簇分析顯示Tams1基因編碼的氨基酸具有13個交叉的抗原決定簇。上述結(jié)果表明牛巴貝斯蟲的MSA-2c基因、牛雙芽巴貝斯蟲的HSP20基因和HSP20外顯子基因以及牛環(huán)形泰勒蟲Tams1基因都具有高度的保守性。2.將克隆的MSA-2c基因、HSP20外顯子基因以及Tams1基因片段分別再克隆至原核表達載體pGEX-4T-2中,將合成的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,進行IPTG誘導表達。通過優(yōu)化這些基因表達獲得了相應(yīng)的重組蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析發(fā)現(xiàn),MSA-2c基因、HSP20外顯子基因以及Tams1基因所表達的融合蛋白分別為55kDa、46kDa、56kDa,它們分別能被抗牛巴貝斯蟲、抗雙芽巴貝斯蟲和抗環(huán)形泰勒蟲的抗血清所識別。這一結(jié)果表明表達出的融合蛋白具有很強的免疫原性和反應(yīng)原性,能夠作為診斷抗原建立牛梨形蟲病的新型血清學檢測方法。3.分別以純化的GST-MSA-2c融合蛋白、GST-HSP20（exon）融合蛋白和GST-Tams1融合蛋白作為診斷抗原,通過優(yōu)化ELISA反應(yīng)條件,分別建立了可以檢測牛巴貝斯蟲、牛雙芽巴貝斯蟲和牛環(huán)形泰勒蟲血清特異性抗體的新型間接ELISA方法。方陣試驗確定（1）GST-MSA-2c抗原的最適包被濃度為2.5μg/ml,血清最佳稀釋倍數(shù)為40倍,ELISA陽性反應(yīng)的臨界值為OD450>0.347,批內(nèi)和批間重復試驗的變異系數(shù)均小于10%。（2）GST-HSP20抗原的最適包被濃度為5μg/ml,血清最佳稀釋倍數(shù)為40倍,ELISA陽性反應(yīng)的臨界值為OD450>0.292,批內(nèi)和批間重復試驗的變異系數(shù)均小于10%。（3）GST-Tams1抗原的最適包被濃度為10μg/ml,血清最佳稀釋倍數(shù)為80倍,ELISA陽性反應(yīng)的臨界值為OD450>0.282,批內(nèi)和批間重復試驗的變異系數(shù)均小于15%。特異性試驗結(jié)果為（1） MSA-2c間接ELISA可以檢出已知的牛巴貝斯蟲陽性血清,對已知的牛雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、東方巴貝斯蟲的陽性血清和牛巴貝斯蟲陰性血清為陰性。（2）HSP20間接ELISA可以檢出已知的雙芽巴貝斯蟲陽性血清,對已知的牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、東方巴貝斯蟲的陽性血清和雙芽巴貝斯蟲陰性血清為陰性。（3）Tams1司接ELISA可以檢出已知的牛環(huán)形泰勒蟲的陽性血清,對已知的牛雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲蟲、東方巴貝斯蟲的陽性血清和牛環(huán)形泰勒蟲的陰性血清為陰性。這些結(jié)果表明檢測牛梨形蟲病的這三種新型間接ELISA方法特異性好,能進行梨形蟲蟲種的診斷與鑒定。與對應(yīng)的三種巢式PCR檢測結(jié)果相比,MSA-2c間接ELISA、HSP20間接ELISA以及Tams1間接ELISA的陽性符合率為96%。上述結(jié)果表明所建立的新型重組蛋白間接ELSIA檢測方法法重復性好、特異性強、靈敏度高,為大規(guī)模地進行新疆牛梨形蟲病的流行病學調(diào)查和血清學診斷提供有效的技術(shù)手段。4.使用所建立的牛梨形蟲病新型血清學診斷方法對2006年～2008年新疆14個地州的牛梨形蟲病流行病學進行了調(diào)查。檢測結(jié)果顯示（1）新疆存在著牛巴貝斯蟲病。在2006年采集的278份牛血清樣品中,陽性血清7份,感染率為2.52%。在2007年的532份牛血清樣品中檢出陽性血清32份,感染率為3.13%。在2008年的530份牛血清中檢出陽性血清43份,感染率為5.28%。2008年,在地方流行性疫病區(qū)牛巴貝斯蟲感染率高達28%。牛巴貝斯蟲病所在的地州由2006年的2個擴大到2008年的9個。（2）新疆還存在著牛雙芽巴貝斯蟲病,而且比牛巴貝斯蟲病嚴重。在2006年采集的278份牛血清樣品中,陽性血清11份,感染率為5.40%。在2007年的532份牛血清樣品中檢出陽性血清25份,感染率為4.70%。在2008年的530份牛血清中檢出陽性血清53份,感染率為7.17%。2008年,在地方流行性疫病區(qū)牛巴貝斯蟲感染率高達30%。牛雙芽巴貝斯蟲病所在的地州由2006年的8個擴大到2008年的13個。（3）牛環(huán)形泰勒蟲病仍是新疆牛梨形病的主要病原。在2006年采集的278份牛血清樣品中,陽性血清31份,感染率為11.15%。在2007年的532份牛血清樣品中檢出陽性血清61份,感染率為11.47%。在2008年的530份牛血清中檢出陽性血清61份,感染率為11.51%。2008年,在地方流行性疫病區(qū)牛環(huán)形泰勒蟲感染率高達24%。（4）在三年采集的1340份血清樣品中共檢出牛梨形蟲陽性血清280例,感染率為20.90%,其中牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、泰勒梨形蟲單一感染率分別為8.21%（23/280）,15.71%（44/280）和43.93%（123/280）。新疆牛梨形蟲混合感染為15.35%,甚至出現(xiàn)三重感染現(xiàn)象。2008年在流行區(qū)內(nèi)的牛梨形蟲感染率高達74%（37/50）,單一感染與混合感染率分別為64.85%（24/37）和35.15%（13/37）,流行區(qū)的混合感染率明顯增高。這些結(jié)果表明新疆牛梨形蟲病由原來的一種牛環(huán)形泰勒蟲病增加到三種牛梨形蟲病,其流行病學特征為感染率逐年增加,疫區(qū)不斷擴大,混合感染使疫情趨于復雜化,對動物和人類構(gòu)成一定的威脅,不容忽視。本研究是新疆首次利用新型血清學方法對全疆牛梨形蟲病進行大規(guī)模的流行病學調(diào)查,初步掌握了新疆梨形蟲病流行的第一手數(shù)據(jù)和流行特點,為今后制定包括牛巴貝斯蟲病、牛雙芽巴貝斯蟲病和牛環(huán)形泰勒蟲在內(nèi)的新疆牛梨形蟲防控計劃和綜合防治措施的制定提供了依據(jù)。

沈炯玉^[2]（2009）在《牛巴貝斯蟲MSA-2c-iELISA抗體檢測方法的建立》文中研究表明牛巴貝斯蟲?。˙ovine babesiosis）是由媒介蜱傳播的巴貝斯蟲科巴貝斯蟲屬的多種病原體寄生于牛的紅細胞內(nèi)所引起的血液原蟲病的總稱。本病以高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿為主要特征,嚴重時常常引起發(fā)病動物死亡。目前對于牛巴貝斯蟲的診斷主要還是通過顯微鏡檢測到蟲體來確診,該方法直觀,但也極易造成誤診,這給該病的診斷和預防帶來了很大的困難。本研究主要針對以上情況,旨在建立一種特異、敏感、能夠在感染早期對牛巴貝斯蟲做出檢測的血清學檢測方法。將含有牛巴貝斯蟲MSA-2c基因的質(zhì)粒pGEX-4T-2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）。挑選出表達量高的克隆子,經(jīng)IPTG誘導表達,谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B（GlutathioneSepharose 4B）純化后,SDS-PAGE和Western-Blot分析結(jié)果表明,誘導表達的pGEX-4T-2/MSA-2c陽性菌株表達出大小為55kDa,具有反應(yīng)活性的重組蛋白。ELISA試驗顯示,重組蛋白免疫的試驗小鼠抗體效價可達1∶5,120,000以上,證明MSA-2c基因的重組蛋白可作為牛巴貝斯蟲病檢測的一種穩(wěn)定的診斷工具。采用純化的重組牛巴貝斯蟲MSA-2c蛋白為檢測抗原,辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗牛IgG為二抗,建立了牛巴貝斯蟲MSA-2c間接酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測技術(shù)（MSA-2c-iELISA）。通過優(yōu)化試驗確定了最佳工作條件:抗原包被濃度為2.5μg/mL,4℃過夜,血清和酶標抗體分別作1∶20倍、1∶1000倍稀釋,以0.05M/pH8.5的碳酸鹽緩沖液為包被液,1%BSA/PBS-T為封閉液,0.1%BSA/PBS-T為稀釋液,血清與酶標抗體的最佳反應(yīng)條件為37℃孵育60 min,底物顯色條件為室溫20-25 min。收集無牛巴貝斯蟲感染的健康小牛血清95份,分別最佳稀釋,用已建立間接ELISA方法檢測,根據(jù)統(tǒng)計學原理,OD450nm值＞（?）+3S的樣品,可以將其判斷為陽性。計算出95份血清的平均值（（?））=0.197,S=0.05。因此,樣品的陰性、陽性的臨界值=0.197+3×0.05=0.347。即樣品判定標準為,樣本OD450nm≥0.347時判為陽性;OD450nm值＜0.347時判為陰性。交叉試驗表明重組MSA-2c抗原不與其它梨形蟲陽性血清反應(yīng),有較強的抗原特異性。此法穩(wěn)定性和重復性較好,批內(nèi)、批間變異系數(shù)能控制在10%以內(nèi)。多例血清檢測結(jié)果表明,所建立的ELSIA檢測法重復性好、特異性強、靈敏度高。

徐明勇^[3]（2004）在《新進奶牛巴貝斯焦蟲病的診治》文中研究表明巴貝斯焦蟲病是牛的一種原蟲病。主要是靠硬蜱傳播,以急性發(fā)熱、貧血、血紅蛋白尿為臨床特征。本病的發(fā)生有明顯的季節(jié)性和地區(qū)性,在我國南方各省發(fā)病較重,一般在4-9月為發(fā)病高峰期,北方發(fā)病較輕,是一種世界性的血液原蟲病。本病一旦發(fā)生,傳播迅速,若防治措施不當,死亡率很

二、新進奶牛巴貝斯焦蟲病的診治（論文開題報告）

（1）論文研究背景及目的

此處內(nèi)容要求：

首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。

寫法范例：

本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細分析其設(shè)計過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。

（2）本文研究方法

調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。

觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。

實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關(guān)系。

文獻研究法：通過調(diào)查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。

實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學理論和實踐的需要提出設(shè)計。

定性分析法：對研究對象進行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。

定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。

跨學科研究法：運用多學科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。

功能分析法：這是社會科學用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。

模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。

三、新進奶牛巴貝斯焦蟲病的診治（論文提綱范文）

（1）建立牛梨形蟲病血清學診斷方法及新疆流行病學調(diào)查（論文提綱范文）

（2）牛巴貝斯蟲MSA-2c-iELISA抗體檢測方法的建立（論文提綱范文）

四、新進奶牛巴貝斯焦蟲病的診治（論文參考文獻）

• [1]建立牛梨形蟲病血清學診斷方法及新疆流行病學調(diào)查[D]. 簡子健. 南京農(nóng)業(yè)大學, 2009(06)
• [2]牛巴貝斯蟲MSA-2c-iELISA抗體檢測方法的建立[D]. 沈炯玉. 新疆農(nóng)業(yè)大學, 2009(12)
• [3]新進奶牛巴貝斯焦蟲病的診治[J]. 徐明勇. 貴州畜牧獸醫(yī), 2004(06)

標簽：牛巴論文;  基因合成論文;  elisa論文;  試劑論文;