一、GNA和α-PAP雙抗表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化（論文文獻(xiàn)綜述）
劉方方[1]（2017）在《轉(zhuǎn)蠟樣芽孢桿菌acdS基因生菜幼苗耐鹽性的提高》文中研究說明全球有近10%的耕地屬于鹽堿地,土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和限制農(nóng)作物產(chǎn)量的重要因素之一,嚴(yán)重影響耕地的有效利用,影響了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。生菜（Lactuca）以其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,低熱量,可生食而成為人們所喜愛的重要蔬菜作物。生菜在栽培過程中經(jīng)常因?yàn)楦珊怠Ⅺ}漬、高溫的影響,導(dǎo)致品質(zhì)和產(chǎn)量下降。利用基因工程進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良成為提高作物耐鹽性的一個(gè)快速有效的方法,建立穩(wěn)定高效的生菜轉(zhuǎn)化體系,培育耐鹽生菜新品種,為鹽堿地的生菜及作物種植提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。ACC脫氨酶可以將乙烯的合成前體ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸）水解成氨和α-酮丁酸,從而減少植物中產(chǎn)生的乙烯量,以提高植物抗性。論文克隆了蠟樣芽孢桿菌（HK）編碼ACC脫氨酶的acd S基因,構(gòu)建植物表達(dá)載體35S::acd S-GFP,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化香港玻璃生菜。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了香港玻璃生菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系。先將生菜葉片在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d,其中分化培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L,然后在OD600為0.6的農(nóng)桿菌菌液中浸泡8min進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化后共培養(yǎng)3d,移入分化篩選培養(yǎng)基,篩選抗生素選擇Hyg10mg/L,抑菌抗生素選擇Cef300mg/L,選用1/2MS+0.05mg/L NAA+Hyg10mg/L作為生根培養(yǎng)基。經(jīng)融合基因PCR分析和Western blot蛋白表達(dá)鑒定,融合基因成功整合到生菜基因組中,獲得了轉(zhuǎn)蠟樣芽孢桿菌acd S基因穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因生菜幼苗株系,融合基因定位在根系細(xì)胞的細(xì)胞膜上。外源acd S基因的導(dǎo)入使轉(zhuǎn)基因生菜表現(xiàn)出明顯的ACC脫氨酶活性。轉(zhuǎn)基因生菜在鹽脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因生菜在鹽脅迫下的生長(zhǎng)優(yōu)于野生型,在最高鹽處理時(shí)優(yōu)勢(shì)更明顯。轉(zhuǎn)基因生菜中脯氨酸含量在300mmol/LNa Cl時(shí)達(dá)到802.02μg/g,是野生型的1.36倍;在300mmol/L Na Cl時(shí),轉(zhuǎn)基因生菜中可溶性糖含量為43033.80μg/g,是野生型的2.09倍,野生型植株為20533.80μg/g;在Na Cl 300mmol/L時(shí),野生型生菜SOD活性為不加鹽對(duì)照組的2.14倍,轉(zhuǎn)基因生菜SOD活性為不加鹽對(duì)照組的3.47倍,活性顯著高于野生型植株;在Na Cl200mmol/L時(shí),轉(zhuǎn)基因生菜中葉綠素含量為0.16mg/g,非轉(zhuǎn)基因生菜葉綠素含量為0.09mg/g;在Na Cl 300mmol/L時(shí),轉(zhuǎn)基因生菜葉片相對(duì)含水量為70.95%,而野生型相對(duì)含水量為60.95%;在Na Cl 300mmol/L時(shí),野生型植株的MDA含量為4.80×10-3μmol/g,轉(zhuǎn)基因生菜的MDA含量為4.00×10-3μmol/g,顯著低于WT植株（P<0.05）。綜上所述,導(dǎo)入acd S基因可有效消除鹽脅迫對(duì)生菜的損害,提高了轉(zhuǎn)基因生菜的耐鹽性。本實(shí)驗(yàn)中,蠟樣芽孢桿菌的ACC脫氨酶基因被導(dǎo)入生菜,獲得ACC脫氨酶含量顯著增加的轉(zhuǎn)基因生菜株系,并通過模擬鹽脅迫研究導(dǎo)入acd S基因?qū)D(zhuǎn)基因生菜耐鹽性的影響,為培育耐鹽生菜品種奠定了基礎(chǔ)。
李文楓[2]（2014）在《番茄高色素hp2基因的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化及功能驗(yàn)證》文中指出番茄（Lycopersicon esculentem.Mill）營(yíng)養(yǎng)豐富,風(fēng)味香郁,適應(yīng)性廣,產(chǎn)量高,在世界各地被廣泛種植,并成為人們?nèi)粘５闹饕卟俗魑镏弧Ｔ诜淹蛔凅w的果實(shí)中含有豐富的番茄紅素,而番茄紅素具有抗氧化、延緩衰老、提高免疫力和抗癌等功能,因而其食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值倍受關(guān)注,已成為國(guó)際功能性食物營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)研究的熱點(diǎn)之一,但我國(guó)在該方向的研究還處初級(jí)階段。為了增加番茄采收時(shí)間、在市場(chǎng)上的上架時(shí)間,減少運(yùn)輸過程中的損傷率,近年耐貯型番茄已成為育種的主要目標(biāo),但耐貯型番茄普遍存在果實(shí)番茄紅素含量較低的品質(zhì)缺陷、并難以有效對(duì)其進(jìn)行選擇。隨著分子生物學(xué)及基因組學(xué)的迅猛發(fā)展,運(yùn)用重組DNA技術(shù)即基因工程改良作物品質(zhì)已成為作物分子育種的主要高效途徑。近年來,研究者發(fā)現(xiàn)了許多影響植物光代謝的單基因突變體,其中番茄高色素hp基因突變體能夠提高類胡蘿卜素含量,尤其對(duì)番茄紅素含量的提高最為顯著,為此,引起了眾多育種者和研究者的高度重視。目前,已發(fā)現(xiàn)的hp類突變體中hp1,hp2和hp3對(duì)番茄紅素含量的影響作用顯著。而對(duì)于耐貯型番茄果實(shí)的番茄紅素含量均普遍偏低的問題,已成為現(xiàn)今和未來商業(yè)及市場(chǎng)品質(zhì)需求的一重大缺陷,快速、高效選育高番茄紅素的耐貯型番茄品種已成為目前番茄品質(zhì)育種中急于解決的主要問題之一,而關(guān)于耐貯型番茄相關(guān)的遺傳轉(zhuǎn)化報(bào)道也甚少,所以給耐貯型番茄的高效分子品質(zhì)育種帶來了諸多不便。為此,本研究以從美國(guó)番茄遺傳研究所引進(jìn)含有3種不同hp基因（hp1, hp2和hp3）類型的7個(gè)突變體和加工番茄為對(duì)照,通過番茄紅素和品質(zhì)的差異分析及相關(guān)分析,篩選其中1個(gè)對(duì)番茄紅素起主導(dǎo)作用同時(shí)兼顧其他主要優(yōu)良品質(zhì)的hp基因類型為耐貯型番茄轉(zhuǎn)hp基因的研究供體；建立和優(yōu)化耐貯型番茄的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系；克隆該hp2基因全長(zhǎng)并構(gòu)建帶有attR重組位點(diǎn)的pCAMBIA-1301入門載體；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將hp2基因?qū)肽唾A型番茄中,獲得轉(zhuǎn)基因植株,并對(duì)其進(jìn)行分子和生理指標(biāo)檢測(cè)分析,為hp基因在耐貯型番茄中的應(yīng)用研究提供理論依據(jù),為含高番茄紅素的番茄創(chuàng)造新的種質(zhì)資源。具體研究結(jié)果如下：（1）以含3種不同hp基因突變類型和不含hp基因類型番茄為材料,經(jīng)其果實(shí)番茄紅素含量的差異分析表明,含不同的hp基因類型番茄果實(shí)中番茄紅素含量存在顯著和極顯著差異,含量趨勢(shì)表現(xiàn)為hp2>hp1>hp3>無hp類型,其中hp2基因?qū)Ψ阎蟹鸭t素含量具有重要的主導(dǎo)作用,并且果實(shí)其他主要綜合品質(zhì)優(yōu)良。（2）以含3種不同hp基因突變類型和不含hp基因類型番茄為材料,經(jīng)其果實(shí)番茄紅素與主要品質(zhì)含量的相關(guān)分析表明,含不同hp基因番茄果實(shí)中番茄紅素含量與其它5個(gè)主要果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)相關(guān)性不顯著,但均具有正向相關(guān)趨勢(shì),其相關(guān)大小分別為糖酸比>維生素C含量>可溶性蛋白含量>可溶性總糖含量>酸度含量。（3）以含hp2基因突變類型的LA3006和LA4013番茄為材料,通過RT-PCR方法對(duì)其進(jìn)行基因克隆及載體構(gòu)建分析表明,在番茄LA3006和LA4013中均可以成功獲得含有attB序列的hp2全長(zhǎng)基因,并構(gòu)造了帶有ccdB基因的重組位點(diǎn)的入門載體,命名為pCAMBIA一1301-ccdB和含hp2基因的植物雙元表達(dá)載體,命名為pCAMBIA一1301-hp2。（4）以耐貯型番茄品種08076和09836為材料,通過子葉高頻再生的方法,對(duì)其再生體系中的主要影響因子進(jìn)行差異分析表明,在耐貯型番茄子葉高頻再生體系中,不同番茄品種間僅在出芽數(shù)存在極顯著差異,其他誘導(dǎo)和再分化影響因子指標(biāo)差異不顯著；其中耐貯型番茄子葉最優(yōu)高頻再生體系為：無菌苗的培養(yǎng)采用,種子用10%NaClO浸種15mmin消毒, MS培養(yǎng)基（進(jìn)口,2.215g/L）+0.70%瓊脂+2%蔗糖；無菌苗培養(yǎng)基采用1/2MS+0.7%瓊脂+1%蔗糖；誘導(dǎo)愈傷養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BAlmg/L+IAA0.2mg/L；不定芽分化養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.75mg/L；生根培養(yǎng)基為MS+IAA2.0mg/L,其獲得的耐貯型番茄再生頻率表現(xiàn)為09836和08076的子葉分化率分別為100%、98.25%。（5）以耐貯型番茄品種09836為材料,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法,對(duì)其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化分析表明,hp2基因可以較好導(dǎo)入耐貯型番茄09836,其中在共培養(yǎng)時(shí)期,成活169份,成活率為42%；在不定芽分化時(shí)期,成活65個(gè)不定芽,成活率為38%；在生根苗時(shí)期,成活38份,成活率為58%；在抗性植株培養(yǎng)時(shí)期,最終獲得到抗性植株14株,成活率為36%。（6）以遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗性植株為材料,經(jīng)“目的PCR"."NPTII基因”和“半定量RT-PCR"檢測(cè)驗(yàn)證分析表明,確定8株表現(xiàn)陽(yáng)性,分別為T0-01、T0-02、T0-05、T0-06、T0-08、T0-10、T0-12、 T0-14,轉(zhuǎn)化株的陽(yáng)性率為57.14%。（7）以獲得的陽(yáng)性植株為材料,經(jīng)方差和多重比較分析表明,果實(shí)中番茄紅素含量、葉片中葉綠素a含量、葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量均極顯著獲得提高,其中果實(shí)中番茄紅素含量分別提高了309.64%-1571.08%；陽(yáng)性番茄植株葉片中葉綠素a提高了139.45%-295.11%,葉片中葉綠素b提高了152.58%-376.29%,葉片中類胡蘿卜素含量提高了20.32%-95.72%。（8）以獲得的陽(yáng)性植株為材料,陽(yáng)性植株的果實(shí)番茄紅素含量與葉片中葉綠素a含量、葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量進(jìn)行相關(guān)分析表明,T。代陽(yáng)性株果實(shí)中番茄紅素含量與其葉片中葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量呈正向顯著相關(guān),而與其葉片中葉綠素b含量呈正向極顯著相關(guān)（r=0.79）；陽(yáng)性株葉片葉綠素a含量、葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量間存在極顯著正相關(guān)。（9）通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了3個(gè)轉(zhuǎn)hp2基因的T2代耐貯型番茄09836株,其中T2-1、T2-5和T2-10的果實(shí)番茄紅素含量分別為33.9.83.7.94.6mg/kg,較非轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)照提高了3.8-10.6倍；其果實(shí)的AS1分別為2.1、1.9和2.3,較對(duì)照下降了45.24%-54.76%；其果實(shí)貨架期分別為48、42和53天,相比對(duì)照下降了27.4%-42.47%；其果實(shí)硬度分別為3.35kg/cm-2、3.02kg/cm-2和4.05kg/cm-2,相比對(duì)照下降了27.68%-46.07%。
王桂英[3]（2012）在《雙Bt基因?qū)顦涞倪z傳轉(zhuǎn)化及外源基因表達(dá)研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理為鑒定并篩選出轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊對(duì)鱗翅目和鞘翅目害蟲同時(shí)具有較強(qiáng)抗性的株系，明確聯(lián)合使用兩種或兩種以上的抗蟲基因的抗蟲效果。以8個(gè)轉(zhuǎn)三基因雙Bt （Cry3Aa+Cry1Ac+API）741楊株系、1個(gè)轉(zhuǎn)雙抗蟲基因（Cry1Ac+API）741楊株系和3個(gè)轉(zhuǎn)單抗蟲基因（Cry3Aa）741楊株系為實(shí)驗(yàn)材料，未轉(zhuǎn)基因741楊為對(duì)照，進(jìn)行了外源基因表達(dá)測(cè)定和抗蟲性對(duì)比試驗(yàn)。同時(shí)借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)，采用共轉(zhuǎn)化法，用構(gòu)建在同一表達(dá)載體pCAMBIA1305-Cry1Ac-Cry3Aa上的雙Bt基因?qū)薨詶钸M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了4株潮霉素抗性植株。經(jīng)過PCR初步檢測(cè)，表明雙Bt基因已經(jīng)整合進(jìn)了巨霸楊基因組中。主要研究結(jié)果如下：1.轉(zhuǎn)抗蟲基因741楊分別為：?jiǎn)无D(zhuǎn)Bt Cry3Aa基因741楊pCC系列3個(gè)株系pCC11、pCC53、pCC84；轉(zhuǎn)雙抗蟲基因（Cry1Ac+API）741楊1個(gè)株系pB29；在pB29基礎(chǔ)上通過二次轉(zhuǎn)化法將Cry3Aa基因轉(zhuǎn)入獲得的轉(zhuǎn)三基因雙Bt（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741楊pCCA系列8個(gè)株系pCCA1、pCCA2、pCCA3、pCCA4、pCCA5、pCCA6、pCCA7和pCCA9。對(duì)各轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照進(jìn)行組培快繁，篩選確立了誘導(dǎo)741楊分化和生根的適宜培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基為：MS+6BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA0.3mg·L-1。2.轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊等13個(gè)參試材料經(jīng)特異引物PCR擴(kuò)增Cry1Ac基因和Cry3Aa基因： pB29和轉(zhuǎn)雙Bt基因pCCA系列均擴(kuò)增得到了Cry1Ac基因特異條帶，對(duì)照741和pCC系列基因組未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。pCC系列和轉(zhuǎn)雙Bt基因pCCA系列均得到了Cry3Aa基因特異條帶，對(duì)照741和pB29基因組未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。說明pB29中Cry1Ac基因和pCC系列中的Cry3Aa基因穩(wěn)定存在。在pB29基礎(chǔ)上，通過二次介導(dǎo)法外源Cry3Aa基因已整合到pCCA各無性系基因組中。3.通過RT-PCR和熒光定量PCR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)外源基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)表明：8個(gè)雙Bt株系即檢測(cè)到了Cry1Ac熒光擴(kuò)增信號(hào)又檢測(cè)到了Cry3Aa基因的熒光擴(kuò)增信號(hào)。pCC-11、53、84只有Cry3Aa基因的熒光信號(hào)表達(dá)，而pB29只有Cry1Ac基因的熒光信號(hào)表達(dá)，對(duì)照741沒有顯現(xiàn)雙Bt基因的熒光擴(kuò)增信號(hào)。根據(jù)測(cè)得的Ct值，計(jì)算出了各樣品中Cry1Ac基因和Cry3Aa基因在mRNA轉(zhuǎn)錄本中的表達(dá)量。雙Bt株系pCCA系列及pB29中Cry1Ac基因的起始表達(dá)量在3.26×1047.50×105之間；雙Bt株系pCCA系列及pCC系列Cry3Aa基因的起始表達(dá)量在1.79×1086.05×109之間。數(shù)據(jù)顯示Cry3Aa基因的起始表達(dá)量在108109數(shù)量級(jí)，比Cry1Ac的起始表達(dá)量（104105數(shù)量級(jí)）高出了一萬(wàn)倍。4.用Bt-Cry1Ab/1Ac和Bt-Cry3A ELISA蛋白檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)Cry1Ac蛋白：雙Bt741楊pCCA系列的8個(gè)系號(hào)和pB29呈現(xiàn)藍(lán)色陽(yáng)性反應(yīng)，蛋白含量在16.4460.32ng·g-1（FW）；pCC系列和對(duì)照741無顯色反應(yīng)。檢測(cè)Cry3Aa蛋白：雙Bt741楊8個(gè)系號(hào)及pCC系列呈現(xiàn)黃色陽(yáng)性反應(yīng)，蛋白含量在2.2413.30μg·g-1（FW）；pB29和對(duì)照741無顯色反應(yīng)。檢測(cè)結(jié)果表明，雙Bt株系能同時(shí)表達(dá)兩種Bt毒蛋白，單Bt株系也表達(dá)了與各自所含基因相應(yīng)的蛋白。從毒蛋白表達(dá)量看Cry3Aa蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Cry1Ac蛋白表達(dá)量。Cry3Aa蛋白表達(dá)量在微克級(jí)，Cry1Ac蛋白表達(dá)量在納克級(jí)。5.用轉(zhuǎn)基因株系新鮮葉片進(jìn)行柳藍(lán)葉甲（Plagiodera versicolora）13齡幼蟲和成蟲及美國(guó)白蛾（Hyphantria cunea）1齡和4齡幼蟲室內(nèi)飼蟲實(shí)驗(yàn)表明：轉(zhuǎn)入不同抗蟲基因的楊樹對(duì)昆蟲的抗性具有選擇性，對(duì)非靶標(biāo)昆蟲沒有毒殺作用。轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊對(duì)鱗翅目的美國(guó)白蛾和鞘翅目的柳藍(lán)葉甲具有雙抗性，不同轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出高中低的抗性水平。pCCA-1、2、5、6、9對(duì)柳藍(lán)葉甲表現(xiàn)高抗，pCCA-3、4、7表現(xiàn)中低抗性。5個(gè)高抗株系的抗性水平明顯比單Bt Cry3Aa基因的3個(gè)高抗株系(pCC-11、53、84)的抗蟲性高，用這5個(gè)系號(hào)飼喂的柳藍(lán)葉甲成蟲3天時(shí)60%以上死亡，5天時(shí)死亡率達(dá)到85%100%；而pCC的3個(gè)系號(hào)3天時(shí)死亡率在50%以下，5天時(shí)也只有60%70%。在對(duì)美國(guó)白蛾的抗性上，有7個(gè)雙Bt株系（pCCA2-7和pCCA9）的抗性水平與pB29表現(xiàn)一致，4齡幼蟲在第79天時(shí)死亡率達(dá)100%；只有1個(gè)系號(hào)pCCA1對(duì)美國(guó)白蛾表現(xiàn)出了極低的抗性，4齡幼蟲在第7天和第9天時(shí)的死亡率分別只有7%和23%。pCC系列不含抗鱗翅目的Bt Cry1Ac基因，對(duì)美國(guó)白蛾未表現(xiàn)抗蟲性。6.飼蟲結(jié)果還表明無論是柳藍(lán)葉甲還是美國(guó)白蛾，1齡幼蟲對(duì)Bt毒蛋白的耐受性比較差，取食23天全部死亡；柳藍(lán)葉甲成蟲及美國(guó)白蛾4齡幼蟲耐受性明顯增強(qiáng)，取食可延長(zhǎng)到711天。通過對(duì)取食葉片實(shí)時(shí)拍照記錄的取食危害面積來看，轉(zhuǎn)基因株系同對(duì)照比，即使中低抗株系也能對(duì)葉片起到很好的保護(hù)作用。7.對(duì)美國(guó)白蛾4齡幼蟲的總排糞量和體長(zhǎng)調(diào)查表明：低抗株系pCCA1的總排糞量是高抗株系pCCA2-7、pCCA9和pB29的723倍，但跟對(duì)照的總排糞量比，只有對(duì)照的25%。從體長(zhǎng)來看，未轉(zhuǎn)基因741楊上的美國(guó)白蛾幼蟲體長(zhǎng)達(dá)到了19mm，pCCA2-7、pCCA9和pB29的體長(zhǎng)在1012mm之間，而取食低抗株系pCCA1的最后體長(zhǎng)也只有13mm（為對(duì)照的68%）。從蟲糞和體長(zhǎng)這兩個(gè)指標(biāo)分析來看，充分說明了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育起到了明顯的抑制作用。8.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以潮霉素做篩選標(biāo)記，用構(gòu)建在同一表達(dá)載體上的雙Bt基因（Cry3Aa+Cry1Ac）對(duì)巨霸楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)葉片分化適宜培養(yǎng)基和適宜潮霉素濃度這兩個(gè)影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素進(jìn)行了深入研究。確定誘導(dǎo)葉片分化不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6BA0.25mg·L-1+IBA0.1mg·L-1。通過潮霉素在0mg·L-115mg·L-1范圍內(nèi)不同濃度梯度對(duì)葉片分化和莖尖生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)，確定誘導(dǎo)抗性芽分化的潮霉素臨界篩選濃度為5mg·L-1。經(jīng)過對(duì)再生抗性芽的多次潮霉素篩選，獲得抗性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊無性系4個(gè)，編號(hào)為JB1、JB2、JB3和JB4。9.用特異引物分別對(duì)獲得的轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊無性系進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：JB1、JB2、JB3和JB4均擴(kuò)增得到一條與陽(yáng)性質(zhì)粒作模板PCR擴(kuò)增條帶大小相同的749bp（Cry1Ac基因）和612bp（Cry3Aa基因）的特異條帶，而對(duì)照未轉(zhuǎn)化巨霸楊基因組未出現(xiàn)PCR擴(kuò)增特異條帶。初步證明雙Bt基因已經(jīng)整合進(jìn)了巨霸楊基因組中。
營(yíng)文文[4]（2012）在《3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因轉(zhuǎn)化煙草及表達(dá)分析》文中指出人類經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，大量的廢氣、廢水、廢物等排放到環(huán)境中，導(dǎo)致環(huán)境污染日益嚴(yán)重。3α-HSD/CR基因是睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）的關(guān)鍵酶3α-羥類固醇脫氫酶/碳?；€原酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase，3α-HSD/CR）基因，對(duì)環(huán)境污染物中的類固醇化合物有很好的降解作用。aiiA基因是從蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis, Bt）中克隆的一種酰基高絲氨酸環(huán)內(nèi)酯酶（acyl homoserine lactones, AHLs）基因。AiiA蛋白對(duì)胡蘿卜歐文氏軟腐病菌（Erwinia carotovora）引起的軟腐病具有抑制作用，其機(jī)制是將該菌產(chǎn)生的AHLs分子的內(nèi)酯鍵打開，使其結(jié)構(gòu)改變，失去信號(hào)分子的功能，進(jìn)而減弱病害。近年來，植物基因工程迅速發(fā)展，“超級(jí)生物”備受關(guān)注，轉(zhuǎn)基因由單基因向多基因方向發(fā)展。但是，由于受到目前可選擇的載體數(shù)目和載體容量的限制，多基因轉(zhuǎn)化困難。融合基因轉(zhuǎn)化以及融合表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)的發(fā)展，為多基因的遺傳轉(zhuǎn)化開辟了一條新途徑。本研究構(gòu)建3α-HSD/CR基因和aiiA基因融合基因植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，初步研究了融合基因在煙草中的表達(dá)。主要方法和結(jié)果如下：1.構(gòu)建了融合基因3α-HSD/CR-aiiA植物表達(dá)載體pTCK303-3α-HSD/CR-aiiA，同時(shí)構(gòu)建了兩個(gè)單基因（3α-HSD/CR和aiiA）植物表達(dá)載體pTCK303-3α-HSD/CR和pTCK303-aiiA作為對(duì)照，研究融合基因的表達(dá)。通過酶切驗(yàn)證及測(cè)序表明載體構(gòu)建成功。2.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將融合基因3α-HSD/CR-aiiA及兩個(gè)單基因3α-HSD/CR和aiiA轉(zhuǎn)化煙草。經(jīng)PCR檢測(cè)及GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明成功獲得轉(zhuǎn)融合基因3α-HSD/CR-aiiA煙草及轉(zhuǎn)單基因3α-HSD/CR和aiiA煙草。3.利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)3α-HSD/CR蛋白在轉(zhuǎn)融合基因3α-HSD/CR-aiiA煙草和轉(zhuǎn)單基因3α-HSD/CR煙草中均成功的表達(dá)了。4.采用膽固醇降解試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)3α-HSD/CR-aiiA和3α-HSD/CR基因煙草對(duì)膽固醇的降解率均達(dá)到70%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照。5.對(duì)轉(zhuǎn)3α-HSD/CR-aiiA和aiiA基因煙草離體葉片針刺法接種胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草離體葉片對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌引起的軟腐病具有抑制作用。6.由膽固醇降解試驗(yàn)及抗病試驗(yàn)結(jié)果表明：轉(zhuǎn)3α-HSD/CR-aiiA融合基因的煙草同時(shí)表達(dá)了3α-HSD/CR蛋白和AiiA蛋白的功能，獲得了對(duì)環(huán)境具有修復(fù)作用的抗病性煙草。
劉曉娜,馮翠蓮,張樹珍[5]（2010）在《GNA基因表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗》文中提出利用經(jīng)人工改造的gna基因分別與Ubi、Rbcs啟動(dòng)子組合,構(gòu)建抗蟲植物表達(dá)載體pUNG和pRNG,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入甘蔗愈傷組織,經(jīng)PPT篩選和PCR檢測(cè),獲得Ubi-gna轉(zhuǎn)基因植株124株,Rbcs-gna轉(zhuǎn)基因植株35株。對(duì)部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),初步證明外源基因已經(jīng)整合到甘蔗基因組中,并得到有效表達(dá);對(duì)RT-PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行GNA（植物外源凝集素）活性測(cè)驗(yàn),結(jié)果表明,甘蔗葉片表達(dá)的凝集素可以使健康公雞的紅細(xì)胞凝集,初步證明表達(dá)的GNA具有正常的生物學(xué)活性。
劉曉娜[6]（2010）在《植物凝集素基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我國(guó)最重要的糖料作物,同時(shí)也是一種重要的能源經(jīng)濟(jì)植物。甘蔗粉蚧和綿蚜是甘蔗的重要害蟲,它們不但直接造成甘蔗減產(chǎn)、糖含量降低,而且還是多種甘蔗病毒的傳播媒介,間接傳播病毒引起的病害損失比蟲害直接造成的損失更為嚴(yán)重。利用植物基因工程技術(shù)把抗蟲基因?qū)雰?yōu)良甘蔗品種中使其得到有效的表達(dá)從而表現(xiàn)出抗蟲性是培育甘蔗抗蟲品種最有效的途徑。雪花蓮凝集素（gna）是目前研究較多的一種單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素,廣泛應(yīng)用于植物害蟲的治理。它能結(jié)合到昆蟲消化道上皮細(xì)胞糖蛋白受體上,對(duì)昆蟲產(chǎn)生局部或系統(tǒng)毒害,抑制害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖,對(duì)蚜蟲和葉蟬等同翅目害蟲具有高效毒性,同時(shí)對(duì)鱗翅目、鞘翅目的害蟲也有一定的毒性。因此把gna基因轉(zhuǎn)入高產(chǎn)高糖甘蔗品種中使其得到高效的表達(dá),以期提高甘蔗對(duì)綿蚜和粉蚧等同翅目害蟲的抗蟲性。本研究成功構(gòu)建了中間表達(dá)載體pUN和一個(gè)組成型啟動(dòng)子Ubi驅(qū)動(dòng)gna基因的植物表達(dá)載體pUNG,并用“凍融法”將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)甘蔗進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得抗性植株227株,對(duì)其中的183株進(jìn)行PCR檢測(cè),有124株呈陽(yáng)性。另外轉(zhuǎn)化了Rbcs驅(qū)動(dòng)的gna基因的植物表達(dá)載體prG,獲得54株抗性植株,PCR結(jié)果表明有35株抗性植株呈陽(yáng)性。初步證明gna基因已整合到甘蔗的基因組中。隨機(jī)選取6株轉(zhuǎn)Ubi驅(qū)動(dòng)的gna PCR陽(yáng)性植物進(jìn)行RT-PCR,檢測(cè)植株均呈陽(yáng)性。對(duì)這些陽(yáng)性植株進(jìn)行進(jìn)一步GNA凝集素體外活性測(cè)驗(yàn),結(jié)果表明甘蔗葉片表達(dá)的GNA粗提物可以使雞紅細(xì)胞凝集,6株均表現(xiàn)不同的凝血活性,初步證明轉(zhuǎn)化植株葉片表達(dá)的GNA具有生物學(xué)活性。另外隨機(jī)選取2株Rbcs驅(qū)動(dòng)的gna基因PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),1株呈陽(yáng)性。由此進(jìn)一步證明外源基因在轉(zhuǎn)錄水平得到了表達(dá)。
安娜[7]（2010）在《根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)D32基因和芪合酶基因轉(zhuǎn)化普通煙草的研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理干旱、低溫、鹽漬等逆境脅迫以及各種病害的發(fā)生對(duì)當(dāng)今農(nóng)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了很大的影響,如何合理開發(fā)和利用鹽堿化土地,以及如何提高作物的抗病性已經(jīng)成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)急需解決的問題。培育耐鹽、抗旱及抗病作物新品種已經(jīng)成為作物品種改良的重要課題。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善,利用基因工程手段培育作物新品種為增加糧食產(chǎn)量和維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了新的途徑和方法。DREB是一類和植物脫水條件下的抗逆性反應(yīng)有關(guān)的調(diào)節(jié)因子蛋白,是可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)逆境誘導(dǎo)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。D32基因產(chǎn)物是DREB轉(zhuǎn)錄因子的一種,當(dāng)植物受到干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫時(shí),D32基因本身會(huì)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng),從而對(duì)逆境刺激作出相應(yīng)的反應(yīng)以增強(qiáng)植物的抗逆性。芪類化合物是一類具有均二苯乙烯母核或其聚合物的物質(zhì)的總稱,其多存在于植物的木質(zhì)部,當(dāng)植物受到蟲害或外界刺激時(shí),芪類化合物在植物體內(nèi)起到植保素的作用,植物受激部位的芪類化合物含量將顯著增加,以防止病原菌入侵,從而提高植物的抗病能力,芪合酶（Stilbene synthase, STS）是芪類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶,它催化產(chǎn)生含二苯乙烯母核的芪類物質(zhì)基本分子,再經(jīng)修飾聚合等作用形成不同的芪類化合物,由芪合酶催化底物丙二酰-CoA和香豆酰-CoA合成的白藜蘆醇（trans-resveratrol,RL）對(duì)真菌、細(xì)菌等具有毒性,其對(duì)子囊菌亞門和半知菌亞門近26種真菌具有抑菌活性,主要表現(xiàn)為對(duì)菌絲生長(zhǎng)或孢子萌發(fā)的抑制。陜西煙草是黃淮煙區(qū)的主要煙草類型之一,其種植面積較小,但地處煙草的優(yōu)質(zhì)氣候生態(tài)帶,日照充足,土壤水分適宜,具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的特點(diǎn),在經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)中占有重要地位。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的D32基因和芪合酶基因轉(zhuǎn)化煙草,可以提高煙草的抗鹽、抗旱和抗病等特性。本研究以陜西煙草種植品種“中煙99”為受體材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓盤法對(duì)其進(jìn)行D32基因和芪合酶基因的轉(zhuǎn)化,探索農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化條件及其影響因素,獲得了以下主要研究結(jié)果:1.以“中煙99”無菌葉片為受體,進(jìn)行卡那霉素水平的敏感性試驗(yàn),得到了該品種的最佳抗性苗篩選濃度,為轉(zhuǎn)基因株系的選擇提供了有效依據(jù),卡那霉素敏感性試驗(yàn)表明:50mg/L是“中煙99”轉(zhuǎn)化植株抗性篩選的最佳濃度。2.優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系,研究了侵染時(shí)間、菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、抗生素的抑菌效果等影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素,通過對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草遺傳轉(zhuǎn)化條件的探索,建立了快速高效的煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系。3.優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)D32基因的遺傳轉(zhuǎn)化條件為:用稀釋10倍的農(nóng)桿菌菌液（OD600,0.7）浸泡8min,轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2d,無菌水沖洗34次,置于含50mg/L卡那霉素和400mg/L羧芐青霉素的篩選分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)煙草葉圓片產(chǎn)生抗性愈傷組織和不定芽,最后轉(zhuǎn)至含50mg/L卡那霉素和400mg/L羧芐青霉素的篩選生根培養(yǎng)基生根成苗。4.優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)芪合酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化條件為:用稀釋10倍的農(nóng)桿菌菌液（OD600,0.6）浸泡8min,轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d,無菌水沖洗34次,置于含50mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的篩選分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗性芽,最后轉(zhuǎn)至含50mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的篩選生根培養(yǎng)基生根成苗。5.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)和卡那霉素抗性篩選,獲得9株經(jīng)PCR檢測(cè)的D32轉(zhuǎn)基因株,轉(zhuǎn)化率達(dá)28.1%,轉(zhuǎn)化株的獲得為進(jìn)一步驗(yàn)證D32基因的抗逆機(jī)理和作物抗逆特性的改良奠定了基礎(chǔ)。6.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)和卡那霉素抗性篩選,獲得7株經(jīng)PCR檢測(cè)的煙草轉(zhuǎn)芪合酶基因株,轉(zhuǎn)化率為25%,初步證明芪合酶基因已整合到“中煙99”基因組中。
曾黎瓊,段玉云,張?jiān)茖O,程在全,黃興奇[8]（2009）在《云南轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物研究與產(chǎn)業(yè)化:現(xiàn)狀及其發(fā)展》文中指出基因轉(zhuǎn)化在農(nóng)作物新品種培育中發(fā)揮著重要的作用.綜述云南在農(nóng)作物基因轉(zhuǎn)化研究和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展方面所做的工作,并提出了今后開展此項(xiàng)工作的設(shè)想和建議.
霍雪梅[9]（2009）在《抗蟲基因植物表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化及表達(dá)研究》文中指出本研究在王彥平構(gòu)建的植物表達(dá)載體基礎(chǔ)上構(gòu)建Bt抗蟲基因表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化煙草,對(duì)Bt基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)進(jìn)一步以普通741楊和轉(zhuǎn)雙抗蟲基因pB29無菌苗為試驗(yàn)材料,建立了葉片再生體系并對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt cry3A （Bt3）基因轉(zhuǎn)入已含Bt cry1A（c） （Bt1）基因的pB29中,獲得轉(zhuǎn)雙Bt基因741毛白楊,對(duì)部分轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了DNA水平和蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)。主要研究結(jié)果如下:利用植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3,通過DNA重組技術(shù),分別將Bt1和Bt3基因正向插入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301中,成功構(gòu)建了pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3植物表達(dá)載體。此可讀框架通過組成型啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng),攜帶PPT乙?；D(zhuǎn)移酶（PAT）基因作為選擇標(biāo)記基因,并將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105。確定煙草轉(zhuǎn)化的潮霉素臨界篩選濃度為50 mg.L-l,頭孢噻肟鈉的抑菌濃度為200 mg.L-l。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將植物表達(dá)載體載體pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3及構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3轉(zhuǎn)入煙草中,均得到完整再生植株。經(jīng)PCR檢測(cè),初步證明目的基因已整合到煙草的基因組中。ELISA檢測(cè)表明,大部分轉(zhuǎn)基因株系中Bt1和Bt3毒蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照。在5株攜帶雙價(jià)Bt基因的轉(zhuǎn)基因煙草中,Bt1毒蛋白和Bt3毒蛋白的表達(dá)量最高分別達(dá)0.030 1%和0.293 8%。對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的741楊遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化,確定葉片誘導(dǎo)分化不定芽的適宜培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.0 mg.L-l + NAA 0.1 mg.L-l,生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ NAA 0.1 mg.L-l。潮霉素臨界篩選濃度為10 mg.L-l,抗生素頭孢噻肟鈉的抑菌濃度為400 mg.L-l。遺傳轉(zhuǎn)化的適宜菌液濃度為OD600 = 0.4,浸菌時(shí)間為810 min,共培養(yǎng)時(shí)間以2 d為宜。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將Bt3基因轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)Bt1基因的雜種741毛白楊無性系pB29中,獲得轉(zhuǎn)雙Bt基因741毛白楊。在含Hyg的培養(yǎng)基中進(jìn)行多次繼代篩選,獲得抗性穩(wěn)定的無性系9個(gè),編號(hào)為pC1pC9。采用特異引物分別對(duì)獲得的轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊無性系進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果表明:Bt1基因穩(wěn)定存在于pB29無性系中,Bt3基因已整合到各無性系的基因組DNA中。對(duì)雜種741毛白楊轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行毒蛋白表達(dá)的ELISA檢測(cè),結(jié)果表明,所選轉(zhuǎn)雙價(jià)Bt基因的741楊的2個(gè)無性系pC1和pC2,均檢測(cè)到Bt1和Bt3毒蛋白的表達(dá)。Bt1毒蛋白的表達(dá)量分別為0.009 4%和0.011 0%;Bt3毒蛋白的表達(dá)量分別為0.217 0%和0.149 4%,高于對(duì)照pB29及轉(zhuǎn)單一Bt3基因的741楊無性系CC71的Bt3蛋白表達(dá)量（0.033 7%）。
張婷婷[10]（2009）在《表達(dá)AMV，WCMV外殼蛋白基因的紅三葉T1，T2代分子生物學(xué)檢測(cè)及抗病性分析》文中研究指明紅三葉病毒病是除根節(jié)線蟲之外的一大病害,其中尤以苜?；ㄈ~病毒（Alfalfa Mosaic Virus, AMV）和白三葉花葉病毒（White Clover Mosaic Virus, WCMV）最為猖獗。大面積草地噴施農(nóng)藥不僅成本高,而且會(huì)造成環(huán)境污染,對(duì)畜產(chǎn)品的安全性也有影響。培育抗AMV和WCMV的轉(zhuǎn)基因紅三葉新品種是解決問題的根本途徑。要實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的多抗效果,目前常用的方法有:構(gòu)建雙元、多元載體,然后進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化;給已經(jīng)轉(zhuǎn)入一個(gè)抗性基因的植株用轉(zhuǎn)基因手段再轉(zhuǎn)入另外一個(gè)抗性基因;在不同的抗病轉(zhuǎn)基因植株之間進(jìn)行人工雜交。本研究以抗苜蓿花葉病毒（AMV）轉(zhuǎn)基因紅三葉和抗白三葉花葉病毒（WCMV）的轉(zhuǎn)基因紅三葉人工雜交后代T1,T2代植株為研究對(duì)象,探討目的基因在人工雜交后代中的表達(dá)情況及其抗病性強(qiáng)弱。研究結(jié)果如下:1)分別用改進(jìn)的CTAB法和植物基因組試劑盒提取34個(gè)T1代植株DNA樣品和30個(gè)T2代植株DNA樣品及1個(gè)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誅NA樣品,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),所有條帶均清晰無污染,利用試劑盒提取DNA較手提法時(shí)間短、質(zhì)量好。對(duì)提取的30個(gè)T2代植株的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,條帶完整、清晰。2) 34株T1代植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果顯示,5株AMV、WCMV陽(yáng)性,6株WCMV陽(yáng)性,1株AMV陽(yáng)性,3株僅nptⅡ陽(yáng)性。3)30株T2代PCR檢測(cè)結(jié)果顯示所有T2代植株nptII均呈陽(yáng)性,其中10株AMV、WCMV均陽(yáng)性,13株WCMV陽(yáng)性、3株AMV陽(yáng)性。4)對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因紅三葉進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),分別得到預(yù)期大小的條帶。其中,9個(gè)正常轉(zhuǎn)錄并表達(dá)AMV和WCMV外殼蛋白基因,3個(gè)表達(dá)AMV外殼蛋白基因,6個(gè)表達(dá)WCMV外殼蛋白基因,3個(gè)表達(dá)nptII基因。5)30株T2代植株有21株能夠表達(dá)外殼蛋白基因,表明外源基因可以通過人工雜交遺傳至后代,并在大部分植株中能夠正常轉(zhuǎn)錄,并且,通過人工雜交能夠?qū)崿F(xiàn)兩種外源基因在同一植株中的累集。6)對(duì)T2代陽(yáng)性植株進(jìn)行苜?；ㄈ~病毒和白三葉花葉病毒的抗病性檢測(cè)。與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因紅三葉T2代整體抗性水平明顯高于對(duì)照,回接轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照的汁液至寄主豇豆,轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生的枯斑數(shù)也明顯小于對(duì)照。表明通過人工雜交獲得的T2代轉(zhuǎn)基因植株具有較強(qiáng)的抗病性。
二、GNA和α-PAP雙抗表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁(yè)面大小,采用多級(jí)分層頁(yè)表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁(yè)表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、GNA和α-PAP雙抗表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化（論文提綱范文）
（1）轉(zhuǎn)蠟樣芽孢桿菌acdS基因生菜幼苗耐鹽性的提高（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 生菜 |
| 1.1.1 生菜 |
| 1.1.2 生菜的耐鹽性 |
| 1.1.3 生菜轉(zhuǎn)基因研究 |
| 1.2 鹽脅迫對(duì)植物造成的傷害 |
| 1.3 ACC脫氨酶與植物耐鹽性 |
| 1.4 ACC脫氨酶的研究現(xiàn)狀 |
| 1.4.1 ACC脫氨酶 |
| 1.4.2 含有ACC脫氨酶基因的植物促生菌的研究現(xiàn)狀 |
| 1.4.3 acd S基因轉(zhuǎn)化植物的研究 |
| 1.5 研究目的意義 |
| 第二章 生菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 生菜無菌苗培養(yǎng) |
| 2.1.3 生菜愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo) |
| 2.1.4 生菜不定芽誘導(dǎo)生根 |
| 2.1.5 潮霉素選擇壓的確定 |
| 2.1.6 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 |
| 2.1.7 頭孢霉素濃度的確定 |
| 2.1.8 農(nóng)桿菌菌液最佳侵染時(shí)間的確定 |
| 2.1.9 最佳共培養(yǎng)時(shí)間的確定 |
| 2.2 結(jié)果與分析 |
| 2.2.1 不同激素濃度對(duì)生菜葉片再生率的影響 |
| 2.2.2 誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基 |
| 2.2.3 選擇培養(yǎng)基中潮霉素濃度的確定 |
| 2.2.4 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生菜轉(zhuǎn)化的影響 |
| 2.2.5 抑菌抗生素Cef的選擇 |
| 2.2.6 不同侵染時(shí)間對(duì)生菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響 |
| 2.2.7 不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生菜轉(zhuǎn)化的影響 |
| 2.3 小結(jié)與討論 |
| 2.3.1 不同激素濃度對(duì)生菜再生的影響 |
| 2.3.2 遺傳轉(zhuǎn)化過程中各因素的影響 |
| 第三章 轉(zhuǎn)蠟樣芽孢桿菌acd S基因生菜幼苗的獲得 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.2 acd S基因的克隆及生物信息學(xué)分析 |
| 3.1.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.1.4 生菜的轉(zhuǎn)化 |
| 3.1.5 轉(zhuǎn)基因生菜的PCR鑒定 |
| 3.1.6 轉(zhuǎn)acd S基因生菜的蛋白表達(dá)分析 |
| 3.1.7 熒光觀察 |
| 3.1.8 轉(zhuǎn)基因生菜ACC脫氨酶活性的檢測(cè) |
| 3.2 結(jié)果與分析 |
| 3.2.1 蠟樣芽孢桿菌acd S基因的克隆及生物信息學(xué)分析 |
| 3.2.2 含acd S基因的表達(dá)載體的鑒定 |
| 3.2.3 蠟樣芽孢桿菌acd S基因?qū)ι说霓D(zhuǎn)化 |
| 3.2.4 轉(zhuǎn)基因生菜的PCR結(jié)果分析 |
| 3.2.5 轉(zhuǎn)基因生菜的蛋白表達(dá)分析 |
| 3.2.6 轉(zhuǎn)基因生菜的熒光觀察 |
| 3.2.7 轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株中ACC脫氨酶活性的比較 |
| 3.3 小結(jié)與討論 |
| 3.3.1 acd S基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.3.2 生菜遺傳轉(zhuǎn)化植株的獲得 |
| 第四章 轉(zhuǎn)acd S基因生菜耐鹽性評(píng)價(jià) |
| 4.1 材料與方法 |
| 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.1.2 鹽脅迫處理 |
| 4.1.3 鹽脅迫處理后生理生化指標(biāo)的測(cè)定 |
| 4.2 結(jié)果與分析 |
| 4.2.1 T2代轉(zhuǎn)基因生菜PCR鑒定 |
| 4.2.2 鹽脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因生菜生長(zhǎng)的影響 |
| 4.2.3 鹽脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因生菜葉片相對(duì)含水量的影響 |
| 4.2.4 鹽脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因生菜葉綠素含量的影響 |
| 4.2.5 鹽脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因生菜丙二醛含量的影響 |
| 4.2.6 鹽脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因生菜細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸含量的影響 |
| 4.2.7 鹽脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因生菜可溶性糖含量的影響 |
| 4.2.8 鹽脅迫處理對(duì)轉(zhuǎn)基因生菜抗氧化物酶系統(tǒng)的影響 |
| 4.3 討論 |
| 第五章 結(jié)論與展望 |
| 5.1 生菜離體再生體系的構(gòu)建 |
| 5.2 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的生菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建 |
| 5.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定 |
| 5.4 acd S轉(zhuǎn)基因生菜功能分析 |
| 主要試劑和配方 |
| 試劑 |
| 配方 |
| 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
| 致謝 |
（2）番茄高色素hp2基因的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化及功能驗(yàn)證（論文提綱范文）
| CONTENTS |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 研究的目的和意義 |
| 1.2 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.2.1 番茄果實(shí)中番茄紅素研究進(jìn)展概述 |
| 1.2.2 hp基因研究進(jìn)展 |
| 1.2.3 轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究進(jìn)展 |
| 1.2.4 利用基因工程進(jìn)行番茄品種改良的研究進(jìn)展 |
| 1.2.5 色素基因在其他作物上的研究進(jìn)展 |
| 1.2.6 Gateway克隆技術(shù)在植物中應(yīng)用進(jìn)展概述 |
| 1.3 主要研究?jī)?nèi)容 |
| 1.3.1 含番茄高色素hp基因突變體的篩選 |
| 1.3.2 番茄再生體系的優(yōu)化 |
| 1.3.3 目的(hp2)基因全長(zhǎng)序列的獲取 |
| 1.3.4 利用GATEWAY方法構(gòu)建含目的(hp2)基因表達(dá)載體 |
| 1.3.5 番茄對(duì)hp2基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究 |
| 1.3.6 遺傳轉(zhuǎn)化株系的鑒定與分析 |
| 1.4 技術(shù)路線 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 高色素番茄hp突變體果實(shí)品質(zhì)性狀的基礎(chǔ)研究 |
| 2.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.1.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.1.3 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 2.2 hp基因的克隆 |
| 2.2.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.2.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.3 利用GATEWAY克隆技術(shù)構(gòu)建植物表達(dá)載體 |
| 2.3.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.3.3 試驗(yàn)方法 |
| 2.4 番茄葉盤法高頻再生體系的優(yōu)化 |
| 2.4.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.4.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.4.3 統(tǒng)計(jì)與分析 |
| 2.5 番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 |
| 2.5.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.5.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.5.3 統(tǒng)計(jì)與分析 |
| 2.6 番茄hp2基因的功能驗(yàn)證 |
| 2.6.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.6.2 試驗(yàn)方法 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 含高色素不同hp基因番茄品種之間品質(zhì)性狀比較及相關(guān)性分析 |
| 3.1.1 不同hp基因番茄間番茄紅素含量比較分析 |
| 3.1.2 不同hp基因番茄間果實(shí)間產(chǎn)量及品質(zhì)比較分析 |
| 3.1.3 番茄果實(shí)品質(zhì)性狀的相關(guān)分析 |
| 3.2 hp2基因的克隆與檢測(cè)分析 |
| 3.2.1 RNA的提取與檢測(cè)分析 |
| 3.2.2 RT-PCR擴(kuò)增hp2基因全長(zhǎng)序列分析 |
| 3.2.3 膠回收產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化與鑒定分析 |
| 3.2.4 克隆基因全長(zhǎng)的生物信息學(xué)比對(duì)分析 |
| 3.3 pCAMBIA-1301-hp2植物表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.3.1 帶有attB序列hp2全長(zhǎng)基因的構(gòu)建與檢測(cè) |
| 3.3.2 含有attR的pCAMBIA-1301-ccdB表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.3.3 pCAMBIA-1301-hp2植物表達(dá)載體的鑒定分析 |
| 3.4 耐貯型番茄子葉高頻再生體系的優(yōu)化 |
| 3.4.1 不同消毒方法和無菌苗培養(yǎng)基對(duì)番茄實(shí)生苗發(fā)生效果的影響 |
| 3.4.2 不同激素與濃度對(duì)耐貯型番茄不定芽的誘導(dǎo)和分化的影響 |
| 3.4.3 激素6BA+IAA的不同處理水平對(duì)番茄品種09836生根的影響 |
| 3.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐貯型番茄09836的遺傳轉(zhuǎn)化 |
| 3.5.1 pCAMBIA-1301-hp2植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的分析 |
| 3.5.2 耐貯型番茄09836的遺傳轉(zhuǎn)化 |
| 3.6 hp2基因功能的驗(yàn)證分析 |
| 3.6.1 T_0代轉(zhuǎn)基因植株DNA檢測(cè)分析 |
| 3.6.2 轉(zhuǎn)hp2基因抗性番茄植株的分子檢測(cè)分析 |
| 3.6.3 轉(zhuǎn)hp2基因抗性番茄植株的半定量RT-PCR檢測(cè)分析 |
| 3.6.4 T_0代轉(zhuǎn)基因植株番茄紅素含量及相關(guān)葉片生理指標(biāo)的檢測(cè)分析 |
| 3.6.5 番茄09836轉(zhuǎn)hp2基因后代(T_1和T_2)的遺傳穩(wěn)定性分析 |
| 4 討論 |
| 4.1 含不同hp基因番茄果實(shí)番茄紅素含量與主要品質(zhì)性狀的關(guān)系 |
| 4.2 影響耐貯型番茄高頻再生體系建立的主要因素 |
| 4.2.1 外植體類型 |
| 4.2.2 無菌苗的培養(yǎng) |
| 4.2.3 基因型 |
| 4.2.4 激素組合 |
| 4.3 影響耐貯型番茄遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素 |
| 4.3.1 預(yù)培養(yǎng) |
| 4.3.2 侵染時(shí)間 |
| 4.3.3 共培養(yǎng)時(shí)間 |
| 4.4 在耐貯型番茄轉(zhuǎn)基因過程中應(yīng)注意的幾個(gè)問題 |
| 4.5 利用Gateway構(gòu)建表達(dá)載體的優(yōu)越性 |
| 4.5.1 帶有attB位點(diǎn)目的片段 |
| 4.5.2 構(gòu)建適合的帶有attR重組位點(diǎn)的植物表達(dá)載體 |
| 4.6 番茄轉(zhuǎn)基植株的后期檢測(cè)驗(yàn)證探討 |
| 4.6.1 PCR擴(kuò)增檢測(cè) |
| 4.6.2 半定量RT-PCR檢測(cè) |
| 4.6.3 生理指標(biāo)的檢測(cè) |
| 4.7 hp2基因遺傳機(jī)制及其利用展望 |
| 4.7.1 hp2基因的調(diào)控功能及分子機(jī)制 |
| 4.7.2 hp2基因的利用及展望 |
| 4.8 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 5 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（3）雙Bt基因?qū)顦涞倪z傳轉(zhuǎn)化及外源基因表達(dá)研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 抗蟲基因來源及殺蟲機(jī)理 |
| 1.1.1 微生物來源的抗蟲基因－Bt 基因 |
| 1.1.2 植物來源的抗蟲基因 |
| 1.1.3 動(dòng)物來源的抗蟲基因 |
| 1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 |
| 1.2.1 農(nóng)桿菌（Agrobacterium） |
| 1.2.2 Ti 質(zhì)粒及 T-DNA |
| 1.3 多基因聚合的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物發(fā)展趨勢(shì) |
| 1.4 獲得基因疊加的主要方法 |
| 1.4.1 二次轉(zhuǎn)化法 |
| 1.4.2 雜交聚合法 |
| 1.4.3 共轉(zhuǎn)化法 |
| 1.5 轉(zhuǎn)基因植物的篩選鑒定方法 |
| 1.5.1 選擇標(biāo)記基因與報(bào)告基因 |
| 1.5.2 DNA 水平的分子鑒定 |
| 1.5.3 外源基因在轉(zhuǎn)錄水平的分子鑒定 |
| 1.5.4 外源基因在翻譯水平的分子鑒定 |
| 1.6 抗蟲基因在楊樹中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀 |
| 1.6.1 單 Bt 基因在楊樹中的應(yīng)用 |
| 1.6.2 蛋白酶抑制劑等其它抗蟲基因在楊樹中的應(yīng)用 |
| 1.7 轉(zhuǎn)雙價(jià)或多價(jià)抗蟲楊研究 |
| 1.7.1 Bt 基因與慈姑蛋白酶抑制劑 API 基因聯(lián)合策略 |
| 1.7.2 Bt 基因和豇豆胰蛋白酶抑制劑 CpTI 基因聯(lián)合策略 |
| 1.7.3 Bt 基因和馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因聯(lián)合策略 |
| 1.7.4 Bt 基因和水稻巰基蛋白酶抑制劑基因 OC-I 聯(lián)合策略 |
| 1.7.5 蛋白酶抑制劑基因之間的聯(lián)合策略 |
| 1.7.6 Bt 基因和半夏凝集素基因 pta 聯(lián)合策略 |
| 1.7.7 Bt 基因和蜘蛛殺蟲肽聯(lián)合策略 |
| 1.7.8 雙 Bt 基因聯(lián)合策略 |
| 1.8 轉(zhuǎn)雙價(jià)或多價(jià)抗蟲基因植物對(duì)昆蟲的致死效應(yīng) |
| 1.9 本課題研究的目的及意義 |
| 2 轉(zhuǎn)單、雙 BT 基因 741 楊外源基因表達(dá)及抗蟲性對(duì)比研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 培養(yǎng)基 |
| 2.1.3 測(cè)試?yán)ハx |
| 2.1.4 主要試劑及試劑盒 |
| 2.1.5 主要儀器 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 適宜分化和生根培養(yǎng)基篩選 |
| 2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株煉苗移栽及田間管理 |
| 2.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的 PCR 檢測(cè) |
| 2.2.4 轉(zhuǎn)基因 741 楊的 RT-PCR 和熒光定量 PCR 檢測(cè) |
| 2.2.5 轉(zhuǎn)基因植株 Bt 毒蛋白測(cè)定 |
| 2.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性檢測(cè) |
| 2.3 結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 適宜分化培養(yǎng)基的確定 |
| 2.3.2 適宜生根培養(yǎng)基的確定 |
| 2.3.3 生根苗移栽及管理 |
| 2.3.4 轉(zhuǎn)基因 741 楊外源基因的 PCR 檢測(cè) |
| 2.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的 RT-PCR 和熒光定量 PCR 檢測(cè) |
| 2.3.6 轉(zhuǎn)基因植株 Bt 毒蛋白的 ELISA 檢測(cè) |
| 2.3.7 轉(zhuǎn)基因株系對(duì)柳藍(lán)葉甲的致死效應(yīng)對(duì)比 |
| 2.3.8 轉(zhuǎn)基因株系對(duì)美國(guó)白蛾的致死效應(yīng)對(duì)比 |
| 2.4 小結(jié) |
| 3 巨霸楊雙 BT 基因遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè) |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌種和質(zhì)粒 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 培養(yǎng)基 |
| 3.1.4 主要試劑、酶和試劑盒 |
| 3.1.5 主要儀器設(shè)備 |
| 3.2 試驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 試驗(yàn)藥品的配制 |
| 3.2.2 巨霸楊再生體系的建立 |
| 3.2.3 潮霉素（Hyg）對(duì)葉片分化及莖尖生長(zhǎng)的影響 |
| 3.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的巨霸楊遺傳轉(zhuǎn)化 |
| 3.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定 |
| 3.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的 DNA 水平檢測(cè) |
| 3.3 結(jié)果與分析 |
| 3.3.1 無菌組培苗建立 |
| 3.3.2 葉片再生體系的確立 |
| 3.3.3 潮霉素（Hyg）對(duì)葉片分化及莖尖生長(zhǎng)的影響 |
| 3.3.4 轉(zhuǎn)雙 Bt 基因巨霸楊植株的獲得 |
| 3.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定 |
| 3.3.6 轉(zhuǎn)基因植株的 PCR 檢測(cè) |
| 3.4 小結(jié) |
| 4 討論 |
| 4.1 RT-PCR 與熒光定量 PCR 技術(shù)結(jié)合 |
| 4.2 多抗蟲基因聚合的抗蟲效應(yīng) |
| 4.3 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的表達(dá)與沉默 |
| 4.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素 |
| 4.5 抗生素在轉(zhuǎn)基因研究中的作用 |
| 4.6 篩選標(biāo)記潮霉素的使用濃度 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
| 致謝 |
（4）3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因轉(zhuǎn)化煙草及表達(dá)分析（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究與應(yīng)用 |
| 1.1.1 植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法 |
| 1.1.2 多基因植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究 |
| 1.1.2.1 多基因植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法 |
| 1.1.2.2 多基因表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 1.1.3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化的研究與應(yīng)用 |
| 1.1.3.1 抗性轉(zhuǎn)基因煙草的研究與應(yīng)用 |
| 1.1.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草用于基礎(chǔ)理論研究 |
| 1.1.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草作為生物反應(yīng)器 |
| 1.2 融合基因的研究概況 |
| 1.2.1 融合基因的基本概念及分類 |
| 1.2.2 融合基因的研究與應(yīng)用 |
| 1.3 睪丸酮叢毛單胞菌 3α-羥類固醇脫氫酶基因(3α-HSD/CR)研究概況 |
| 1.3.1 睪丸酮叢毛單胞菌簡(jiǎn)介 |
| 1.3.2 3α-羥類固醇脫氫酶基因(3α-HSD/CR)研究概況 |
| 1.4 aiiA 基因的研究現(xiàn)狀 |
| 1.4.1 aiiA 基因及其功能簡(jiǎn)介 |
| 1.4.2 aiiA 基因的應(yīng)用研究進(jìn)展 |
| 1.4.2.1 aiiA 基因的發(fā)現(xiàn)及在微生物中的表達(dá) |
| 1.4.2.2 aiiA 基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用研究 |
| 1.5 本研究的目的意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株及質(zhì)粒 |
| 2.1.1.2 酶及試劑盒 |
| 2.1.1.3 儀器 |
| 2.1.1.4 培養(yǎng)基及溶液的配制 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物設(shè)計(jì) |
| 2.1.2.2 大腸桿菌質(zhì)粒的提取——堿裂解法 |
| 2.1.2.3 大腸桿菌感受態(tài)的制備—TSS 法 |
| 2.1.2.4 農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)的制備 |
| 2.1.2.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.1.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌——電擊法 |
| 2.1.2.7 轉(zhuǎn)化子 PCR 鑒定 |
| 2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及陽(yáng)性植株的分子檢測(cè) |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 植物材料 |
| 2.2.1.2 培養(yǎng)基 |
| 2.2.1.3 藥品及試劑 |
| 2.2.1.4 儀器 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 煙草無菌苗的培養(yǎng) |
| 2.2.2.2 根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng) |
| 2.2.2.3 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草 |
| 2.2.2.4 陽(yáng)性植株的檢測(cè) |
| 2.3 目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株中的表達(dá)分析 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.1.1 植物材料 |
| 2.3.1.2 藥品與試劑 |
| 2.3.1.3 儀器 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.2.1 ELISA 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中 3α-HSD/CR 蛋白的表達(dá) |
| 2.3.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)膽固醇降解能力測(cè)定 |
| 2.3.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌抗病性測(cè)定 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.1.1 真核表達(dá)載體質(zhì)粒的酶切鑒定 |
| 3.1.2 農(nóng)桿菌中質(zhì)粒目的基因的 PCR 鑒定 |
| 3.1.3 測(cè)序結(jié)果 |
| 3.2 再生芽及轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性株的生長(zhǎng) |
| 3.3 轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株的檢測(cè) |
| 3.3.1 PCR 檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草 GUS 組織化學(xué)染色結(jié)果分析 |
| 3.4 目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)與分析 |
| 3.4.1 ELISA 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中 3α-HSD/CR 蛋白的表達(dá) |
| 3.4.2 轉(zhuǎn)基因煙草降解膽固醇的能力測(cè)定 |
| 3.4.3 轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌抗病性測(cè)定 |
| 3.4.4 融合基因 3α-HSD/CR-aiiA 在轉(zhuǎn)煙草中的表達(dá) |
| 4 討論 |
| 4.1 3α-HSD/CR 和 aiiA 基因 |
| 4.2 融合基因 3α-HSD/CR-aiiA 的表達(dá) |
| 4.3 融合基因基因表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 4.4 融合基因中不同來源的基因的表達(dá)及各基因之間的干擾作用 |
| 4.5 轉(zhuǎn)基因植物抗病試驗(yàn)病原菌接種的方式的選擇 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄Ⅰ 試驗(yàn)所用部分試劑配方 |
| 附錄Ⅱ 縮略詞 |
| 致謝 |
（5）GNA基因表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗（論文提綱范文）
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 1.2.1 植物表達(dá)載體p UNG的構(gòu)建 |
| 1.2.2 植物表達(dá)載體p RNG的構(gòu)建 |
| 1.3 植物表達(dá)載體p UNG和p RNG導(dǎo)入農(nóng)桿菌 |
| 1.4 甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化 |
| 1.5 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) |
| 1.6 轉(zhuǎn)化植株TR-PCR分析 |
| 1.7 轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白提取液凝血活性測(cè)定 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 植物表達(dá)載體p UNG的構(gòu)建 |
| 2.2 植物表達(dá)載體p RNG的構(gòu)建 |
| 2.3 植物表達(dá)載體p UNG和p RNG導(dǎo)入農(nóng)桿菌 |
| 2.4 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) |
| 2.5 部分PCR陽(yáng)性植株RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.6 凝血實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及SAS分析結(jié)果 |
| 3 討論 |
（6）植物凝集素基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 甘蔗的重要性 |
| 1.1.1 重要的糖料作物 |
| 1.1.2 重要的能源作物 |
| 1.1.3 其它用途 |
| 1.2 甘蔗蟲害 |
| 1.3 植物抗蟲基因工程的研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 雪花蓮凝集素基因的研究進(jìn)展 |
| 1.3.1.1 雪花蓮凝集素的定義,結(jié)構(gòu) |
| 1.3.1.2 雪花蓮凝集素的抗蟲機(jī)理 |
| 1.3.1.3 雪花蓮凝集素基因的應(yīng)用 |
| 1.3.1.4 凝集素檢測(cè)方法 |
| 1.3.2 殺蟲晶體蛋白的研究進(jìn)展 |
| 1.3.2.1 Bt殺蟲晶體蛋白的分類 |
| 1.3.2.2 蘇云金桿菌毒蛋白基因的殺蟲機(jī)理 |
| 1.3.2.3 Bt殺蟲晶體蛋白基因的應(yīng)用 |
| 1.3.3 蛋白酶抑制劑基因 |
| 1.3.4 淀粉酶抑制劑基因 |
| 1.3.5 其它抗蟲基因 |
| 1.3.5.1 異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因(ipt) |
| 1.3.5.2 膽固醇氧化酶基因 |
| 1.3.5.3 動(dòng)物的抗蟲基因 |
| 1.3.5.4 麥胚凝集素基因 |
| 1.3.5.5 半夏凝集素基因 |
| 1.3.5.6 幾丁質(zhì)酶基因及其應(yīng)用 |
| 1.3.6 植物抗蟲基因工程存在的問題及其對(duì)策 |
| 1.4 甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 |
| 1.4.1 抗病性改良 |
| 1.4.2 抗菌性改良 |
| 1.4.3 抗蟲性改良 |
| 1.4.4 抗旱基因改良 |
| 1.4.5 提高甘蔗蔗糖含量和改良蔗糖色澤的轉(zhuǎn)基因研究 |
| 1.4.6 甘蔗生物反應(yīng)器研究進(jìn)展 |
| 1.5 本論文研究的目的、內(nèi)容和技術(shù)路線 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究?jī)?nèi)容 |
| 1.5.3 技術(shù)路線 |
| 2. 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 |
| 2.1.1 菌種與質(zhì)粒 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 主要試劑及儀器 |
| 2.1.3.1 主要試劑 |
| 2.1.3.2 主要儀器 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)室常用溶液及培養(yǎng)基配制 |
| 2.2.1 培養(yǎng)基配制 |
| 2.2.2 溶液配制 |
| 2.2.3 抗生素及激素的配制 |
| 2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.3.1 構(gòu)建策略 |
| 2.3.2 pNU中間表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.3.2.1 載體質(zhì)粒的大量提取與純化 |
| 2.3.2.2 載體質(zhì)粒的酶切 |
| 2.3.2.3 目的片段的回收 |
| 2.3.2.4 目的片段(Ubi)與載體pNOS的連接 |
| 2.3.2.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 2.3.2.7 重組質(zhì)粒DNA的小量提取 |
| 2.3.2.8 重組質(zhì)粒pUN的電泳分析 |
| 2.3.2.9 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 |
| 2.3.2.10 重組菌pUN的保存 |
| 2.3.3 植物表達(dá)載體pUNG的獲得 |
| 2.3.3.1 質(zhì)粒pUN和GNA-T的提取 |
| 2.3.3.2 酶切 |
| 2.3.3.3 目的片段的回收 |
| 2.3.3.4 回收片段的連接 |
| 2.3.3.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 2.3.3.6 重組質(zhì)粒DNA的小量提取 |
| 2.3.3.7 重組質(zhì)粒pUNG的電泳分析 |
| 2.3.3.8 重組質(zhì)粒pUNG的酶切鑒定 |
| 2.3.3.9 重組菌pUNG的保存 |
| 2.4 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 |
| 2.4.1 轉(zhuǎn)化方法 |
| 2.4.1.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.4.1.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 |
| 2.4.2 重組子PCR鑒定 |
| 2.4.2.1 目的基因GNA的PCR鑒定 |
| 2.5 雪花蓮凝集素基因遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗 |
| 2.5.1 甘蔗轉(zhuǎn)化材料及其農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備 |
| 2.5.1.1 甘蔗培養(yǎng)基的成分 |
| 2.5.1.2. 外植體的處理 |
| 2.5.1.3 農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備 |
| 2.5.1.4 轉(zhuǎn)化材料的預(yù)處理 |
| 2.5.2 農(nóng)桿菌菌液浸染愈傷組織及共培養(yǎng) |
| 2.5.3 農(nóng)桿菌浸染后的愈傷組織分化成苗 |
| 2.5.4 甘蔗小植株的篩選培養(yǎng) |
| 2.5.5 甘蔗抗性苗的煉苗 |
| 2.6 轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè) |
| 2.6.1 植物總DNA的小量提取 |
| 2.6.2 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) |
| 2.6.2.1 Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GNA基因轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) |
| 2.6.2.2 Rbcs啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GNA基因轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) |
| 2.6.3 RT-PCR檢測(cè) |
| 2.6.3.1 轉(zhuǎn)化植株的總RNA的提取 |
| 2.6.3.2 RT-PCR的擴(kuò)增 |
| 2.6.4 轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白提取液凝血活性測(cè)定 |
| 3. 結(jié)果與分析 |
| 3.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.1.1 中間載體pUN的構(gòu)建 |
| 3.1.2 植物表達(dá)載體pUNG的構(gòu)建 |
| 3.1.3 植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌 |
| 3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)化 |
| 3.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè) |
| 3.3.1 植物總DNA的提取 |
| 3.3.2 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) |
| 3.3.2.1 Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gna基因轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) |
| 3.3.2.2 Rbcs啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gna基因轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè) |
| 3.3.3 RNA的小量提取 |
| 3.3.4 部分轉(zhuǎn)化植株RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.4.1 Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gna基因部分轉(zhuǎn)化植株的RT-PCR檢測(cè) |
| 3.3.4.2 Rbcs啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gna基因部分轉(zhuǎn)化植株的RT-PCR檢測(cè) |
| 3.3.5 凝血實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及SAS分析結(jié)果 |
| 4. 討論 |
| 4.1 關(guān)于GNA基因 |
| 4.2 關(guān)于葉肉特異表達(dá)啟動(dòng)子rbcs和玉米泛素基因ubi啟動(dòng)子 |
| 4.3 關(guān)于轉(zhuǎn)化及篩選 |
| 5. 結(jié)論 |
| 6. 本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)工作 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 8. 縮寫詞(Abbreviation) |
| 致謝 |
（7）根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)D32基因和芪合酶基因轉(zhuǎn)化普通煙草的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法 |
| 1.1.1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 |
| 1.1.2 基因槍轉(zhuǎn)化法 |
| 1.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 煙草遺傳轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀 |
| 1.2.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用 |
| 1.2.3 煙草轉(zhuǎn)基因的前景與展望 |
| 1.3 DREB 轉(zhuǎn)錄因子及其研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 轉(zhuǎn)錄因子概述 |
| 1.3.2 DREB 轉(zhuǎn)錄因子基因 |
| 1.3.3 DREB 基因在改良植物抗逆性方面的應(yīng)用 |
| 1.4 芪合酶基因及其研究進(jìn)展 |
| 1.4.1 芪合酶基因的種類 |
| 1.4.2 芪合酶基因的結(jié)構(gòu)特征和功能 |
| 1.4.3 芪合酶的表達(dá)調(diào)控及基因工程研究進(jìn)展 |
| 1.5 本研究的目的和意義 |
| 第二章 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo) D32 基因轉(zhuǎn)化煙草的研究 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 結(jié)果與分析 |
| 2.2.1 卡那霉素質(zhì)量濃度對(duì)煙草葉片出愈率的影響 |
| 2.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)D32 基因的遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化 |
| 2.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得 |
| 2.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè) |
| 2.3 討論 |
| 第三章 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)芪合酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 結(jié)果與分析 |
| 3.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)芪合酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 |
| 3.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得 |
| 3.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR 檢測(cè) |
| 3.3 討論 |
| 第四章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 附錄1 英文縮寫詞表（Abbreviations） |
| 附錄2 植物培養(yǎng)基的配制 |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
（8）云南轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物研究與產(chǎn)業(yè)化:現(xiàn)狀及其發(fā)展（論文提綱范文）
| 1 轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物發(fā)展概況 |
| 2 云南轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物研究現(xiàn)狀 |
| 2.1 水稻 |
| 2.2 小麥 |
| 2.3 馬鈴薯 |
| 2.4 番茄 |
| 2.5 煙草 |
| 2.6 油菜 |
| 2.7 非洲菊 |
| 2.8 香石竹 |
| 3 云南轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的發(fā)展設(shè)想 |
| 3.1 充分利用資源優(yōu)勢(shì), 分離克隆具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要功能基因 |
| 3.2 進(jìn)一步完善云南農(nóng)作物基因轉(zhuǎn)化相應(yīng)平臺(tái) |
| 3.3 大力推進(jìn)云南特色農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因新品種的選育 |
| 3.4 加快云南轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程 |
（9）抗蟲基因植物表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化及表達(dá)研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 蘇云金芽孢桿菌基因 |
| 1.1.1 Bt 毒蛋白殺蟲機(jī)理 |
| 1.1.2 Bt 毒蛋白的分類 |
| 1.2 轉(zhuǎn)Bt 基因植物研究 |
| 1.3 影響B(tài)t 基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的因素 |
| 1.3.1 表達(dá)單元及輔助因子 |
| 1.3.2 植物發(fā)育 |
| 1.3.3 外部環(huán)境條件 |
| 1.3.4 受體植物的遺傳背景 |
| 1.3.5 Bt 基因在受體細(xì)胞染色體上的插入位點(diǎn) |
| 1.3.6 轉(zhuǎn)基因植物中Bt 基因的沉默 |
| 1.4 解決害蟲對(duì)轉(zhuǎn)Bt 基因作物產(chǎn)生抗性的策略 |
| 1.4.1 選擇啟動(dòng)子 |
| 1.4.2 同時(shí)使用兩種以上的Bt 基因轉(zhuǎn)化 |
| 1.4.3 聯(lián)合使用Bt 基因和其它類型的抗蟲基因 |
| 1.5 獲得多價(jià)轉(zhuǎn)基因植物策略 |
| 1.6 楊樹Bt 抗蟲基因工程的研究 |
| 1.6.1 國(guó)外楊樹Bt 抗蟲基因工程研究進(jìn)展 |
| 1.6.2 國(guó)內(nèi)楊樹Bt 抗蟲基因工程研究進(jìn)展 |
| 1.7 研究目的及意義 |
| 2 植物表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和載體 |
| 2.1.2 酶及生化試劑 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.1.4 常用培養(yǎng)基和試劑的配制 |
| 2.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 pCAMBIA3301-Bt1 表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.2.2 pCAMBIA3301-Bt3 表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.2.3 pCAMBIA3301-Bt1-Bt3 表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.3 結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 質(zhì)粒pCAMBIA1305-Bt1 的PCR 檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.3.2 pCAMBIA3301-Bt1 陽(yáng)性克隆的酶切及PCR 鑒定 |
| 2.3.3 質(zhì)粒pCAMBIA1305-Bt3 的PCR 檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.3.4 pCAMBIA3301-Bt3 陽(yáng)性克隆的酶切及PCR 鑒定 |
| 2.3.5 質(zhì)粒 pCAMBIA1305-Bt1-Bt3 的酶切及 PCR 檢測(cè) |
| 2.3.6 pCAMBIA3301-Bt1-Bt3 陽(yáng)性克隆鑒定 |
| 3 煙草遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè) |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌種和質(zhì)粒 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 培養(yǎng)基 |
| 3.1.4 抗生素 |
| 3.1.5 重要試劑、酶和試劑盒 |
| 3.1.6 重要儀器設(shè)備 |
| 3.2 試驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 選擇壓濃度的確定 |
| 3.2.2 抑菌抗生素濃度的確定 |
| 3.2.3 菌株培養(yǎng)及菌液制備 |
| 3.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 |
| 3.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的抗性鑒定 |
| 3.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草的DNA 水平檢測(cè) |
| 3.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草的蛋白質(zhì)水平檢測(cè) |
| 3.3 結(jié)果與分析 |
| 3.3.1 潮酶素(Hyg)對(duì)煙草葉片分化的影響 |
| 3.3.2 潮酶素(Hyg)對(duì)嫩莖生根的影響 |
| 3.3.3 頭孢噻肟鈉(CTX)對(duì)葉片分化的影響 |
| 3.3.4 頭孢噻肟鈉(CTX)對(duì)農(nóng)桿菌的抑制能力 |
| 3.3.5 遺傳轉(zhuǎn)化單、雙價(jià)Bt 基因轉(zhuǎn)基因煙草的獲得 |
| 3.3.6 轉(zhuǎn)化植株抗性鑒定 |
| 3.3.7 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR 鑒定 |
| 3.3.8 轉(zhuǎn)基因煙草Bt 毒蛋白的ELISA 檢測(cè) |
| 4 741 楊遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化植株的檢測(cè) |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌種和質(zhì)粒 |
| 4.1.3 培養(yǎng)基 |
| 4.1.4 主要試劑 |
| 4.1.5 主要儀器設(shè)備 |
| 4.2 試驗(yàn)方法 |
| 4.2.1 葉片再生體系的確立 |
| 4.2.2 選擇壓濃度的確定 |
| 4.2.3 抑菌抗生素濃度的確定 |
| 4.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的741 楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 |
| 4.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化741 楊 |
| 4.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定 |
| 4.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(cè) |
| 4.2.8 轉(zhuǎn)基因植株Bt 毒蛋白的ELISA 檢測(cè) |
| 4.3 結(jié)果與分析 |
| 4.3.1 741 楊葉片再生體系的確立 |
| 4.3.2 潮霉素(Hyg)對(duì)葉片分化的影響 |
| 4.3.3 潮霉素(Hyg)對(duì)嫩莖生根的影響 |
| 4.3.4 頭孢噻肟鈉(CTX)對(duì)葉片分化的影響 |
| 4.3.5 頭孢噻肟鈉(CTX)抑菌濃度的確定 |
| 4.3.6 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率因素的優(yōu)化 |
| 4.3.7 轉(zhuǎn)雙 Bt 基因741 楊的篩選及獲得 |
| 4.3.8 轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定 |
| 4.3.9 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(cè) |
| 4.3.10 轉(zhuǎn)基因植株Bt 毒蛋白的ELISA 檢測(cè) |
| 5 討論 |
| 5.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 5.2 標(biāo)記基因的選擇 |
| 5.3 Bt 毒蛋白表達(dá)的分析 |
| 5.4 轉(zhuǎn)雙Bt 基因741 楊的獲得 |
| 5.5 轉(zhuǎn)Bt 抗蟲基因植物潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性 |
| 6 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
| 致謝 |
（10）表達(dá)AMV，WCMV外殼蛋白基因的紅三葉T1，T2代分子生物學(xué)檢測(cè)及抗病性分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 1 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.2.1 植物抗病毒基因工程的研究進(jìn)展 |
| 1.2.2 轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)與鑒定研究現(xiàn)狀 |
| 1.2.3 植物病毒檢測(cè)方法概述 |
| 1.2.4 紅三葉基因工程及抗病分子育種研究現(xiàn)狀 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)使用的主要試劑和儀器 |
| 2.1.1 主要試劑 |
| 2.1.2 常用溶液及緩沖液 |
| 2.1.3 儀器設(shè)備 |
| 2.2 轉(zhuǎn)基因紅三葉T1 代植株外源基因整合檢測(cè) |
| 2.2.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3 轉(zhuǎn)基因紅三葉T1 代植株的人工雜交及穴盤育苗 |
| 2.3.1 人工雜交 |
| 2.3.2 穴盤育苗 |
| 2.4 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株外源基因整合檢測(cè) |
| 2.4.1 材料 |
| 2.4.2 方法 |
| 2.5 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株外源基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) |
| 2.5.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.5.2 RNA 實(shí)驗(yàn)器皿的預(yù)處理 |
| 2.5.3 方法 |
| 2.6 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株對(duì)AMV、WCMV 的抗性檢測(cè) |
| 2.6.1 材料 |
| 2.6.2 試驗(yàn)方法 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 轉(zhuǎn)基因紅三葉T1 代植株外源基因整合檢測(cè) |
| 3.1.1 T1 代植株及對(duì)照DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 |
| 3.1.2 轉(zhuǎn)基因紅三葉T1 代植株外源基因整合PCR 檢測(cè) |
| 3.2 轉(zhuǎn)基因紅三葉T1 代植株人工雜交 |
| 3.3 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株外源基因整合檢測(cè) |
| 3.3.1 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株及對(duì)照DNA 提取 |
| 3.3.2 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株外源基因整合PCR 檢測(cè) |
| 3.4 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株外源基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) |
| 3.4.1 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株及對(duì)照RNA 提取 |
| 3.4.2 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株外源基因整合RT-PCR 檢測(cè) |
| 3.5 轉(zhuǎn)基因紅三葉T2 代植株對(duì)AMV、WCMV 的抗性檢測(cè) |
| 3.5.1 T2 代接種AMV、WCMV 病毒結(jié)果 |
| 3.5.2 接種后AMV、WCMV 在轉(zhuǎn)基因與對(duì)照植株體內(nèi)積累的差異 |
| 4 討論 |
| 4.1 DNA、RNA 提取及RT-PCR 技術(shù)要點(diǎn) |
| 4.2 目的基因在轉(zhuǎn)基因紅三葉后代中的累集 |
| 4.3 外源基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中的遺傳 |
| 4.4 轉(zhuǎn)基因植株的抗病性檢測(cè) |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 附錄Ⅰ 主要實(shí)驗(yàn)試劑及配置 |
| 附錄Ⅱ 主要實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
四、GNA和α-PAP雙抗表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化（論文參考文獻(xiàn)）
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標(biāo)簽：農(nóng)桿菌論文; 轉(zhuǎn)基因植物論文; 轉(zhuǎn)基因番茄論文; 基因合成論文; 三農(nóng)論文;