一、裸鼠人子宮內(nèi)膜異位癥模型建立與病灶血管形成相關檢測（論文文獻綜述）
孫瑞英[1]（2021）在《補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠JAK2/STAT3信號通路相關因子的影響》文中研究指明目的:本課題將JAK2/STAT3信號通路引入到EM腎虛血瘀型大鼠研究中,并用補腎溫經(jīng)湯干預,以此來探討JAK2/STAT3信號通路在EM腎虛血瘀型大鼠中的作用機制以及補腎溫經(jīng)湯治療EM的藥物靶點,以期為EM臨床規(guī)范選用方藥提供可靠的依據(jù)。方法:從SPF級雌性未孕健康105只SD大鼠中隨機選取10只為空白組,余采用復合因素法構(gòu)建腎虛血瘀型大鼠模型,造模成功后隨機抽取10只為假手術(shù)組,僅開腹,不縫內(nèi)膜,余采用自體內(nèi)膜移植法構(gòu)建EM腎虛血瘀型大鼠模型。從造模成功的56只大鼠中隨機選取50只大鼠隨機分為模型組、達那唑組(63 mg·kg-1)以及補腎溫經(jīng)湯低、中、高劑量組(5,10,20 g·kg-1),每組10只,每日灌胃1次,連續(xù)28 d。測量治療前后各造模組異位灶長（D1）,寬（D2）,高（D3）,并計算異位灶體積（V=0.52×D1×D2×D3）;取各組大鼠在位、異位內(nèi)膜組織進行HE染色,觀察組織病理變化。ELISA檢測各組大鼠血清中IL-10,IL-17含量。IHC檢測各組大鼠在位、異位內(nèi)膜組織JAK2,STAT3,p-STAT3,Caspase-8,TNF-α,VEGF,TSP-1,MMP-9,E-cadherin,N-cadherin表達水平;WB檢測Caspase-8,TNF-α,VEGF,TSP-1,MMP-9,E-cadherin以及N-cadherin蛋白表達水平。RT-PCR檢測Caspase-8,TNF-α,MMP-9,E-cadherin以及N-cadherin基因表達水平。結(jié)果:治療前,各模型組異位灶肉眼可見典型囊狀水泡,鏡下可見子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整,呈子宮腔狀或環(huán)形封閉式結(jié)構(gòu),內(nèi)有囊腫形成,上皮為立方狀或柱狀上皮,大部分上皮細胞有分泌現(xiàn)象,間質(zhì)致密,基質(zhì)呈少許纖維化,血管增生密集。治療后達那唑組與補腎溫經(jīng)湯低、中、高劑量組異位灶體積顯著減?。≒<0.01）,子宮內(nèi)膜上皮層均有不同程度的變薄,甚至萎縮呈線狀排列,細胞排列不緊密,多數(shù)內(nèi)膜脫落,間質(zhì)細胞減少且表現(xiàn)為小而稀疏狀,血管明顯減少。經(jīng)IHC檢測:與空白組、假手術(shù)組比較,模型組在位與異位內(nèi)膜組織中JAK2,STAT3,p-STAT3蛋白表達均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較,補腎溫經(jīng)湯低劑量組在位與異位內(nèi)膜組織中JAK2蛋白表達顯著降低（P<0.05）,達那唑組與補腎溫經(jīng)湯中、高劑量組在位與異位內(nèi)膜組織中JAK2,STAT3,p-STAT3蛋白表達均顯著降低（P<0.05）。經(jīng)ELISA檢測:與空白組、假手術(shù)組比較,模型組血清中IL-10含量顯著降低（P<0.01）,IL-17含量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較,達那唑組與溫經(jīng)湯加味低、中、高劑量組血清中IL-10含量顯著升高（P<0.01）,IL-17含量顯著降低（P<0.01）。經(jīng)IHC和WB檢測:與空白組、假手術(shù)組比較,模型組在位與異位內(nèi)膜組織中Caspase-8,TSP-1,E-cadherin蛋白表達均顯著降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01）;TNF-α,VEGF,MMP-9,N-cadherin蛋白表達均顯著升高（P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01）;與模型組比較,達那唑組與補腎溫經(jīng)湯中、高劑量組在位與異位內(nèi)膜組織中Caspase-8,TSP-1,E-cadherin蛋白表達顯著升高（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,TNF-α,VEGF,MMP-9,N-cadherin蛋白表達顯著降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01）。經(jīng)PCR檢測:與空白組、假手術(shù)組比較,模型組在位與異位內(nèi)膜組織中Caspase-8,E-cadherin基因表達顯著降低（P<0.01）,TNF-α,MMP-9,N-cadherin基因表達顯著升高（P<0.01）,與模型組比較,達那唑組與補腎溫經(jīng)湯中、高劑量組在位與異位內(nèi)膜組織中Caspase-8,E-cadherin基因表達顯著升高（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,達那唑組與補腎溫經(jīng)湯中、高劑量組在位與異位內(nèi)膜組織中MMP-9基因表達顯著降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,達那唑組與補腎溫經(jīng)湯中、高劑量組在位與異位內(nèi)膜組織中TNF-α,N-cadherin基因表達顯著降低（P<0.05）。結(jié)論:1.補腎溫經(jīng)湯具有抑制EM腎虛血瘀型大鼠異位灶侵襲的作用,其具體作用機制可能與調(diào)控JAK2/STAT3信號通路過度激活所介導的免疫抑制以及阻斷微血管新生功能有關。2.STAT3被JAK2激活,使得STAT3過度磷酸化,導致JAK2/STAT3信號通路在EM腎虛血瘀型大鼠中處于異?；罨癄顟B(tài)。3.JAK2/STAT3信號通路的異?；罨癄顟B(tài)表現(xiàn)為上調(diào)IL-17,TNF-α,VEGF,MMP-9,N-cadherin表達水平,下調(diào)IL-10,Caspase-8,TSP-1,E-cadherin表達水平而引起EM腎虛血瘀型大鼠免疫失衡以及大量微血管新生,導致EM發(fā)生、發(fā)展。
韋佳慧[2]（2020）在《基于Wnt通路的內(nèi)異消抑制異體移植子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制研究》文中進行了進一步梳理背景子宮內(nèi)膜異位癥是指具有活性的內(nèi)膜細胞生長在子宮內(nèi)膜以外部位所引起的疾患,屬于中醫(yī)血瘀證范疇,治法當以活血化瘀為主。內(nèi)異消來源于中醫(yī)經(jīng)典婦科名方“佛手散”,是本實驗室創(chuàng)制的抗子宮內(nèi)膜異位癥的中藥新藥,由川芎嗪、阿魏酸配以延胡索乙素組成,我們前期發(fā)現(xiàn)內(nèi)異消對自體移植子宮內(nèi)膜異位癥有一定的療效,但在異體移植模型上的作用尚未闡明。結(jié)合網(wǎng)絡藥理學方法,有利于系統(tǒng)地分析內(nèi)異消對子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制。侵襲轉(zhuǎn)移被認為是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的重要步驟之一,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關,而Wnt通路能促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此,本研究首先觀察了內(nèi)異消對異體移植子宮內(nèi)膜異位癥的療效,然后從調(diào)控Wnt通路、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移的角度探討其作用機制。最后運用網(wǎng)絡藥理學方法,進一步挖掘內(nèi)異消抑制子宮內(nèi)膜異位癥的潛在作用機制,為內(nèi)異消治療子宮內(nèi)膜異位癥提供依據(jù)。目的在熒光異體移植子宮內(nèi)膜異位癥模型上驗證內(nèi)異消是否具有抑制子宮內(nèi)膜上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進而抑制內(nèi)膜侵襲轉(zhuǎn)移的作用,且其作用機制是否與Wnt通路相關,并運用網(wǎng)絡藥理學方法進一步挖掘內(nèi)異消作用于子宮內(nèi)膜異位癥的潛在靶點。方法1.熒光異體移植子宮內(nèi)膜異位癥模型的改進選取處于動情期的8～10周齡雌性C3H tdTomato小鼠,取雙側(cè)子宮,剪成4 mm2大小的組織塊移植于裸鼠的腹部皮下,手術(shù)后每5 d肌肉注射2 mg·kg-1苯甲酸雌二醇一次。造模28 d后,于活體成像系統(tǒng)下檢測異位病灶的熒光強度,游標卡尺測量并根據(jù)公式:體積=0.52×長×寬×高,計算異位病灶的體積,然后構(gòu)建異位病灶熒光強度與體積的關系曲線,HE染色觀察異位病灶的組織結(jié)構(gòu),免疫組化檢測異位病灶中子宮內(nèi)膜異位蛋白ENDO-I的表達。2.內(nèi)異消抑制子宮內(nèi)膜異位癥的藥效學研究在造模28 d后,將造模成功的動物根據(jù)熒光強度隨機分為模型組、內(nèi)異消低、中、高劑量組和孕三烯酮組,另設正常雌性C3H tdTomato小鼠為空白對照組,空白對照組和模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液,內(nèi)異消低、中、高劑量組分別給予90、180、360 mg·Kg-1內(nèi)異消,孕三烯酮組給予2 mg·Kg-1孕三烯酮,連續(xù)28 d每天灌胃給藥一次。給藥結(jié)束后,檢測異位病灶的熒光強度和體積,HE染色觀察異位內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)的變化,ELISA法檢測血清中E2和PROG水平的變化。3.內(nèi)異消抑制異位內(nèi)膜侵襲轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究取空白對照組子宮內(nèi)膜、模型組以及內(nèi)異消各組異位組織,提取RNA和蛋白,用RT-qPCR法檢測侵襲轉(zhuǎn)移MMP-2、MMP-9、TIMP-1基因和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist、Snail、Slug、ZEB1基因的表達,Western blot法檢測侵襲轉(zhuǎn)移MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表達。4.內(nèi)異消調(diào)控異位內(nèi)膜Wnt通路的機制研究取空白對照組子宮內(nèi)膜、模型組以及內(nèi)異消各組異位組織,提取RNA和蛋白,用RT-qPCR法檢測Wnt通路APC、GSK3β、β-catenin、c-Myc、CyclinD1基因的表達,Western blot法檢測Wnt3a、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、c-Myc蛋白的表達。5.內(nèi)異消抑制子宮內(nèi)膜異位癥的網(wǎng)絡藥理學研究運用TCMID、TCMSP和SEA數(shù)據(jù)庫收集內(nèi)異消各成分的作用靶點,OMIM、DisGeNET和GEO數(shù)據(jù)庫收集子宮內(nèi)膜異位癥的靶點。通過Cytoscape 3.5.0軟件構(gòu)建“內(nèi)異消成分-靶點”和“內(nèi)異消靶點-子宮內(nèi)膜異位癥靶點”網(wǎng)絡,運用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡的拓撲參數(shù),計算出所有靶點的度及中介中心性的平均值,篩選出網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點,通過DAVID及PANTHER數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點進行GO及通路富集分析,運用Sybyl-X 2.1.1軟件將內(nèi)異消各成分與部分關鍵靶點進行分子對接驗證。結(jié)果1.熒光異體移植子宮內(nèi)膜異位癥模型的改進造模28 d后,裸鼠腹部皮下的異位病灶可見較強熒光,熒光強度≥9.58E+6,開腹后肉眼可見病灶呈透明的囊狀,表面有豐富的血管形成,內(nèi)有積液,積液高度≥1 mm,異位病灶體積≥4 mm3。異位病灶熒光強度與體積的線性關系公式為y=862154x+6.13E+6,R2=0.9005。HE染色顯示,異位病灶中有子宮內(nèi)膜上皮細胞、腺體及間質(zhì)的生長,免疫組化結(jié)果表明,在異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞的胞漿可見ENDO-I蛋白的表達,說明熒光異體移植子宮內(nèi)膜異位癥模型改進成功。2.內(nèi)異消能抑制子宮內(nèi)膜異位癥給藥28 d后發(fā)現(xiàn),模型組給藥前后,異位病灶的熒光強度和體積沒有顯著變化（P>0.05）。與給藥前相比,內(nèi)異消各組異位病灶的熒光強度和體積均顯著降低（P<0.05）,孕三烯酮也能顯著減小異位病灶的熒光強度和體積（P<0.01）。HE染色結(jié)果顯示,模型組異位內(nèi)膜具有與正常子宮內(nèi)膜相似的結(jié)構(gòu),單層上皮細胞呈柱狀排列,且內(nèi)膜壁較厚,腺體數(shù)較多,血管豐富,有炎性細胞的浸潤。給予360mg·Kg-1內(nèi)異消后,異位內(nèi)膜壁明顯變薄,腺體及血管的數(shù)量明顯減少,炎性細胞的浸潤也減少。ELISA結(jié)果表明,與空白對照組相比,模型組血清中E2、PROG含量顯著升高（P<0.05）,與模型組相比,內(nèi)異消能顯著降低血清中E2及PROG水平（P<0.05）。以上結(jié)果表明,內(nèi)異消對子宮內(nèi)膜異位癥具有較好的療效。3.內(nèi)異消抑制侵襲轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（1）RT-qPCR結(jié)果表明,與空白對照組相比,模型組MMP-2、MMP-9 mRNA水平顯著升高（P<0.01）,TIMP-1 mRNA水平顯著降低（P<0.05）。與模型組相比,內(nèi)異消顯著下調(diào)MMP-2、MMP-9基因的表達（P<0.05）,顯著上調(diào)TIMP-1基因的表達（P<0.05）。Western blot結(jié)果表明,與空白對照組相比,模型組MMP-2、MMP-9蛋白的表達顯著增加（P<0.05）,TIMP-1蛋白的表達顯著減少（P<0.05）。與模型組相比,內(nèi)異消顯著抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表達（P<0.05）,顯著增加TIMP-1蛋白的表達（P<0.05）。（2）RT-qPCR結(jié)果顯示,與空白對照組相比,模型組E-cadherin mRNA水平顯著下降（P<0.01）,N-cadherin、Vimentin、Twist、Slug、Snail、ZEB1 mRNA水平顯著上升（P<0.05）。與模型組相比,內(nèi)異消顯著上調(diào)E-cadherin基因的表達（P<0.05）,顯著下調(diào)N-cadherin、Vimentin、Twist、Slug、Snail、ZEB1基因的表達（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示,與空白對照組相比,模型組E-cadherin蛋白水平顯著降低（P<0.05）,N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白水平顯著升高（P<0.05）。與模型組相比,內(nèi)異消顯著促進E-cadherin蛋白的表達（P<0.05）,顯著抑制N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表達（P<0.05）。4.內(nèi)異消調(diào)控Wnt通路RT-qPCR結(jié)果表明,與空白對照組相比,模型組APC、GSK3β基因的表達顯著減少（P<0.05）,β-catenin、c-Myc、CyclinD1基因的表達顯著增加（P<0.05）。與模型組相比,內(nèi)異消顯著升高GSK3β、APC mRNA水平（P<0.05）,顯著降低β-catenin、c-Myc、CyclinD1 mRNA水平（P<0.05）。Western blot結(jié)果表明,與空白對照組相比,模型組GSK3β、p-β-catenin蛋白的水平顯著下調(diào)（P<0.05）,Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、c-Myc蛋白的水平顯著上調(diào)（P<0.05）。與模型組相比,內(nèi)異消顯著上調(diào)GSK3β、p-β-catenin蛋白的表達（P<0.05）,顯著下調(diào)Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、c-Myc蛋白的表達（P<0.05）。5.內(nèi)異消抑制子宮內(nèi)膜異位癥的網(wǎng)絡藥理學研究通過數(shù)據(jù)庫收集得到內(nèi)異消靶點275個,子宮內(nèi)膜異位癥靶點401個,二者共同靶點22個,構(gòu)建了“內(nèi)異消成分-靶點”和“內(nèi)異消靶點-子宮內(nèi)膜異位癥靶點”網(wǎng)絡,由22個共同靶點及其鄰居節(jié)點構(gòu)成的核心蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡,分析得到66個關鍵靶點。GO分析結(jié)果顯示,66個關鍵靶點主要參與凋亡過程的負調(diào)節(jié)、DNA模板化、代謝等生物過程,主要存在于核、細胞質(zhì)、細胞膜中,并具有蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、信號轉(zhuǎn)換等分子功能。通路富集分析結(jié)果顯示,關鍵靶點主要參與調(diào)控PI3K-Akt signaling pathway,Estrogen signaling pathway,TNF signaling pathway,Apoptosis signaling pathway,Wnt signaling pathway,VEGF signaling pathway等。分子對接結(jié)果顯示,阿魏酸與IL6、MMP-2具有較好的結(jié)合活性,與TP53、MMP-9及VEGFA具有一定的結(jié)合活性;延胡索乙素與MMP-2、IL8具有較好的結(jié)合活性,與VEGFA、TIMP-1具有一定的結(jié)合活性;川芎嗪與各靶點的對接得分值均較低,無結(jié)合活性。結(jié)論綜上所述,體內(nèi)實驗表明,在熒光異體移植子宮內(nèi)膜異位癥模型中,構(gòu)建了異位病灶熒光強度與體積的關系曲線,R2=0.9005。內(nèi)異消能顯著降低異位病灶的熒光強度和體積,改善異位內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)的病理變化,降低血清中E2和PROG含量,其作用機制可能與內(nèi)異消調(diào)節(jié)Wnt通路,影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進而抑制子宮內(nèi)膜發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移有關。網(wǎng)絡藥理學研究也表明,內(nèi)異消作用于子宮內(nèi)膜異位癥的關鍵靶點有66個,其中包含了侵襲轉(zhuǎn)移靶點MMP-2、MMP-9和TIMP-1,并可參與調(diào)控包括Wnt通路在內(nèi)的多個信號通路過程,內(nèi)異消中阿魏酸、延胡索乙素與包括侵襲轉(zhuǎn)移因子在內(nèi)的多個關鍵靶點有結(jié)合活性。
林翔[3]（2020）在《缺氧調(diào)控的細胞粘附和細胞周期在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用》文中進行了進一步梳理子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis,EM）,簡稱內(nèi)異癥,是指子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）在子宮腔被覆內(nèi)膜及子宮以外的部位粘附、生長、周期性出血,繼而形成包塊或結(jié)節(jié),引發(fā)疼痛、不孕等癥狀。雖然是育齡期婦女的常見病,內(nèi)異癥的發(fā)病機制至今不明且眾說紛紜,目前仍以Sampson的經(jīng)血逆流-種植學說為主導,該學說認為隨經(jīng)血逆流入盆腔的子宮內(nèi)膜碎片經(jīng)歷粘附、增殖、血管新生等過程,形成異位囊腫或結(jié)節(jié)。但種植學說并不能解釋為什么90%的女性發(fā)生經(jīng)血逆流,而僅10%左右的育齡期婦女罹患內(nèi)異癥。這也提示我們內(nèi)異癥不僅與月經(jīng)逆流相關,盆腔微環(huán)境引起的異位內(nèi)膜生物學改變在內(nèi)異癥發(fā)病中的作用也不可忽視。月經(jīng)期子宮內(nèi)膜功能層螺旋小動脈持續(xù)性收縮,子宮內(nèi)膜缺血缺氧,剝脫出血,形成月經(jīng),現(xiàn)有研究已證明隨經(jīng)血逆流的子宮內(nèi)膜碎片在異位組織粘附生長前處于相對缺氧的狀態(tài)。缺氧狀態(tài)下缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）的表達升高,介導內(nèi)異癥細胞克服缺氧環(huán)境并啟動異位粘附-增殖-浸潤等生物學行為。粘附被認為是異位病灶形成的第一步,有研究表明轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）、粘附分子整合素Integrins家族在內(nèi)異癥粘連中發(fā)揮重要作用,但起關鍵作用的Integrins并未被闡明,HIF-1α、TGF-β1與內(nèi)異癥細胞異位粘附的具體關系也尚無報道。內(nèi)異癥細胞異位粘附之后仍然長期受到缺氧的應激,其在子宮腔外氧化應激環(huán)境下持續(xù)存活、復制的機制還不明確。Micro RNA-210（miR-210）是缺氧處理后上調(diào)最為顯著的HIF-1α相關micro RNA,miR-210常通過其靶基因參與細胞周期進展、氧化應激（oxidative stress,OS）下的細胞分裂增殖、DNA損傷修復、血管新成及能量代謝轉(zhuǎn)換等多項生物學過程,被認為是缺氧標志性的micro RNA。現(xiàn)有文獻表明內(nèi)異癥異位病灶存在過度氧化應激,但異位病灶氧化/抗氧化失衡的機制不明。我們在前期缺氧促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞（ESCs）異位粘附的研究中發(fā)現(xiàn)長期慢性缺氧會導致子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞及上皮細胞發(fā)生DNA損傷,同時發(fā)現(xiàn)缺氧相關miR-210-3p在異位病灶的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和上皮細胞中表達均升高。目前,內(nèi)異癥細胞在異位粘附之后克服氧化應激壓力持續(xù)存活、異常分裂增殖的機制尚不明確。我們應用Target Scan,RNA-hybrid和miRanda數(shù)據(jù)庫預測到BARD1是miR-210-3p的靶基因。BARD1（BRCA1 associated RING domain 1,BRCA1相關環(huán)結(jié)構(gòu)域）通過指環(huán)區(qū)與BRCA1相連形成異二聚體復合物,在細胞中發(fā)揮DNA損傷修復和激活細胞周期檢測點的功能,且BARD1蛋白已被證明決定了BRCA1蛋白的穩(wěn)定性及BRCA1/BARD1異二聚體復合物在細胞周期調(diào)控、DNA損傷應答、癌癥進展中的功能,但目前尚無miR-210-3p及其靶基因參與內(nèi)異癥發(fā)病的報道。本研究基于經(jīng)血逆流-種植學說,探討了缺氧在內(nèi)異位癥發(fā)病三部曲之——異位粘附、異常增殖中的作用,證明了缺氧不但能夠通過激活TGF-β1/p-Smad2/p-Smad3/Smad4/Integrins信號通路增加子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的異位粘附能力,啟動內(nèi)異癥的發(fā)生;缺氧上調(diào)的miR-210-3p還能通過靶向抑制BARD1的表達,促進BRCA1蛋白的降解,使BRCA1/BARD1蛋白復合物無法發(fā)揮正常的DNA損傷應答及細胞周期檢測點功能,內(nèi)異癥細胞逃逸氧化應激損傷、細胞周期持續(xù)進展、細胞在宮腔外不斷復制增殖,從而促進內(nèi)異癥的發(fā)展。本研究旨在闡明缺氧及其相關分子（HIF-1α、miR-210-3p等）在內(nèi)異癥異位病灶形成、生長中的具體作用機制及尋找內(nèi)異癥治療的潛在靶點。目的:明確在內(nèi)異癥異位病灶形成中起關鍵作用的Integrins及其與缺氧的關系。方法:（1）收集15例非內(nèi)異癥患者的正常增生期子宮內(nèi)膜,15例行宮腹聯(lián)合手術(shù)的內(nèi)異癥患者的異位病灶和同期的在位子宮內(nèi)膜,通過免疫組織化學（immunohistochemistry assay,IHC）分析標本中HIF-1α及Integrins的表達情況;（2）收集13例月經(jīng)周期的增生期行宮腔鏡手術(shù)的內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜,提取內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞（eutopic endometrial stromal cells,ESCs）,建立穩(wěn)定的內(nèi)異癥原代間質(zhì)細胞提取、純化、鑒定、編號及培養(yǎng)體系;（3）對新鮮提取的13例ESCs（編號為:ESC-1、ESC-2、ESC-3、ESC-4、ESC-5、ESC-6、ESC-7、ESC-8、ESC-9、ESC-10、ESC-11、ESC-12、ESC-13）進行常氧（21%O2）、缺氧（1%O2）處理及細胞粘附能力、遷移能力分析;（4）提取缺氧處理0、48小時后的ESCs的m RNA和蛋白進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time PCR,RT-q PCR）及免疫印跡分析（western blot,WB）,檢測缺氧對HIF-1α及Integrins表達的影響。結(jié)果:（1）IHC結(jié)果表明:與正常增生期子宮內(nèi)膜相比,內(nèi)異癥患者異位病灶及配對的增生期在位子宮內(nèi)膜的上皮細胞、間質(zhì)細胞中均異常高表達HIF-1α,但僅間質(zhì)細胞中特異性高表達整合素家族中的Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5;（2）功能實驗表明:缺氧培養(yǎng)顯著提高ESCs的粘附能力、遷移能力;（3）缺氧培養(yǎng)增加ESCs中HIF-1α、Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的m RNA和蛋白表達。結(jié)論:HIF-1α在內(nèi)異癥異位病灶的間質(zhì)細胞和上皮細胞中表達升高,且異位病灶間質(zhì)細胞上Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的特異性高表達參與了ESCs的異位粘附和異位病灶的形成,缺氧培養(yǎng)可能通過上調(diào)整合素的表達促進ESCs的粘附能力,但缺氧上調(diào)Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的具體機制不明。目的:探索缺氧促進ESCs異位粘附的具體機制及小鼠內(nèi)異癥模型的異位病灶形成初期HIF-1α、TGF-β1及Integrins的表達情況。方法:（1）IHC檢測內(nèi)異癥患者異位病灶及在位內(nèi)膜中TGF-β1、TGF-β受體2（TGF-βreceptor II）的表達情況;（2）酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測缺氧培養(yǎng)后13種ESCs細胞上清液中TGF-β1的表達情況;（3）常氧培養(yǎng)時添加TGF-β1、缺氧培養(yǎng)下添加TGF-β1特異性抑制劑（SB431542）,利用粘附實驗、Transwell遷移實驗檢測TGF-β1對ESCs粘附能力、遷移能力的影響;（4）RT-q PCR,WB,免疫熒光（Immunofluorescence assay,IF）檢測經(jīng)典的TGF-β1/p-Smad2/p-Smad3/Smad4信號通路激活情況;（5）SB431542預處理、HIF-1α的特異性RNA干擾病毒感染細胞后,通過RT-q PCR,WB檢驗HIF-1α在TGF-β1/Smads信號通路激活及整合素表達上調(diào)中的作用;（6）通過將內(nèi)異癥患者增生期的在位子宮內(nèi)膜組織植入8周齡的雌性C57BL/6小鼠腹腔,構(gòu)建11只小鼠內(nèi)異癥模型,在植入0、48小時后取出病灶并通過IHC檢測異位病灶中HIF-1α、TGF-β1、Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的表達情況。結(jié)果:（1）IHC結(jié)果表明:TGF-β1及TGF-βreceptor II在內(nèi)異癥患者異位病灶間質(zhì)細胞中顯著高表達;（2）缺氧培養(yǎng)顯著增加ESCs中TGF-β1蛋白的分泌;（3）IF結(jié)果表明:缺氧培養(yǎng)ESCs促進p-Smad2由細胞漿進入細胞核,且缺氧處理后4小時、8小時,p-Smad2蛋白在核內(nèi)表達明顯升高;（4）WB結(jié)果顯示:缺氧培養(yǎng)下p-Smad2,p-Smad3,Smad4及整合素Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的蛋白表達均增加;（5）TGF-β1特異性抑制劑SB431542有效抑制Smads信號通路的激活,且顯著降低缺氧上調(diào)的整合素水平;敲降HIF-1α顯著抑制缺氧培養(yǎng)下TGF-β1的分泌、Smads信號通路的激活及整合素表達的上調(diào);（5）動物實驗的IHC結(jié)果表明,異位病灶形成初期（內(nèi)膜植入48小時）,子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中HIF-1α、TGF-β1及Integrins的表達均增加,與體外實驗結(jié)果一致。結(jié)論:缺氧刺激ESCs分泌TGF-β1,TGF-β1與TGF-βreceptor II結(jié)合后磷酸化Smad2、Smad3,增加p-Smad2入核,激活p-Smad2/p-Smad3/Smad4信號通路,進而增加下游整合素Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的表達及ESCs的粘附能力,且此過程依賴于HIF-1α。目的:評估缺氧環(huán)境對內(nèi)異癥細胞DNA的影響,明確缺氧標志性miRNA-210-3p在內(nèi)異癥患者異位病灶中的定位和表達情況。方法:（1）收集27例非內(nèi)異癥患者來源的正常增生期子宮內(nèi)膜、57例配對的內(nèi)異癥異位病灶和同期在位子宮內(nèi)膜,IHC檢測組織中HIF-1α和氧化應激誘導的DNA損傷標志蛋白8-OHd G的表達情況;（2）對新鮮提取的另外5例原代ESCs（編號為ESC-14、ESC-15、ESC-16、ESC-17、ESC-18）及購買的人子宮內(nèi)膜腺癌上皮細胞系Ishikawa進行缺氧培養(yǎng),利用單細胞凝膠電泳實驗（堿性彗星實驗）檢測缺氧處理0天、28天后ESCs和Ishikawa的DNA雙鏈損傷情況;（3）對缺氧處理后的原代ESCs進行高通量測序,篩選出顯著變化的micro RNAs并進行RT-q PCR驗證;（4）通過熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridisation analysis,FISH）和免疫熒光雙染色檢測5例正常增生期子宮內(nèi)膜組織、5例配對的異位病灶、在位內(nèi)膜組織,明確miR-210-3p在異位病灶中的定位情況;再通過RT-q PCR對15例正常增生期子宮內(nèi)膜組織,15例配對的異位病灶、在位內(nèi)膜組織中miR-210-3p的表達情況進行定量分析。結(jié)果:（1）IHC結(jié)果表明:與正常子宮內(nèi)膜相比,內(nèi)異癥患者異位病灶及配對在位子宮內(nèi)膜的上皮細胞及間質(zhì)細胞中均異常高表達8-OHd G,且趨勢與HIF-1α的表達情況一致,提示內(nèi)異癥細胞存在DNA損傷,且缺氧可能參與了該過程;（2）堿性彗星實驗結(jié)果顯示:缺氧培養(yǎng)28天顯著增加彗星的尾長（Tail length）、彗星尾部熒光強度（Tail DNA%）及彗星尾矩（Tail olive moment）,說明慢性缺氧誘發(fā)了ESCs和Ishikawa的DNA損傷;（3）高通量測序及組織RT-q PCR結(jié)果表明:缺氧培養(yǎng)顯著上調(diào)ESCs和Ishikawa中miR-210-3p的表達水平,且內(nèi)異癥患者異位病灶組織中miR-210-3p的表達也顯著高于在位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜;（4）FISH及免疫熒光雙染色結(jié)果顯示:異位病灶中高表達的miR-210-3p定位于子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細胞和上皮細胞。結(jié)論:慢性缺氧是誘發(fā)內(nèi)異癥細胞氧化應激性DNA損傷的原因之一,但內(nèi)異癥細胞逃逸氧化應激壓力,持續(xù)在宮腔外存活、增殖的機制不明,異位病灶間質(zhì)細胞和上皮細胞中顯著高表達的miR-210-3p可能通過表觀遺傳調(diào)控參與了該過程,但是具體機制有待探究。目的:探索缺氧上調(diào)的miR-210-3p在內(nèi)異癥細胞逃逸氧化應激性DNA損傷及異位存活、增殖中的作用及具體分子機制。方法:（1）在常氧、缺氧培養(yǎng)下,利用慢病毒特異性敲除miR-210-3p,并對ESCs和Ishikawa進行細胞增殖實驗、流式細胞檢測（Flow cytometric analysis,FCM）及WB,分析miR-210-3p在常氧、缺氧環(huán)境下對細胞增殖及細胞周期分布的影響;（2）為減少原代ESCs帶來的個體差異,先對商品化的人子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜永生化間質(zhì)細胞系h EM15A進行miR-210-3p的過表達,然后進行高通量測序、生物信息學分析及雙熒光素酶報告基因分析（Luciferase assays）以尋找miR-210-3p參與的主要生物學過程和miR-210-3p的靶基因;（3）利用RT-q PCR、WB等技術(shù)驗證靶基因BARD1及其下游效應蛋白BRCA1在過表達、敲降miR-210-3p的ESCs及Ishikawa中的表達情況;（4）對第三部分中驗證miR-210-3p表達情況的15例正常增生期子宮內(nèi)膜、15份配對的異位病灶組織和同期在位子宮內(nèi)膜進行RT-q PCR分析,并對15份異位病灶組織中miR-210-3p和BARD1 m RNA的表達水平進行相關性分析;（5）IHC檢測27例正常增生期子宮內(nèi)膜、57對配對的異位病灶組織和同期在位子宮內(nèi)膜中BARD1和BRCA1的表達情況;（6）常氧、缺氧培養(yǎng)下敲降miR-210-3p或過表達BARD1,利用WB分析下游功能分子BRCA1、p-BRCA1、p53,p21,Cyclin B1及Cdc2的表達情況,并利用流式細胞術(shù)分析缺氧條件下miR-210-3p、BARD1對細胞周期分布的影響。結(jié)果:（1）缺氧培養(yǎng)下敲降miR-210-3p導致ESCs和Ishikawa發(fā)生細胞周期的G2/M期阻滯,且使缺氧上調(diào)的Cyclin B1、Cdc2蛋白及缺氧下調(diào)的p53、p21蛋白水平得到恢復,但常氧培養(yǎng)下敲降miR-210-3p對細胞周期分布、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白無影響;（2）高通量測序、生物信息學及熒光素酶報告基因分析顯示:過表達miR-210-3p影響h EM15A的細胞周期調(diào)控過程,如有絲分裂、染色體定位、細胞分裂、微管運動、紡錘體和著絲點微管組裝等;軟件預測和Luciferase assays結(jié)果證明miR-210-3p通過直接結(jié)合BARD1的3’-UTR區(qū)域靶向抑制BARD1的表達;（3）RT-q PCR及WB結(jié)果表明:過表達miR-210-3p下調(diào)ESCs及Ishikawa中BARD1的m RNA表達,干擾miR-210-3p則增加BARD1的m RNA表達,且過表達和敲降miR-210-3p后BARD1、BRCA1在蛋白水平上表現(xiàn)出與BARD1 m RNA一樣的變化趨勢;（4）IHC結(jié)果表明:異位病灶、在位內(nèi)膜的間質(zhì)細胞及上皮細胞中BARD1的表達均顯著低于其在正常增生期子宮內(nèi)膜中的表達;RT-q PCR結(jié)果顯示異位病灶組織BARD1的m RNA表達與組織中miR-210-3p的表達顯著負相關;（5）WB和功能實驗結(jié)果表明:缺氧抑制的BRCA1蛋白表達能被miR-210-3p的干擾病毒逆轉(zhuǎn),BARD1過表達則能逆轉(zhuǎn)BRCA1蛋白在miR-210-3p過表達的ESCs和Ishikawa細胞中的表達下降,且缺氧條件下過表達BARD1導致G2/M期阻滯,BRCA1、p-BRCA1、p53、p21表達升高,Cyclin B1、Cdc2蛋白表達下降。結(jié)論:缺氧雖誘發(fā)內(nèi)異癥細胞的DNA損傷,但缺氧上調(diào)的miR-210-3p又能通過靶向抑制BARD1的表達,促進BRCA1蛋白的泛素化降解,擾亂DNA損傷修復復合物BRCA1/BARD1發(fā)揮正常的細胞周期檢測點功能,使細胞周期不阻滯,內(nèi)異癥細胞逃逸氧化應激壓力而持續(xù)在宮腔外生長、增殖。目的:利用小鼠內(nèi)異癥模型研究miR-210-3p抑制劑、抗氧化劑維生素C（Vitamin C）在體內(nèi)對異位囊腫生長的作用。方法:（1）構(gòu)建50只C57BL/6小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型:每天根據(jù)體重用200ug/kg雌激素處理供體鼠7天,將供體鼠雙側(cè)子宮沿其最長軸切開,并剪成0.5×0.3cm大小,然后將子宮內(nèi)膜面貼緊腸系膜縫入去勢后的8周齡受體C57BL/6小鼠腹腔,術(shù)后隔天給予200ug/kg雌激素維持,直至4周后實驗結(jié)束;（2）隨機選取16只內(nèi)異癥小鼠,均分為兩組,利用體內(nèi)傳送系統(tǒng)（in vivo-jet PEI?delivery agent）將對照組試劑（Negative control,NC）、miR-210-3p抑制劑（In-210）注射入小鼠腹腔,4周后取出異位病灶,測量病灶體積,IHC分析BARD1、BRCA1在異位病灶的間質(zhì)細胞和上皮細胞中的表達情況;（3）剩余33只內(nèi)異癥小鼠隨機分三組,每組11只,PBS組正常飼養(yǎng),隔日腹腔注射等體積PBS（約100u L）,口服維生素C組（OIVC組）將飲用水更換為2.5g/L維生素C水溶液,維生素C注射組（IPIVC組）根據(jù)小鼠體重隔天腹腔注射500mg/kg維生素C并正常給予飲水和食物;4周后取出異位病灶,測量病灶體積;IHC分析HIF-1α、8-OHd G、BARD1及BRCA1表達情況。結(jié)果:（1）同種異體移植法能有效構(gòu)建小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型,成功率為49/50,且異位病灶可見典型的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和上皮細胞;（2）利用in vivo-jet PEI?delivery agent體內(nèi)敲降miR-210-3p顯著縮小內(nèi)異癥模型中異位病灶的體積,且增加BARD1、BRCA1蛋白在異位病灶間質(zhì)細胞和上皮細胞中的表達;（3）抗氧化劑Vitamin C口服、腹腔給藥均能抑制小鼠內(nèi)異癥模型異位病灶的生長,IHC結(jié)果顯示腹腔注射Vitamin C顯著抑制異位病灶間質(zhì)細胞和上皮細胞中HIF-1α、8-OHd G蛋白的表達,增加間質(zhì)細胞和上皮細胞中BARD1、BRCA1蛋白表達。結(jié)論:體內(nèi)敲降miR-210-3p可能通過上調(diào)內(nèi)異癥細胞中BARD1蛋白表達,引起B(yǎng)RCA1蛋白的累積,激活DNA的損傷修復,從而抑制內(nèi)異癥細胞周期進展和異位病灶的生長;而抗氧化劑Vitamin C腹腔注射不僅增加BARD1、BRCA1蛋白表達,也有效抑制異位病灶中HIF-1α及8-OHd G的表達,提示維生素C可能通過減輕異位病灶整體的氧化應激水平,恢復氧化/抗氧化平衡,抑制異位病灶的生長,抗氧化劑為內(nèi)異癥的臨床輔助治療提供了新的思路。
劉陽[4]（2020）在《LncRNA MEG3-210在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用及相關機制研究》文中指出子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis,內(nèi)異癥）是指子宮內(nèi)膜樣組織出現(xiàn)在子宮腔及肌層以外的部位,引起不孕、痛經(jīng)、性交痛等癥狀,嚴重影響女性生活質(zhì)量。其在育齡期婦女中的發(fā)病率高且易復發(fā),給社會醫(yī)療體系造成巨大負擔。盡管內(nèi)異癥的研究持續(xù)數(shù)十年,但是它的具體發(fā)病機制尚不明了。目前的主流學說有“經(jīng)血逆流學說”、“體腔上皮化生學說”、“免疫學說”等,其中“經(jīng)血逆流學說”備受推崇,然而任何一種學說都不能完美的解釋所有類型的內(nèi)異癥。在“經(jīng)血逆流學說”的基礎上,由國內(nèi)學者郎景和教授提出的“在位內(nèi)膜決定論”指出子宮內(nèi)膜本身的生物學特性決定了內(nèi)異癥的發(fā)生。隨著測序和組學的發(fā)展,越來越多的結(jié)果表明內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜之間在表觀遺傳學、RNA水平、蛋白水平上有著明顯差異,而這些差異可能造成了子宮內(nèi)膜細胞功能的不同。如何通過機制的研究,找到對內(nèi)異癥診斷、治療的新方法是當下研究的熱點。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是指長度超過200個堿基且不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。Lnc RNA可以通過和DNA、RNA、蛋白質(zhì)的相互作用從轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾等層面調(diào)控多種重要生理過程。母系表達基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）被認為是“抑癌分子”廣泛表達于多種正常組織、細胞中,它的表達降低或者缺失可以促進腫瘤的發(fā)生和進展。MEG3具有多個轉(zhuǎn)錄本,有研究指出不同轉(zhuǎn)錄本之間的功能活性有所差異,因此有必要選擇一種或者一類轉(zhuǎn)錄本進行細致且深入的探索分析。目前尚未見MEG3在內(nèi)異癥中的相關報道,而我們的前期測序結(jié)果表明MEG3-210作為MEG3的一個轉(zhuǎn)錄本,在內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜中表達降低,提示MEG3-210可能與內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展相關。半乳糖凝集素-1（Galectin-1）通過糖識別結(jié)構(gòu)域結(jié)合β-半乳糖蛋白殘基,參與細胞的增殖、遷移、凋亡等。Galectin-1在內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中表達增加,且在小鼠內(nèi)異模型中阻斷Galectin-1作用可以縮小病灶并抑制血管生成。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路是介導細胞外信號向細胞內(nèi)傳遞的重要信號轉(zhuǎn)導通路。3ˊ,5ˊ-環(huán)腺苷酸（3’,5’-cyclic adenosine,c AMP）依賴性的蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）是連接鈣離子信號通路和c AMP信號通路的中心分子。肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2,SERCA2)通過將細胞內(nèi)Ca2+泵向肌漿網(wǎng)中,控制胞內(nèi)Ca2+濃度,維持細胞內(nèi)鈣平衡。MEG3-210在內(nèi)異癥中的調(diào)控機制尚不可知,通過對其調(diào)控關系的研究可能有助于探索疾病的發(fā)病機制。本研究通過對前期測序數(shù)據(jù)的再分析,確定MEG3-210在內(nèi)異癥的表達差異,通過對MEG3-210沉默和過表達后檢測子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞（ESCs）的功能變化探索其對內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的作用,而后通過生物信息學分析和分子機制相關實驗發(fā)現(xiàn)Galectin-1和p38 MAPK及PKA/SERCA2信號通路參與了MEG3-210對ESCs的功能調(diào)控,根據(jù)通路間的交互作用繪制MEG3-210在內(nèi)異癥中的調(diào)控網(wǎng)絡圖,為內(nèi)異癥的新型診斷和治療提供分子基礎。第一部分MEG3-210在內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的作用目的:研究MEG3-210在內(nèi)異癥患者和非內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜組織和間質(zhì)細胞中的表達水平差異;探索MEG3-210對內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。方法:對5對內(nèi)異癥患者和非內(nèi)異癥患者的子宮內(nèi)膜組織二代測序結(jié)果進行再分析;收集內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜40例（EU,n=40）,非內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜39例（NE,n=39）,分離培養(yǎng)在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞19例（Eu ESCs,n=19）,對照內(nèi)膜間質(zhì)細胞18例（Ne ESCs,n=18）,并進行間質(zhì)細胞鑒定。q RT-PCR檢測MEG3-210在組織和細胞中的表達水平。在Ne ESCs中轉(zhuǎn)染MEG3-210 si RNA來抑制MEG3-210表達,在Eu ESCs中轉(zhuǎn)染MEG3-210過表達質(zhì)粒來促進MEG3-210表達,采用CCK-8、transwell、流式細胞術(shù)檢測細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。結(jié)果:1.內(nèi)異癥患者和非內(nèi)異患者的子宮內(nèi)膜組織測序共鑒定出26種MEG3轉(zhuǎn)錄本,僅MEG3-210和MEG3-202轉(zhuǎn)錄本在兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義。2.MEG3-210在內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜組織和間質(zhì)細胞中表達水平降低3.MEG3-210表達下調(diào)后,Ne ESCs遷移、侵襲能力增強,而凋亡減弱,增殖能力無明顯影響。4.MEG3-210表達上調(diào)后,Eu ESCs遷移、侵襲能力減弱,凋亡增加,增殖能力無明顯影響。結(jié)論:1.組織驗證結(jié)果和測序結(jié)果一致,測序結(jié)果可靠。2.MEG3-210可調(diào)控ESCs遷移、侵襲和凋亡,而對增殖無明顯作用。3.MEG3-210下調(diào)可促進內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展第二部分MEG3-210通過p38 MAPK和PKA/SERCA2信號通路調(diào)控ESCs遷移、侵襲和凋亡目的:探索參與MEG3-210對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞調(diào)控的信號通路。方法:利用生物信息學分析提取與MEG3共表達的基因列表并對其進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。Western blot驗證目標信號通路中相關分子的蛋白水平變化。拯救實驗確定該通路參與MEG3-210對ESCs功能的調(diào)控。結(jié)果:1.根據(jù)生信分析結(jié)果,與MEG3存在共表達關系的基因可富集出26條主要的信號通路,其中環(huán)磷酸腺苷（c AMP）、鈣離子和MAPK三條信號通路上富集的基因數(shù)最多。2.MEG3-210下調(diào)后,p38、ATF2磷酸化水平升高,Bcl-2和MMP2蛋白水平升高,PKA、SERCA2蛋白水平下降。3.聯(lián)合MEG3-210 si RNA處理,p38 MAPK信號抑制劑SB203580加入后Ne ESCs遷移、侵襲能力部分減弱,凋亡能力恢復。4.聯(lián)合MEG3-210 si RNA處理,SERCA2過表達后,Ne ESCs遷移、侵襲和抗凋亡能力的均明顯抑制。5.聯(lián)合MEG3-210過表達質(zhì)粒處理,SERCA2下調(diào)后,Eu ESCs的遷移、侵襲能力增強,而細胞凋亡減少。6.SERCA2下調(diào)后,p38和ATF2磷酸化水平升高,SB203580加入后,SERCA2蛋白水平下降。結(jié)論:1.MEG3-210下調(diào)可激活p38 MAPK信號通路并抑制PKA/SERCA2信號。2.p38 MAPK通路的激活和PKA/SERCA2信號的抑制可部分解釋MEG3-210下調(diào)對ESCs遷移、侵襲和凋亡能力的調(diào)控。3.p38 MAPK和PKA/SERCA兩條信號通路之間存在交互作用,協(xié)同促進內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。第三部分Galectin-1介導MEG3-210對ESCs的作用和機制研究目的:探索與MEG3-210結(jié)合的蛋白,以及MEG3-210在內(nèi)異癥中的調(diào)控機制方法:構(gòu)建MEG3-210 RNA探針,通過RNA-pull down質(zhì)譜分析、RIP、共定位等實驗確定Galectin-1與MEG3-210的結(jié)合關系。通過western blot確定Galectin-1對p38 MAPK和PKA/SERCA2信號的調(diào)控。通過western blot和ELISA檢測Galectin-1的表達水平。利用Galectin-1過表達質(zhì)粒和MEG3-210 si RNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染Ne ESCs后,采用transwell、流式細胞術(shù)檢測細胞的遷移、侵襲和凋亡。結(jié)果:1.RNA-pull down聯(lián)合質(zhì)譜分析鑒定出與MEG3-210存在潛在結(jié)合的蛋白質(zhì)。2.MEG3-210探針結(jié)合MEG3同時可捕獲Galectin-1;Galectin-1抗體沉淀Galectin-1同時可捕獲MEG3-210。3.MEG3-210和Galectin-1在ESCs中分布一致。4.Galectin-1過表達后p38磷酸化水平升高,PKA和SERCA2蛋白水平下降。5.Galectin-1在內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜組織、間質(zhì)細胞和血清中表達水平升高。6.Galectin-1下調(diào)后,Ne ESCs遷移、侵襲能力下降,凋亡增加。結(jié)論:1.MEG3-210與Galectin-1之間存在結(jié)合互作關系。2.Galectin-1介導了MEG3-210對ESCs遷移、侵襲和凋亡的調(diào)控。3.Galectin-1過表達可激活p38 MAPK信號通路并抑制PKA/SERCA2信號。4.Galectin-1可與其他指標聯(lián)合用于內(nèi)異癥血清學診斷模型。第四部分MEG3-210和Galectin-1在內(nèi)異癥在體模型中的作用目的:建立內(nèi)異癥動物模型,探索MEG3-210和Galectin-1對在體病灶的作用。方法:利用人源子宮內(nèi)膜組織和裸鼠構(gòu)建裸鼠腹腔內(nèi)異病灶和皮下內(nèi)異病灶模型,評價病灶的活力,病理檢查病灶組織結(jié)構(gòu)。構(gòu)建sh-MEG3-210腺病毒顆粒,轉(zhuǎn)染組織后觀察MEG3-210下調(diào)后對在體病灶的作用?；铙w注射Galectin-1 si RNA,觀察Galectin-1下調(diào)后對病灶的作用。免疫組化檢測病灶中Galectin-1表達水平。結(jié)果:1.人源子宮內(nèi)膜組織可成功構(gòu)建裸鼠腹腔內(nèi)異病灶和皮下病灶,但是皮下病灶活性較好。2.腺病毒sh-MEG3-210處理組中的裸鼠病灶體積增加。3.Galectin-1 si RNA聯(lián)合sh-MEG3-210處理組中的裸鼠病灶體積較sh-MEG3-210處理組中的明顯縮小。結(jié)論:1.腺病毒能有效地轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜組織。2.MEG3-210下調(diào)可促進裸鼠皮下內(nèi)異病灶的生長。3.抑制Galectin-1表達可縮小由MEG3-210下調(diào)引起的病灶體積增加。
范為之[5]（2017）在《加味芍藥甘草湯對子宮腺肌病裸鼠miR-27a調(diào)控的P53/EGFR/STAT3通路的干預機制》文中認為背景:子宮腺肌?。╝denomyosis,AM）是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵入到子宮肌層內(nèi)定植并增生而形成的一種雌激素依賴性疾病,近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢,已成為婦科常見疑難病。漸進性痛經(jīng)、不孕為其最主要的臨床表現(xiàn),痛經(jīng)發(fā)生率高達77.8%,嚴重影響患者生活、工作等。根治療法目前僅有全子宮切除術(shù),但不易被患者所接受,尤其是年輕且有生育要求的患者;西醫(yī)藥物治療副作用大,服藥期間不能孕育,停藥后痛經(jīng)等癥狀容易復發(fā),因此尋求一種有效療法迫在眉睫,而中醫(yī)藥在緩解或消除痛經(jīng)癥狀、提高患者生存質(zhì)量和生育能力、副作用小、遠期療效穩(wěn)定等方面顯示了獨特的優(yōu)勢。多年來,眾多學者和專家探索運用中醫(yī)藥治療子宮腺肌病,在理論創(chuàng)建和臨床實踐方面多有建樹,為后來的研究者提供了良好的基礎。目的:1.建立人來源型子宮腺肌病裸鼠模型,為深入研究子宮腺肌病發(fā)病機制、病理特點以及探索有效的治療方案提供理想的動物模型。2.本課題擬通過動物實驗觀察加味芍藥甘草湯影響下miR-27a對裸鼠病灶組織中P53/EGFR/STAT3信號通路相關因子的調(diào)控作用,以期闡明加味芍藥甘草湯治療子宮腺肌病的深層作用機理,對深入了解子宮腺肌病的病因病理,指導臨床辨證用藥,為子宮腺肌病新藥研發(fā)提供科學依據(jù)。研究方法:1.采用腹腔移植法建立人來源性子宮腺肌病裸鼠模型,并運用HE染色及免疫組織化學法檢測波形蛋白及角蛋白鑒定造模結(jié)果。2.運用人來源性子宮腺肌病裸鼠模型,建立手術(shù)對照組模型作為對照。將實驗裸鼠隨機分為手術(shù)對照組、模型組、米非司酮組、加味芍藥甘草湯高劑量組、加味芍藥甘草湯中劑量組、加味芍藥甘草湯低劑量組分別用藥干預,3周后取材。3.測量各組裸鼠病灶組織最大直徑（L）及最大橫徑（W）,計算病灶體積（V）,V=L×W2/2,比較各組體積差異;4.采用免疫組化法檢測各組裸鼠病灶組織p53蛋白表達差異;5.采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組裸鼠病灶組織p53-273H、c-Src、LIF、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、C0X-2 的表達差異;6.采用RT-qPCR技術(shù)檢測各組裸鼠病灶組織p53-273HmRNA、miR-27a、EGFR mRNA、LIFR mRNA的表達差異。結(jié)果:1.使用腹腔種植法建立人來源性子宮腺肌病裸鼠模型外觀、體積、組織病理學以及波形蛋白、角蛋白的表達情況,均符合子宮腺肌病的特征,可以認為人來源性子宮腺肌病裸鼠模型建立成功。2.各組間的裸鼠腹腔內(nèi)移植組織體積的比較,差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。模型組裸鼠的腹腔內(nèi)移植組織體積較其余各組大（P<0.05）;米非司酮組與加味芍藥甘草湯各劑量組之間均無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3.采用免疫組織化學法檢測加味芍藥甘草湯對各組間的裸鼠腹腔內(nèi)移植組織中P53蛋白的表達的影響,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）,手術(shù)對照組裸鼠移植組織內(nèi)P53表達量低于其余各組（P<0.01）;模型組裸鼠移植組織內(nèi)P53表達高于其余各組（P<0.05）。4.采用Western Blot法檢測各組間的裸鼠腹腔內(nèi)移植組織中p53-273H、c-Src、LIF、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、C0X-2蛋白的表達量,均有統(tǒng)計學意義。模型組中P53-273H蛋白表達量高于其余各組（P＜0.05）。模型組中LIF表達較其余各組高（P＜0.05）;手術(shù)對照組中EGFR表達較其余各組低（P＜0.05）;模型組中P-EGFR高于其余各組（P＜ 0.05）;模型組中c-Src表達量高于其余各用藥組（P＜0.05）,手術(shù)對照組中P-STAT3表達較其余各用藥組低（P＜0.05）。P53-273H、c-Src、STAT3、P-STAT3蛋白米非司酮組及加味芍藥甘草湯各劑量組之間無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。5.RT-qPCR法檢測各組間的裸鼠腹腔內(nèi)移植組織中p53-273HmRNA、miR-27a、EGFR mRNA、LIFRmRNA的相對表達量,差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。米非司酮組中miR-27amRNA的相對表達量最高,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。加味芍藥甘草湯高劑量組及加味芍藥甘草湯中劑量組的EGFR mRNA表達量低于模型組（P＜ 0.05）。加味芍藥甘草湯低劑量組中P53-273HmRNA的相對表達量較米非司酮組低（P＜0.05）,模型組中P53-273H mRNA的相對表達量高于其它各組（P＜0.05）。模型組中LIFR表達較其余各用藥組高（P<0.05）。6.通過mmiR-27a對P53/EGFR/STAT3信號通路的調(diào)控作用機制相關性分析,P53-273H基因與miR-27a中度負相關,miR-27a與其他基因都呈輕度負相關,而P53-273H與其他基因都輕度相關。結(jié)論:1.腹腔種植法建立人來源性子宮腺肌病裸鼠模型,該造模方法穩(wěn)定性良好,可重復性高,且能夠模擬子宮腺肌病病灶在腹腔內(nèi)自然生長過程以及腹腔微環(huán)境的變化,是一種提高子宮腺肌病建模成功率、符合人體機制的新方法,能夠為探索子宮腺肌病病理生理機制以及治療方法提供理想的動物模型。2.加味芍藥甘草湯能夠有效縮小人來源型子宮腺肌病裸鼠模型腹腔內(nèi)病灶組織的體積,并且降低病灶組織內(nèi)P53、EGFR、P-EGRG、STAT3、P-STAT3、C0X-2蛋白的表達,能夠抑制子宮腺肌病細胞的增殖,減少病灶組織內(nèi)血管的新生。因此,臨床運用加味芍藥甘草湯治療子宮腺肌病可以限制或延緩子宮腺肌病的發(fā)展和侵襲。3.加味芍藥甘草湯各劑量組對于miR-27a均有上調(diào)作用,對P53/EGFR/STAT3通路中各基因及蛋白均具有抑制作用。加味芍藥甘草湯作為一個多靶點的復方湯劑,其復雜的藥效機制對于多個基因及蛋白的表達均有影響,本研究為進一步研發(fā)加味芍藥甘草湯提供了一定的理論基礎和科學依據(jù)。
倪惠娟[6]（2016）在《Warburg效應標志物在改良子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型中表達的探究》文中研究說明第一章人子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠皮下模型的構(gòu)建目的:改良人子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型,分析皮下移植后切口縫合與否的建模效果。材料及方法:選取我院符合入選標準的病人的子宮內(nèi)膜組織,并將內(nèi)膜組織種植在符合標準的裸鼠皮下（裸鼠由浙江大學附屬邵逸夫醫(yī)院動物房提供）。18只裸鼠隨機分為2組,一組皮下移植后皮膚不予縫合（a組）,另一組皮下移植后皮膚予縫合（b組）。收集兩組模型的成功率（腫塊體積=腫塊長徑×寬徑×厚徑>27mm3）、皮膚創(chuàng)面的炎癥反應率（創(chuàng)面炎癥率=炎癥反應只數(shù)/該組總只數(shù),排除死亡數(shù)）及累積存活率（累積存活率=建模期間存活只數(shù)/該組總只數(shù)）。分析對皮下組織塊移植后切口兩種不同處理后的建模效果。結(jié)果:（1）一般情況:a組均成活,b組1只死亡。a組傷口于術(shù)后第3d甲級愈合;b組傷口外縫線于2～4d自行脫落,甲級愈合。a組的7d組有1只未見病灶,b組1只種植后Id因腹脹死亡,b組的14d組有1只未見病灶。其余小鼠相對應時間病灶形成均無差異。大體觀察:7d病灶皮膚呈單個球形約黃豆大小,切開后見清亮多囊小水泡樣突起,淡粉紅色,病灶周圍包繞豐富新生血管;14d病灶轉(zhuǎn)為單個大水泡樣突起,粉色,周圍血管較前略減少;21d病灶轉(zhuǎn)為囊實性突起,灰白色,體積較14d時縮小。（2）HE染色:兩組建模后1、2、3周均可見典型的腺體結(jié)構(gòu)和間質(zhì)組織結(jié)構(gòu),腺體呈增殖期改變,間質(zhì)內(nèi)見含鐵血黃素。實驗前留取的內(nèi)膜組織行HE染色,常規(guī)病理提示子宮內(nèi)膜呈增殖期改變。（3）病灶生長情況:a組建模后1周病灶累積成模率及裸鼠累積存活率分別為2/3、3/3,2周分別為3/3、3/3,3周分別為3/3、3/3。b組建模后1周病灶累積成模率及裸鼠累積存活率分別為2/3、2/3,2周分別為2/3、3/3,3周分別為3/3、3/3。統(tǒng)計兩組總的成模率a組為8/9,b組為7/9,存活率a組為9/9,b組為8/9,差異無統(tǒng)計學意義。傷口愈合兩組無明顯差異。結(jié)論:（1）皮下移植是一種理想的方式,操作簡便,對裸鼠創(chuàng)傷小,對內(nèi)膜體外運輸與儲存要求較低,并更能精確地計算異位灶的大小,方便進行動態(tài)觀察。（2）皮下不縫合組與縫合組在我們觀察的三個指標均無統(tǒng)計學意義,但是不進行傷口縫合減少了實驗步驟,縮短了操作時間,故在實驗中值得推廣。第二章 Warburg效應標志物在子宮內(nèi)膜異位癥動物模型中表達的探究目的:在體外實驗中,Warburg效應（無氧糖酵解）被報道參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生,但其是否也在體內(nèi)實驗（子宮內(nèi)膜異位癥動物模型）中發(fā)揮作用,目前并不明確。在改良的人子官內(nèi)膜異位癥裸鼠模型上,檢測缺氧引起的糖代謝相關標志物的表達水平,證實子官內(nèi)膜異位癥發(fā)病初期存在Warburg效應的改變。材料及方法:選取我院臨床14例符合入選標準的病人的子宮內(nèi)膜組織,并建立改良的子官內(nèi)膜異位癥模型。將裸鼠內(nèi)異癥模型異位病灶行實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)（Quantitative Real-time PCR Detecting System,qRT-PCR）及免疫組織化學檢查,比較DO（移植前）、D1、D7、D14的Warburg效應標志物包括缺氧誘導因子α（HIF1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT1）、乳酸脫氫酶（LDHA）、丙酮酸脫氫酶激酶（PDK1）等的表達水平。結(jié)果:以人在位子宮內(nèi)膜作為對照組織（實驗初直接從女性獲取的子官內(nèi)膜組織,記為0d）,獲取移植后1天、7天、14天的小鼠皮下子宮內(nèi)膜異位組織作為研究組（分別記為1d、7d、14d）。通過qRT-PCR和免疫組化檢測Warburg效應標志物水平變化。qRT-PCR結(jié)果顯示HIF-1α、VEGF、GLUT1、LDHA和PDK1在組織移植后1天或7天的表達顯著高于0天。在14天,大多數(shù)基因表達基本恢復到了 0天的水平。同時免疫組化結(jié)果顯示,腺體及間質(zhì)細胞的HIF-1α、VEGF、GLUT1、LDHA以及PDK1的蛋白表達水平在第1天和第7天也顯著高于第0天的水平,而第14天表達也基本恢復至第0天的水平,與qRT-PCR結(jié)果一致。結(jié)論:我們的研究證實,在子宮內(nèi)膜異位癥動物模型中Warburg效應標志物在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生初期呈現(xiàn)先高表達后降低的規(guī)律,提示W(wǎng)arburg效應參與了內(nèi)異癥的發(fā)生。闡明內(nèi)異癥發(fā)病初期病灶內(nèi)的代謝途徑有利于為內(nèi)異癥的病因治療提供理論依據(jù)。
趙采云[7]（2014）在《周細胞在子宮內(nèi)膜異位癥血管生成中作用的研究》文中認為目的：本實驗通過測定子宮內(nèi)膜異位癥（EMs, endometriosis）患者異位、在位、正常內(nèi)膜及不同時相的裸鼠異位病灶中周細胞數(shù)目（PN, Pericytes number）、微血管密度（MVD, microvessel density）以及PN/MVD：北值,研究探討周細胞在EMs血管生成中的作用。方法：選取EMs患者異位內(nèi)膜20例（異位組）、在位內(nèi)膜40例（增殖期、分泌期各20例）（在位組）及非子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜40例（增殖期、分泌期各20例）（對照組）。利用異體移植方法建立40只裸鼠人EMs模型,并隨機平均分為A組、B組、C組、D組,分別于建模后7天、14天、21天、28天時處死并獲取異位病灶。觀察裸鼠異位病灶肉眼及鏡下組織學形態(tài),并采用免疫組化法檢測三組人子宮內(nèi)膜及四組裸鼠異位病灶中PN、MVD的表達,并對二者的比值（PN/MVD）進行比較。結(jié)果：（1）裸鼠EMs模型成功率達100%；（2）人異位內(nèi)膜MVD值高于正常內(nèi)膜和在位內(nèi)膜（P<0.05）,在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期與相應的正常內(nèi)膜相比差異均無統(tǒng)計學意義,在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組內(nèi)比較均分泌期高于增殖期（P<0.05）；（3）人異位內(nèi)膜PN值低于正常內(nèi)膜和在位內(nèi)膜（P<0.05）,在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期與相應的正常內(nèi)膜相比差異均無統(tǒng)計學意義,在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組內(nèi)比較均增殖期高于分泌期（P<0.05）；（4）人異位內(nèi)膜PN/MVD值低于正常內(nèi)膜和在位內(nèi)膜,在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期均低于相應的正常內(nèi)膜（P<0.05）,在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜組內(nèi)比較均增殖期高于分泌期（P<0.05）；（5）A組裸鼠開腹探查見異位病灶呈清亮水皰狀,鏡下可見點簇狀新生血管形成,MVD=35.70±3.16, B組裸鼠開腹探查見異位病灶呈紅色囊泡狀,表面可見血管走形,鏡下可見腺體增生,間質(zhì)中血管生成明顯,MVD=68.60±9.07, C組裸鼠開腹探查見異位病灶呈暗紅色囊狀或結(jié)節(jié)狀,欠新鮮,鏡下可見腺體豐富、呈增殖期子宮內(nèi)膜表現(xiàn),間質(zhì)新生血管數(shù)目減少、血管壁結(jié)構(gòu)完整,MVD=53.50±3.57, D組裸鼠開腹探查見異位病灶呈黃白色囊狀或結(jié)節(jié)狀、質(zhì)稍硬,鏡下可見腺體數(shù)目減少,部分腺體及間質(zhì)纖維化,間質(zhì)新生血管數(shù)目進一步減少,可見部分血管結(jié)構(gòu)破壞；MVD=48.00+4.99；四組裸鼠異位病灶MVD值差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；（6）A-D組裸鼠異位病灶中PN與MVD的變化趨勢平行,分別為（27.30+2.50）、（79.40±10.68）、（64.70±4.64）、（38.30±4.50）,差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；（7）A-C組裸鼠PN/MVD值呈上升趨勢,在C組裸鼠異位病灶中達到峰值,D組裸鼠異位病灶中PN/MVD值同C組比較呈下降趨勢,但仍高于A組裸鼠,差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：（1）采用異體移植方法可在裸鼠體內(nèi)較完整地復制人類子宮內(nèi)膜異位癥,可實現(xiàn)對EMs發(fā)展過程的動態(tài)觀察及相關實驗研究,方法可行、成功率高,所得結(jié)果具有參考價值；（2）四組裸鼠異位病灶中PN值隨著病灶中血管的生長、消退發(fā)生相應的改變,與相應內(nèi)膜中MVD值變化趨勢相一致,提示周細胞在EMs血管生成中起著重要作用；（3）EMs患者異位內(nèi)膜中PN/MVD值低于在位和正常內(nèi)膜,C組裸鼠異位病灶中PN/MVD值達峰值,結(jié)合肉眼與鏡下所見,提示EMs病灶中周細胞覆蓋率與血管穩(wěn)定性高度一致性；（4）EMs患者在位內(nèi)膜無論增殖期還是分泌期中的PN/MVD值均低于相應的正常內(nèi)膜,進一步佐證了“在位內(nèi)膜決定論”,在位子宮內(nèi)膜中周細胞覆蓋率低可能是EMs發(fā)病的因素之一；（5）周細胞在EMs血管生成中的作用機制還有待進一步研究。
郭蕊萌[8]（2013）在《CD146在異位及在位子宮內(nèi)膜中的表達及意義》文中提出目的：本研究取子宮內(nèi)膜異位癥（EMs, endometriosis）患者在位、異位內(nèi)膜及子宮肌瘤患者正常子宮內(nèi)膜,同時利用異體移植法將正常子宮內(nèi)膜接種于裸鼠體內(nèi),建立裸鼠EMs模型。通過測定人在位、異位、正常內(nèi)膜及裸鼠異位病灶中CD146表達情況及微血管密度（MVD, microvessel density）,探討CD146在EMs發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法：取EMs患者在位內(nèi)膜（在位組）和異位內(nèi)膜（異位組）各30例,在位組內(nèi)膜中增殖期16例,分泌期14例；取子宮肌瘤患者子宮內(nèi)膜30例（對照組）,其中增殖期13例,分泌期17例。利用異體移植方法將30只裸鼠接種對照組正常子宮內(nèi)膜,建立EMs模型,并隨機平均分為A組、B組、C組。A組、B組、C組裸鼠分別于建模后5天、10天、30天時處死并獲取異位病灶。觀察裸鼠異位病灶肉眼及鏡下組織學形態(tài)。采用免疫組化法檢測三組人子宮內(nèi)膜及三組裸鼠異位病灶中CD146表達情況及MVD值。結(jié)果：（1）裸鼠EMs模型成功建立,成模率100%。（2）人在位組、異位組內(nèi)膜中MVD值均高于對照組（P<0.05）,但在位組、異位組內(nèi)膜之間相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。（3）在位組分泌期內(nèi)膜MVD值高于增殖期內(nèi)膜（P<0.01）,而對照組內(nèi)此差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（4）A組裸鼠開腹探查見接種組織粘于裸鼠組織表面,底部發(fā)紅,鏡下可見異位病灶周圍有新生血管形成,MVD=6.90±0.98；B組裸鼠開腹探查見接種組織與裸鼠組織完全融合,呈紅色囊泡狀,鏡下見腺體增生、數(shù)目增加、腺腔擴大,部分有乳頭狀增生,腺上皮呈柱狀或立方形,異位病灶內(nèi)部及周圍可見血管生成明顯,MVD=21.30±0.67；C組裸鼠開腹探查見異位病灶色白,不新鮮,鏡下見子宮內(nèi)膜腺體萎縮、數(shù)目減少、結(jié)構(gòu)有破壞,間質(zhì)新生血管數(shù)目減少,MVD=16.13±1.06；三組裸鼠異位病灶MVD值差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（5）人在位組、異位組內(nèi)膜中CD146陽性率均高于對照組（P<0.05）,但在位組、異位組內(nèi)膜之間相比無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。（6）在位組分泌期內(nèi)膜CD146陽性率高于增殖期內(nèi)膜（P<0.01）,而對照組內(nèi)此差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（7）A組、B組、C組裸鼠異位病灶中CD146陽性率分別為（9.88±1.12）%、（20.92±1.34）%、（16.18±1.27）%,差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（8）三組人子宮內(nèi)膜CD146陽性率分別與相應組別的MVD值呈正相關（rs=0.477、0.819、0.897,P<0.01）。（9）三組裸鼠異位病灶CD146陽性率分別與相應組別MVD值呈明顯正相關（rs=0.929、0.711、0.903,P<0.05）。結(jié)論：采用異體移植方法將人子宮內(nèi)膜接種于裸鼠體內(nèi),可實現(xiàn)對EMs發(fā)展過程的動態(tài)觀察,并進行相關的實驗研究,方法可靠,成功率高,所得實驗結(jié)果具有參考價值。EMs患者在位及異位內(nèi)膜CD146陽性率較正常子宮內(nèi)膜明顯增高；裸鼠異位病灶中CD146的表達情況隨著病灶的生長、萎縮發(fā)生相應的改變；且無論是三組人子宮內(nèi)膜中CD146陽性率,還是三組裸鼠異位病灶中CD146陽性率均與相應內(nèi)膜中MVD值呈明顯正相關,提示CD146的過表達通過影響血管形成進而促進EMs發(fā)生、發(fā)展。EMs患者在位分泌期內(nèi)膜MVD值和CD146陽性率均高于增殖期內(nèi)膜,而正常子宮內(nèi)膜內(nèi)卻未表現(xiàn)出此差異,提示分泌期內(nèi)膜CD146的過表達可能在EMs發(fā)生、進展中起了更重要的作用。CD146在EMs中的作用機制還有待進一步研究。
林敏[9]（2012）在《組織因子及蛋白酶激活受體2在子宮內(nèi)膜異位癥的表達及ENMD-1068治療子宮內(nèi)膜異位癥的動物實驗研究》文中進行了進一步梳理背景子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis, EMs）指具有生長功能的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在宮腔被覆黏膜以外部位的一種疾病，主要表現(xiàn)為不孕及慢性盆腔疼痛，嚴重影響育齡婦女的生活質(zhì)量。目前發(fā)病率呈上升趨勢，約為6%10%，發(fā)病機制未明確。通常所使用的手術(shù)與藥物結(jié)合的治療方法效果不理想，2年復發(fā)率高達40%以上。因此，探索EMs更有效的治療措施成為當今婦科及生殖研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，組織因子（Tissue Factor, TF）不僅啟動凝血級聯(lián)反應，而且通過激活下游受體蛋白酶激活受體-2（proteinase activated receptors, PAR-2）介導細胞信號傳導，調(diào)節(jié)惡性腫瘤的血管、炎癥微環(huán)境生成，促進惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而EMs具有類似惡性腫瘤的某些生物學特征，如血管生成、侵襲、局部遠處轉(zhuǎn)移等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)EMs的異位、在位內(nèi)膜中的TF蛋白及在位內(nèi)膜的PAR-2蛋白表達顯著升高。國外學者提出TF/PAR-2信號通路可能參與EMs的發(fā)病過程。PAR-2基因敲除鼠模型的研究也表明，該動物模型可明顯抑制EMs的發(fā)展。由于TF/PAR-2信號通路在EMs上研究較少，研究TF及PAR-2在EMs中的表達及其與月經(jīng)周期的關系如何，有助于進一步了解EMs的發(fā)病機制及尋找治療EMs的新靶點。探索利用該靶點行特異性抗體靶向治療EMs的可行性，為EMs的抗血管、炎癥生成抗體治療提供理論和實驗研究。目的臨床研究EMs異位、在位內(nèi)膜中TF、PAR-2的表達及TF/PAR-2信號與月經(jīng)周期的關系，探討TF/PAR-2信號在EMs發(fā)病中的作用。構(gòu)建及利用可視化EMs裸鼠熒光模型，探索PAR-2拮抗劑ENMD-1068治療EMs的作用及其可能的機制，為發(fā)展靶向性、特異性的抗體治療EMs提供理論和實驗依據(jù)。（一）組織因子及蛋白酶激活受體2在子宮內(nèi)膜異位癥的表達及意義方法1.資料的收集及標本的獲取選擇2010年9月至2011年7月于廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院、南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院42例EMs腹腔鏡手術(shù)治療的患者，術(shù)中及術(shù)后病理證實為EMs，其中留取異位內(nèi)膜40例及在位內(nèi)膜20例；同期20例因單純性卵巢囊腫行腹腔鏡手術(shù)治療的患者為對照組，留取其宮腔內(nèi)膜組織。所有患者均排除子宮肌瘤、子宮腺肌病等雌激素相關性疾病，術(shù)前6個月未使用激素類藥物及宮腔內(nèi)放置節(jié)育器（如促性腺激素釋放激素，口服避孕藥等）。本研究經(jīng)兩院倫理委員會批準，所有內(nèi)膜提供者均知情同意。2.檢測各組內(nèi)膜組織的TF、PAR-2表達利用免疫組化法檢測各組內(nèi)膜組織的TF蛋白、PAR-2蛋白表達，根據(jù)陽性率和表達強度進行量化評分（Hscore評分）；實時熒光定量PCR法檢測TF mRNA及PAR-2mRNA表達水平。結(jié)果1. EMs異位、在位內(nèi)膜TF、PAR-2的蛋白表達均主要位于腺上皮細胞的胞膜和胞漿中，少數(shù)病例見間質(zhì)表達。與正常人子宮內(nèi)膜組比較，異位、在位內(nèi)膜組TF及PAR-2的總蛋白及總mRNA水平均顯著升高（P<0.05）。異位內(nèi)膜組TF、PAR-2的總蛋白及總mRNA表達與在位內(nèi)膜組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。2.增殖期與分泌期中，異位內(nèi)膜組TF、PAR-2的蛋白及mRNA的表達量和在位內(nèi)膜組TF蛋白及mRNA的表達量均顯著高于正常子宮內(nèi)膜組（P<0.05）。分泌期中，在位內(nèi)膜組PAR-2的蛋白及mRNA的表達量高于正常子宮內(nèi)膜組（P<0.05），而其在增殖期的表達量與正常內(nèi)膜組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。三組內(nèi)膜TF、PAR-2的蛋白及mRNA在增殖期中的表達量與同組分泌期比較，統(tǒng)計無差異（P>0.05）。結(jié)論1. EMs異位、在位內(nèi)膜TF及PAR-2的蛋白及mRNA的異常表達可能與EMs的發(fā)生發(fā)展有關，他們可能是研究分子靶向治療EMs新的靶點。2.在位內(nèi)膜分泌期中TF及PAR-2的異常表達提示在位內(nèi)膜原發(fā)性功能異常，在位內(nèi)膜異常的TF/PAR-2信號可能與EMs的發(fā)病有關，為我們進一步研究EMs發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。（二）ENMD-1068治療子宮內(nèi)膜異位癥的動物實驗研究方法1.子宮內(nèi)膜組織標本的獲取與內(nèi)膜的準備收集2011年8月至2011年10月于廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院、南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院腹腔鏡下18例EMs患者分泌期的在位內(nèi)膜，納入標準同上。無菌PBS漂洗后，培養(yǎng)皿內(nèi)剪成1mm32mm3碎塊。2.編碼紅色熒光蛋白慢病毒（LV-CMV-RFP）轉(zhuǎn)染5個組織塊置于48孔板的1個孔內(nèi)，加入整合了增強型紅色熒光蛋白的慢病毒顆粒（LV-CMV-RFP），終濃度為1×108PFU/mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱環(huán)境下感染24h后將子宮內(nèi)膜組織收集，PBS沖洗。3.熒光人EMs裸鼠模型制作與觀察（1）選取68周齡BABL/C雌性裸鼠，隨機腹腔內(nèi)種植1012塊LV-CMV-RFP的組織。種植后連續(xù)3天肌注苯甲酸雌二醇0.02mg/d促進內(nèi)膜生長，青霉素1000U/d預防感染。810天后活體成像系統(tǒng)下拍照或開腹觀察成瘤情況。（2）預實驗9只：建模成功鼠建模術(shù)后第1012d（手術(shù)當天不算）予隨機分3組：即NS組=生理鹽水（NS）0.2ml/d；PAR-2拮抗劑ENMD-1068：E0.5組=ENMD-10680.5mg/d；E1.0組=ENMD-10681.0mg/d。藥物腹腔注射后分別于第1，3，5d，NS組、E0.5及E1.0組各取1只小鼠予頸椎脫臼法處死，取出病灶。初步判斷是否成瘤及療效觀察。預實驗組每組3只，分籠飼養(yǎng)。（3）實驗組25只（其中1只建模失?。撼赡Ｊ?4只，建模術(shù)后第1012d予隨機分3組（手術(shù)當天不算），每組8只。每天腹腔注射藥物劑量同預實驗，即NS組=NS0.2ml/d×5d；E0.5組=ENMD-10680.5mg/d×5d；E1.0組=ENMD-10681.0mg/d×5d。每周稱裸鼠體重。每天觀察裸鼠進食、毛色、活動情況。4.在末次腹腔注射藥物后第6d即內(nèi)膜植入術(shù)后第1618d處死小鼠，測量異位病灶體積及無菌收集，立刻放入0.5ml無菌、無抗生素M199培養(yǎng)液（pH=7.4）中，置于37℃溫箱培養(yǎng)2h，收集組織培養(yǎng)液，ELISA檢測白介素（IL）-6，單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）。5.免疫組化法檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、核轉(zhuǎn)錄因子-kB（NF-kB）、Ki-67。6. TUNEL細胞凋亡檢測。7. HE染色檢測裸鼠重要臟器心、肝、脾、肺、腎、子宮及卵巢的形態(tài)學改變。結(jié)果1.成功構(gòu)建人子宮內(nèi)膜異位癥可視化動物模型：（1）實驗組腹腔種植鼠共25只：成模24只（96%）（即24只裸鼠，每只裸鼠通過活體成像系統(tǒng)觀察或開腹探查病灶，病理證實異位子宮內(nèi)膜），成活率100%。其中，建模第810d體外熒光探測見熒光病灶鼠12只（48%）（圖2-2），無熒光鼠予開腹探測見肉眼病灶12只（48%），無熒光、無肉眼病灶鼠1只為建模失?。?%）。（2） NS組（圖2-3A、B），E0.5組（圖2-3D）各約13處病灶不等，分布于前腹膜、側(cè)腹膜，脂肪（膀胱旁）、盆腔深部，少數(shù)見腸管表面生長（圖2-3D）。移植內(nèi)膜與裸鼠盆腹腔組織牢固粘附，隆起明顯，血管網(wǎng)在黏附區(qū)域發(fā)育良好，病灶與其周旁組織呈融合狀態(tài)，與腸管輕度粘連能夠分離（圖2-3C）。E1.0組異位病灶萎縮成近扁平的斑塊狀物或粗糙面痕跡，未見顯著粘連（圖2-3E）。（3）鏡下觀察E0.5（圖2-4B）、E1.0組（圖2-4C）較NS組（圖2-4A）腺體數(shù)目減少，腺腔變窄，細胞稀疏呈萎縮狀態(tài)，部分間質(zhì)伴有不同程度的炎癥及壞死。2.異位病灶體積比較：E0.5、E1.0組裸鼠的異位病灶平均體積較NS組顯著降低（P<0.05），且體積改變呈劑量依賴性，E0.5與NS組，E1.0與NS組，E1.0與E0.5組的病灶體積比較有顯著性意義（P<0.05）（圖2-5）。3. ELISA檢測： E0.5、 E1.0組裸鼠異位內(nèi)膜組織培養(yǎng)液IL-6、MCP-1濃度（pg/mg/2h）較NS組顯著降低（P<0.05）。 E1.0組異位內(nèi)膜組織培養(yǎng)液IL-6的濃度（pg/mg/2h）較E0.5組降低（P<0.05）（圖2-6）。4. E0.5、E1.0組異位內(nèi)膜VEGF、NF-kB和Ki-67表達均明顯低于NS組（圖2-7，2-8）（P<0.05）。E1.0組異位內(nèi)膜NF-kB和Ki-67的表達弱于E0.5組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。5. TUNEL法檢測細胞凋亡率：E0.5、E1.0組異位內(nèi)膜細胞凋亡率較NS組顯著升高，E1.0組異位內(nèi)膜細胞凋亡率顯著高于E0.5組（P<0.05）（圖2-9，2-10）。6. ENMD-1068對全身重要臟器的影響：給藥后第6天，對E0.5、E1.0組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎、子宮及卵巢組織進行顯微鏡下觀察，未見缺血、壞死和炎癥反應改變（圖2-11）。結(jié)論1.采用編碼紅色熒光蛋白的慢病毒（LV-CMV-RFP）轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜，采用腹腔種植法建立的EMs裸鼠模型具有可視化、無創(chuàng)損傷、模擬人類EMs的發(fā)病特點，為EMs治療研究提供有效實驗工具。2.采用PAR-2拮抗劑ENMD-1068明顯抑制EMs裸鼠模型異位病灶的生長并誘導其凋亡而縮小病灶，且這種作用呈劑量依賴。下調(diào)VEGF、NF-kB、Ki-67的表達及抑制炎癥介質(zhì)IL-6，MCP-1的表達可能為ENMD-1068治療EMs的分子機制之一。3. ENMD-1068對EMs裸鼠重要臟器如心、肝、脾、肺、腎及子宮、卵巢無影響，但其引起的過敏反應或毒性作用尚需進一步研究。PAR-2拮抗劑可能成為EMs抗體靶向治療的新選擇。
孫俊杰,尹利榮[10]（2012）在《子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型的建立與血管生成研究進展》文中研究說明子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）的發(fā)病機制和治療一直是困擾婦科醫(yī)師的難題。由于倫理學問題,不能直接在人體上進行實驗研究,更不能反復地進行有創(chuàng)性檢查監(jiān)測疾病的進展,限制了EMs的研究。裸鼠模型是EMs理想的動物模型,能夠準確地再現(xiàn)疾病的特點,并能反映疾病的發(fā)展變化,尤其在研究血管形成等因素在EMs中的作用和抗血管生成治療的應用方面更具有價值。
二、裸鼠人子宮內(nèi)膜異位癥模型建立與病灶血管形成相關檢測（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細分析其設計過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關信息。
實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關系。
文獻研究法：通過調(diào)查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學理論和實踐的需要提出設計。
定性分析法：對研究對象進行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。
跨學科研究法：運用多學科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。
功能分析法：這是社會科學用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、裸鼠人子宮內(nèi)膜異位癥模型建立與病灶血管形成相關檢測（論文提綱范文）
（1）補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠JAK2/STAT3信號通路相關因子的影響（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符號表 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 動物 |
| 1.2 藥材 |
| 1.3 藥品與試劑 |
| 1.4 儀器 |
| 2 方法 |
| 2.1 EM腎虛血瘀型大鼠模型制備 |
| 2.2 EM腎虛血瘀型大鼠模型評價標準 |
| 2.3 分組及給藥 |
| 2.4 觀察大鼠造模情況 |
| 2.5 觀察大鼠一般情況 |
| 2.6 標本采集與處理 |
| 2.7 統(tǒng)計學方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 EM腎虛血瘀型模型大鼠造模情況 |
| 3.2 補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠一般情況的影響 |
| 3.3 補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠異位灶體積變化的影響 |
| 3.4 補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠在位、異位子宮內(nèi)膜組織病理變化的影響 |
| 3.5 IHC法檢測補腎溫經(jīng)湯對各組大鼠在位、異位內(nèi)膜組織中JAK2,STAT3,p-STAT3蛋白表達的影響 |
| 3.6 ELISA法檢測補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠血清中IL-10,IL-17含量的影響 |
| 3.7 補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠在位、異位內(nèi)膜組織中Caspase-8,TNF-α蛋白及基因表達的影響 |
| 3.8 補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠在位、異位內(nèi)膜組織中VEGF,TSP-1蛋白表達的影響 |
| 3.9 補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠在位、異位內(nèi)膜組織中MMP-9,E-cadherin,N-cadherin蛋白及基因表達的影響 |
| 4 討論 |
| 4.1 EM的發(fā)病機制 |
| 4.2 JAK2/STAT3信號通路 |
| 4.3 EM病理機制的探討 |
| 4.4 補腎溫經(jīng)湯治療 EM 腎虛血瘀型作用機制探討 |
| 5 結(jié)論 |
| 6 問題與展望 |
| 參考文獻 |
| 附錄 綜述 子宮內(nèi)膜異位癥動物模型制備方法研究概括 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（2）基于Wnt通路的內(nèi)異消抑制異體移植子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| Abbreviation |
| 前言 |
| 第一章 熒光異體移植子宮內(nèi)膜異位癥模型的改進及內(nèi)異消的治療作用研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結(jié)果 |
| 3.1 小鼠性周期檢測及異位病灶熒光強度與體積之間的關系 |
| 3.2 異位病灶的組織結(jié)構(gòu)及ENDO-I蛋白的表達 |
| 3.3 內(nèi)異消顯著降低異位病灶的熒光強度 |
| 3.4 內(nèi)異消顯著減小異位病灶的體積 |
| 3.5 內(nèi)異消改善異位組織結(jié)構(gòu)的病理變化 |
| 3.6 內(nèi)異消顯著減少血清中E2和PROG的含量 |
| 4 小結(jié) |
| 第二章 內(nèi)異消抑制異位內(nèi)膜侵襲轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結(jié)果 |
| 3.1 內(nèi)異消顯著抑制子宮內(nèi)膜侵襲轉(zhuǎn)移 |
| 3.2 內(nèi)異消顯著抑制子宮內(nèi)膜上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 |
| 4 小結(jié) |
| 第三章 內(nèi)異消調(diào)控異位內(nèi)膜Wnt通路的作用機制研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結(jié)果 |
| 3.1 內(nèi)異消調(diào)節(jié)Wnt通路相關基因的表達 |
| 3.2 內(nèi)異消調(diào)控Wnt通路相關蛋白的表達 |
| 4 小結(jié) |
| 第四章 內(nèi)異消抑制子宮內(nèi)膜異位癥的網(wǎng)絡藥理學研究 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 2.1 靶點的收集 |
| 2.2 網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析 |
| 2.3 GO 及通路富集分析 |
| 2.4 分子對接 |
| 3 實驗結(jié)果 |
| 3.1 “內(nèi)異消成分-靶點”網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析 |
| 3.2 “內(nèi)異消靶點-EMS靶點”網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析 |
| 3.3 關鍵靶點的GO及通路富集分析 |
| 3.4 內(nèi)異消成分與靶點的分子對接 |
| 4 小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 創(chuàng)新點與意義 |
| 思考與展望 |
| 討論 |
| 參考文獻 |
| 文獻綜述 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 碩士期間科研工作匯報 |
| 附圖 |
（3）缺氧調(diào)控的細胞粘附和細胞周期在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 緒論 |
| 一、子宮內(nèi)膜異位癥 |
| 二、子宮內(nèi)膜異位癥與缺氧 |
| 三、子宮內(nèi)膜異位癥與整合素依賴的異位粘附 |
| 四、缺氧與整合素依賴的異位粘附 |
| 五、子宮內(nèi)膜異位癥與DNA損傷 |
| 六、miRNAs的概述 |
| 七、缺氧相關miR-210的概述 |
| 八、MiR-210-3p與子宮內(nèi)膜異位癥 |
| 第1章 HIF-1α和Integrins內(nèi)異癥中的表達及作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 實驗結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 結(jié)論 |
| 第2章 缺氧促進子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞ESCs粘附的機制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 實驗結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 結(jié)論 |
| 第3章 缺氧誘發(fā)內(nèi)異癥細胞DNA損傷并上調(diào)miR-210-3p的表達 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 實驗結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 結(jié)論 |
| 第4章 MiR-210-3p保護內(nèi)異癥細胞免受氧化應激損傷及促進其細胞周期進程的機制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 實驗結(jié)果 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 結(jié)論 |
| 第5章 體內(nèi)敲降miR-210-3p、抗氧化劑維生素C對小鼠內(nèi)異癥模型異位病灶生長的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.3 實驗結(jié)果 |
| 5.4 討論 |
| 5.5 結(jié)論 |
| 全文結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 文獻綜述 缺氧在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中的研究進展 |
| 參考文獻 |
| 作者簡歷及在讀期間所取得科研成果 |
（4）LncRNA MEG3-210在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用及相關機制研究（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 縮略詞表 |
| 第一部分 MEG3-210在內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料與方法 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 結(jié)論 |
| 1.6 參考文獻 |
| 附表 1 子宮內(nèi)膜捐獻者臨床信息總結(jié) |
| 第二部分 MEG3-210 通過p38 MAPK和 PKA/SERCA2 信號通路調(diào)控ESCs |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 結(jié)論 |
| 2.6 參考文獻 |
| 附圖 |
| 第三部分 Galectin-1 介導MEG3-210對ESCs的作用和機制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 結(jié)論 |
| 3.6 參考文獻 |
| 第四部分 MEG3-210和Galectin-1 在內(nèi)異癥在體模型中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.3 結(jié)果 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 結(jié)論 |
| 4.6 參考文獻 |
| 全文結(jié)論 |
| 綜述 長鏈非編碼 RNA 在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究進展 |
| 參考文獻 |
| 作者簡歷及在學期間所取得的科研成果 |
（5）加味芍藥甘草湯對子宮腺肌病裸鼠miR-27a調(diào)控的P53/EGFR/STAT3通路的干預機制（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文獻研究 |
| 1.1 現(xiàn)代醫(yī)學對子宮腺肌病研究概況 |
| 1.1.1 子宮腺肌病的定義 |
| 1.1.2 子宮腺肌病的流行病學研究 |
| 1.1.3 子宮腺肌病的病因及危險因素 |
| 1.1.4 子宮腺肌病的發(fā)病機制 |
| 1.1.5 現(xiàn)代醫(yī)學對子宮腺肌病的診斷 |
| 1.1.6 現(xiàn)代醫(yī)學對子宮腺肌病的治療 |
| 1.2 中醫(yī)學對子宮腺肌病研究概況 |
| 1.2.1 子宮腺肌病的中醫(yī)病因病機 |
| 1.2.2 子宮腺肌病的中醫(yī)治療進展 |
| 1.2.3 導師李坤寅教授應用加味芍藥甘草湯治療子宮腺肌病 |
| 1.3 加味芍藥甘草湯及相關研究進展 |
| 1.3.1 加味芍藥甘草湯的來源及主治病癥 |
| 1.3.2 加味芍藥甘草湯及主要化學成分的機理研究 |
| 1.4 子宮腺肌病的實驗模型研究進展 |
| 1.4.1 子宮腺肌病的細胞模型研究進展 |
| 1.4.2 子宮腺肌病的動物模型研究進展 |
| 1.5 子宮腺肌病的研究問題與研究展望 |
| 第二章 裸鼠人來源性子宮腺肌病模型的建立和鑒定 |
| 2.1 目的和意義 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 實驗材料 |
| 2.2.2 實驗方法 |
| 2.3 實驗結(jié)果 |
| 2.3.1 造模后裸鼠生存及一般情況 |
| 2.3.2 移植標本造模前后外觀觀察 |
| 2.3.3 移植標本造模前后體積變化 |
| 2.3.4 移植標本的HE染色觀察 |
| 2.3.5 移植物標本的免疫組化標志蛋白的表達觀察 |
| 2.4 討論 |
| 2.4.1 動物模型經(jīng)驗總結(jié) |
| 2.4.2 裸鼠人來源性子宮腺肌病模型造模成功的鑒定 |
| 第三章 加味芍藥甘草湯對人來源性子宮腺肌病裸鼠的治療作用及機制 |
| 3.1 目的和意義 |
| 3.2 實驗一:加味芍藥甘草湯對腺肌病裸鼠體重、移植組織體積及P53表達的影響 |
| 3.2.1 實驗材料 |
| 3.2.2 實驗方法 |
| 3.2.3 統(tǒng)計方法 |
| 3.2.4 實驗結(jié)果 |
| 3.3 實驗二:WESTERN BLOT法檢測P53/EGFR/STAT3通路中相關蛋白的表達 |
| 3.3.1 實驗材料 |
| 3.3.2 實驗方法 |
| 3.3.3 統(tǒng)計方法 |
| 3.3.4 實驗結(jié)果 |
| 3.4 q-PCR法檢測P53/EGFR/STAT3通路中相關蛋白的表達 |
| 3.5 討論 |
| 結(jié)語 |
| 參考文獻 |
| 附錄 |
| 在校期間發(fā)表論文情況 |
| 致謝 |
| 統(tǒng)計學審核證明 |
（6）Warburg效應標志物在改良子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型中表達的探究（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 縮寫、術(shù)語表 |
| 第一章 人子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠皮下模型的構(gòu)建 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 第二章 WARBURG效應標志物在子宮內(nèi)膜異位癥動物模型中表達的探究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 綜述 |
| References |
| 作者簡歷及在學期間所取得的科研成果 |
（7）周細胞在子宮內(nèi)膜異位癥血管生成中作用的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 縮略語/符號說明 |
| 前言 |
| 研究現(xiàn)狀、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 對象和方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 發(fā)表論文和參加科研情況說明 |
| 綜述 |
| 綜述參考文獻 |
| 致謝 |
（8）CD146在異位及在位子宮內(nèi)膜中的表達及意義（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 縮略語/符號說明 |
| 前言 |
| 研究現(xiàn)狀、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 對象和方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 發(fā)表論文和參加科研情況說明 |
| 綜述 |
| 綜述參考文獻 |
| 致謝 |
（9）組織因子及蛋白酶激活受體2在子宮內(nèi)膜異位癥的表達及ENMD-1068治療子宮內(nèi)膜異位癥的動物實驗研究（論文提綱范文）
| 英文縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 組織因子及蛋白酶激活受體 2 在子宮內(nèi)膜異位癥的表達及意義 |
| 一、材料與方法 |
| 二、結(jié)果 |
| 三、討論 |
| 四、小結(jié) |
| 第二部分 ENMD-1068 治療子宮內(nèi)膜異位癥的動物實驗研究 |
| 一、材料與方法 |
| 二、結(jié)果 |
| 三、討論 |
| 四、小結(jié) |
| 全文結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新點的自我評價 |
| 參考文獻 |
| 綜述 |
| 參考文獻 |
| 在學期間科研成績 |
| 致謝 |
（10）子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型的建立與血管生成研究進展（論文提綱范文）
| 1 EMs裸鼠模型的建立 |
| 1.1 不同取材的子宮內(nèi)膜對造模的影響 |
| 1.1.1 不同月經(jīng)周期的內(nèi)膜對造模的影響 |
| 1.1.2 不同部位的內(nèi)膜對造模的影響 |
| 1.2 取材內(nèi)膜的處理對造模的影響 |
| 1.3 不同的移植方法對造模的影響 |
| 1.3.1 腹腔種植法 |
| 1.3.2 腹腔注射法 |
| 1.3.3 皮下種植法 |
| 1.3.4 皮下注射法 |
| 1.4 外源性的女性激素對造模的影響 |
| 1.5 是否行卵巢去勢對造模的影響 |
| 2 EMs裸鼠模型的移植病灶血管形成特點 |
| 3 EMs血管生成機制的研究 |
| 4 EMs抗血管生成治療的應用 |
| 5 結(jié) 語 |
四、裸鼠人子宮內(nèi)膜異位癥模型建立與病灶血管形成相關檢測（論文參考文獻）
- [1]補腎溫經(jīng)湯對EM腎虛血瘀型大鼠JAK2/STAT3信號通路相關因子的影響[D]. 孫瑞英. 山西中醫(yī)藥大學, 2021(09)
- [2]基于Wnt通路的內(nèi)異消抑制異體移植子宮內(nèi)膜異位癥的作用機制研究[D]. 韋佳慧. 西南大學, 2020(01)
- [3]缺氧調(diào)控的細胞粘附和細胞周期在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用[D]. 林翔. 浙江大學, 2020(01)
- [4]LncRNA MEG3-210在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用及相關機制研究[D]. 劉陽. 浙江大學, 2020(01)
- [5]加味芍藥甘草湯對子宮腺肌病裸鼠miR-27a調(diào)控的P53/EGFR/STAT3通路的干預機制[D]. 范為之. 廣州中醫(yī)藥大學, 2017(11)
- [6]Warburg效應標志物在改良子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型中表達的探究[D]. 倪惠娟. 浙江大學, 2016(06)
- [7]周細胞在子宮內(nèi)膜異位癥血管生成中作用的研究[D]. 趙采云. 天津醫(yī)科大學, 2014(01)
- [8]CD146在異位及在位子宮內(nèi)膜中的表達及意義[D]. 郭蕊萌. 天津醫(yī)科大學, 2013(02)
- [9]組織因子及蛋白酶激活受體2在子宮內(nèi)膜異位癥的表達及ENMD-1068治療子宮內(nèi)膜異位癥的動物實驗研究[D]. 林敏. 廣州醫(yī)學院, 2012(08)
- [10]子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型的建立與血管生成研究進展[J]. 孫俊杰,尹利榮. 醫(yī)學綜述, 2012(07)
標簽：子宮內(nèi)膜異位癥論文; 子宮內(nèi)膜論文; 細胞增殖論文; 缺氧癥狀論文; mir論文;