一、氟對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞增殖活力的影響（論文文獻(xiàn)綜述）
賈凌璐[1]（2021）在《PSAT1對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用及機(jī)制研究》文中研究表明背景與目的先天畸形、外傷、腫瘤、牙周病等都可能造成口腔骨組織缺損,給患者帶來極大的痛苦。近年來,口腔骨組織工程技術(shù)飛速發(fā)展,它將種子細(xì)胞、支架材料、生長因子三大要素有機(jī)結(jié)合,盡量避免了傳統(tǒng)治療方法的痛苦大、療程長、治療效果有限等弊端,促使已喪失的口腔骨組織進(jìn)行修復(fù)與再生,是極具潛力的骨組織再生新方法。具有自我更新與多向分化能力的干細(xì)胞是口腔骨組織工程種子細(xì)胞的主要候選細(xì)胞。近年來,口腔組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞如牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）、牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells,DPSCs）、牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞（gingivalmesenchymal stemcells,GMSCs）等,因可以在醫(yī)療廢物中獲取、具有較強(qiáng)的成骨分化能力而備受關(guān)注。特別是PDLSCs,被證實(shí)具有優(yōu)良的增殖、成骨分化、抗凋亡、免疫調(diào)控等能力,且在組織來源上與牙槽骨、頜骨聯(lián)系更加緊密,因而在口腔骨組織工程中更具有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。目前,基于PDLSCs開展的骨再生研究已經(jīng)在犬、豬、鼠等動(dòng)物的口腔骨缺損模型及人牙槽骨缺損病例中取得了一定的新骨形成效果,但不可否認(rèn)的是其距臨床期望仍有一定差距。因此,進(jìn)一步增強(qiáng)PDLSCs的成骨分化能力、提高PDLSCs介導(dǎo)的骨組織再生效果,是口腔骨組織工程研究的關(guān)鍵問題。闡明PDLSCs成骨分化的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制,可以為深入理解干細(xì)胞的生命活動(dòng)特征、靶向增強(qiáng)PDLSCs的成骨分化能力提供理論基礎(chǔ)。除了經(jīng)典的成骨分化調(diào)控因子外,越來越多的新蛋白、長鏈非編碼RNA、microRNA等被證實(shí)參與了成骨分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò);還有學(xué)者指出口腔組織來源的干細(xì)胞由于其發(fā)育的特殊性,可能存在與其他部位來源的干細(xì)胞不同的成骨分化調(diào)控機(jī)制?？傊?目前人們對(duì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的了解依然有限,有必要進(jìn)一步深入探究PDLSCs成骨分化的分子調(diào)控機(jī)制,從而為靶向增強(qiáng)PDLSCs介導(dǎo)的骨組織再生效果提供新思路。為此,本研究前期利用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析手段,對(duì)PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化前后差異表達(dá)的基因進(jìn)行了綜合分析及比較,再經(jīng)過初步的功能驗(yàn)證后,篩選出可能在PDLSCs的成骨分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用的基因 PSAT1。基因PSAT1編碼的蛋白為磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶1（phosphoserinetransaminase 1,PSAT1）,是一種具有酶活性的蛋白質(zhì),催化絲氨酸的生物合成反應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),除了影響絲氨酸合成外,PSAT1還參與了機(jī)體多項(xiàng)生命活動(dòng)的調(diào)控,如影響小鼠體細(xì)胞胰島素敏感性、影響肺細(xì)胞的膠原合成、調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲等。近期的幾項(xiàng)研究證實(shí)了 PSAT1與小鼠胚胎干細(xì)胞的分化時(shí)機(jī)調(diào)控和小鼠成骨細(xì)胞的生物礦化有關(guān),這提示PSAT1可能對(duì)干細(xì)胞這一特殊細(xì)胞類群有調(diào)控作用。然而,目前關(guān)于PSAT1對(duì)干細(xì)胞成骨分化調(diào)控作用及機(jī)制的報(bào)道寥寥無幾?；谝陨鲜聦?shí)及前期基因芯片的結(jié)果,本研究推測(cè)PSAT1可能對(duì)PDLSCs的成骨分化有調(diào)節(jié)作用,擬對(duì)該問題進(jìn)行深入的探究及驗(yàn)證。綜上所述,本研究前期利用基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)手段,分析、篩選可能參與口腔來源的PDLSCs、DPSCs、GMSCs的成骨分化調(diào)控的基因;在此基礎(chǔ)之上,深入探究PSAT1對(duì)PDLSCs的增殖、遷移、成骨分化等與骨組織工程密切相關(guān)的生物學(xué)行為的影響,重點(diǎn)闡釋PSAT1對(duì)PDLSCs成骨分化的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制,以期為闡明間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的分子生物學(xué)調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ),也為靶向提升PDLSCs成骨分化能力、增強(qiáng)PDLSCs介導(dǎo)的骨組織再生效果提供新思路。研究方法1、PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化調(diào)控基因的生物信息學(xué)分析分離、培養(yǎng)、鑒定PDLSCs、DPSCs及GMSCs;收集經(jīng)普通培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d及成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7d的PDLSCs、DPSCs及GMSCs（每種細(xì)胞三個(gè)樣本重復(fù)）用于基因芯片檢測(cè);利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證基因芯片結(jié)果;使用GO分析、KEGG分析等生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)差異表達(dá)基因的潛在功能及相互關(guān)系;基于所有基因芯片及生物信息學(xué)分析結(jié)果,篩選出多個(gè)可能調(diào)控成骨分化的候選基因;使用siRNA在PDLSCs中沉默候選基因的表達(dá),而后檢測(cè)成骨誘導(dǎo)后PDLSCs堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）活性的變化,以初步選擇最有可能調(diào)控成骨分化的基因用于后續(xù)研究。2、探究PSAT1對(duì)PDLSCs在體外培養(yǎng)環(huán)境中增殖、遷移、分化能力的調(diào)控通過慢病毒感染技術(shù)在PDLSCs中穩(wěn)定過表達(dá)及敲減PSAT1,并檢測(cè)過表達(dá)及敲減效率;通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)等分析過表達(dá)及敲減PSAT1后PDLSCs增殖能力的變化;通過劃痕實(shí)驗(yàn)分析PDLSCs的遷移能力;通過ALP活性分析、ALP染色、茜素紅染色、礦化結(jié)節(jié)定量分析、成骨相關(guān)因子COL1、ALP、RUNX2的蛋白及mRNA表達(dá)檢測(cè)等分析PDLSCs的成骨分化能力;通過油紅O染色及成脂相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè)分析PDLSCs的成脂分化能力。3、探究PSAT1對(duì)PDLSCs介導(dǎo)的體內(nèi)骨組織再生的調(diào)控構(gòu)建大鼠下頜骨骨缺損模型,將過表達(dá)及敲減PSAT1的PDLSCs與Bio-Oss骨粉混合后移植于骨缺損處,覆蓋屏障膜;8w后,通過micro-CT分析骨缺損處新骨生成情況,通過石蠟切片蘇木素-伊紅染色及Masson染色分析新生骨組織形態(tài)學(xué)特征,通過免疫組化染色分析新生骨的成骨相關(guān)因子ALP、RUNX2的表達(dá)情況。構(gòu)建裸鼠皮下移植模型,將過表達(dá)及敲減PSAT1的PDLSCs與骨粉混合后移植于裸鼠皮下;6 w后,通過石蠟切片蘇木素-伊紅染色及Masson染色分析移植組織的形態(tài)學(xué)特征。4、探究PSAT1促進(jìn)PDLSCs成骨分化的分子機(jī)制從兩個(gè)角度探究PSAT1調(diào)控PDLSCs成骨分化的分子機(jī)制:（1）探究PSAT1是否通過影響Akt-GSK3β-β-catenin信號(hào)通路調(diào)控成骨分化:通過Western Blot檢測(cè)過表達(dá)及敲減PSAT1后Akt-GSK3β-β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的磷酸化水平及蛋白量變化;使用抑制劑LY294002處理過表達(dá)PSAT1的細(xì)胞,或用激活劑SC79處理敲減PSAT1的細(xì)胞,而后通過Western Blot檢測(cè)Akt-GSK-3β-β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的磷酸化水平及蛋白量變化,通過ALP活性分析、ALP染色、茜素紅染色、礦化結(jié)節(jié)定量分析、成骨相關(guān)因子的蛋白及mRNA表達(dá)檢測(cè)等方法檢測(cè)細(xì)胞成骨分化能力的變化。（2）探究PSAT1是否通過影響其催化的代謝反應(yīng)的下游產(chǎn)物絲氨酸或α酮戊二酸調(diào)控成骨分化:使用siRNA分別沉默絲氨酸生物合成反應(yīng)中的上游酶PHGDH和下游酶PSPH,或用絲氨酸處理敲減PSAT1的細(xì)胞,而后檢測(cè)成骨誘導(dǎo)后PDLSCs的ALP活性;檢測(cè)過表達(dá)及敲減PSAT1后細(xì)胞內(nèi)α酮戊二酸的含量;通過CCK-8實(shí)驗(yàn)分析一定濃度梯度的外源性α酮戊二酸二甲酯（dm-αKG）處理對(duì)PDLSCs增殖活性的影響;通過ALP活性分析、ALP染色、茜素紅染色、礦化結(jié)節(jié)定量分析、成骨相關(guān)因子的蛋白及mRNA表達(dá)檢測(cè)等方法分析一定濃度梯度的dm-αKG對(duì)PDLSCs成骨分化的影響;使用dm-αKG處理敲減PSAT1的PDLSCs,而后檢測(cè)成骨誘導(dǎo)后PDLSCs成骨分化能力的變化;通過Western Blot檢測(cè)dm-αKG對(duì)PDLSCs中Akt-GSK3β-β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子的磷酸化水平及蛋白量的影響。5、探究PDLSCs成骨分化過程中轉(zhuǎn)錄因子ATF4對(duì)PSAT1的調(diào)控通過qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)ATF4及PSAT1在PDLSCs成骨分化后的mRNA及蛋白表達(dá)水平變化;構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒及siRNA,對(duì)PDLSCs中的ATF4進(jìn)行過表達(dá)及沉默,而后檢測(cè)PSAT1的表達(dá)變化;使用JASPAR數(shù)據(jù)庫、GTRD數(shù)據(jù)庫分析ATF4與基因PSAT1啟動(dòng)子區(qū)域的潛在結(jié)合位點(diǎn);使用Ch1P-PCR實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證ATF4與基因PSAT1啟動(dòng)子預(yù)測(cè)位點(diǎn)的結(jié)合。結(jié)果1、PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化調(diào)控基因的生物信息學(xué)分析成功分離、培養(yǎng)及鑒定PDLSCs、DPSCs及GMSCs;基因芯片分析獲得了成骨誘導(dǎo)后113個(gè)在PDLSCs、DPSCs及GMSCs三種細(xì)胞中均差異表達(dá)的基因,及188、94、144個(gè)分別僅在PDLSCs、DPSCs、GMSCs中差異表達(dá)的基因;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)基因芯片結(jié)果可信;通過GO分析及KEGG分析對(duì)差異基因進(jìn)行了功能分析;使用siRNA沉默初步選出的8個(gè)候選基因,證實(shí)沉默基因PSAT1導(dǎo)致成骨誘導(dǎo)后PDLSCs的ALP活性下降最顯著,因而確定PSAT1為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。2、PSAT1對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境中PDLSCs在增殖、遷移、分化能力的調(diào)控使用慢病毒成功在PDLSCs中穩(wěn)定過表達(dá)及敲減PSAT1;CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明過表達(dá)PSAT1促進(jìn)PDLSCs的增殖,而敲減PSAT1抑制PDLSCs的增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)及敲減PSAT1對(duì)PDLSCs的遷移能力沒有顯著影響;成骨分化檢測(cè)結(jié)果顯示,過表達(dá)PSAT1促進(jìn)了 PDLSCs的成骨分化,而敲減PSAT1抑制了 PDLSCs的成骨分化;成脂分化檢測(cè)結(jié)果表明,過表達(dá)PSAT1促進(jìn)了 PDLSCs的成脂分化,而敲減PSAT1抑制了 PDLSCs的成脂分化。3、PSAT1對(duì)PDLSCs介導(dǎo)的體內(nèi)骨組織再生的調(diào)控構(gòu)建大鼠下頜骨骨缺損模型后,micro-CT結(jié)果顯示過表達(dá)PSAT1組與對(duì)照組相比形成的新骨的骨量更多,而敲減PSAT1組的新骨骨量減少、骨小梁相對(duì)稀疏;石蠟切片蘇木素-伊紅染色及Masson染色顯示,過表達(dá)PSAT1組形成的新骨比對(duì)照組骨量多、礦化程度高,敲減PSAT1組的新骨骨量少、礦化程度低;免疫組化染色結(jié)果表明,過表達(dá)PSAT1組的成骨相關(guān)因子ALP、RUNX2的表達(dá)量更高,而敲減PSAT1組的表達(dá)量降低。構(gòu)建裸鼠皮下移植模型后,石蠟切片蘇木素-伊紅染色及Masson染色結(jié)果顯示,PDLSCs在裸鼠皮下形成了類牙周膜/骨樣組織,過表達(dá)PSAT1組與對(duì)照組相比形成的膠原更致密、局部骨基質(zhì)沉積增加,而敲減PSAT1組形成的膠原變得稀疏、局部骨基質(zhì)沉積減少。4、PSAT1促進(jìn)PDLSCs成骨分化的分子機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PSAT1通過兩條途徑調(diào)控PDLSCs的成骨分化:第一,過表達(dá)及敲減PSAT1后PDLSCs中Akt-GSK3 β-β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子的激活水平相應(yīng)升高及降低;LY294002抑制了 Akt的磷酸化激活,并逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)PSAT1對(duì)Akt-GSK3β-β-catenin信號(hào)通路的活化作用,且逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)PSAT1對(duì)PDLSCs成骨分化的促進(jìn)作用;激活劑SC79促進(jìn)了 Akt的磷酸化激活,逆轉(zhuǎn)了敲減PSAT1對(duì)Akt-GSK3β-β-catenin信號(hào)通路的抑制作用,挽救了敲減PSAT1造成的PDLSCs成骨分化水平降低。上述結(jié)果表明,PSAT1可以通過Akt-GSK3β-β-catenin信號(hào)通路調(diào)控PDLSCs的成骨分化。第二,siRNA沉默PHGDH后PDLSCs的ALP活性下降,而沉默PSPH后PDLSCs的ALP活性不變;向培養(yǎng)基中添加絲氨酸沒有逆轉(zhuǎn)敲減PSAT1造成的PDLSCs的ALP活性下降,如此初步排除了絲氨酸的調(diào)控作用;過表達(dá)及敲減PSAT1后細(xì)胞內(nèi)α酮戊二酸的水平相應(yīng)升高及降低;濃度小于等于3mM的dm-αKG對(duì)PDLSCs的增殖能力沒有顯著影響,對(duì)PDLSCs的成骨分化有顯著促進(jìn)作用;3 mM dm-αKG處理挽救了敲減PSAT1后PDLSCs成骨分化能力的降低;3 mM dm-αKG對(duì)PDLSCs中Akt-GSK3β-β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子的磷酸化水平?jīng)]有顯著影響。上述結(jié)果表明,PSAT1可以通過影響其催化的代謝反應(yīng)的下游產(chǎn)物α酮戊二酸調(diào)控PDLSCs的成骨分化。5、PDLSCs成骨分化過程中PSAT1的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子ATF4調(diào)控qRT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示,PDLSCs成骨分化后ATF4和PSAT1的mRNA及蛋白表達(dá)水平皆下降;在PDLSCs中過表達(dá)及沉默ATF4后,PSAT1的mRNA及蛋白表達(dá)水平相應(yīng)升高及降低;過表達(dá)ATF4后,成骨誘導(dǎo)后原本降低的PSAT1表達(dá)水平被提升;JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了 ATF4與基因PSAT1啟動(dòng)子區(qū)域的潛在結(jié)合位點(diǎn)為Ch9:78296092-78296101;ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)表明ATF4可以與預(yù)測(cè)位點(diǎn)結(jié)合;GTRD數(shù)據(jù)庫分析驗(yàn)證了 ATF4與基因PSAT1啟動(dòng)子區(qū)域存在結(jié)合峰。結(jié)論1、PSAT1可以正向調(diào)控PDLSCs在體外培養(yǎng)環(huán)境中的增殖和成骨分化能力,并促進(jìn)PDLSCs在體內(nèi)環(huán)境中介導(dǎo)的骨組織再生。2、PSAT1可能通過兩條途徑調(diào)控PDLSCs的成骨分化:一是PSAT1可以影響成骨相關(guān)信號(hào)通路Akt-GSK3β-β-catenin活性,二是PSAT1通過影響細(xì)胞中重要化合物α酮戊二酸的水平來調(diào)控成骨分化。3、PDLSCs成骨分化過程中PSAT1的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子ATF4調(diào)控。
俞超楠[2]（2021）在《原花青素減輕NaF所致小鼠MLO-Y4骨細(xì)胞損傷研究》文中研究指明目的 氟是人體必需的微量元素之一,適量的氟對(duì)人體骨骼、牙齒的生長和形成具有促進(jìn)作用。然而當(dāng)氟攝入平衡失調(diào)時(shí),機(jī)體代謝和生理功能都會(huì)受到影響,尤其是高劑量氟會(huì)引發(fā)氟中毒,并導(dǎo)致氟斑牙和氟骨癥。骨細(xì)胞是成熟骨組織中的主要細(xì)胞,由骨母細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。研究表明,骨細(xì)胞通過影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化和成熟來完成骨重塑的過程,是骨重構(gòu)的核心調(diào)控者。目前與氟中毒有關(guān)的基礎(chǔ)研究主要集中在成骨和破骨細(xì)胞,而關(guān)于氟化物對(duì)骨細(xì)胞功能影響的研究相對(duì)較少。與此同時(shí),研究表明抗氧化劑可顯著促進(jìn)骨形成并抑制骨吸收過程,具有修復(fù)因過量氟化物所致骨組織細(xì)胞損傷的潛力。原花青素具有很強(qiáng)的抗氧化活性,且對(duì)許多急性和慢性疾病具有預(yù)防和控制作用。本論文以氟化鈉（NaF）誘導(dǎo)損傷MLO-Y4骨細(xì)胞,模擬高劑量氟導(dǎo)致的氟中毒,建立氟中毒癥體外細(xì)胞模型,并利用該模型探究原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 1.將不同濃度NaF（0.2、0.5、1.0、2.5和5 mM）作用于MLO-Y4骨細(xì)胞48 h后,利用相差顯微鏡觀察NaF對(duì)骨細(xì)胞形態(tài)的影響;鈣黃綠素乙酰甲酯（Calcein-AM）染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（CCK-8）法檢測(cè)NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響;經(jīng)自噬檢測(cè)試劑（CYTO-ID）和吖啶橙（AO）染色并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨細(xì)胞自噬和酸性自噬泡水平;采用碘化丙啶（PI）染色并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NaF對(duì)骨細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的影響;采用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）測(cè)定NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞自噬相關(guān)Beclin-1,輕鏈3（LC3）,核孔糖蛋白（P62）,磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）,哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）蛋白信號(hào)通路和細(xì)胞增殖相關(guān)的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白信號(hào)表達(dá)的影響。2.MLO-Y4骨細(xì)胞采用原花青素（1、3、10、30、100μM）預(yù)保護(hù)2h后,再與2.5 mM NaF共孵育48 h,隨后采用如前所述方法檢測(cè)原花青素對(duì)NaF所致骨細(xì)胞細(xì)胞活性、自噬和細(xì)胞增殖改變的影響。結(jié)果 1.形態(tài)學(xué)觀測(cè)結(jié)果顯示:1 mM以上的NaF能顯著改變MLO-Y4骨細(xì)胞形態(tài)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1 mM以上的NaF呈劑量依賴性顯著抑制MLO-Y4骨細(xì)胞的活性。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明NaF顯著誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞自噬水平上調(diào)和細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡數(shù)量增加,并顯著抑制骨細(xì)胞增殖。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,2.5 mM NaF誘導(dǎo)Beclin-1,LC3,p62,p-mTOR蛋白表達(dá)上調(diào),mTOR蛋白表達(dá)下調(diào);此外,2.5 mM NaF還導(dǎo)致PCNA蛋白表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步提示NaF染毒可導(dǎo)致骨細(xì)胞自噬流受損和增殖抑制。2.給予不同濃度原花青素（1、3、10、30、100μM）干預(yù)后,形態(tài)學(xué)觀測(cè)結(jié)果顯示:與2.5 mM NaF模型組相比,3 μM、10 μM和30μM原花青素對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞的保護(hù)有一定效果,活細(xì)胞數(shù)有上升趨勢(shì);CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3 μM、10μM和30μM原花青素能顯著提升NaF所致的MLO-Y4骨細(xì)胞細(xì)胞活性,其中10 μM原花青素的保護(hù)作用最為顯著;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明原花青素能顯著抑制NaF誘導(dǎo)的MLO-Y4骨細(xì)胞自噬流受阻,且對(duì)NaF所致的細(xì)胞增殖抑制有顯著促進(jìn)作用。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與2.5mMNaF模型組相比,原花青素使Beclin-1,LC3,p62,p-mTOR蛋白表達(dá)下調(diào),mTOR蛋白表達(dá)上升;此外,原花青素使PCNA蛋白表達(dá)上升。提示原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)的骨細(xì)胞自噬流受阻和增殖抑制有修復(fù)作用。結(jié)論 NaF可以誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞活性下降,造成細(xì)胞自噬流阻滯并抑制細(xì)胞增殖,對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞造成損傷。原花青素可減輕NaF所致的MLO-Y4骨細(xì)胞損傷,其機(jī)制可能與其減輕自噬流受損和緩解細(xì)胞增殖抑制相關(guān)。
喬婷婷[3]（2021）在《氟對(duì)胚胎大鼠脛骨生長、礦化及骺軟骨糖原水平影響的研究》文中研究說明目的:氟作為人體必需微量元素之一,以化合物形式廣泛分布于自然界。機(jī)體攝入適量氟可降低齲齒發(fā)生率,有利于鈣、磷吸收,增加骨骼硬度。但攝入過量可引起以氟骨癥和氟斑牙為主要特征的慢性全身性疾病,即地氟病。地氟病作為我國重要的公共衛(wèi)生問題,嚴(yán)重影響人群健康。為了更好地防治地氟病,需對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究。研究發(fā)現(xiàn),氟抑制長骨的生長發(fā)育。本研究通過建立體外脛骨器官培養(yǎng)模型,觀察染氟對(duì)脛骨縱向生長及礦化的影響,測(cè)量骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo),檢測(cè)軟骨細(xì)胞糖原儲(chǔ)存情況以及成骨標(biāo)志物的變化,探討氟對(duì)大鼠長骨生長發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)方法:分離胚胎第20天SD大鼠后肢脛骨,以左側(cè)脛骨為對(duì)照組,右側(cè)脛骨為10-4MF-組。常規(guī)培養(yǎng)于ɑMEM培養(yǎng)基（含0.2%牛血清白蛋白、0.05mg/ml抗壞血酸、1mmol/Lβ甘油磷酸鈉,1×105U/L青、鏈霉素）,5%CO2、37℃培養(yǎng)7天,隔天換液。體式顯微鏡采集圖像并測(cè)量脛骨全長及礦化區(qū)長度,計(jì)算相對(duì)縱向生長率。脛骨固定、脫鈣及石蠟包埋,制作5μm切片,進(jìn)行H&E、甲苯胺藍(lán)、番紅固綠和PAS染色,分析骺軟骨各區(qū)形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo),采用Osteo Measure骨測(cè)量軟件測(cè)量骨小梁形態(tài)學(xué)指標(biāo)。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè):Ⅰ型膠原（TypeⅠcollagen,Col1a1）、骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）、糖原合成酶（Glycogen Synthase,GYS1）、糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase,PYGL）、糖原合成酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase-3β,GSK-3β）的蛋白表達(dá)情況。SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異采用兩組獨(dú)立樣本t-test進(jìn)行分析。結(jié)果:染氟組脛骨縱向生長率低于對(duì)照,染氟第7天縱向生長率顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。染氟組脛骨礦化區(qū)縱向生長率在第3天（P<0.05）、第5天和第7天均顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。骺軟骨形態(tài)計(jì)量學(xué)顯示,與對(duì)照組相比,染氟組脛骨骺軟骨總長度（P<0.05）、靜息區(qū)（P<0.05）和增殖區(qū)厚度（P<0.01）均顯著降低,肥大區(qū)厚度顯著增加（P<0.05）。PAS染色發(fā)現(xiàn),染氟組脛骨軟骨增殖區(qū)（P<0.05）和肥大區(qū)（P<0.01）糖原儲(chǔ)存較對(duì)照均顯著增加。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示染氟組軟骨細(xì)胞GYS1表達(dá)顯著高于對(duì)照（P<0.01）,GSK-3β和PYGL表達(dá)顯著降低（P<0.01）。與對(duì)照組相比,染氟組脛骨骨小梁減少且稀疏、變細(xì),定量結(jié)果顯示,染氟組組骨小梁參數(shù):骨體積分?jǐn)?shù)（P<0.01）、骨小梁數(shù)量（P<0.05）和骨小梁厚度（P<0.01）均顯著低于對(duì)照組,骨小梁間隙與對(duì)照組相比顯著升高（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:成骨標(biāo)志物Col1a1（P<0.05）和OPN（P<0.01）表達(dá)均降低。結(jié)論:1、氟抑制大鼠體外脛骨縱向生長,抑制成骨標(biāo)志物表達(dá);2、染氟后骺軟骨總長度變短,增殖區(qū)厚度變薄,肥大區(qū)厚度增加,軟骨細(xì)胞各區(qū)比例失衡;3、氟通過抑制軟骨細(xì)胞糖原合成酶激酶的表達(dá),從而減弱其對(duì)糖原合成酶的抑制作用,糖原合成酶表達(dá)增加促進(jìn)糖原合成;另一方面,氟通過抑制軟骨細(xì)胞糖原磷酸化酶的表達(dá),抑制糖原分解,使軟骨細(xì)胞糖原蓄積。
馬瑞[4]（2021）在《氟通過PHD2/HIF1α信號(hào)通路抑制SW1353軟骨細(xì)胞糖酵解》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的:氟是一種人體生長發(fā)育所必需的微量元素。氟對(duì)機(jī)體具有雙重影響,適量攝入氟能增強(qiáng)牙齒抗齲能力,促進(jìn)骨骼鈣磷吸收,而長期過量攝入氟則會(huì)導(dǎo)致氟中毒。氟對(duì)骨骼有極強(qiáng)的親和力,因而氟中毒最具代表性的癥狀是氟骨癥和氟斑牙,軟骨損傷是氟骨癥的基本表現(xiàn)之一。軟骨細(xì)胞是生長板軟骨的重要構(gòu)成細(xì)胞,維持軟骨細(xì)胞合成與分解代謝平衡是軟骨生長發(fā)育的基礎(chǔ)條件。葡萄糖是所有活細(xì)胞重要的代謝原料,在軟骨細(xì)胞中,葡萄糖不僅能為軟骨細(xì)胞提供能量來源,還是軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖的結(jié)構(gòu)前體,對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成十分重要。由于生長板軟骨是一種無血管的結(jié)締組織,其含氧量極低,軟骨細(xì)胞主要以糖酵解方式供能。缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α能感知和適應(yīng)低氧環(huán)境,是調(diào)控糖酵解的關(guān)鍵因子。然而,氟是否通過PHD2/HIF1α信號(hào)通路調(diào)控軟骨細(xì)胞糖酵解,進(jìn)而改變其合成、分解代謝的穩(wěn)態(tài)尚未見報(bào)道。為此,我們通過體外脛骨培養(yǎng)檢測(cè)氟對(duì)HIF1α表達(dá)的影響,并以SW1353細(xì)胞為研究對(duì)象,探討氟是否通過調(diào)控PHD2/HIF1α信號(hào)通路改變SW1353細(xì)胞糖酵解,進(jìn)而影響合成代謝和分解代謝間的平衡。方法:本研究選取胚胎第20天的大鼠脛骨,采取左右配對(duì)方式,分為對(duì)照組和10-4M Na F組,培養(yǎng)于含0.2%牛血清蛋白、0.05 mg/ml Vc、1m Mβ-甘油磷酸鈉的α-MEM培養(yǎng)基中。7天后,脛骨經(jīng)固定、脫鈣、石蠟包埋并切片,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脛骨HIF1α蛋白的表達(dá)。SW1353細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的L-15培養(yǎng)基中。采用CCK8法檢測(cè)SW1353細(xì)胞活性,以確定染氟劑量和時(shí)間;阿利新藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖合成情況;用ATP、乳酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定ATP、乳酸產(chǎn)量;GOD-POD法檢測(cè)葡萄糖消耗;細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)HIF1α的細(xì)胞定位和表達(dá)強(qiáng)度;實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞合成與分解代謝標(biāo)志因子（Aggrecan、Col2a1、Col10a1、MMP13）、HIF1α信號(hào)通路（PHD2、HIF1α）和糖酵解相關(guān)因子（Glut1、HK2、PKM、ENO1、LDHA、MCT4）的m RNA和蛋白表達(dá)情況;并用Co Cl2上調(diào)HIF1α的表達(dá),檢測(cè)上述相關(guān)因子的表達(dá)變化。結(jié)果:1、氟能降低體外脛骨肥大軟骨細(xì)胞HIF1α的表達(dá):染氟組脛骨HIF1α表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。2、氟對(duì)SW1353細(xì)胞活性的影響:5×10-4M Na F處理SW1353細(xì)胞時(shí),細(xì)胞活力顯著下降,且72小時(shí)下降最明顯（P<0.001）。3、氟對(duì)SW1353細(xì)胞合成代謝的影響:阿利新藍(lán)染色檢測(cè)氟對(duì)SW1353細(xì)胞蛋白多糖合成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)染氟組阿利新藍(lán)染色強(qiáng)度較對(duì)照組弱,用鹽酸胍溶解阿利新藍(lán)進(jìn)行定量分析,染氟組蛋白多糖生成顯著低于對(duì)照組（P<0.05）;氟處理顯著抑制Aggrecan、Col2a1和Col10a1等軟骨細(xì)胞合成代謝標(biāo)志因子的表達(dá)（P<0.05）。4、氟對(duì)SW1353細(xì)胞分解代謝的影響:較對(duì)照組而言,氟促進(jìn)MMP13的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5、氟對(duì)糖酵解的影響:染氟組中ATP、乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。6、氟對(duì)PHD2/HIF1α信號(hào)通路及糖酵解相關(guān)因子的影響:與對(duì)照組相比,染氟組HIF1α免疫熒光染色信號(hào)變?nèi)?氟在m RNA和蛋白水平均上調(diào)PHD2的表達(dá),下調(diào)HIF1α的表達(dá)（P<0.05）;在染氟組中,糖酵解相關(guān)因子Glut1、HK2、PKM、ENO1、LDHA和MCT4的表達(dá)均降低（P<0.05）。7、Co Cl2通過抑制PHD2的表達(dá)來上調(diào)HIF1α及其下游因子表達(dá):染氟組中PHD2表達(dá)顯著高于對(duì)照組,HIF1α表達(dá)低于對(duì)照組;與對(duì)照組相比,Co Cl2組PHD2的表達(dá)受到抑制,HIF1α表達(dá)顯著增加;在Na F+Co Cl2組中,較染氟組而言,PHD2表達(dá)顯著降低,HIF1α顯著增加（P<0.05）。8、氟通過抑制HIF1α降低SW1353細(xì)胞糖酵解:染氟組中,細(xì)胞ATP、乳酸的產(chǎn)量和葡萄糖消耗均低于對(duì)照組,糖酵解相關(guān)因子的表達(dá)均降低;與對(duì)照組相比,Co Cl2組ATP、乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗增加,糖酵解相關(guān)因子的表達(dá)上調(diào);在Na F+Co Cl2組中,與染氟組相比,細(xì)胞ATP生成、乳酸產(chǎn)量、葡萄糖消耗和糖酵解相關(guān)因子的表達(dá)均顯著增加。9、氟通過抑制HIF1α降低SW1353細(xì)胞合成代謝,加速其分解代謝:與對(duì)照組相比,染氟組Col2a1和Col10a1表達(dá)降低,MMP13的表達(dá)升高;較對(duì)照組而言,Co Cl2組上調(diào)Col2a1和Col10a1的表達(dá),下調(diào)MMP13的表達(dá);在Na F+Co Cl2組中,與染氟組相比,Col2a1和Col10a1表達(dá)增加,MMP13的表達(dá)下降（P<0.05）。結(jié)論:1、氟抑制SW1353細(xì)胞合成代謝,加速其分解代謝,破壞細(xì)胞合成與分解代謝的平衡。2、氟通過增加PHD2的表達(dá)下調(diào)HIF1α,進(jìn)而抑制其下游靶基因表達(dá)。3、氟通過PHD2/HIF1α信號(hào)通路降低SW1353細(xì)胞糖酵解,從而影響其合成分解代謝。
蔣寧寧[5]（2020）在《氟對(duì)骨細(xì)胞調(diào)控成骨作用的研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理研究背景:氟元素對(duì)人體健康不可或缺,但攝入過量的氟可引起人體生理及病理的變化,從而對(duì)身體造成損害。地方性氟中毒是我國流行最為廣泛、病情最為嚴(yán)重的地方病之一。氟主要侵犯骨組織,氟斑牙和氟骨癥是地方性氟中毒的特征性損害。成年人體內(nèi)99%的氟化物都存在于鈣化組織（主要是骨骼）中,過量氟暴露引起的氟骨癥與代謝性骨轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。研究者已經(jīng)證明了氟骨癥病變?cè)诓煌瑮l件下也會(huì)有活躍進(jìn)展時(shí)期或相對(duì)靜止時(shí)期;就其進(jìn)展時(shí)期而言,無疑是處于高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)骨代謝的主要形式或骨重建循環(huán),即破骨細(xì)胞通過分泌酸性物質(zhì)溶解舊骨,從而發(fā)揮骨吸收功能;成骨細(xì)胞通過分泌、合成以及礦化骨基質(zhì)來形成新骨,從而發(fā)揮骨形成功能。大量研究表明骨細(xì)胞直接參與骨形成和骨重建過程,其通過影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化成熟來影響骨重建過程。近年來,有關(guān)氟骨癥的基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)多在于氟化物對(duì)成骨、破骨的調(diào)控機(jī)制上,對(duì)骨細(xì)胞的研究相對(duì)較少,而氟化物對(duì)骨細(xì)胞如何調(diào)控成骨作用的研究更是少見。甲狀旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）是由甲狀旁腺細(xì)胞所分泌的能夠調(diào)控機(jī)體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的一種活性多肽類激素。大量研究證實(shí),PTH能夠通過影響成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞來參與骨轉(zhuǎn)換過程。因此本實(shí)驗(yàn)利用骨組織的三種主要類型細(xì)胞進(jìn)行染氟實(shí)驗(yàn)研究,旨在探究氟化物在骨細(xì)胞調(diào)控成骨機(jī)制中的作用,并進(jìn)一步分析PTH在其中的地位,從而為進(jìn)一步深入研究氟骨癥的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法:1.單獨(dú)培養(yǎng)的骨組織細(xì)胞染氟實(shí)驗(yàn)研究:我們選取骨組織的三種類型細(xì)胞,即成骨細(xì)胞選擇其祖細(xì)胞（BMSCs）和前體細(xì)胞系（MC3T3-E1）、破骨細(xì)胞前體（RAW264.7）和骨細(xì)胞（IDG-SW3）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):（1）利用小鼠的股骨來分離成骨細(xì)胞祖細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定其表面受體,得到確認(rèn)其為BMSCs細(xì)胞;利用核因子κB受體活化因子配體（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體7天后,進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）染色,確認(rèn)其分化為TRACP陽性、多核的破骨細(xì)胞樣細(xì)胞;利用礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)IDG-SW3細(xì)胞1442天后,采用Western Blot法檢測(cè)到SOST蛋白表達(dá)陽性,確認(rèn)其骨細(xì)胞特征;利用礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)成骨前體細(xì)胞728天,使其分化為成熟的成骨細(xì)胞;（2）利用濃度為0.00132 mg/L的氟離子處理成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞前體和骨細(xì)胞7天后,采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)骨組織中三種類型細(xì)胞的增殖活性。（3）利用濃度為0.5、4、16 mg/L氟離子聯(lián)合其他條件處理三種細(xì)胞7天后,進(jìn)行細(xì)胞的凋亡率分析。用濃度為0.5、4、16 mg/L氟離子或相同氟濃度聯(lián)合10 nmol/L的PTH（1-34）處理骨細(xì)胞7天;用濃度為0.5、4、16 mg/L氟離子或相同氟濃度聯(lián)合10 ng/mL轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）處理破骨細(xì)胞前體7天;用濃度為0.5、4、16 mg/L氟離子或相同氟濃度聯(lián)合10 nmol/L PTH或相同氟濃度聯(lián)合10 ng/mL TGF-β1處理成骨細(xì)胞祖細(xì)胞7天。各個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,采用美國BD公司的Annexin V-FITC凋亡試劑盒進(jìn)行檢測(cè),觀察骨組織三種細(xì)胞的凋亡情況。（4）利用明顯影響細(xì)胞活性的,濃度為0.5、4 mg/L的氟離子,以及相同氟濃度聯(lián)合10 nmol/L的PTH處理成骨細(xì)胞7天后,采用Western Blot法檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下,成骨細(xì)胞中Wnt10b、β連環(huán)蛋白（β-catenin）、Smad3、磷酸化Smad3、甲狀旁腺素1受體（PTH1R）、核心結(jié)合因子2（Runx2）蛋白的表達(dá)變化;（5）利用明顯影響細(xì)胞活性,濃度為0.5、4 mg/L的氟離子,以及相同氟濃度聯(lián)合10nmol/L的PTH處理骨細(xì)胞12天后,采用Western Blot法檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下,骨細(xì)胞中Smad3、磷酸化Smad3、硬化蛋白（SOST）、Dickkopf相關(guān)蛋白1（DKK1）、Wnt10b、β-catenin蛋白的表達(dá)變化。2.利用Transwell共培養(yǎng)骨組織細(xì)胞的染氟實(shí)驗(yàn)研究:利用孔徑為3.0μm Polyester Membrance Transwell小室組成共培養(yǎng)系統(tǒng),進(jìn)行以下共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):（1）將成骨細(xì)胞祖細(xì)胞、破骨細(xì)胞前體分別種植在Transwell小室上層,骨細(xì)胞種植在下層,利用明顯影響破骨細(xì)胞活性,濃度為4 mg/L的氟離子,以及相同氟濃度聯(lián)合10 nmol/L的PTH處理下層骨細(xì)胞7天。采用實(shí)時(shí)定量PCR法,檢測(cè)兩種共培養(yǎng)系統(tǒng)中骨細(xì)胞所分泌的SOST、DKK1、RANKL、骨保護(hù)素（OPG）基因的表達(dá)變化。（2）將成骨細(xì)胞祖細(xì)胞種植在Transwell小室上層,骨細(xì)胞或骨細(xì)胞破骨細(xì)胞前體（比例為2:1）混合培養(yǎng)在下層。利用明顯影響成骨細(xì)胞活性,濃度為0.5 mg/L的氟離子處理下層骨細(xì)胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation轉(zhuǎn)染質(zhì)粒激活骨細(xì)胞中SOST蛋白表達(dá)48 h后。采用Diff-Quick Stain試劑盒進(jìn)行染色,觀察上層成骨細(xì)胞祖細(xì)胞增殖數(shù)量的變化。（3）將成骨細(xì)胞種植在Transwell小室上層,骨細(xì)胞或骨細(xì)胞破骨細(xì)胞前體（比例為2:1）混合培養(yǎng)在下層。利用明顯影響細(xì)胞活性,濃度為0.5、4 mg/L的氟離子,以及相同氟濃度聯(lián)合10 nmol/L的PTH處理下層骨細(xì)胞7天。上層成骨細(xì)胞通過堿性磷酸酶（ALP）染色檢測(cè)其分化情況;下層骨細(xì)胞采用Western Blot法檢測(cè)不同條件處理7天后,骨細(xì)胞內(nèi)調(diào)控成骨相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。（4）將成骨細(xì)胞種植在Transwell小室上層,骨細(xì)胞種植在下層,利用明顯影響細(xì)胞活性,濃度為0.5、4 mg/L的氟離子,以及相同氟濃度聯(lián)合10 nmol/L的PTH處理下層骨細(xì)胞28天。上層成骨細(xì)胞通過茜素紅染色檢測(cè)其礦化結(jié)節(jié)形成情況;下層骨細(xì)胞采用Western Blot法檢測(cè)不同條件處理28天,骨細(xì)胞內(nèi)調(diào)控成骨相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。（5）將成骨細(xì)胞種植在Transwell小室上層,骨細(xì)胞種植在下層。利用明顯影響細(xì)胞活性,濃度為0.5、4 mg/L的氟離子,以及相同氟濃度聯(lián)合10 nmol/L的PTH處理下層骨細(xì)胞,并用50 nM SOST siRNA降低骨細(xì)胞中SOST蛋白表達(dá)48 h。采用實(shí)時(shí)定量PCR法,檢測(cè)上層成骨細(xì)胞和下層骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.單獨(dú)培養(yǎng)的骨組織細(xì)胞染氟實(shí)驗(yàn)結(jié)果:（1）流式細(xì)胞儀鑒定成骨細(xì)胞祖細(xì)胞（BMSCs）表現(xiàn)為CD34/CD44雙陽性信號(hào),證明成骨細(xì)胞祖細(xì)胞具有成骨分化的潛能;破骨細(xì)胞前體（RAW264.7）經(jīng)RANKL誘導(dǎo)7天后進(jìn)行TRACP染色,破骨細(xì)胞前體表現(xiàn)為三核或多核的TRACP陽性細(xì)胞,表明其已誘導(dǎo)成為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞;IDG-SW3細(xì)胞經(jīng)礦化培養(yǎng)液誘導(dǎo)1442天,采用Western Blot法檢測(cè)骨細(xì)胞標(biāo)志物SOST蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IDG-SW3細(xì)胞從21天開始表達(dá)骨細(xì)胞標(biāo)志物硬化蛋白,直至42天仍表達(dá)硬化蛋白,證明其分化成為骨細(xì)胞。后續(xù)均選取礦化28天的IDG-SW3細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。（2）細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明:氟對(duì)成骨細(xì)胞祖細(xì)胞作用范圍窄,抑制作用較顯著;破骨細(xì)胞前體對(duì)氟化物的作用比較敏感;成骨細(xì)胞活性整體呈現(xiàn)“倒U型”趨勢(shì),即隨著氟濃度增加,成骨細(xì)胞活性逐漸增加,達(dá)到峰值后又逐漸下降;與其他骨組織細(xì)胞類型比較,骨細(xì)胞對(duì)氟離子的耐受性較強(qiáng)。（3）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明:高劑量的氟顯著促進(jìn)骨組織中三種主要類型細(xì)胞的凋亡,氟聯(lián)合PTH顯著促進(jìn)骨細(xì)胞的凋亡,TGF-β1輕度提高了破骨細(xì)胞前體的凋亡率,但PTH和TGF-β1對(duì)成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的促凋亡作用不明顯。（4）染氟或染氟聯(lián)合PTH處理成骨細(xì)胞7天,蛋白表達(dá)水平分析的結(jié)果顯示:單獨(dú)染氟、染氟聯(lián)合PTH不同程度的抑制了Wnt10b、β-catenin以及Runx2蛋白的表達(dá),氟聯(lián)合PTH處理與單獨(dú)氟處理相比較,上面各因子的變化相類似。另外,染氟能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的Smad3蛋白的磷酸化。（5）染氟或染氟聯(lián)合PTH處理骨細(xì)胞12天,蛋白表達(dá)水平分析的結(jié)果顯示:單獨(dú)染氟、染氟聯(lián)合PTH處理,不同程度的下調(diào)SOST蛋白的表達(dá),而上調(diào)DKK1蛋白表達(dá)。低劑量氟可以不同程度的促進(jìn)Wnt10b、β-catenin、Smad3和P-Smad3蛋白的表達(dá)。氟聯(lián)合PTH作用與單獨(dú)氟處理相比較,Wnt10b和β-catenin蛋白的變化相類似。2.利用Transwell共培養(yǎng)骨組織細(xì)胞的染氟實(shí)驗(yàn)結(jié)果:（1）成骨細(xì)胞祖細(xì)胞、破骨細(xì)胞前體分別與骨細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),染氟或染氟聯(lián)合PTH處理下層成骨細(xì)胞7天,基因表達(dá)水平分析的結(jié)果顯示:成骨細(xì)胞祖細(xì)胞與骨細(xì)胞共培養(yǎng)組中,骨細(xì)胞表達(dá)的SOST基因由染氟組輕度下降,到染氟聯(lián)合PTH組顯著下降,而DKK1基因的表達(dá)量正好與之相反,由染氟組輕度上升,到染氟聯(lián)合PTH組顯著上升。破骨細(xì)胞前體與骨細(xì)胞共培養(yǎng)組中,骨細(xì)胞表達(dá)的SOST基因由染氟組輕度下降,到染氟聯(lián)合PTH組顯著上升。而DKK1基因顯著下降。另一方面,成骨細(xì)胞祖細(xì)胞與骨細(xì)胞共培養(yǎng)組中,骨細(xì)胞中RANKL/OPG的比值在單獨(dú)染氟或染氟聯(lián)合PTH處理?xiàng)l件下均顯著下降。破骨細(xì)胞前體與骨細(xì)胞共培養(yǎng)組中,骨細(xì)胞中RANKL/OPG的比值由染氟組輕度上升,到染氟聯(lián)合PTH組顯著上升。（2）利用氟處理下層骨細(xì)胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation轉(zhuǎn)染質(zhì)粒激活骨細(xì)胞中SOST蛋白表達(dá)48 h,上層成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的迪夫染色結(jié)果顯示:Transwell小室上層的成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的個(gè)數(shù),在氟處理骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞混合培養(yǎng)組最低。其余各陽性激活SOST組,包括染氟的骨細(xì)胞或骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞前體混合培養(yǎng)組,成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量也呈下降趨勢(shì)。（3）將成骨細(xì)胞種植在Transwell小室上層,骨細(xì)胞或骨細(xì)胞破骨細(xì)胞前體混合培養(yǎng)在下層,染氟或染氟聯(lián)合PTH處理下層骨細(xì)胞7天或28天,上層成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶、茜素紅染色結(jié)果顯示:單獨(dú)氟化物處理,刺激骨細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和成熟;而氟聯(lián)合PTH處理,顯著降低了成骨細(xì)胞的ALP活性,但刺激骨細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞成熟。骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞前體混合培養(yǎng),單獨(dú)染氟或染氟聯(lián)合PTH處理下層骨細(xì)胞,上層成骨細(xì)胞分化趨勢(shì)不明顯。（4）將成骨細(xì)胞種植在Transwell小室上層,骨細(xì)胞種植在下層,染氟或染氟聯(lián)合PTH處理下層骨細(xì)胞7天和28天,下層骨細(xì)胞在蛋白表達(dá)水平分析的結(jié)果顯示:單獨(dú)染氟處理7天和28天,均顯著促進(jìn)骨細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)的以及Smad3蛋白的磷酸化,均抑制了骨細(xì)胞標(biāo)志物SOST蛋白的表達(dá)。單獨(dú)染氟或染氟聯(lián)合PTH處理7天,不同程度促進(jìn)骨細(xì)胞內(nèi)Wnt10b和DKK1蛋白的表達(dá)。對(duì)比之下,單獨(dú)染氟或染氟聯(lián)合PTH處理28天,對(duì)骨細(xì)胞DKK1蛋白的表達(dá)影響不大。單獨(dú)染氟28天,骨細(xì)胞中Wnt10b蛋白的表達(dá)量下降,而染氟聯(lián)合PTH作用進(jìn)一步抑制了Wnt10b蛋白的表達(dá)。（5）染氟和染氟聯(lián)合PTH處理下層骨細(xì)胞,并用50 nM SOST siRNA技術(shù)降低骨細(xì)胞中SOST蛋白表達(dá)48 h,基因表達(dá)水平分析的結(jié)果顯示:Transwell小室下層骨細(xì)胞SOST表達(dá)干擾成功,表現(xiàn)為各處理組骨細(xì)胞的SOST基因水平明顯下降。單獨(dú)氟化物處理,以及氟聯(lián)合PTH處理骨細(xì)胞內(nèi)DKK1基因的表達(dá)量上升,也不同程度促進(jìn)RANKL和OPG基因的表達(dá)。與空白對(duì)照組比較,Tranwell上層成骨細(xì)胞在單獨(dú)染氟處理組成骨細(xì)胞的標(biāo)志物Runx2基因成輕度下降趨勢(shì),而成骨細(xì)胞中Smad3和Wnt10b基因的表達(dá)量上升,并且β-catenin基因的表達(dá)增加較為顯著。低劑量氟聯(lián)合PTH處理骨細(xì)胞,成骨細(xì)胞內(nèi)成骨標(biāo)志物ALP和Runx2基因的表達(dá)量顯著增加,同時(shí)成骨細(xì)胞中的Smad3、wnt10b基因的表達(dá)量也是升高的。結(jié)論:本研究表明氟雖然不能直接刺激成骨細(xì)胞內(nèi)Wnt10b/β-catenin以及Runx2的蛋白表達(dá),但可以介導(dǎo)骨細(xì)胞內(nèi)SOST和Wnt10b蛋白來發(fā)揮作用。SOST在氟化物影響骨細(xì)胞調(diào)控成骨細(xì)胞分化方面扮演著重要角色,其中Smad3蛋白磷酸化、Wnt10b/β-catenin等因子參與了氟對(duì)骨細(xì)胞調(diào)控成骨細(xì)胞分化的機(jī)制。PTH不僅影響SOST,而且可以調(diào)節(jié)骨細(xì)胞內(nèi)其他因子來發(fā)揮刺激成骨的作用。
陳慶真[6]（2020）在《補(bǔ)腎中藥調(diào)控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的研究》文中研究表明目的:1.亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序（BSP）技術(shù)檢測(cè)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血液中ER α甲基化情況,探索基因甲基化對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化影響及其分子機(jī)制;2.探索ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化影響;3.探索補(bǔ)腎中藥有效成分牛膝甾酮對(duì)ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響及其對(duì)成骨細(xì)胞作用機(jī)制。方法:1.ER α基因甲基化對(duì)骨質(zhì)疏松的影響收集2017年6月份～2018年12月份研究對(duì)象血液樣本43例,包括14例女性健康人群血液樣本,14例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松人群和15例絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松人群血液樣本,BSP測(cè)序檢測(cè)患者ESR1（雌激素受體alpha,ER alpha）甲基化頻率,RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證ESR1 mRNA表達(dá)水平。ELISA檢測(cè)患者血清中雌二醇和ESR1含量變化。2.體外驗(yàn)證ER α DNA甲基化對(duì)成骨分化影響體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3E1-colon24（MC3T3E1-24）,設(shè)計(jì)合成特異性DNMT1 siRNA干預(yù)成骨細(xì)胞DNMT1表達(dá)和DNA甲基化,RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)基因ER α,p-ER α,成骨分化指標(biāo)OPG和RANKL,驗(yàn)證ESR1基因甲基化對(duì)成骨細(xì)胞分化影響,茜素紅染色和ALP活性檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證ESR1基因甲基化對(duì)成骨細(xì)胞成熟影響,MTT技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞活性情況,驗(yàn)證ESR1基因甲基化對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響。3.ER α調(diào)節(jié)AMPK α和Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞活性為驗(yàn)證ER α對(duì)AMPK α的調(diào)節(jié)作用,運(yùn)用在線網(wǎng)站PROMO和GPMiner預(yù)測(cè)ER α作為轉(zhuǎn)錄因子在AMPK α基因的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步驗(yàn)證ER α對(duì)成骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制,構(gòu)建合成ESR1 shRNA和過表達(dá)慢病毒載體,無處理的和陰性慢病毒載體干預(yù)的MC3T3E1-24細(xì)胞作為對(duì)照組,RT-qPCR 和 Western blot 技術(shù)檢測(cè)ER α,AMPK α 1/2,p-AMPK α 1/2,檢測(cè)Wnt/β-catenin 通路重要分子 frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin,phspho-β-catenin表達(dá)變化,檢測(cè)成骨分化指標(biāo)OPG,以及ALP表達(dá)變化,ALP活性檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證ESR1基因表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞成熟影響,MTT技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞活性情況。4.AMPK α介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞活性上一步驗(yàn)證了 ER α調(diào)節(jié)AMPK α表達(dá)和活化影響成骨細(xì)胞活性,為進(jìn)一步驗(yàn)證AMPK α對(duì)成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)作用和機(jī)制,本研究用AMPK激動(dòng)劑AICAR處理體外小鼠成骨細(xì)胞,無藥物處理的MC3T3E1-24細(xì)胞作為對(duì)照組,RT-qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè) AMPK α,p-AMPK α,檢測(cè) Wnt/β-catenin 通路重要分子 frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin,phspho-β-catenin表達(dá)變化,檢測(cè)成骨分化指標(biāo)OPG以及ALP表達(dá)變化,茜素紅染色和ALP活性檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證ESR1基因表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞成熟影響,MTT技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞活性情況。5.牛膝甾酮介導(dǎo)ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響成骨細(xì)胞活性牛膝甾酮（10 ng/μL）干預(yù) MC3T3E1-24 細(xì)胞 48h,RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè) ER α、AMPKα,frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin轉(zhuǎn)錄水平變化,探索牛膝甾酮對(duì)ER-AMPK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響;RT-qPCR檢測(cè)成骨分化指標(biāo)OPG以及ALP表達(dá)變化,茜素紅染色和ALP活性檢測(cè)觀察成骨細(xì)胞鈣化情況,驗(yàn)證牛膝甾酮對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用,MTT技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞活性情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡情況,驗(yàn)證牛膝甾酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響。結(jié)果:1.ERα DNA甲基化誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松臨床血液樣本進(jìn)行BSP測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血液中ER α甲基化頻率較健康人（P<0.01）和絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松人群（P<0.01）高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外,RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與健康人（P<0.05）和絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松人群（P<0.01）相比較,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血液樣本中ERα轉(zhuǎn)錄水平顯著增高,然而ELISA檢測(cè)血清樣本中雌二醇（E2）（P<0.01）和ER α（P<0.05）表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.抑制體外成骨細(xì)胞DNA甲基化水平可促進(jìn)成骨分化絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與ERα DNA高甲基化水平相關(guān),其可能通過抑制ER α蛋白表達(dá)導(dǎo)致患者骨量減少。體外培養(yǎng)MC3T3E1-24細(xì)胞,并通過DNMT1 siRNA干預(yù)細(xì)胞DNA甲基化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制DNA甲基化水平,可促進(jìn)OPG和ALP的mRNA和蛋白表達(dá),抑制RANKL表達(dá)。茜素紅染色結(jié)果表明,與對(duì)照組相比較,DNMT1 siRNA干預(yù)組細(xì)胞鈣化水平顯著較高（P<0.05）。MTT結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組和陰性siRNA干預(yù)組相比較,DNMT1 siRNA干預(yù)組細(xì)胞活性較強(qiáng)（P<0.05）。3.ER α磷酸化介導(dǎo)AMPK和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖1)ER α與AMPK轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)ER α作為轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。PROMO和GPMiner在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),ER α在編碼AMPK α的基因PRKAA2的啟動(dòng)區(qū)域有結(jié)合位點(diǎn)。2)ER α磷酸化對(duì)AMPK和Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響和成骨細(xì)胞影響。ERα shRNA慢病毒載體抑制MC3T3E1-24細(xì)胞中ER α轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)。另外,RT-qPCR和WB技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組和陰性慢病毒載體組比較,AMPK α和p-AMPK α水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Wnt/β-catenin信號(hào)通路中,frizzled,GSK 3β,LRP5,β-catenin表達(dá)降低;與此同時(shí),骨形成指標(biāo)OPG和ALP表達(dá)降低;ALP活性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示與對(duì)照組比較,ERα低表達(dá)組的成骨細(xì)胞鈣化水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,MTT結(jié)果展示成骨細(xì)胞活性也顯著降低。3)ERα過表達(dá)慢病毒載體促進(jìn)MC3T3E1-24細(xì)胞中ER α蛋白表達(dá)和磷酸化,RT-q PCR和WB技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組和陰性慢病毒載體組比較,AMPK α 1/2水平提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著增多,Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活;檢測(cè)成骨指標(biāo)發(fā)現(xiàn),OPG和ALP表達(dá)與對(duì)照組比較顯著增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ALP活性檢測(cè)和MTT檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明,ER α高表達(dá)組的成骨細(xì)胞鈣化和增殖水平顯著增高。4)AMPK對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響和成骨細(xì)胞影響。AICAR激活A(yù)MPK通路后,MC3T3E1細(xì)胞中AMPK轉(zhuǎn)錄表達(dá)提高,蛋白活化水平也增多,RT-qPCR和WB結(jié)果也表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路中frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin表達(dá)顯著增多,phspho-β-catenin表達(dá)降低;OPG和ALP表達(dá)也顯著增多;ALP活性檢測(cè)和MTT檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,AMPK過表達(dá)組成骨細(xì)胞鈣化和增殖水平增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.牛膝甾酮發(fā)揮促進(jìn)ER α磷酸化作用,激活A(yù)MPK和Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖牛膝甾酮孵育48h后,RT-qPCR和WB檢測(cè)MC3T3E1-24細(xì)胞中ER α-AMPK-Wnt/β-cat enin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),ER α,p-ER α,AMPK α,p-AMPK α,frizzl ed,GSK3 β,LRP5,β-catenin表達(dá)與無藥物處理組比較均顯著增多,表明ER α-AMP K-Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活,OPG和ALP表達(dá)也顯著增多,組間差異有意義,表明成骨細(xì)胞分化能力增強(qiáng),茜素紅染色和ALP活性檢測(cè)結(jié)果表明,牛膝甾酮促進(jìn)骨細(xì)胞鈣化水平,TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較,牛膝甾酮組細(xì)胞凋亡和增殖率均無顯著差異。結(jié)論:1.ER α基因高甲基化促進(jìn)骨質(zhì)疏松的發(fā)生;2.ERα低表達(dá)抑制OPG和ALP表達(dá),促進(jìn)RANKL表達(dá),成骨分化受到抑制,成骨細(xì)胞活性降低;3.ER α激活后促進(jìn)AMPK α活化,上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá),從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖;4.牛膝甾酮通過激活ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化發(fā)揮促進(jìn)骨形成作用。
張瑞雪[7]（2020）在《氟通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制ATDC5細(xì)胞增殖和分化》文中提出目的:氟是一種人體必需微量元素,適量氟能夠維持機(jī)體正常生理功能,過量氟則會(huì)引起氟中毒。流行病學(xué)調(diào)查顯示,高氟地區(qū)兒童骨齡延遲,身高、體重、胸圍均低于正常同齡兒童。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟通過抑制軟骨內(nèi)成骨過程損害長骨縱向生長。軟骨內(nèi)成骨是骨形成的主要方式,此過程受到全身激素、細(xì)胞因子和局部產(chǎn)生的信號(hào)因子共同作用。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一種廣泛存在于生物細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸激酶,是細(xì)胞生長、增殖、分化、存活和自噬的中心調(diào)控因子。然而,氟是否通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制軟骨內(nèi)成骨尚未見報(bào)道。為此,我們通過體外器官培養(yǎng)胚胎大鼠脛骨和體外培養(yǎng)源于畸胎瘤細(xì)胞的小鼠軟骨發(fā)生細(xì)胞ATDC5細(xì)胞模擬軟骨細(xì)胞分化,觀察氟是否通過調(diào)控PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞的增殖和分化。本研究為闡明氟抑制長骨生長的機(jī)制提供線索,為氟骨癥的防治提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:本研究選取胚胎第20天的胎鼠脛骨,采用左右配對(duì)的方法分為兩組,左側(cè)脛骨為對(duì)照組,右側(cè)脛骨為染氟組（10-4M NaF）,培養(yǎng)于含0.2%牛血清蛋白、0.05mg/ml Vc、1m Mβ-甘油磷酸鈉的α-MEM培養(yǎng)基中。7天后,脛骨經(jīng)固定、石蠟包埋并切片,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脛骨PCNA和p-S6的蛋白表達(dá),觀察氟對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和mTOR活性的影響。ATDC5細(xì)胞培養(yǎng)于含有5%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素和1?ITS的DMEM培養(yǎng)基中,分別予以染氟3、5、7、14和21天。采用CCK8方法檢測(cè)ATDC5細(xì)胞活力并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;阿利新藍(lán)染色檢測(cè)聚集蛋白多糖（Aggrecan）的合成及軟骨結(jié)節(jié)的形成情況;Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)軟骨細(xì)胞分化相關(guān)基因（Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X）和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因（PI3K、AKT、mTOR、S6K1、4EBP1、LC3II/I、Beclin1、P62）的mRNA和蛋白表達(dá),應(yīng)用m TOR激動(dòng)劑MHY1485和mTOR抑制劑Rapamycin,探討PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在氟致軟骨損傷中的作用。結(jié)果:1.氟對(duì)脛骨軟骨細(xì)胞增殖和m TOR活性的影響:染氟組脛骨中PCNA和p-S6陽性細(xì)胞率顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。2.氟對(duì)小鼠ATDC5細(xì)胞活力及細(xì)胞形態(tài)的影響:染氟濃度為10-3M時(shí),細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;對(duì)照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好,基本保持著原有的細(xì)胞結(jié)構(gòu);染氟組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)細(xì)胞碎片顆粒物增多,細(xì)胞生長緩慢,收縮變形,多偽足。3.氟對(duì)小鼠ATDC5細(xì)胞分化的影響:在ITS的作用下,ATDC5細(xì)胞快速增殖融合成單層,融合后的細(xì)胞形成軟骨結(jié)節(jié),軟骨結(jié)節(jié)形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間增加逐漸擴(kuò)大,軟骨結(jié)節(jié)數(shù)量逐漸增多;對(duì)照組細(xì)胞阿利新藍(lán)染色強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增強(qiáng),染氟組細(xì)胞染色強(qiáng)度低于對(duì)照組、軟骨結(jié)節(jié)數(shù)量少于對(duì)照組;與對(duì)照組比較,染氟組細(xì)胞Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X mRNA表達(dá)和Sox9、Col II蛋白表達(dá)均顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4.氟對(duì)軟骨細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響:染氟組細(xì)胞mTOR、S6K1和4EBP1 mRNA表達(dá)和PI3K、AKT、mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5.氟對(duì)ATDC5細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響:與對(duì)照組相比,染氟組細(xì)胞Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表達(dá)顯著增加,P62蛋表達(dá)白顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。6.mTOR激動(dòng)劑MHY1485上調(diào)氟抑制的p-mTOR、p-S6K1和p-4EBP1的表達(dá):染氟組細(xì)胞中mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組,mTOR激動(dòng)劑MHY1485組中細(xì)胞mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組。染氟+m TOR激動(dòng)劑MHY1485組細(xì)胞mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表達(dá)顯著高于染氟組,差異具均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組相比,染氟+mTOR激動(dòng)劑MHY1485組細(xì)胞中mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表達(dá)無明顯差異,mTOR抑制劑Rapamycin組細(xì)胞中mTOR,S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。7.氟通過抑制mTOR的磷酸化誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞自噬:與對(duì)照組比較,染氟組細(xì)胞中P62的蛋白表達(dá)顯著下調(diào),mTOR激動(dòng)劑MHY1485組細(xì)胞中P62的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。與染氟組比較,染氟+m TOR激動(dòng)劑MHY1485組細(xì)胞中P62的蛋白表達(dá)顯著上調(diào),差異具均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表達(dá)結(jié)果與P62的蛋白表達(dá)結(jié)果相反。與對(duì)照組比較,染氟+m TOR激動(dòng)劑MHY1485組細(xì)胞中P62,Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表達(dá)無顯著差異。mTOR抑制劑Rapamycin組細(xì)胞中P62蛋白表達(dá)顯著下調(diào),Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表達(dá)顯著上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。8.氟通過下調(diào)m TOR的磷酸化抑制ATDC5細(xì)胞分化:染氟組細(xì)胞中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組,mTOR激動(dòng)劑MHY1485組細(xì)胞中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表達(dá)顯著增加。染氟+mTOR激動(dòng)劑MHY1485組細(xì)胞Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表達(dá)顯著高于染氟組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組比較,染氟+mTOR激動(dòng)劑MHY1485激動(dòng)劑組細(xì)胞分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)均無顯著差異。mTOR抑制劑Rapamycin組中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表達(dá)顯著降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,Sox9和Col II的蛋白表達(dá)結(jié)果與mRNA表達(dá)結(jié)果一致。結(jié)論:1.氟下調(diào)PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路,抑制其下游因子S6K1和4EBP1的磷酸化,進(jìn)而抑制軟骨細(xì)胞增殖和分化。2.氟下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬的發(fā)生。
赫佳[8]（2019）在《EPCs和BMSCs促進(jìn)骨再生修復(fù)的機(jī)制研究》文中研究說明[目 的]探討內(nèi)皮祖細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨再生修復(fù)的作用及其分子機(jī)制。[方法]1、從大鼠股骨和脛骨采集骨髓,從骨髓中分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）;體外培養(yǎng)鏡下觀察兩種細(xì)胞形態(tài);采用成脂分化和成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)BMSCs分化。油紅O染色和茜素紅S染色檢測(cè)BMSCs的分化能力,流式細(xì)胞儀和免疫熒光法分別檢測(cè)BMSCs與EPCs表面分子標(biāo)記;體外培養(yǎng)成管試驗(yàn)檢測(cè)EPC細(xì)胞血管形成能力;RT-qPCR檢測(cè)EPCs標(biāo)記基因表達(dá);Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。2、體外構(gòu)建EPC+BMSC共培養(yǎng)體系;RT-qPCR和Western blot檢測(cè)骨生成相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平;茜素紅染色檢測(cè)BMSCs細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的形成;CCK-8檢測(cè)BMSCs增殖活力;ALP活性檢測(cè)試劑盒定量ALP活性;免疫組化檢測(cè)ALP表達(dá)和分布;掃描電鏡（SEM）觀察BMSCs骨生成。3、以方法2中的共培養(yǎng)體系為對(duì)象,CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPC增殖活力;免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白在EPC的表達(dá);RT-qPCR和Westernblot分析內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá)、Transwell檢測(cè)EPC細(xì)胞的遷移能力;體外培養(yǎng)檢測(cè)EPC血管形成能力。4、制備EPC和BMSC單培條件培養(yǎng)基上清（CM-S）,用EPC-CM-S處理BMSC;用BMSC-CM-S處理EPC;用BMSC-CM-S處理后的EPC來源的EPC-CMS再處理BMSC;ELISA檢測(cè)各單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞和共培養(yǎng)體系中BMP2與VEGF的分泌水平;RT-qPCR和Western blot檢測(cè)骨生成相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平;免疫組化檢測(cè)BMSC細(xì)爬片ALP水平;免疫熒光檢測(cè)測(cè)BMSC細(xì)胞中成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix（Osx）表達(dá)。5、培養(yǎng)并分離EPC-外泌體,透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài),Western blotting檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物表達(dá);將EPC-外泌體與BMSCs細(xì)胞共培養(yǎng),探究EPC外泌體體來源miR-212-3p通過Smad-7對(duì)BMSCs成骨分化的影響。CCK-8和Transwell分別檢測(cè)BMSC細(xì)胞增殖活力和遷移能力;ALP試劑盒檢測(cè)ALP活性,RT-qPCR和Westernblot分別檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因的表達(dá);茜紅素染色檢測(cè)BMSC鈣化結(jié)節(jié)形成;雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-212-3p與Smad-7的靶向關(guān)系。6、lncRNA-seq芯片檢測(cè)共培養(yǎng)體系EPCs細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA;CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPC細(xì)胞的增殖活力;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs細(xì)胞的遷移能力;RT-qPCR和Western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因和蛋白的表達(dá)水平;體外成管實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPC細(xì)胞血管形成能力。[結(jié)果]1、從大鼠骨髓中成功分離到EPCs和BMSCs的細(xì)胞。與單獨(dú)培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞相比,EPCs+BMSCs共培養(yǎng)體系顯著促進(jìn)BMSCs細(xì)胞的增殖活力、ALP活性、成骨相關(guān)基因表達(dá)水平、鈣結(jié)節(jié)形成。與單獨(dú)培養(yǎng)EPCs細(xì)胞相比,EPCs+BMSCs共培養(yǎng)體系顯著促進(jìn)EPCs細(xì)胞的增殖活力、遷移能力、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平、體外成管能力。2、單獨(dú)培養(yǎng)的EPCs不分泌VEGF-A和BMP-2,單獨(dú)培養(yǎng)的BMSCs不分泌BMP-2,但分泌VEGF-A,共培養(yǎng)體系中的VEGF-A和BMP2均具高分泌。EPCs條件上清不能啟動(dòng)和促進(jìn)BMSCs的成骨分化。BMSCs激活的EPCs細(xì)胞通過分泌BMP-2促進(jìn)BMSCs的成骨分化。3、EPCs外泌體處理后的BMSCs細(xì)胞中miR-212-3p異常高表達(dá),敲降miR-212-3p顯著降低BMSCs的成骨分化水平;EPCs外泌體miR-212-3p通過下調(diào)SMAD7促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖、遷移、和成骨分化。4、lncRNAMALAT1、lncRNAMEG3、lncRNA-ATB、lncRNAHULC 在共培養(yǎng)體系的EPCs細(xì)胞中高表達(dá),且lncRNAMALAT1的上調(diào)水平最高。敲降LncRNAMALAT1顯著將低共培養(yǎng)體系EPCs細(xì)胞細(xì)胞的增殖、遷移、內(nèi)皮細(xì)胞分化和成管能力。本研究表明,共培養(yǎng)體系顯著促進(jìn)了 EPCs細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-MALAT1的表達(dá)上調(diào),并通過降低miR-124-3p對(duì)SOX7的負(fù)調(diào)控作用而促進(jìn)EPCs細(xì)胞的增殖、遷移、內(nèi)皮細(xì)胞分化和血管形成。[結(jié)論]1、EPC與BMSC共培養(yǎng)能夠顯著促進(jìn)骨再生過程中的成骨分化和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。2、共培養(yǎng)體系中BMSC細(xì)胞分泌VEGF-A刺激和激活EPC細(xì)胞,激活后的EPC細(xì)胞分泌MBP2促進(jìn)BMSC細(xì)胞的成骨分化;這是一種“BMSC-EPC-BMSC循環(huán)反饋”的調(diào)控模式。3、共培養(yǎng)體系中EPC與BMEC的交互作用或互相調(diào)控,主要通過兩種方式:直接分泌關(guān)鍵細(xì)胞因子調(diào)控成骨或血管生成;一種細(xì)胞以胞外分泌囊泡的方式轉(zhuǎn)移核酸類或蛋白類調(diào)控因子而影響另一種細(xì)胞的分化或生物學(xué)行為。4、miR-212-3p、Smad-7、LncRNAMALAT1、miR-124-3p 和 SOX7 可能是骨再生和血管形成過程中的潛在標(biāo)志分子。
孫靜[9]（2019）在《蛇床子素促成骨作用及代謝多態(tài)性研究》文中研究指明目的:目前臨床應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松藥物帶來治療作用的同時(shí)副作用不容忽視,有效低毒的新藥研發(fā)仍在進(jìn)行中。文獻(xiàn)報(bào)道傳統(tǒng)中草藥蛇床子及其活性成分蛇床子素具有用于骨質(zhì)疏松的治療作用,本論文通過研究蛇床子素與骨調(diào)節(jié)靶點(diǎn)的結(jié)合情況,對(duì)成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的機(jī)制以及代謝酶多態(tài)性相關(guān)作用的研究,明確蛇床子素作為新型治療骨質(zhì)疏松藥物的特點(diǎn)及可能性。方法:1.計(jì)算機(jī)模擬蛇床子素和多靶點(diǎn)骨調(diào)節(jié)信號(hào)因子的分子對(duì)接。2.應(yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察蛇床子素對(duì)人成骨樣MG-63細(xì)胞增殖能力的影響。應(yīng)用磷酸苯二鈉實(shí)驗(yàn)法測(cè)定蛇床子素對(duì)人成骨樣MG-63細(xì)胞分化功能的影響。應(yīng)用DAPI染色法觀察蛇床子素對(duì)凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的人成骨樣MG-63細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用半定量RT-PCR和Western Blot技術(shù)觀察蛇床子素對(duì)人成骨樣MG-63細(xì)胞OPG、RANKL、Osterix表達(dá)的影響。測(cè)定蛇床子素對(duì)P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白時(shí)間表達(dá)的影響。3.應(yīng)用雌激素受體阻斷劑ICI 182780,MEK抑制劑PD 98059,PI3K抑制劑Wortmannin和Wnt抑制劑DKK-1檢測(cè)其對(duì)蛇床子素調(diào)節(jié)作用的阻斷。檢測(cè)阻斷劑對(duì)蛇床子素對(duì)OPG、RANKL和Osterix調(diào)節(jié)的阻斷。測(cè)定阻斷劑對(duì)蛇床子素P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白調(diào)節(jié)作用的阻斷。4.建立LC-MS/MS的CYP2C9經(jīng)典探針底物雙氯芬酸、CYP2D6經(jīng)典探針底物右美沙芬代謝物測(cè)定方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,測(cè)定蛇床子素對(duì)不同代謝酶基因型藥物代謝的影響。結(jié)果:1.對(duì)接結(jié)果表明,蛇床子素和骨代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的多個(gè)靶點(diǎn)具有不同程度的結(jié)合能力,從微觀機(jī)制展示了多靶標(biāo)作用的可能性。2.蛇床子素的促成骨作用主要表現(xiàn)為促分化,小劑量蛇床子素能夠促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞中OPG/RANKL的mRNA及蛋白比率,上調(diào)Osterix mRNA和蛋白的表達(dá),促使細(xì)胞內(nèi)P-ERK、P-AKT表達(dá)增多,細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin蛋白降低,細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白升高。3.ICI 182780、PD98059、Wortmannin和DKK-1均可部分阻斷蛇床子素的促增殖分化作用,部分阻斷蛇床子素對(duì)OPG、RANKL、Osterix的mRNA及蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。提示該四種信號(hào)通路在蛇床子素調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中均參與發(fā)揮作用。4.蛇床子素對(duì)3種CYP2C9、4種CYP2D6基因型藥物代謝酶的半數(shù)抑制濃度分別為:CYP2C9*1,91.51μM;CYP2C9*2,104.5μM;CYP2C9*3,120.4μM;CYP2D6*1,61.86μM;CYP2D6*2,74.09μM;CYP2D6*10,47.95μM;CYP2D6*39,56.99μM。結(jié)論:蛇床子素的促成骨作用涉及多靶點(diǎn)、多條信號(hào)通路,對(duì)常見存在多態(tài)性的代謝酶作用弱。由于骨質(zhì)疏松需要長期用藥,蛇床子素具有多靶點(diǎn)、相互作用少的特點(diǎn),和現(xiàn)有的抗骨質(zhì)疏松藥物相比,具有作為一個(gè)新型治療骨質(zhì)疏松藥物的良好前景。
陳欣瑋[10]（2019）在《乳鐵蛋白通過IGF-1信號(hào)通路促進(jìn)衰老成骨細(xì)胞增殖和分化》文中認(rèn)為目的:通過提取SD大鼠原代成骨細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至細(xì)胞衰老,探究乳鐵蛋白（Lactoferrin,LF）對(duì)于衰老成骨細(xì)胞的改善作用,及通過RNA干擾（RNA interfere,RNAi）探究胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factors-1,IGF-1）信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用。方法:（1）提取Sprague-Dawley（SD）大鼠原代成骨細(xì)胞,連續(xù)傳代培養(yǎng)至第10代,進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè),如MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性、pNPP法檢測(cè)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）法檢測(cè)骨代謝相關(guān)基因Igf-1,骨保護(hù)素（osteoprotegerin,Opg）,核因子-κb配體受體激活劑（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,Rankl）,骨鈣素（Bone gla protein,Bglap）,和衰老相關(guān)基因（p16,p21）表達(dá)情況,檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）水平和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的變化情況。（2）用乳鐵蛋白干預(yù)衰老成骨細(xì)胞,采用透射電鏡觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)、檢測(cè)細(xì)胞增殖活性、ALP活性、骨代謝相關(guān)基因以及衰老相關(guān)基因表達(dá)的變化,觀察氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的改變,探究乳鐵蛋白對(duì)衰老成骨細(xì)胞的影響。（3）構(gòu)建IGF-1 shRNA慢病毒載體,利用RNAi技術(shù)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)IGF-1的表達(dá),乳鐵蛋白干預(yù)轉(zhuǎn)染了IGF-1慢病毒載體的衰老成骨細(xì)胞,檢測(cè)上述指標(biāo)的改變,以及Western blot法檢測(cè)IGF-1及其下游信號(hào)通路的改變,以明確乳鐵蛋白在改善骨代謝過程中IGF-1信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮的作用。結(jié)果:（1）成功提取大鼠原代成骨細(xì)胞,培養(yǎng)至第10代,隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,細(xì)胞增殖活力、ALP活性、骨代謝相關(guān)基因（Igf-1,Opg,Rankl,Bglap）表達(dá)水平下降;衰老相關(guān)基因（p16,p21）表達(dá)水平上升;SOD的活力下降,MDA的含量增加,氧化應(yīng)激損傷加劇。（2）100μg/mL濃度干預(yù)3 d時(shí),乳鐵蛋白對(duì)衰老成骨細(xì)胞作用最佳,它可改善成骨細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu),減少次級(jí)溶酶體數(shù)量;增加成骨細(xì)胞增殖活力、ALP活性以及骨代謝相關(guān)基因表達(dá)水平;降低衰老相關(guān)基因表達(dá)水平;減輕氧化應(yīng)激損傷,提高SOD的活力,降低MDA的含量;（3）用IGF-1 shRNA慢病毒干預(yù)后,衰老成骨細(xì)胞的IGF-1表達(dá)下調(diào),乳鐵蛋白促進(jìn)其增殖的作用減輕,ALP活性下降,促進(jìn)骨代謝相關(guān)基因水平表達(dá)的作用減輕,氧化應(yīng)激損傷加劇,下游p-PI3K,p-Akt蛋白表達(dá)水平下降。結(jié)論:乳鐵蛋白可促進(jìn)衰老成骨細(xì)胞的增殖與分化,其作用可能與IGF-1/PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。
二、氟對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞增殖活力的影響（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、氟對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞增殖活力的影響（論文提綱范文）
（1）PSAT1對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用及機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符號(hào)說明 |
| 前言 |
| 一、骨組織工程技術(shù)是實(shí)現(xiàn)口腔骨組織再生的重要方法 |
| 二、口腔來源的牙周膜千細(xì)胞是口腔骨組織工程研宄的優(yōu)勢(shì)種子細(xì)胞 |
| 三、深入闡釋牙周膜干細(xì)胞成骨分化的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制有助于促進(jìn)其介導(dǎo)的骨再生 |
| 四、PSAT1可能對(duì)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化有調(diào)控作用 |
| 課題相關(guān)文獻(xiàn)回顧 |
| 一、現(xiàn)階段常用口腔骨綱修復(fù)攤 |
| 二、口腔雜織工觸 |
| 三、干細(xì)胞概述 |
| 四、口腔組織來海干細(xì)胞在口腔骨組織工程中的應(yīng)用 |
| 五、干細(xì)胞成骨分化調(diào)控基因及信號(hào)通路 |
| 六、PSAT1研宄現(xiàn)狀 |
| 第一部分 PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化調(diào)控基因的生物信息學(xué)分析 |
| 1.1背景 |
| 1.2 材料與方法 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第二部分 PSAT1對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境中PDLSCs增殖、遷移、分化能力的調(diào)控 |
| 2.1背景 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第三部分 PSAT1對(duì)PDLSCs介導(dǎo)的體內(nèi)骨組織再生的調(diào)控 |
| 3.1背景 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第四部分 PSAT1促進(jìn)PDLSCs成骨分化的分子機(jī)制研究 |
| 4.1背景 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.3 結(jié)果 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 小結(jié) |
| 第五部分 PDLSCs成骨分化過程中PSAT1的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子ATF4調(diào)控 |
| 5.1背景 |
| 5.2 材料與方法 |
| 5.3 結(jié)果 |
| 5.4 討論 |
| 5.5 小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文目錄 |
| 外文論文 |
| 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表 |
（2）原花青素減輕NaF所致小鼠MLO-Y4骨細(xì)胞損傷研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞的損傷研究 |
| 一、材料與方法 |
| (一) 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1. 細(xì)胞 |
| 2. 主要實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 3. 主要儀器設(shè)備 |
| 4. 主要試劑配制 |
| (二) 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng) |
| 2.NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞損傷模型的建立 |
| 3.倒置顯微鏡下觀察不同濃度NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞形態(tài)的影響 |
| 4.鈣黃綠素乙釀甲酯（Calcein-AM)染色法觀察不同濃度NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| 5.細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（CellCountingKit-8, CCK-8)法測(cè)定NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| 6.自嗤檢測(cè)試劑（Green detection reagent, CYTO-ID)染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NaF對(duì)骨細(xì)胞自噬作用 |
| 7.吖啶橙（Acridine Orange, AO)熒光染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NaF對(duì)骨細(xì)胞的酸性囊泡細(xì)胞器（acidic vesicle organelles，AVO)的作用 |
| 8.碘化丙啶（Propidiumlodide，PI)染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NaF對(duì)骨細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的作用 |
| 9.蛋白質(zhì)印跡（Western Blot)法測(cè)定NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞損傷在細(xì)胞自噬、増殖相關(guān)通路的影響 |
| 10. 統(tǒng)計(jì)方法 |
| 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| (一) 光學(xué)顯微鏡觀察不同濃度NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞形態(tài)的影響 |
| (二) Calcein-AM染色法熒光顯微鏡觀察不同濃度NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| (三) CCK-8法測(cè)定不同濃度NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| (四) 不同濃度NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞自噬作用的影響 |
| (五) 不同濃度NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞AVO數(shù)量的影響 |
| (六) 不同濃度NaF對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞增殖作用的影響 |
| (七) 不同濃度NaF對(duì)MO-Y4骨細(xì)胞自噬、增殖相關(guān)蛋白信號(hào)通路的影響 |
| 三、分析與討論 |
| 第二部分 原花青素對(duì)NaF所致MLO-Y4骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制 |
| 一、材料與方法 |
| (一) 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1. 細(xì)胞 |
| 2. 主要實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 3. 主要儀器設(shè)備 |
| 4. 主要試劑配制 |
| (二) 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1. 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2. CCK-8法測(cè)定不同濃度原花青素對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| 3. 倒置顯微鏡下觀察不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞形態(tài)的影響 |
| 4. Calcein-AM染色法觀察不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| 5. CCK-8法測(cè)定不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| 6. CYTO-ID染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞自噬的作用 |
| 7. PI染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的作用 |
| 8. Westem Blot法測(cè)定原花青素對(duì)NaF所致MLO-Y4骨細(xì)胞損傷在細(xì)胞自噬、增殖相關(guān)通路的影響 |
| 9. 統(tǒng)計(jì)方法 |
| 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| (一) 不同濃度原花青素對(duì)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| (二) 光學(xué)顯微鏡觀察不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞形態(tài)的影響 |
| (三) Calcein-AM染色法熒光顯微鏡觀察不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| (四) 不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞活性的影響 |
| (五) 不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞自噬作用的影響 |
| (六) 不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞增殖作用的影響 |
| (七) 不同濃度原花青素對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4骨細(xì)胞在自噬、增殖相關(guān)蛋白信號(hào)通路的影響 |
| 三、分析與討論 |
| 四、不足與展望 |
| 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 原花育素對(duì)地方性振中毒癥作用的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
（3）氟對(duì)胚胎大鼠脛骨生長、礦化及骺軟骨糖原水平影響的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略語 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 主要儀器及試劑 |
| 2.1.1 主要藥品試劑 |
| 2.1.2 主要儀器 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3.1 體外脛骨培養(yǎng)模型建立 |
| 2.3.2 大鼠脛骨總長度、礦化區(qū)長度測(cè)量 |
| 2.3.3 石蠟切片制作 |
| 2.3.4 甲苯胺藍(lán)染色 |
| 2.3.5 蘇木素-伊紅染色 |
| 2.3.6 番紅固綠染色 |
| 2.3.7 PAS染色 |
| 2.3.8 骨小梁參數(shù)測(cè)量 |
| 2.3.9 免疫組織化學(xué)染色 |
| 2.3.10 圖像采集 |
| 2.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 氟對(duì)體外培養(yǎng)大鼠脛骨縱向生長的影響 |
| 3.2 氟對(duì)體外培養(yǎng)大鼠脛骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響 |
| 3.3 氟對(duì)體外培養(yǎng)大鼠脛骨成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 |
| 3.4 氟對(duì)體外培養(yǎng)大鼠脛骨骺軟骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響 |
| 3.5 氟對(duì)體外培養(yǎng)大鼠脛骨骺軟骨糖原蓄積的影響 |
| 3.6 氟對(duì)體外培養(yǎng)大鼠脛骨骺軟骨糖原代謝酶的影響 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞能量代謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 社會(huì)實(shí)踐 |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
（4）氟通過PHD2/HIF1α信號(hào)通路抑制SW1353軟骨細(xì)胞糖酵解（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略語 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 主要儀器及試劑 |
| 2.1.1 主要藥品試劑 |
| 2.1.2 主要儀器 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 體外脛骨器官培養(yǎng) |
| 2.2.2 脛骨石蠟包埋及切片 |
| 2.2.3 免疫組織化學(xué)染色 |
| 2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.2.5 CCK8(Cell Counting kit-8)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 |
| 2.2.6 阿利新藍(lán)染色 |
| 2.2.7 ATP釋放檢測(cè) |
| 2.2.8 乳酸生成測(cè)定 |
| 2.2.9 葡萄糖消耗檢測(cè) |
| 2.2.10 細(xì)胞免疫熒光染色 |
| 2.2.11 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
| 2.2.12 蛋白提取 |
| 2.2.13 Western blot免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) |
| 2.2.14 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 氟抑制脛骨軟骨細(xì)胞 HIF1α 蛋白表達(dá) |
| 3.2 氟對(duì)SW1353 細(xì)胞活力的影響 |
| 3.3 氟對(duì)SW1353 細(xì)胞合成分解代謝及糖酵解的影響 |
| 3.3.1 氟對(duì)SW1353 細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)的影響 |
| 3.3.2 氟對(duì)SW1353 細(xì)胞合成分解代謝標(biāo)志因子表達(dá)的影響 |
| 3.3.3 氟對(duì)SW1353 細(xì)胞糖酵解的影響 |
| 3.4 氟對(duì)SW1353 細(xì)胞PHD2/HIF1α信號(hào)通路及糖酵解相關(guān)因子的影響 |
| 3.4.1 氟對(duì)SW1353 細(xì)胞PHD2/HIF1α信號(hào)通路的影響 |
| 3.4.2 氟抑制SW1353 細(xì)胞HIF1α蛋白的表達(dá) |
| 3.4.3 氟對(duì)SW1353 細(xì)胞糖酵解相關(guān)因子表達(dá)的影響 |
| 3.5 HIF1α激活劑CoCl_2通過抑制PHD2 上調(diào)HIF1α的表達(dá) |
| 3.5.1 CoCl_2對(duì)SW1353 細(xì)胞活性的影響 |
| 3.5.2 CoCl_2通過抑制PHD2 上調(diào)HIF1α的表達(dá) |
| 3.6 氟通過下調(diào)HIF1α表達(dá)抑制SW1353 細(xì)胞糖酵解 |
| 3.7 氟通過抑制HIF1α使 SW1353 細(xì)胞合成代謝降低,分解代謝增加 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 葡萄糖代謝在軟骨內(nèi)成骨中的作用 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 社會(huì)實(shí)踐 |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
（5）氟對(duì)骨細(xì)胞調(diào)控成骨作用的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文縮寫詞對(duì)照表 |
| 第一篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 第1章 代謝性骨病 |
| 1.1 代謝性骨病發(fā)病機(jī)制 |
| 1.2 代謝性骨病——骨質(zhì)疏松癥 |
| 1.3 代謝性骨病——侏儒癥 |
| 1.4 代謝性骨病——骨軟化癥 |
| 第2章 骨細(xì)胞在代謝性骨病中的作用 |
| 2.1 骨細(xì)胞 |
| 2.2 骨細(xì)胞參與骨的生理性重建 |
| 第3章 氟骨癥的機(jī)制研究進(jìn)展 |
| 3.1 氟元素與氟骨癥 |
| 3.2 氟骨癥發(fā)病機(jī)理 |
| 第4章 成骨細(xì)胞在氟骨癥中的作用 |
| 4.1 成骨細(xì)胞與骨形成 |
| 4.2 成骨細(xì)胞在氟骨癥發(fā)病機(jī)制中的作用 |
| 第5章 研究設(shè)想及意義 |
| 第二篇 實(shí)驗(yàn)研究 |
| 第1章 單獨(dú)培養(yǎng)骨組織細(xì)胞染氟實(shí)驗(yàn)研究 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 |
| 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.1.4 實(shí)驗(yàn)器械 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.2.1 骨組織細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定 |
| 1.2.1.1 小鼠骨髓成骨細(xì)胞祖細(xì)胞(BMSCS)的分離、培養(yǎng)及鑒定 |
| 1.2.1.2 IDG-SW3 細(xì)胞的礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)及檢測(cè) |
| 1.2.1.3 RAW264.7 細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及檢測(cè) |
| 1.2.1.4 MC3T3-E1 細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng) |
| 1.2.2 MTT法檢測(cè)骨組織細(xì)胞的增殖活性 |
| 1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨組織細(xì)胞的凋亡率 |
| 1.2.4 Western Blot法檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá) |
| 1.2.5 Western Blot法檢測(cè)骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá) |
| 1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1.3.1 骨組織中BMSCs、IDG-SW3和RAW264.7 細(xì)胞的鑒定 |
| 1.3.1.1 BMSCs細(xì)胞上表面抗原的測(cè)定 |
| 1.3.1.2 IDG-SW3 細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)成為骨細(xì)胞的測(cè)定 |
| 1.3.1.3 RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)RANKL誘導(dǎo)成為破骨細(xì)胞樣細(xì)胞的測(cè)定 |
| 1.3.2 染氟不同時(shí)間不同濃度對(duì)骨組織中細(xì)胞增殖活性的影響 |
| 1.3.3 染氟不同濃度對(duì)骨組織中細(xì)胞凋亡的影響 |
| 1.3.4 染氟成骨細(xì)胞內(nèi)特征性蛋白的表達(dá)變化 |
| 1.3.4.1 染氟成骨細(xì)胞內(nèi)Smad3/P-Smad3以及Wnt10b/β-catenin蛋白的表達(dá) |
| 1.3.4.2 染氟成骨細(xì)胞內(nèi)Runx2和PTH1R蛋白的表達(dá) |
| 1.3.5 染氟骨細(xì)胞內(nèi)調(diào)控成骨和破骨相關(guān)蛋白的表達(dá) |
| 1.3.5.1 染氟骨細(xì)胞內(nèi)SOST、 DKK1、以及Wnt10b/β-catenin蛋白的表達(dá) |
| 1.3.5.2 染氟骨細(xì)胞內(nèi)Smad3/P-Smad3 蛋白的表達(dá) |
| 1.4 小結(jié) |
| 第2章 共培養(yǎng)骨組織細(xì)胞染氟實(shí)驗(yàn)研究 |
| 2.1 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 |
| 2.1.2 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2.1.3 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 2.1.4 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)器材 |
| 2.2 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 PCR法檢測(cè)成骨細(xì)胞祖細(xì)胞、破骨細(xì)胞前體分別與骨細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中下層骨細(xì)胞特定基因的表達(dá)變化 |
| 2.2.2 激活骨細(xì)胞的SOST對(duì)成骨細(xì)胞祖細(xì)胞增殖的影響 |
| 2.2.3 成骨細(xì)胞與骨細(xì)胞共培養(yǎng)7 天 |
| 2.2.4 成骨細(xì)胞與骨細(xì)胞共培養(yǎng)28 天 |
| 2.2.5 干擾骨細(xì)胞中的SOST對(duì)成骨細(xì)胞活性的影響 |
| 2.2.5.1 篩選siRNA最適濃度 |
| 2.2.5.2 實(shí)驗(yàn)流程 |
| 2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.1 成骨細(xì)胞祖細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體對(duì)骨細(xì)胞內(nèi)成骨、破骨調(diào)控基因表達(dá)的影響 |
| 2.3.1.1 成骨細(xì)胞祖細(xì)胞對(duì)骨細(xì)胞內(nèi)成骨、破骨調(diào)控基因表達(dá)的影響 |
| 2.3.1.2 破骨細(xì)胞前體對(duì)骨細(xì)胞內(nèi)成骨、破骨調(diào)控基因表達(dá)的影響 |
| 2.3.2 激活骨細(xì)胞中SOST經(jīng)迪夫染色觀察成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖 |
| 2.3.3 染氟骨細(xì)胞對(duì)共培養(yǎng)系統(tǒng)中成骨細(xì)胞分化的影響 |
| 2.3.3.1 通過堿性磷酸酶染色觀察Transwell小室上層成骨細(xì)胞分化的情況 |
| 2.3.3.2 Transwell小室下層染氟7 天骨細(xì)胞內(nèi)調(diào)控成骨相關(guān)信號(hào)通路因子的變化 |
| 2.3.4 染氟骨細(xì)胞對(duì)共培養(yǎng)系統(tǒng)中成骨細(xì)胞礦化成熟的影響 |
| 2.3.4.1 通過茜素紅染色觀察Transwell小室上層成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的情況 |
| 2.3.4.2 Transwell小室下層染氟28 天骨細(xì)胞內(nèi)調(diào)控成骨相關(guān)信號(hào)通路因子的變化 |
| 2.3.5 干擾骨細(xì)胞表達(dá)SOST對(duì)骨細(xì)胞內(nèi)調(diào)控成骨、破骨相關(guān)因子的影響 |
| 2.3.5.1 siRNA最適濃度 |
| 2.3.5.2 干擾染氟骨細(xì)胞中SOST的表達(dá)對(duì)共培養(yǎng)系統(tǒng)中骨細(xì)胞內(nèi)調(diào)控成骨、破骨基因表達(dá)的影響 |
| 2.3.5.3 干擾染氟骨細(xì)胞中SOST的表達(dá)對(duì)共培養(yǎng)系統(tǒng)中成骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子表達(dá)的影響 |
| 2.4 小結(jié) |
| 第三篇 討論與結(jié)論 |
| 第四篇 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間取得的科研成果 |
| 致謝 |
（6）補(bǔ)腎中藥調(diào)控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文獻(xiàn)研究 |
| 1 中醫(yī)學(xué)關(guān)于骨質(zhì)疏松癥病因病機(jī)的認(rèn)識(shí) |
| 1.1 中醫(yī)學(xué)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的認(rèn)識(shí) |
| 1.2 骨質(zhì)疏松的病因病機(jī) |
| 2 中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥的現(xiàn)狀 |
| 2.1 常用的補(bǔ)腎類方劑 |
| 2.2 單味補(bǔ)腎中藥及其活性成分與骨質(zhì)疏松研究進(jìn)展 |
| 2.3 補(bǔ)腎中藥牛膝及牛膝單體與PMOP研究進(jìn)展 |
| 3 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OP、PMOP的認(rèn)識(shí) |
| 3.1 OP和PMOP流行病學(xué)研究進(jìn)展 |
| 3.2 雌激素和雌激素受體與PMOP研究進(jìn)展 |
| 3.3 AMPK信號(hào)通路與PMOP的研究進(jìn)展 |
| 3.4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路與PMOP的研究進(jìn)展 |
| 第二章 臨床與實(shí)驗(yàn)研究部分 |
| 1 血清中ER α甲基化檢測(cè)對(duì)PMOP臨床研究意義 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 2 DNA甲基化對(duì)體外成骨細(xì)胞增殖和成熟影響 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 3 ERα調(diào)控AMPK α活化對(duì)成骨細(xì)胞分化影響 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 4 ERα調(diào)控Wnt-β-catenin信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞分化影響 |
| 4.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.3 結(jié)果 |
| 4.4 討論 |
| 5 牛膝甾酮調(diào)控ERα -AMPKα-Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響 |
| 5.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 5.4 討論 |
| 第三章 結(jié)語 |
| 1 總結(jié) |
| 2 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 3 不足 |
| 4 展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 在校期間發(fā)表論文 |
| 致謝 |
| 統(tǒng)計(jì)學(xué)審核證明 |
| 詳細(xì)摘要 |
（7）氟通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制ATDC5細(xì)胞增殖和分化（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略語 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 主要試劑及儀器 |
| 2.1.1 主要藥品試劑 |
| 2.1.2 主要儀器 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 脛骨器官培養(yǎng) |
| 2.2.2 脛骨石蠟包埋及切片 |
| 2.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá) |
| 2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.2.5 細(xì)胞活力測(cè)定 |
| 2.2.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 |
| 2.2.7 ATDC5細(xì)胞分化及處理 |
| 2.2.8 阿利新藍(lán)染色 |
| 2.2.9 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) |
| 2.2.10 蛋白提取、蛋白定量和Western blot免疫印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) |
| 2.2.11 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 氟抑制脛骨軟骨細(xì)胞增殖和mTOR活性 |
| 3.1.1 氟對(duì)脛骨軟骨細(xì)胞增殖的影響 |
| 3.1.2 氟對(duì)脛骨軟骨細(xì)胞mTOR活性的影響 |
| 3.2 氟對(duì)小鼠ATDC5細(xì)胞活力及細(xì)胞形態(tài)影響 |
| 3.2.1 氟對(duì)ATDC5細(xì)胞活力的影響 |
| 3.2.2 氟對(duì)ATDC5細(xì)胞形態(tài)的影響 |
| 3.3 氟對(duì)小鼠ATDC5細(xì)胞分化的影響 |
| 3.3.1 ITS誘導(dǎo)ATDC5 細(xì)胞分化 |
| 3.3.2 氟對(duì)ATDC5細(xì)胞分化過程中蛋白多糖合成的影響 |
| 3.3.3 氟對(duì)ATDC5細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響 |
| 3.4 氟對(duì)小鼠ATDC5 細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響 |
| 3.4.1 氟對(duì)ATDC5 細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路以及下游因子表達(dá)的影響 |
| 3.4.2 氟對(duì)ATDC5細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響 |
| 3.5 mTOR激動(dòng)劑MHY1485 上調(diào)氟抑制的p-mTOR,p-S6K1和p-4EBP1 的表達(dá) |
| 3.6 氟通過抑制mTOR的磷酸化誘導(dǎo)ATDC5 細(xì)胞自噬 |
| 3.7 氟通過下調(diào)mTOR的磷酸化抑制ATDC5 細(xì)胞分化 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 實(shí)踐報(bào)告 |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
（8）EPCs和BMSCs促進(jìn)骨再生修復(fù)的機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 實(shí)驗(yàn)一 BMSC與EPC的分離、鑒定及BMSC-EPC共培養(yǎng)對(duì)成骨和血管生成的作用研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 小結(jié)與討論 |
| 實(shí)驗(yàn)二 共培養(yǎng)體系中成骨的作用的啟動(dòng)機(jī)制研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 小結(jié)與討論 |
| 實(shí)驗(yàn)三 EPC外泌體通過miR-212-3p下調(diào)BMSC細(xì)胞中Smad-7表達(dá)促進(jìn)BMSC的成骨分化 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 小結(jié)與討論 |
| 實(shí)驗(yàn)四 共培養(yǎng)體系EPC細(xì)胞中LncRNA MALAT1上調(diào)通過miR-124-3p/SOX7分子軸促進(jìn)EPC細(xì)胞增殖、遷移、內(nèi)細(xì)胞分化和血管生成 |
| 1 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 小結(jié)與討論 |
| 討論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 BMSC在骨組織工程成骨作用中的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果 |
| 致謝 |
（9）蛇床子素促成骨作用及代謝多態(tài)性研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符號(hào)說明 |
| 前言 |
| 研究現(xiàn)狀、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、蛇床子素與骨調(diào)節(jié)靶點(diǎn)相互作用的分子模擬研究 |
| 1.1 對(duì)象和方法 |
| 1.1.1 分子對(duì)接 |
| 1.1.2 治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫 |
| 1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.2 結(jié)果及討論 |
| 1.3 小結(jié) |
| 二、蛇床子素對(duì)人成骨樣MG-63 細(xì)胞的作用 |
| 2.1 對(duì)象和方法 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑制備 |
| 2.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.1.4 細(xì)胞體外增殖能力的測(cè)定 |
| 2.1.5 蛇床子素對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性影響的測(cè)定 |
| 2.1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 |
| 2.1.7 RT-PCR |
| 2.1.8 免疫印跡細(xì)胞實(shí)驗(yàn) |
| 2.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.2.1 蛇床子素對(duì)MG-63 細(xì)胞增殖能力的影響 |
| 2.2.2 蛇床子素對(duì)MG-63 細(xì)胞分化能力的影響 |
| 2.2.3 蛇床子素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 |
| 2.2.4 蛇床子素對(duì)OPG,RANKL,Osterix表達(dá)的影響 |
| 2.2.5 蛇床子素對(duì)P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) |
| 2.3 討論 |
| 2.4 小結(jié) |
| 三、阻斷劑對(duì)蛇床子素調(diào)節(jié)作用的阻斷 |
| 3.1 對(duì)象和方法 |
| 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑的配制 |
| 3.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 3.1.4 細(xì)胞體外增殖能力的測(cè)定 |
| 3.1.5 堿性磷酸酶活性的測(cè)定 |
| 3.1.6 RT-PCR |
| 3.1.7 免疫印跡細(xì)胞實(shí)驗(yàn) |
| 3.1.8 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.2.1 阻斷劑對(duì)蛇床子素增殖分化作用的阻斷 |
| 3.2.2 阻斷劑對(duì)蛇床子素調(diào)節(jié)OPG,RANKL,Osterix表達(dá)的阻斷 |
| 3.2.3 阻斷劑對(duì)蛇床子素調(diào)節(jié)的信號(hào)蛋白表達(dá)的阻斷 |
| 3.3 討論 |
| 3.4 小結(jié) |
| 四、蛇床子素對(duì)3種CYP2C9 基因型及4種CYP2D6 基因型藥物代謝的影響 |
| 前言 |
| 4.1 對(duì)象和方法 |
| 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 4.1.3 樣品配制 |
| 4.1.4 探針底物的LC-MS/MS方法測(cè)定 |
| 4.1.5 酶反應(yīng)研究 |
| 4.2 結(jié)果 |
| 4.2.1 探針?biāo)幬锏腖C-MS/MS方法測(cè)定及驗(yàn)證 |
| 4.2.2 酶反應(yīng)條件確定 |
| 4.2.3 代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線 |
| 4.2.4 蛇床子素對(duì)底物酶代謝的影響 |
| 4.3 討論 |
| 4.4 小結(jié) |
| 總結(jié)和展望 |
| 論文創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 發(fā)表論文和參加科研情況說明 |
| 綜述 蛇床子素藥理作用研究進(jìn)展 |
| 綜述參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
（10）乳鐵蛋白通過IGF-1信號(hào)通路促進(jìn)衰老成骨細(xì)胞增殖和分化（論文提綱范文）
| 中英文縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 乳鐵蛋白對(duì)衰老成骨細(xì)胞增殖和分化的影響 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.結(jié)果 |
| 3.1 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 |
| 3.2 不同代數(shù)成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的比較 |
| 3.3 乳鐵蛋白對(duì)第10代成骨細(xì)胞增殖和分化的影響 |
| 4.討論 |
| 第二部分 乳鐵蛋白對(duì)衰老成骨細(xì)胞增殖和分化影響的機(jī)制研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.結(jié)果 |
| 3.1 慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) |
| 3.2 乳鐵蛋白對(duì)IGF-1基因沉默后第10代成骨細(xì)胞增殖和分化影響的機(jī)制研究 |
| 4.討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 課題綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文 |
四、氟對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞增殖活力的影響（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]PSAT1對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用及機(jī)制研究[D]. 賈凌璐. 山東大學(xué), 2021(12)
- [2]原花青素減輕NaF所致小鼠MLO-Y4骨細(xì)胞損傷研究[D]. 俞超楠. 浙江中醫(yī)藥大學(xué), 2021(02)
- [3]氟對(duì)胚胎大鼠脛骨生長、礦化及骺軟骨糖原水平影響的研究[D]. 喬婷婷. 中國醫(yī)科大學(xué), 2021(02)
- [4]氟通過PHD2/HIF1α信號(hào)通路抑制SW1353軟骨細(xì)胞糖酵解[D]. 馬瑞. 中國醫(yī)科大學(xué), 2021(02)
- [5]氟對(duì)骨細(xì)胞調(diào)控成骨作用的研究[D]. 蔣寧寧. 吉林大學(xué), 2020(08)
- [6]補(bǔ)腎中藥調(diào)控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的研究[D]. 陳慶真. 廣州中醫(yī)藥大學(xué), 2020(06)
- [7]氟通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制ATDC5細(xì)胞增殖和分化[D]. 張瑞雪. 中國醫(yī)科大學(xué), 2020(01)
- [8]EPCs和BMSCs促進(jìn)骨再生修復(fù)的機(jī)制研究[D]. 赫佳. 昆明醫(yī)科大學(xué), 2019
- [9]蛇床子素促成骨作用及代謝多態(tài)性研究[D]. 孫靜. 天津醫(yī)科大學(xué), 2019(02)
- [10]乳鐵蛋白通過IGF-1信號(hào)通路促進(jìn)衰老成骨細(xì)胞增殖和分化[D]. 陳欣瑋. 福建醫(yī)科大學(xué), 2019(07)
標(biāo)簽：細(xì)胞增殖論文; 細(xì)胞分化論文; 基因合成論文; 信號(hào)通路論文; ampk論文;