一、肉雞IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大腸桿菌中的表達(dá)（論文文獻(xiàn)綜述）
宋世斌[1]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表達(dá)及產(chǎn)物活性鑒定》文中研究表明干擾素（Interferon,IFN）是機(jī)體細(xì)胞受到病毒等生物誘導(dǎo)劑刺激而產(chǎn)生的一類(lèi)分泌型糖蛋白類(lèi)細(xì)胞因子,而白細(xì)胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一種具有促炎作用的細(xì)胞因子,由機(jī)體活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等產(chǎn)生,能誘導(dǎo)IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌,具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)Th1型細(xì)胞、NK細(xì)胞及CTL細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng),與臨床自身免疫性疾病及心血管系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)相關(guān)性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生蟲(chóng)和細(xì)菌感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能。因此,本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相關(guān)研究,采用分子克隆和基因工程等技術(shù)獲得了3個(gè)基因,體外制備了藏獒犬3個(gè)基因的重組蛋白,驗(yàn)證了其生物學(xué)活性,并開(kāi)展了臨床相關(guān)實(shí)驗(yàn),豐富了犬細(xì)胞因子的知識(shí),對(duì)犬疾病的檢測(cè)和防控以及保障人類(lèi)健康有著重要的意義,在犬疾病的防控上有著廣闊的應(yīng)用前景。第一,從藏獒犬血液中分離淋巴細(xì)胞,利用脂多糖（LPS）與植物血凝素（PHA）聯(lián)合刺激淋巴細(xì)胞后提取RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全長(zhǎng)片段,將擴(kuò)增到的基因分別克隆到pGEM-T-easy載體,經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定,結(jié)果表明:所克隆的IFN-γ基因與GenBank上登載的犬核苷酸序列同源性達(dá)99.6%,開(kāi)放閱讀框?yàn)?01 bp,編碼166個(gè)氨基酸（AA）,N端23個(gè)AA為信號(hào)肽,成熟蛋白編碼143個(gè)AA,分子量為17.2 kD;克隆的IFN-α基因與GenBank上登載的犬核苷酸序列同源性達(dá)96.0%,其開(kāi)放閱讀框?yàn)?64 bp,N端23個(gè)AA為信號(hào)肽,成熟蛋白編碼164個(gè)AA,推測(cè)的分子量為19.0 kD;克隆的IL-18基因與GenBank上登載的犬核苷酸序列同源性達(dá)100%,其開(kāi)放閱讀框?yàn)?82 bp,編碼193個(gè)AA,N端36個(gè)AA為信號(hào)肽,成熟蛋白編碼157個(gè)AA,推測(cè)的分子量為18.1 kD。第二,根據(jù)克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因閱讀框序列,設(shè)計(jì)3個(gè)基因去掉信號(hào)肽的表達(dá)引物,克隆去信號(hào)肽后的目的片段,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)優(yōu)化誘導(dǎo)條件后,3個(gè)重組菌都能夠在溫度為37℃,濃度為0.5 mM IPTG的誘導(dǎo)條件下成功的表達(dá),3個(gè)重組菌在誘導(dǎo)后主要以包涵體形式表達(dá),其中pET-30a-IFN-γ重組蛋白在上清中也有一定量的表達(dá);經(jīng)SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表達(dá)的蛋白分別約為23 kD、25kD和24 kD,表達(dá)的蛋白大約占菌體蛋白30%35%。第三,用鎳瓊脂糖凝膠純化層析柱純化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重組蛋白,純度達(dá)到90%以上,通過(guò)梯度透析復(fù)性法復(fù)性蛋白。利用抑制病毒噬斑法測(cè)定重組藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物學(xué)活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用強(qiáng)于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的濃度范圍內(nèi)有作用,在高于或低于這個(gè)濃度范圍時(shí)發(fā)揮的效果一般;利用MTS法檢測(cè)重組藏獒犬IL-18重組蛋白的生物學(xué)活性,純化的重組IL-18具有誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖的能力,說(shuō)明表達(dá)的蛋白具有生物學(xué)活性。第四,通過(guò)對(duì)總數(shù)為128只犬病毒性傳染病病例（包括犬細(xì)小病毒病、犬冠狀病毒病及犬瘟熱3類(lèi)寵物常見(jiàn)?。┑腎FN治療組和對(duì)照治療組的比較分析結(jié)果顯示:IFN治療組中3類(lèi)疾病總計(jì)67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,對(duì)照治療組中3類(lèi)疾病總計(jì)61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本實(shí)驗(yàn)獲得的IFN-α重組蛋白治療寵物犬病毒性傳染病,能顯著提高治愈率,有較好的臨床治療病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并應(yīng)用分子生物學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析;首次成功的表達(dá)了3個(gè)基因,純化、復(fù)性了重組蛋白,發(fā)現(xiàn)IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有較高的生物學(xué)活性,可以開(kāi)發(fā)利用;通過(guò)藏獒犬IFN-α重組蛋白的臨床病毒性犬病的治療,驗(yàn)證了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中國(guó)特有的大型犬種,本研究為犬基因工程生物制品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和相關(guān)疾病的檢測(cè)及防治奠定了理論基礎(chǔ)。
王建榮[2]（2019）在《Thermomyces dupontii脂肪酶高效制備及應(yīng)用研究》文中提出研究表明Thermomyces dupontii脂肪酶（簡(jiǎn)稱(chēng)TDL）在洗滌、生物柴油、油脂改性等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用潛力,而天然菌T.dupontii培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜,脂肪酶發(fā)酵活力低,限制了TDL產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。要使TDL實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,必須通過(guò)高效制備技術(shù)降低其生產(chǎn)成本。除了發(fā)酵酶活,溫度特性也是工業(yè)領(lǐng)域關(guān)注的技術(shù)指標(biāo),TDL在低溫條件下相對(duì)酶活性低,在高溫條件下熱穩(wěn)定性差,因此若想將TDL廣泛應(yīng)用到不同工業(yè)領(lǐng)域,需要優(yōu)化其溫度特性。本論文針對(duì)限制TDL產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的難點(diǎn),通過(guò)五個(gè)方面（啟動(dòng)子優(yōu)化、信號(hào)肽優(yōu)化、組合策略高效表達(dá)、溫度理性設(shè)計(jì)以及TDL及其突變體應(yīng)用）對(duì)TDL進(jìn)行系統(tǒng)的研究,為T(mén)DL的產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。本論文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:（1）不同啟動(dòng)子對(duì)重組TDL在畢赤酵母表達(dá)的影響:研究了15種甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和9種組成型啟動(dòng)子對(duì)TDL在畢赤酵母重組表達(dá)的影響,在15種甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中,啟動(dòng)子PFLD1效果最好,其次為PAOX1和PDAS1,這三種不同啟動(dòng)子重組菌在5 L發(fā)酵罐最高酶活分別為27076 U/mL,24159 U/mL和22342U/mL。在所選的9種組成型啟動(dòng)子中,啟動(dòng)子PGCW14效果最好,其次為P0472和PGAP,這三種組成型啟動(dòng)子重組菌在5 L發(fā)酵罐最高酶活分別為17353 U/mL,15046 U/mL和14276 U/mL。（2）不同信號(hào)肽對(duì)重組TDL在畢赤酵母表達(dá)的影響:在最佳啟動(dòng)子PFLD1的基礎(chǔ)上研究了7種異源信號(hào)肽、8種同源信號(hào)肽、2種密碼子優(yōu)化α-MF信號(hào)肽以及8種α-MF信號(hào)肽突變體對(duì)TDL表達(dá)的影響。在這25種信號(hào)肽中,D57-74效果最好,其次為Fre和D57-70,在搖瓶培養(yǎng)條件下D57-74,Fre以及D57-70重組菌的發(fā)酵酶活分別比對(duì)照提高了12.9%、9.1%和8.1%。D57-74重組工程菌在5 L發(fā)酵罐最高酶活為31137 U/mL,比對(duì)照菌提升了15%。（3）組合策略提升TDL在畢赤酵母的表達(dá):在最佳啟動(dòng)子和最佳信號(hào)肽的基礎(chǔ)上,通過(guò)組合策略（基因多拷貝、分子伴侶共表達(dá)和高密度發(fā)酵條件優(yōu)化）進(jìn)一步提升重組TDL在畢赤酵母的表達(dá)量。首先研究了基因拷貝數(shù)對(duì)TDL表達(dá)的影響,在216個(gè)轉(zhuǎn)化子中多拷貝重組菌X33-T23（拷貝數(shù)為3）發(fā)酵酶活最高,在搖瓶培養(yǎng)和5 L發(fā)酵罐條件下分別比單拷貝重組菌提升了47.4%和26.8%。其次以X33-T23為宿主,共表達(dá)單分子伴侶蛋白能夠有效提升重組TDL的表達(dá)量,在12種分子伴侶蛋白中,PDI效果最好,其次為KAR2,HAC1和ERO1,這四種分子伴侶蛋白共表達(dá)重組菌在5 L發(fā)酵罐條件下的發(fā)酵酶活分別為57521U/mL,54280 U/mL,54234 U/mL和48156 U/mL。以重組菌X33-T23-PDI為宿主,再分別轉(zhuǎn)入分子伴侶蛋白發(fā)現(xiàn)雙分子伴侶蛋白共表達(dá)不能進(jìn)一步提升重組TDL的表達(dá)量。最后優(yōu)化了高密度發(fā)酵的誘導(dǎo)溫度和pH,在最佳誘導(dǎo)條件下重組菌X33-T23-PDI在5 L、50 L和30立方發(fā)酵罐的最高酶活分別達(dá)到81203U/mL、81062 U/mL和56121 U/mL。（4）理性設(shè)計(jì)優(yōu)化TDL溫度特性:通過(guò)去糖基化提高了TDL在低溫條件下的酶活性,突變體N55D的最適反應(yīng)溫度為50℃（比TDL降低了10℃）,N55D在30℃和40℃的相對(duì)酶活分別比TDL提升了28%和31%。通過(guò)增加二硫鍵和點(diǎn)突變提升了TDL在高溫條件下的穩(wěn)定性。首先通過(guò)引入二硫鍵提高TDL的熱穩(wěn)定性,二硫鍵突變體F12C/K237C和G66C/S121C在75℃水浴處理10分鐘后,殘留酶活分別是TDL的1.9倍和1.3倍。其次通過(guò)篩選獲得點(diǎn)突變體42/45、98/100和103/104。在70℃水浴處理10分鐘后,點(diǎn)突變體42/45、98/100和103/104殘留酶活分別比TDL提高11%、13%和8%。最后通過(guò)組合二硫鍵突變體和點(diǎn)突變體進(jìn)一步提升重組TDL的熱穩(wěn)定性,以二硫鍵突變體F12C/K237C為出發(fā)模板,通過(guò)組合突變獲得7個(gè)熱穩(wěn)定性顯著提升的組合突變體,其中組合突變體5效果最好。組合突變體5在75℃和80℃水浴處理20分鐘后,殘留酶活分別是TDL的6.9倍和4.6倍。（5）TDL及其溫度突變體的應(yīng)用研究:將TDL和N55D應(yīng)用于造紙脫墨領(lǐng)域,TDL和N55D均能有效提升造紙脫墨效果,在30℃至50℃條件下,N55D的應(yīng)用效果要好于TDL。將TDL和組合突變體5應(yīng)用于肉雞養(yǎng)殖領(lǐng)域,在玉米豆粕型飼料中添加TDL和組合突變體5均能提升肉雞的日增重、粗脂肪消化利用率和養(yǎng)分表觀利用率。相同添加量的情況下,組合突變體5的應(yīng)用效果要好于TDL。本論文的研究結(jié)果為T(mén)DL的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ),此外也為脂肪酶的高效制備、溫度理性設(shè)計(jì)以及在造紙脫墨和肉雞養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)參考。
楊潤(rùn)時(shí)[3]（2019）在《動(dòng)物源腸桿菌中碳青霉烯耐藥基因blaNDM的流行分布及分子傳播機(jī)制研究》文中研究指明碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物被認(rèn)為是目前用于治療多重耐藥革蘭陰性桿菌最有效的抗菌藥物之一,而隨著該類(lèi)藥物的廣泛使用,碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株的檢出率呈快速上升的趨勢(shì),這已經(jīng)成為威脅公共衛(wèi)生安全的重要議題。碳青霉烯類(lèi)藥物并未批準(zhǔn)用于獸醫(yī)臨床,而現(xiàn)有的研究表明,動(dòng)物源中耐碳青霉烯菌株的檢出率越來(lái)越高,存在著在動(dòng)物源中全面流行的可能和趨勢(shì)。因此本研究對(duì)耐碳青霉烯菌株在我國(guó)動(dòng)物源中的流行分布情況和分子傳播機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性的調(diào)查和研究,探求不同來(lái)源中重要碳青霉烯耐藥基因及其質(zhì)粒之間的相關(guān)性,以期為控制重要耐藥基因以及耐藥菌的擴(kuò)散傳播和減緩耐藥性發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。本研究2015～2017年從全國(guó)21個(gè)省或直轄市共采集動(dòng)物源樣品6302份,包括食品動(dòng)物源2771份,候鳥(niǎo)源3188份,寵物源343份。采用含美羅培南的加藥培養(yǎng)基篩選出碳青霉烯不敏感菌株2255株,分離自1791份樣品,樣品陽(yáng)性率為28.4%（1791/6302）,其中食品動(dòng)物源樣品陽(yáng)性數(shù)654份,候鳥(niǎo)源1067份,寵物源70份。通過(guò)改良型Carba NP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯不敏感菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的能力,結(jié)果顯示能夠產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株為1002株,對(duì)應(yīng)分離自850份樣品,分離率為13.5%（850/6302）。其中食品動(dòng)物源產(chǎn)酶陽(yáng)性樣品數(shù)為208份,候鳥(niǎo)源為619份,寵物源23份,分離率分別為7.5%（208/2771）、19.4%（619/3188）和6.7%（23/343）。對(duì)產(chǎn)酶陽(yáng)性菌株進(jìn)行碳青霉烯酶耐藥基因檢測(cè)并對(duì)耐藥基因陽(yáng)性菌株進(jìn)行菌種鑒定,結(jié)果顯示檢出593株bla NDM陽(yáng)性大腸桿菌,10株bla VIM陽(yáng)性惡臭假單胞菌,4株bla VIM陽(yáng)性嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和2株bla IMP陽(yáng)性大腸桿菌。食品動(dòng)物及其環(huán)境源和寵物源中所分離出的主要為大腸桿菌,候鳥(niǎo)及其環(huán)境源中分離得到的菌株則以克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌和變形桿菌為主。這609株陽(yáng)性菌株的藥敏結(jié)果顯示其多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,除了對(duì)頭孢類(lèi)和碳青霉烯類(lèi)耐藥率為100%外,對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考和慶大霉素的耐藥率超過(guò)或接近80%,同時(shí)食品動(dòng)物源菌株對(duì)阿米卡星,氨曲南,磷霉素,黏菌素和環(huán)丙沙星的耐藥率明顯高于候鳥(niǎo)源。采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）對(duì)89株食品動(dòng)物源、235株候鳥(niǎo)源和6株寵物源,共330株bla NDM陽(yáng)性腸桿菌進(jìn)行菌株分子分型,分析菌株間親緣關(guān)系。結(jié)果顯示食品動(dòng)物源和寵物源中攜帶bla NDM基因腸桿菌之間相互親緣關(guān)系較遠(yuǎn),食品動(dòng)物源中分離到的bla NDM陽(yáng)性大腸桿菌有4組、每組2株菌間存在較高的親緣關(guān)系,除此以外69株bla NDM陽(yáng)性大腸桿菌各自屬于不同的種系進(jìn)化群,寵物源分離到的6株bla NDM陽(yáng)性大腸桿菌被分為五個(gè)不同的種系進(jìn)化群。候鳥(niǎo)源菌株的分型結(jié)果顯示,230株陽(yáng)性克雷伯氏菌分為5個(gè)種系進(jìn)化群,其中202株歸屬于B群,這表明候鳥(niǎo)源中存在優(yōu)勢(shì)克隆群,bla NDM基因可能是通過(guò)優(yōu)勢(shì)克隆群進(jìn)而在鳥(niǎo)群中傳播。通過(guò)接合轉(zhuǎn)移研究上述330株攜帶bla NDM基因腸桿菌的水平轉(zhuǎn)移能力,結(jié)果顯示動(dòng)物源中攜帶bla NDM基因菌株的接合成功率較高,食品動(dòng)物源、候鳥(niǎo)源和寵物源中成功率都達(dá)到了85%以上,顯示其可轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)。采用質(zhì)粒復(fù)制子分型、S1-PFGE、Southern雜交等方法進(jìn)一步分析攜帶bla NDM基因的質(zhì)粒特征,發(fā)現(xiàn)動(dòng)物源中介導(dǎo)bla NDM基因傳播的主要載體是Inc X3型質(zhì)粒。這表明雖然不同來(lái)源的NDM陽(yáng)性菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn),但因bla NDM基因能夠通過(guò)Inc X3型質(zhì)粒在不同菌株間傳播,這或許是導(dǎo)致該基因在我國(guó)動(dòng)物源中分布廣泛的重要原因。選取78株食品動(dòng)物源、46株候鳥(niǎo)源和2株寵物源,共130株bla NDM陽(yáng)性菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序并分析,結(jié)果顯示,食品動(dòng)物源中bla NDM陽(yáng)性菌攜帶率較高的耐藥基因?yàn)樗沫h(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)以及酰胺醇類(lèi),候鳥(niǎo)源中則是β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)。MLST分型結(jié)果顯示食品動(dòng)物源bla NDM陽(yáng)性大腸桿菌中比較流行的克隆群為ST48、ST165、ST405和ST34,候鳥(niǎo)源bla NDM陽(yáng)性克雷伯菌中則是ST1697,該優(yōu)勢(shì)克隆群是K.pneumoniae subsp.pneumoniae與K.quasipneumoniae subsp.similipneumoniae重組后所形成的雜合菌株。介導(dǎo)我國(guó)動(dòng)物源bla NDM基因傳播的基因環(huán)境有四種,以IS26-tat-trp F-ble MBL-bla NDM-ISAba125-IS3000-△Tn2的結(jié)構(gòu)為主。除此以外,發(fā)現(xiàn)寵物源中一株原菌及其接合子中存在一個(gè)Inc X3和Inc X4質(zhì)粒雜合以后所形成的質(zhì)粒,雜合后的質(zhì)粒同時(shí)攜帶bla NDM-5和mcr-1兩個(gè)耐藥基因,能夠同時(shí)介導(dǎo)對(duì)碳青霉烯類(lèi)和黏菌素的耐藥。綜上所述,我國(guó)動(dòng)物源中耐碳青霉烯菌株和產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的流行較廣,bla NDM-5基因是介導(dǎo)其產(chǎn)碳青霉烯酶并耐藥的主要原因,且陽(yáng)性菌株在不同來(lái)源菌株之間傳播方式有一定差異,Inc X3型質(zhì)粒是動(dòng)物源中介導(dǎo)bla NDM基因傳播的重要載體。本研究首次發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶bla NDM-5和mcr-1基因的Inc X3-X4型雜合質(zhì)粒,同時(shí)首次報(bào)道候鳥(niǎo)中攜帶NDM-5,且其優(yōu)勢(shì)克隆株由克雷伯氏菌中兩個(gè)亞種之間雜合形成,暗示了耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移、質(zhì)粒和菌株間的重組在耐藥基因的傳播以及細(xì)菌的進(jìn)化上起著重要的作用。
樊倩[4]（2017）在《四個(gè)乳酸菌素的原核表達(dá)及plnK對(duì)黃羽肉雞腸道菌群的影響》文中提出腸道菌群對(duì)動(dòng)物的健康至關(guān)重要,具有多種生理功能,一旦菌群失調(diào)就可能會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。在這種情況下,大多都是使用抗生素來(lái)解決。但是,隨著抗生素的大量使用和濫用,抗生素產(chǎn)生了很多的副作用,這問(wèn)題引起了廣泛的關(guān)注。乳酸菌素是由某些乳酸菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性的多肽或前體多肽,其具有無(wú)毒、無(wú)副作用、無(wú)殘留、對(duì)環(huán)境無(wú)污染的特點(diǎn),在畜禽生產(chǎn)中,可作為飼料添加劑替代抗生素。但由于野生乳酸菌分泌的乳酸菌素產(chǎn)量低和乳酸菌素分離純化困難,給規(guī)?；a(chǎn)乳酸菌素帶來(lái)了極大的麻煩。因此,本試驗(yàn)采用基因工程技術(shù),體外表達(dá)乳酸菌素,并通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)初步驗(yàn)證乳酸菌素的抑菌作用,最后,通過(guò)飼養(yǎng)試驗(yàn)來(lái)探討乳酸菌素plnK對(duì)肉雞腸道微生物菌群和黏膜免疫功能的影響。具體內(nèi)容如下:1.四個(gè)乳酸菌素的原核表達(dá)。方法:針對(duì)乳酸菌素plnE、plnF、plnJ和plnK編碼框序列,設(shè)計(jì)四對(duì)特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將這四個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,分別與原核表達(dá)載體pET-32a（+）連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序等進(jìn)行鑒定,將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以及誘導(dǎo)條件優(yōu)化,并進(jìn)行Western blot鑒定,對(duì)重組表達(dá)蛋白進(jìn)行Ni-NTA親和層析法純化。結(jié)果:PCR、雙酶切及測(cè)序等進(jìn)行鑒定結(jié)果表明,pET-32a（+）-plnE、pET-32a（+）-plnF、pET-32a（+）-plnJ和pET-32a（+）-plnK四個(gè)重組原核表達(dá)質(zhì)粒均被構(gòu)建成功。將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),SDS-PAGE分析結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的這四個(gè)重組蛋白大小分別為26.2ku、25.7ku、26.0ku和26.2ku,與預(yù)期的結(jié)果都一致。重組蛋白的誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果表明,pET-32a（+）-plnE蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件為12h、37℃和1.0 mmoL/L;pET-32a（+）-plnF蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件為12h、37℃和0.6mmoL/L;pET-32a（+）-plnJ 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件為 12h、37℃和 1.2 mmoL/L;pET-32a（+）-plnK蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件為12h、37℃和0.4 mmoL/L。Western blot結(jié)果表明,重組的四個(gè)乳酸菌素都被正確表達(dá)。Ni-NTA親和層析純化結(jié)果表明,pET-3 2a（+）-plnE蛋白、pET-32a（+）-plnJ蛋白、pET-32a（+）-plnK蛋白這三個(gè)重組蛋白在280mM的咪唑濃度洗脫效率最高,而pET-32a（+）-plnF蛋白在200mM的咪唑濃度洗脫效率最高。2.乳酸菌素體外抑制試驗(yàn)。方法:以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和巴氏桿菌為指示菌,牛津杯法檢測(cè)四個(gè)重組乳酸菌素不同濃度下的抑菌效果;分別添加1uL、10uL、50uL和100uL的0.50mg/mL重組乳酸菌素,篩選出最佳的抑菌濃度;最后比較分析了 plnE+plnF、plnJ+plnK、plnE、plnF、plnJ、plnK抑菌效果。結(jié)果:四個(gè)重組乳酸菌素在添加量為50uL（終濃度為2.5×10-2mg/mL）時(shí)抑菌效果最好;乳酸菌素plnE、乳酸菌素plnF單獨(dú)和組合的抑菌效果一致,乳酸菌素plnJ、乳酸菌素plnK單獨(dú)和組合的抑菌效果一致,都達(dá)到了良好的抑菌效果;從牛津杯抑菌試驗(yàn)結(jié)果可以知道,這四個(gè)乳酸菌素在蛋白濃度為2.5×10-2mg/mL時(shí),可以看到明顯的抑菌圈。表明四個(gè)重組乳酸菌素具有廣譜抗菌活性。3.乳酸菌素plnK對(duì)黃羽肉雞腸道菌群和黏膜免疫的影響。方法:選取300羽4日齡健康黃羽肉公雞,分成5個(gè)組,每組設(shè)置5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)12羽。Ⅰ組為空白對(duì)照組,Ⅱ組為乙酸對(duì)照組,Ⅲ組為 5.00×10-3mg/mL 乳酸菌素 plnK 組,Ⅳ組為 2.50×1 0-3mg/mL 乳酸菌素plnK組,V組為1.25×10-3mg/mL乳酸菌素plnK組。試驗(yàn)期為28d,分別于飼喂后1周、2周、4周稱(chēng)重,記錄采食量,計(jì)算料重比。采集各處理組肉雞十二指腸,ELISA法測(cè)定各處理組SIgA含量;熒光定量PCR法檢測(cè)各處理組肉雞十二指腸黏膜免疫細(xì)胞因子（MDA5、IFN-α、IFN-β、TLR3、IFITM10、IFITM3 基因）的表達(dá)量;最后應(yīng)用高通量測(cè)序分析各處理組肉雞盲腸內(nèi)容物菌群。結(jié)果:飼喂1周,Ⅳ組的平均日增重、平均日采食量、十二指腸黏膜SIgA含量顯著高于 Ⅰ組（P<0.05）,Ⅳ組的 MDA5、IFN-α、IFN-β、TLR3、IFITM10、IFITM3基因的表達(dá)量極顯著高于Ⅰ組（P<0.01）;高通量測(cè)序結(jié)果表明,飼喂1周,Ⅲ組出現(xiàn)特有的菌科:雙歧桿菌科,且Ⅳ組、V組瘤胃球菌屬UCG-013的豐度顯著高于Ⅰ組（P<0.05）;Ⅲ組、Ⅳ組、V組乳桿菌屬豐度高于Ⅰ組（P>0.05）;飼喂2周,Ⅳ組出現(xiàn)特有的菌科:酸桿菌科,Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組放線菌門(mén)的豐度小于Ⅰ組,V組糞球菌屬的豐度顯著高于Ⅰ組（P<0.05）,Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組乳桿菌屬的豐度高于Ⅰ組（P>0.05）;飼喂4周,Ⅳ組、V組乳桿菌屬的豐度高于Ⅰ組（P>0.05）。綜上所述,本試驗(yàn)成功構(gòu)建了 pET-32a（+）-plnE、pET-32a（+）-plnF、pET-32a（+）-plnJ和pET-32a（+）-plnK重組質(zhì)粒,并成功在體外表達(dá),獲得了四個(gè)重組乳酸菌素,四個(gè)重組乳酸菌素均具有廣譜抗菌活性;飼喂2.50×10-3mg/mL乳酸菌素plnK 2周提高了肉雞十二指腸黏膜SIgA的含量,刺激免疫細(xì)胞因子的表達(dá);提高了肉雞腸道內(nèi)酸桿菌門(mén)、軟壁菌門(mén)、芽孢菌科、乳桿菌屬等的豐度,從而促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)。
賈如[5]（2016）在《枯草芽孢桿菌黃曲霉毒素降解酶的分離純化、基因克隆及表達(dá)》文中研究指明試驗(yàn)一目的是通過(guò)高效液相色譜法對(duì)我國(guó)不同年份、季節(jié)和地區(qū)飼料及飼料原料中黃曲霉毒素（AF）的分布規(guī)律及玉米生長(zhǎng)和貯存過(guò)程中AF含量變化規(guī)律進(jìn)行研究,為飼料生產(chǎn)企業(yè)及養(yǎng)殖企業(yè)提供數(shù)據(jù)參考。調(diào)查結(jié)果顯示,1)2013-2015年北京地區(qū)12種飼料原料和6種飼料中AF污染普遍存在,2013年飼料與飼料原料中AF污染率和平均含量最高,2014年次之,2015年最低。三年內(nèi),DDGS和青貯中AF平均含量和超標(biāo)率均高于其他飼料原料,污染嚴(yán)重。2)季節(jié)和地區(qū)不同,飼料原料中AF含量不同。冬夏兩季玉米相比,夏季玉米更容易受AF污染;同期調(diào)研我國(guó)東北、華北、西南和南方地區(qū)玉米受AF污染情況發(fā)現(xiàn):我國(guó)西南和南方地區(qū)玉米中AF的含量高于東北和華北地區(qū)。3)調(diào)研玉米中AF含量受生長(zhǎng)環(huán)境和貯存條件的影響時(shí)發(fā)現(xiàn):玉米在生長(zhǎng)過(guò)程中更易受到AF的污染。試驗(yàn)二運(yùn)用蛋白分離純化技術(shù)和LC-MS技術(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subitilis）ANSB060分泌的枯草芽孢桿菌黃曲霉毒素降解酶（Bacillus subtilis aflatoxin degradation enzyme,BADE）進(jìn)行粗提、分離、純化和鑒定。ANSB060發(fā)酵上清液乙醇沉淀粗酶經(jīng)兩次陰離子層析和疏水層析后,在SDS-PAGE電泳上顯示單一蛋白條帶,其表觀分子量約為32.0 kDa。BADE經(jīng)多步分離純化后被純化了約193倍,產(chǎn)率為35.4%,比活為75.25 ×103 U/mg。經(jīng)過(guò)膠內(nèi)酶解和LC-MS檢測(cè)后,得到了 BADE的21段特征氨基酸序列。試驗(yàn)三目的是對(duì)產(chǎn)自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的黃曲霉毒素降解酶（B.subtilis aflatoxin degradation enzyme,BADE）進(jìn)行基因克隆和原核外源表達(dá)。本試驗(yàn)通過(guò)試驗(yàn)二中特征氨基酸序列的信息設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增,進(jìn)行同源基因的克隆。最終得到一條870 bp大小的全長(zhǎng)序列,870 bp全長(zhǎng)序列中含終止密碼子TAA,共編碼289個(gè)氨基酸,且此氨基酸序列與試驗(yàn)二中特征肽段的已知氨基酸序列比對(duì),相似度為100%,認(rèn)為基因克隆結(jié)果正確。將289個(gè)氨基酸編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè),推測(cè)BADE蛋白分子量為33.3 kDa,理論等電點(diǎn)為5.29,N端含有一段信號(hào)肽,剪切位點(diǎn)在第29位和30位氨基酸殘基之間,無(wú)糖基化位點(diǎn),有3個(gè)絲氨酸（Ser）和1個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn),二級(jí)結(jié)構(gòu)中以a螺旋和隨機(jī)卷曲為主。同時(shí),將降解酶BADE基因在大腸桿菌中進(jìn)行外源表達(dá)。首先將BADE基因和大腸桿菌表達(dá)載體pET30a經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切后,體外連接,構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pET30a-BADE,然后將重組載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli Rosseta（DE3）中。通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo),重組蛋白被成功表達(dá),主要以包涵體形式存在。最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為:IPTG濃度為0.3 mM,誘導(dǎo)時(shí)間2 h。1L重組大腸桿菌工程菌發(fā)酵能獲得1 370 mg rBADE蛋白,降解AFB1的總活性為450 000 U,rBADE的酶比活為 328.5 U/mg。試驗(yàn)四對(duì)重組大腸桿菌黃曲霉毒素降解酶（rBADE）酶學(xué)特性進(jìn)行了初步研究,同時(shí)分析了該重組酶與AFB1作用108 h后,降解產(chǎn)物的毒性。研究發(fā)現(xiàn)rBADE在溫度為25～35℃,pH為6.0～8.5之間有較高的酶活,其中最佳酶活反應(yīng)條件是溫度30℃,pH為6.5;Km為 1.55×10-5 mol/L,具有良好的酶動(dòng)力學(xué)特性。AFB1經(jīng)rBADE降解生成的產(chǎn)物為致突變陰性,屬低毒或無(wú)毒性物質(zhì)。證明:rBADE是一種安全的AF降解劑。試驗(yàn)五目的是研究枯草芽孢桿菌ANSB060和ANSB01G制成的霉毒素生物降解劑,對(duì)采食AF和玉米赤霉烯酮（ZEA）污染日糧蛋雞產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)及雞蛋中毒素殘留量的影響。試驗(yàn)選用18周齡的“京紅1號(hào)”蛋雞336只,隨機(jī)分為7個(gè)處理,每個(gè)處理8個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6只雞。試驗(yàn)分為兩個(gè)階段,第一階段（18-23周）為攻毒期,第二階段為恢復(fù)期（24-29周）。在攻毒期,將18周齡蛋雞隨機(jī)分為7個(gè)處理,分別飼喂7種不同的試驗(yàn)組日糧,C組（正對(duì)照組）為正常玉米-花生粕型基礎(chǔ)日糧:AF組是用21%的霉變花生粕等量替代C日糧中的正常花生粕;ZEA組是57.7%的霉變玉米等量替代C日糧中的正常玉米;AF+ZEA組是分別用21%霉變花生粕和57.7%霉變玉米等量替代C日糧中的正?；ㄉ珊陀衩?AH 000、ZEA1 000和AF+ZEA1 000組分別在AF、ZEA和AF+ZEA組中添加1 000 g/t的毒素降解劑。在恢復(fù)期,所有組都換成無(wú)毒的對(duì)照組日糧。結(jié)果表明:1)攻毒期,蛋雞采食被AF或AF+ZEA同時(shí)污染的自然霉變?nèi)占Z后,其產(chǎn)蛋率、采食量、飼料轉(zhuǎn)化效率、蛋殼厚度顯著（P<0.05）低于對(duì)照組,雞蛋中毒素殘留量顯著（P<0.05）高于對(duì)照組;添加降解劑改善了蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì),降低蛋中毒素殘留量,使其與正常對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）2)AF和ZEA具有協(xié)同毒害作用,可協(xié)同降低蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì),增加蛋中毒素的殘留量。3)停止飼喂毒素日糧6周后,AF+ZEA同時(shí)污染組中,蛋雞產(chǎn)蛋率和飼料轉(zhuǎn)化率仍顯著（P<0.05）低于對(duì)照組。
詹湉湉[6]（2016）在《黃羽肉雞胰蛋白酶原的原核表達(dá)及體內(nèi)分布研究》文中認(rèn)為目的:胰蛋白酶原（Trypsinogen,TRY）是動(dòng)物消化蛋白質(zhì)不可或缺的一種酶。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶原不僅具有消化功能,它還扮演著其它功能。為更好的了解TRY的功能,本試驗(yàn)對(duì)TRY進(jìn)行了基因克隆分析,原核表達(dá)及其在黃羽肉雞體內(nèi)的表達(dá)和分布情況的研究,研究結(jié)果可為肉雞消化吸收功能研究提供理論基礎(chǔ)。方法:（1）采用分子克隆技術(shù)克隆黃羽肉雞胰蛋白酶原基因,并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)黃羽肉雞TR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。（2）采用原核表達(dá)技術(shù),進(jìn)行目的蛋白表達(dá);利用親和層析法純化目的蛋白,將純化后的目的蛋白免疫新西蘭白兔,制備兔抗TRY多克隆抗體。（3）利用免疫組織化學(xué)法、反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)分析TRY基因在黃羽肉雞體內(nèi)的分布情況,及不同生長(zhǎng)發(fā)育階段黃羽肉雞胰腺組織中TRY基因表達(dá)的情況。結(jié)果:本試驗(yàn)成功克隆了黃羽肉雞TRY基因,該基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)747bp,由248個(gè)氨基酸殘基組成,其中包含15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽（MKFLVLVAFLGVA VA）和10個(gè)氨基酸（FPISDEDDDK）的激活肽;該蛋白的分子量為26.1ku,屬于疏水性蛋白,不存在跨膜區(qū),不含糖基化位點(diǎn),有11個(gè)磷酸化位點(diǎn)。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示:黃羽肉雞TRY具有絲氨酸蛋白酶的保守結(jié)構(gòu)特征,如含有催化三聯(lián)體氨基酸（組氨酸-64,天冬氨酸-110和絲氨酸-203）;具有構(gòu)成6個(gè)二硫鍵所需的12個(gè)半胱氨酸殘基等。序列一致性分析發(fā)現(xiàn),黃羽肉雞TRY與原雞的同源性最高,高達(dá)98.8%。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR、酶切和測(cè)序分析表明,黃羽肉雞TRY基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BL21感受態(tài)細(xì)胞,采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析顯示,重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功,最佳誘導(dǎo)條件為:37℃,200r/min,IPTG=0.8 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間24h。通過(guò)親和層析法純化蛋白,梯度咪唑進(jìn)行洗脫,結(jié)果表明160mM濃度的咪唑洗脫效果最好。利用免疫組化、反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR法探討TRY基因在黃羽肉雞體內(nèi)分布情況,結(jié)果表明:（1）TRY基因在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等均有分布,以胰腺表達(dá)量最高,且雌雄黃羽肉雞均有此分布特點(diǎn)。（2）TRY基因不僅具有組織分布的廣泛性,還具有性別差異性與組織差異性。利用免疫組化、反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR法對(duì)胰腺組織RY基因與黃羽肉雞生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系進(jìn)行了研究探索。結(jié)果表明:（1）雌雄黃羽肉雞存在相似的表達(dá)特點(diǎn),TRY基因在1日齡即開(kāi)始表達(dá),且隨著黃羽肉雞的生長(zhǎng)發(fā)育,其表達(dá)量也隨之增加,在14日齡時(shí),其表達(dá)量極顯著提高。（2）胰腺組織TRY基因具有性別差異性。2周齡后,雄性黃羽肉雞的表達(dá)量高于雌性的表達(dá)量。其中,14日齡差異顯著（P<0.05）,35日齡和56日齡差異極顯著（P<0.01）。結(jié)論:1.本試驗(yàn)成功克隆了黃羽肉雞胰蛋白酶原基因,通過(guò)體外表達(dá)獲得了肉雞TRY蛋白,并成功制備了高效價(jià)的兔抗雞胰蛋白酶原多克隆抗體。2.黃羽肉雞胰蛋白酶原基因在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等均有分布,以胰腺表達(dá)量最高。3.黃羽肉雞胰蛋白酶原基因在1日齡即開(kāi)始表達(dá),其表達(dá)量隨日齡增加而提高。4.黃羽肉雞胰蛋白酶原基因表達(dá)量與性別有關(guān)。2周齡后,雄性黃羽肉雞表達(dá)量顯著高于雌性黃羽肉雞表達(dá)量。
毛婭卿[7]（2014）在《禽白血病病毒抗原/抗體ELISA檢測(cè)方法的建立及準(zhǔn)種分析》文中指出禽白血?。ˋvian leukosis）是制約養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的主要禽類(lèi)傳染病,以垂直傳播為主,免疫污染禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）的活疫苗也是引發(fā)該病的重要原因之一。目前主要通過(guò)定期對(duì)雞群進(jìn)行ALV血清學(xué)監(jiān)測(cè),采取淘汰凈化的方法控制該病。我國(guó)開(kāi)展ALV血清學(xué)監(jiān)測(cè)通常使用美國(guó)IDEXX等公司的檢測(cè)試劑盒,檢測(cè)成本高、推廣范圍窄。因此,研究開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ALV檢測(cè)試劑盒,降低ALV檢測(cè)成本,擴(kuò)大雞群檢測(cè)范圍,對(duì)我國(guó)防控本病有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。另外,ALV-J在臨床上自報(bào)道以來(lái)一直處于不斷的變異中,當(dāng)前尚無(wú)確切證據(jù)證明ALV-J在我國(guó)雞群中致病作用有多樣性的機(jī)制,而病毒準(zhǔn)種的多樣性很有可能是ALV-J致病作用多樣性的機(jī)制之一。因此,開(kāi)展ALV準(zhǔn)種研究對(duì)于從分子水平上解析ALV-J在我國(guó)不同雞群中致病作用的多樣性具有重要的理論意義。本研究通過(guò)原核表達(dá)ALV p27蛋白,制備抗p27蛋白多克隆抗體,建立了ALV抗原ELISA檢測(cè)方法和ALV抗體ELISA檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明,建立的兩種檢測(cè)方法與禽常見(jiàn)傳染病病毒或其陽(yáng)性血清、大腸桿菌陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng),具有較好的特異性；兩種方法的批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10%,具有良好的可重復(fù)性；ALV抗原ELISA檢測(cè)方法與IDEXX公司的ALV抗原檢測(cè)試劑盒敏感性相當(dāng),符合率達(dá)到98.9%；ALV抗體ELISA檢測(cè)方法比IDEXX公司的ALVA/B和J亞群抗體檢測(cè)試劑盒相對(duì)于間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）有更高的符合率。利用本研究建立的抗原ELISA檢測(cè)方法對(duì)918批不同疫苗進(jìn)行了ALV檢測(cè),結(jié)果檢測(cè)出63批外源性ALV污染疫苗。從2006年-2009年間污染的FPV. NDV和IBDV活疫苗中分別分離和鑒定到三株ALV,并對(duì)這三株ALV進(jìn)行全基因組序列測(cè)定與分析。結(jié)果顯示,三株ALV的gp85氨基酸序列與A亞群ALV參考毒株的gp85氨基酸序列同源性最高,為88.3%-97.7%,并且他們的全基因組整體同源性均較高；三株ALV與2009年分離自海蘭褐祖代雞的A亞群ALV中國(guó)分離株SDAU09C3同源性最高,顯示它們很可能有共同的來(lái)源,也說(shuō)明疫苗ALV污染是導(dǎo)致臨床上雞群發(fā)病的原因之一。從山東省某地方品系雞疑似白血病發(fā)病雞群分離到自然感染的血管瘤型ALV-J,并采用本研究建立的ALV抗原／抗體ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行了抗原和抗體驗(yàn)證,同時(shí)選取LY1201株對(duì)其env基因進(jìn)行了比較分析。結(jié)果證明ALV-J單一病毒株中存在差異極大的不同準(zhǔn)種,發(fā)現(xiàn)gp85在氨基酸位點(diǎn)210-219發(fā)生10個(gè)連續(xù)的氨基酸缺失的準(zhǔn)種,該缺失在此前我國(guó)ALV-J野毒株中均未發(fā)現(xiàn),該研究說(shuō)明可通過(guò)gp85序列測(cè)定進(jìn)行ALV準(zhǔn)種分析研究。在此基礎(chǔ)上,將ALV-J LY1201株在DF-1細(xì)胞上連傳3代后,擴(kuò)增其gp85基因并對(duì)其20個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序和準(zhǔn)種分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20個(gè)克隆中g(shù)p85缺失的突變準(zhǔn)種已經(jīng)完全消失,原來(lái)的優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種比例由33.3%上升為85.0%成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種。這表明ALV-J在適應(yīng)細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中病毒的準(zhǔn)種組成是不斷變化的,且發(fā)生突變的準(zhǔn)種只有其復(fù)制能力高于原優(yōu)勢(shì)準(zhǔn)種才可能具備競(jìng)爭(zhēng)性優(yōu)勢(shì)。綜上所述,本研究建立的ALV抗原/抗體ELISA檢測(cè)方法,可用于ALV病毒檢測(cè)和血清學(xué)監(jiān)測(cè),對(duì)于控制我國(guó)禽用病毒類(lèi)活疫苗質(zhì)量,加強(qiáng)禽白血病防控和凈化具有重要的意義。目前本研究建立的ALV抗原ELISA檢測(cè)方法已作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)用于禽用病毒類(lèi)活疫茁外源病毒檢驗(yàn)。從禽用病毒類(lèi)活疫苗中分離到污染的ALV,提示加強(qiáng)疫苗中ALV等外源病毒監(jiān)測(cè)的重要性。同時(shí),本研究建立的ALV-J準(zhǔn)種分析方法,對(duì)于解析ALV-J在我國(guó)不同雞群中致病作用的多樣性提供了理論與技術(shù)支持。
劉棟[8]（2010）在《畜禽補(bǔ)體C3d基因克隆及序列分析和重組雞C3d免疫佐劑效果研究》文中研究指明在生產(chǎn)實(shí)踐中,傳統(tǒng)的疫苗（弱毒苗、滅活苗）對(duì)防治動(dòng)物疫病發(fā)揮了重要作用,但近年來(lái)該類(lèi)疫苗暴露出來(lái)的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉價(jià)的新型疫苗顯得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表達(dá)載體和保護(hù)性抗原基因構(gòu)成,此種疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比,具有設(shè)計(jì)靈活、安全性高、性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫等優(yōu)點(diǎn)。然而核酸疫苗存在的問(wèn)題是產(chǎn)生抗體慢且水平低,需要加入有效的佐劑才能克服這些缺陷;核酸疫苗的佐劑需用分子佐劑,分子佐劑主要有干擾素分子佐劑、白細(xì)胞介素分子佐劑、胸腺肽分子佐劑及C3d分子佐劑等,其中C3d分子作為一種新型分子佐劑日益引起人們的關(guān)注。補(bǔ)體C3是機(jī)體補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑、替代途徑以及甘露聚糖結(jié)合凝集素（MBL）途徑的交匯點(diǎn)的中心成分,是宿主防御機(jī)能的一個(gè)分子。C3d片段是補(bǔ)體C3的裂解片段之一,是C3分子α鏈不能被蛋白酶再裂解并仍保持與抗原共價(jià)連接的最小片段,具有廣泛的免疫學(xué)功能。其可以直接與抗原遞呈細(xì)胞（APC）上的CR2受體結(jié)合,從而降低淋巴細(xì)胞的活化閾,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被認(rèn)為是一種具有研究、開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值的核酸疫苗分子佐劑。鑒于上述研究背景,本研究在對(duì)不同動(dòng)物補(bǔ)體C3d基因克隆及序列測(cè)定比較分析的基礎(chǔ)上,探討了補(bǔ)體C3d在不同畜禽間基因水平上的相關(guān)性和差異性;驗(yàn)證了雞補(bǔ)體C3d原核表達(dá)重組蛋白（rChC3d）對(duì)大腸桿菌疫苗和新城疫滅活油乳苗的免疫增強(qiáng)作用;然后采用新城疫病毒F基因?yàn)樵囼?yàn)材料、以雞補(bǔ)體C3d的受體結(jié)合功能區(qū)P29作為分子佐劑,構(gòu)建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚體分子佐劑新城疫F基因疫苗,并經(jīng)過(guò)檢測(cè)證明了其具有較好的免疫保護(hù)效果。本研究成果為以后研制禽類(lèi)的其他有效細(xì)菌及病毒性疫苗提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。本研究主要內(nèi)容如下:1、不同畜禽補(bǔ)體C3d基因的克隆及序列分析:從不同畜禽的肝細(xì)胞提取總RNA,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出C3d基因的cDNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定后直接克隆到pMD18-T載體,構(gòu)建pMD18-T-C3d重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,酶切鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定,然后進(jìn)行C3d序列比較、CR2結(jié)合區(qū)同源性分析比較。結(jié)果表明,畜禽補(bǔ)體C3d基因同源性相差較大,進(jìn)化樹(shù)反映出C3d基因具有種的多樣性,親緣關(guān)系越近,進(jìn)化關(guān)系也越近。對(duì)CR2結(jié)合區(qū)分析發(fā)現(xiàn),禽類(lèi)的該區(qū)為29個(gè)氨基酸,而哺乳動(dòng)物的為28個(gè)氨基酸,兩類(lèi)動(dòng)物該區(qū)氨基酸的同源性僅為40%,而哺乳動(dòng)物之間的同源性高達(dá)80%,證明補(bǔ)體C3d及CR2結(jié)合區(qū)具有種屬的特異性。另外,用生物學(xué)軟件對(duì)補(bǔ)體C3d基因編碼的氨基酸序列以及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析、用ESyPred 3D同源建模等軟件對(duì)補(bǔ)體C3d的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分子特征分析,分析結(jié)果顯示,C3d 3D模型是一種由核心和外層構(gòu)成的桶狀分子結(jié)構(gòu)。本研究為進(jìn)一步研究動(dòng)物C3d分子佐劑基因疫苗奠定了基礎(chǔ)。2、雞補(bǔ)體C3d原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其重組蛋白的純化:補(bǔ)體C3d是補(bǔ)體系統(tǒng)（Complement system,CS）中補(bǔ)體C3的最終裂解產(chǎn)物。為研究其免疫增強(qiáng)的生物學(xué)功能,利用RT-PCR技術(shù)從羅曼蛋雞肝臟總RNA中擴(kuò)增出C3d cDNA,經(jīng)克隆測(cè)序證實(shí)所得基因?yàn)镃3d。然后,將其連接至表達(dá)載體pET-32a（+）,轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果表明,目的基因在大腸桿菌中以包涵體的形式進(jìn)行了高效表達(dá),Western-blotting證實(shí)目的蛋白為C3d。包涵體蛋白通過(guò)尿素溶解液洗滌并溶解后,經(jīng)硫酸銨鹽析、透析、濃縮和Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析,重組C3d蛋白得到純化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting檢測(cè)驗(yàn)證該C3d表達(dá)蛋白得到很好的純化,并且純化后的表達(dá)蛋白仍具有良好的反應(yīng)原性。本研究為進(jìn)一步研究、利用雞補(bǔ)體C3d蛋白提供了保證。3、雞補(bǔ)體C3d重組蛋白對(duì)大腸桿菌疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究:從SDS-PAGE凝膠中分離純化原核表達(dá)的重組C3d蛋白,用戊二醛將其與大腸桿菌抗原連接,免疫注射SPF雞;對(duì)照組雞免疫注射完全弗氏佐劑大腸桿菌疫苗。分別在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法測(cè)定血清中的抗體含量,同時(shí)測(cè)定血清中總補(bǔ)體活性。結(jié)果表明,免疫后3周,弗氏佐劑大腸桿菌疫苗誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生的抗體效價(jià)高于C3d佐劑疫苗組,但至第4周,弗氏佐劑疫苗組的抗體水平達(dá)到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗組雞免疫后的抗體水平持續(xù)上升,從免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。證明原核表達(dá)的C3d能夠促進(jìn)免疫記憶細(xì)胞的產(chǎn)生,并能夠使細(xì)菌抗原給予免疫細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定的刺激,從而使雞體維持高水平抗體的時(shí)間延長(zhǎng)。研究結(jié)果為研制有效的家禽細(xì)菌性疫苗提供了理論依據(jù)。4、雞補(bǔ)體C3d重組蛋白對(duì)新城疫病毒滅活油乳苗的免疫增強(qiáng)作用研究:為進(jìn)一步探討重組雞補(bǔ)體C3d蛋白的佐劑作用,本試驗(yàn)觀察了原核表達(dá)純化后的重組雞補(bǔ)體C3d蛋白和新城疫滅活油乳苗共同免疫雞群之后,重組雞補(bǔ)體C3d蛋白對(duì)新城疫滅活油乳苗的免疫協(xié)同作用。將7日齡雛雞分為三組進(jìn)行免疫注射,作用結(jié)果顯示聯(lián)合免疫滅活油乳苗和重組雞補(bǔ)體C3d蛋白的雞群,在免疫后1～7周（即14～57日齡）整個(gè)觀察期內(nèi),不但其胸腺T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA、法氏囊B淋巴細(xì)胞對(duì)PMA的反應(yīng)均明顯強(qiáng)于單純油乳苗免疫組（其中除在接種后第1周時(shí)兩組雞的B淋巴細(xì)胞增殖OD值差異不顯著外,其余各檢測(cè)時(shí)間兩組間均表現(xiàn)為差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）,特別是T淋巴細(xì)胞增殖情況在接種第2周后均表現(xiàn)為差異極顯著（P<0.01））;而且聯(lián)合免疫組的HI抗體效價(jià)水平也持續(xù)性高于單純油乳苗免疫雞群,并在免疫接種后5～7周時(shí)差異顯著（P<0.05）。在免疫接種后第7周時(shí)進(jìn)行的攻毒保護(hù)試驗(yàn)中,聯(lián)合免疫組的保護(hù)率為100%,而單純油乳苗免疫組雞在觀察期內(nèi)則有3只發(fā)病,保護(hù)率為83.3%,且有1只死亡?？傊?本試驗(yàn)所用重組雞補(bǔ)體C3d蛋白和滅活油乳苗聯(lián)合免疫可顯著提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫水平,產(chǎn)生了較好的免疫協(xié)同作用,使機(jī)體對(duì)新城疫病毒的綜合免疫保護(hù)能力得到進(jìn)一步的增強(qiáng),從而初步驗(yàn)證了重組C3d蛋白的免疫佐劑作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐劑F基因疫苗的構(gòu)建及其表達(dá):C3d是補(bǔ)體C3的裂解產(chǎn)物之一,與抗原相連時(shí)可以明顯提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能發(fā)揮過(guò)程中起到重要作用,P29為編碼C3d與CR2結(jié)合區(qū)域的基因。在克隆出C3d cDNA基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)引物克隆P29至pUC19載體,利用同裂酶BamH I和Bgl II構(gòu)建pUC-P29.n。酶切獲得P29.n,將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR擴(kuò)增新城疫F基因,定向克隆至真核表達(dá)載體pcDNA-P29.n中P29.n的上游,構(gòu)建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法檢測(cè)pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表達(dá)。本研究為進(jìn)一步研究補(bǔ)體C3d的分子佐劑效應(yīng)以及開(kāi)發(fā)和利用雞C3d奠定了基礎(chǔ)。6、雞C3d-P29重組質(zhì)粒特異性增強(qiáng)雞補(bǔ)體總活性與C3含量的初步研究:為驗(yàn)證雞補(bǔ)體C3d-P29分子佐劑作用,本試驗(yàn)比較研究了免疫注射含有雞C3d-P29基因重組表達(dá)質(zhì)粒之后的雞血清中補(bǔ)體水平及其補(bǔ)體C3含量與含有異種動(dòng)物（如小鼠）CR2結(jié)合區(qū)基因序列重組質(zhì)?；蚩瞻讓?duì)照之間的差異,以探討雞補(bǔ)體C3d基因重組質(zhì)粒能否特異性的增強(qiáng)雞補(bǔ)體總活性與補(bǔ)體C3含量。根據(jù)構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒不同分為五組對(duì)雞進(jìn)行免疫注射,具體為空白對(duì)照（PBS）組;pcDNA3.1空質(zhì)粒組;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F組;含有新城疫F基因以及雞CR2結(jié)合區(qū)（P29）基因序列C3d-P29六聚體的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6組;含有新城疫F基因以及小鼠CR2結(jié)合區(qū)（P28）基因序列C3d-P28六聚體的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6組。分別采取各組經(jīng)二免后成年雞的新鮮血清,測(cè)定其補(bǔ)體總活性;利用生化合成的C3α鏈N端21肽,經(jīng)免疫家兔后制備的抗雞C3抗體,具有能夠與雞血清中的補(bǔ)體C3發(fā)生特異性反應(yīng)的特性,用來(lái)測(cè)定注射過(guò)不同真核表達(dá)質(zhì)粒后雞血清中C3含量差異。結(jié)果表明,空白對(duì)照（PBS）組;pcDNA3.1空質(zhì)粒組; pcDNA3.1-F組; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6組和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6組五個(gè)試驗(yàn)組雞血清中的補(bǔ)體C3含量分別為0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫雞補(bǔ)體C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6組）的雞血清中補(bǔ)體總活性和C3含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組,差異極顯著（P<0.01）;并且雞C3d重組質(zhì)粒能特異性增強(qiáng)雞補(bǔ)體總活性與C3含量,差異極顯著（P<0.01）。7、新城疫補(bǔ)體C3d分子佐劑疫苗免疫效果的研究:在克隆了雞C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基礎(chǔ)上,構(gòu)建編碼CR2結(jié)合區(qū)P29基因的多聚體,以此多聚體為分子佐劑構(gòu)建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通過(guò)了實(shí)驗(yàn)室安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)。將含有不同個(gè)數(shù)P29基因的多聚體作為分子佐劑的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳劑滅活苗以及質(zhì)粒載體作為對(duì)照分別免疫SPF雞,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分別檢測(cè)不同疫苗免疫后的細(xì)胞免疫和體液免疫水平,并在免疫后第五周進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)。最后,還進(jìn)行了重組雞補(bǔ)體C3d質(zhì)粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表達(dá)重組C3d蛋白（rChC3d）對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞增殖效果對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果表明,以補(bǔ)體C3d-P29為分子佐劑的新城疫F基因重組疫苗安全性好;雖然免疫后抗體水平和保護(hù)率不如新城疫油乳劑滅活苗,但是能夠抵抗致死量病毒的攻擊,具有較好的保護(hù)作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法測(cè)定T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果表明,補(bǔ)體C3d-P29.6佐劑能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,多數(shù)時(shí)間點(diǎn)與油佐劑的效果相當(dāng),部分時(shí)間點(diǎn)顯著強(qiáng)于油佐劑。MTT法檢測(cè)pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6與rChC3d對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞增殖效果顯示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫組峰值較rChC3d協(xié)同免疫組出現(xiàn)時(shí)間稍晚,但隨后質(zhì)粒免疫組可維持在更高的水平值。這表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在體內(nèi)持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)。本研究中C3d分子佐劑疫苗免疫效果的驗(yàn)證,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用雞C3d奠定了基礎(chǔ)。
韓清林[9]（2010）在《天府肉鴨α干擾素的原核表達(dá)及抗病毒活性研究》文中研究指明本文對(duì)天府肉鴨的干擾素進(jìn)行如下系列研究：對(duì)天府肉鴨Ⅰ型干擾素基因IFN-αORF進(jìn)行克隆、鑒定和序列分析；構(gòu)建IFN-αORF基因原核表達(dá)載體；IFN-α原核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究；利用DEF-VSV系統(tǒng),對(duì)稀釋復(fù)性后的天府肉鴨IFN-α成熟蛋白抗病毒活性進(jìn)行了研究,獲得以下結(jié)果：1.天府肉鴨IFN-αORF基因克隆、序列比對(duì)分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)了兩對(duì)加入EcoRⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)的特異性引物,從經(jīng)過(guò)5μg/ml PHA誘導(dǎo)培養(yǎng)的天府肉鴨外周血單核細(xì)胞中提取RNA,采用RT-PCR的方法,擴(kuò)增得到天府肉鴨α干擾素ORF基因的DNA片段。構(gòu)建了pMD18-T-DuIFNα克隆載體并測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果采用DNAStar7.0軟件進(jìn)行序列分析以及與鴨、雞、鵝等GenBank上α干擾素序列進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示天府肉鴨與鴨（X84764）ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性達(dá)到99.5%,氨基酸同源性為98.4%。與鵝（AY524422）核苷酸及氨基酸同源性分別為96.2%,92.15%；與雞（NM205427）的核苷酸及氨基酸同源性分別為73.4%、51.3%。同時(shí)對(duì)該基因所推測(cè)的蛋白進(jìn)行了分析,結(jié)果表明天府肉鴨干擾素有2個(gè)潛在糖基化位點(diǎn),8個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn),信號(hào)肽切割位點(diǎn)28-29位ANA和FS氨基酸之間,存在跨膜區(qū)。2.天府肉鴨IFN-α成熟蛋白基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備構(gòu)建天府肉鴨IFN-α成熟蛋白基因的重組原核表達(dá)載體pET-32a（+）-mDuIFNα,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 （DE3）pLysS表達(dá)菌株,利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),得到大小約為35 kDa的重組融合蛋白,與預(yù)期表達(dá)的蛋白大小相一致,主要以包涵體的形式存在。最佳表達(dá)優(yōu)化條件為0.2 mmol/L的IPTG,37℃下誘導(dǎo)3～4 h。利用純化的重組蛋白制備兔抗高免血清,瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)為1：32。兔抗鴨IFN-α成熟蛋白IgG經(jīng)硫酸銨鹽析和High-Q陰離子交換層析純化具特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。3.天府肉鴨α干擾素成熟蛋白基因原核表達(dá)產(chǎn)物的復(fù)性及抗病毒活性研究對(duì)純化后的天府肉鴨IFN-α成熟蛋白包涵體采用稀釋復(fù)性的方法復(fù)性,采用DEF-VSV系統(tǒng)初步檢測(cè)抗病毒活性,干擾素的抗病毒活性約為256U/ml,比活力為646.4U/mg。結(jié)果發(fā)現(xiàn),表達(dá)的干擾素具有抑制病毒增殖的生物學(xué)活性。
陳斌[10]（2008）在《鴨α干擾素原（真）核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究》文中研究說(shuō)明本文對(duì)四川省內(nèi)地方品種四川麻鴨的干擾素進(jìn)行如下系列研究:對(duì)四川麻鴨Ⅰ型干擾素基因IFN-αORF進(jìn)行克隆、鑒定和序列分析;構(gòu)建IFN-αORF基因原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體;IFN-α原核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究;利用雛鴨為模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒在鴨體內(nèi)的動(dòng)態(tài)表達(dá)分布規(guī)律;同時(shí)對(duì)作為免疫佐劑的pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行研究,獲得以下結(jié)果:1.四川麻鴨IFN-αORF基因克隆、序列比對(duì)分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)了兩對(duì)加入EcoRI和BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的特異性引物對(duì),采用PCR和nest-PCR的方法,從鴨肝臟組織基因組DNA擴(kuò)增得到大小兩個(gè)完全包含麻鴨α干擾素ORF基因的DNA片段。其中小片段更適合用于表達(dá),并將其進(jìn)行pGEM-T載體克隆與測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果采用ClustalX軟件進(jìn)行序列分析以及與北京鴨、雞、鵝等NCBI上序列進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示四川麻鴨與北京鴨ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性達(dá)到99.13%,氨基酸同源性為98.96%。與雞的核苷酸及氨基酸同源性分別為71.8%、49.97-50.47%,與鵝的核苷酸同源性為96%。同時(shí)用BioEdit、NetNGlyc、TreeView軟件對(duì)該基因所推測(cè)的蛋白進(jìn)行了分析,結(jié)果表明四川麻鴨有2個(gè)潛在糖基化位點(diǎn),1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（Protein kinase C phosphorylation）和1個(gè)酪蛋白激酶Ⅲ磷酸化位點(diǎn)（Casein kinaseⅢphosphorylation site）,信號(hào)肽切割位點(diǎn)28-29位ANA和FS氨基酸之間,成熟的鴨α干擾素有5個(gè)疏水區(qū),無(wú)跨膜區(qū)。2.SDIFN-αORF基因原核表達(dá)載體pBV220-SDIFN-α的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性采用BamHI和EcoRI酶切,通過(guò)定向粘末段連接法,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pBV220-SDIFN-α質(zhì)粒。并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌株DH5α中進(jìn)行表達(dá),采用溫度誘導(dǎo)的方式,對(duì)誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示工程菌進(jìn)行了表達(dá),產(chǎn)生的包涵體蛋白分子量為40KD左右。對(duì)純化后的包涵體采用稀釋復(fù)性的方法復(fù)性,采用VSV/DEF系統(tǒng)初步檢測(cè)抗病毒活性,干擾素的抗病毒活性約為150U/ml,比活力為440U/mg。應(yīng)用FQ-PCR檢測(cè)方法,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)抑制DHBV和體外抑制DPV病毒核酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn),表達(dá)的干擾素具有強(qiáng)烈的病毒復(fù)制抑制作用,具有明顯的生物學(xué)活性。3.SDIFN-αORF基因真核表達(dá)載體pcDNA-SDIFN-α的構(gòu)建及鑒定利用合成在引物兩端的EcoRI、BamHI酶切位點(diǎn),將目的基因成功地從pGEM-T載體克隆重組體中切下,并通過(guò)粘端連接的方法,連接到pUC18定向位置上,然后用EcoRI和XbaI雙酶切真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）和pUC18-SDIFN-α,實(shí)現(xiàn)了SDIFN-α定向克隆到pcDNA3.1（+）載體上。四川麻鴨IFN-α真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α經(jīng)BamHI、EcoRI和XbaI三種酶切驗(yàn)證,并測(cè)序證明四川麻鴨IFN-α的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α構(gòu)建正確。4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α在鴨體內(nèi)表達(dá)方法的建立及動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律的研究以pcDNA-SDIFN-α真核質(zhì)粒免疫鴨,分時(shí)間段采集鴨16種不同組織,建立了免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法,并應(yīng)用該方法檢測(cè)干擾素在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律。pcDNA-SDIFN-α免疫鴨后,持續(xù)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9周。能在肺臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、腸腺和腸絨毛細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、皮膚內(nèi)檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物,在14d-35d進(jìn)行了高峰表達(dá)。胸腺、胰腺、法氏囊和哈德氏腺未檢測(cè)到陽(yáng)性黃色顆粒,肺臟、免疫部位最早出現(xiàn)陽(yáng)性顆粒,腦組織細(xì)胞中陽(yáng)性顆粒數(shù)量隨時(shí)間變化較小。其中基因槍免疫鴨后,各組織中的含量和表達(dá)量呈現(xiàn)的總體規(guī)律為6μg組＞3μg組＞1μg組。肌肉注射免疫鴨后,各組織中的含量和表達(dá)量呈現(xiàn)的總體規(guī)律為200μg組＞100μg組＞50μg組,都具有一定的劑量相關(guān)性?；驑屴Z擊法較肌肉注射法IFN-α基因表達(dá)出現(xiàn)的時(shí)間早,3h就可以檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物。同時(shí),相對(duì)于肌肉注射法免疫,基因槍轟擊法所用的表達(dá)質(zhì)粒用量更少。5.真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α在鴨體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)劑活性的初步研究以pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒為免疫調(diào)節(jié)劑,研究對(duì)DPV/DVH弱毒苗免疫活性調(diào)節(jié)作用。分不同時(shí)間段采血,采用MTT法測(cè)定鴨外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效果、CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化和特異性DPV中和抗體IgG水平。結(jié)果表明,一定劑量的pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒作為免疫調(diào)節(jié)劑在一定時(shí)間內(nèi)能促進(jìn)和提高細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,發(fā)揮著有效的正向免疫調(diào)節(jié)作用。
二、肉雞IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大腸桿菌中的表達(dá)（論文開(kāi)題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問(wèn)題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問(wèn)題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫(xiě)法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過(guò)程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁(yè)面大小,采用多級(jí)分層頁(yè)表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁(yè)表轉(zhuǎn)換過(guò)程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過(guò)主支變革、控制研究對(duì)象來(lái)發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過(guò)調(diào)查文獻(xiàn)來(lái)獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過(guò)具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來(lái)分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過(guò)創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來(lái)間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、肉雞IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大腸桿菌中的表達(dá)（論文提綱范文）
（1）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表達(dá)及產(chǎn)物活性鑒定（論文提綱范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 縮略語(yǔ)表 |
| 第一章 犬干擾素研究進(jìn)展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分類(lèi) |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因組成 |
| 1.3 IFN的空間結(jié)構(gòu)及受體研究 |
| 1.4 IFN生物學(xué)活性及作用機(jī)制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬長(zhǎng)效IFN研究 |
| 3 犬IFN臨床應(yīng)用 |
| 3.1 治療犬病毒性傳染病 |
| 3.2 治療犬皮膚性疾病 |
| 3.3 治療眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN應(yīng)用展望 |
| 第二章 白細(xì)胞介素18研究進(jìn)展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)、特性 |
| 1.2 IL-18受體及信號(hào)傳導(dǎo)途徑 |
| 1.3 IL-18結(jié)合蛋白 |
| 2 IL-18生物學(xué)作用 |
| 2.1 IL-18抗腫瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫調(diào)節(jié)作用 |
| 3 IL-18與臨床疾病的關(guān)系 |
| 3.1 IL-18與自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系 |
| 3.3 IL-18與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系 |
| 3.4 IL-18與腫瘤疾病的關(guān)系 |
| 3.5 IL-18與糖尿病等其他疾病的關(guān)系 |
| 4 IL-18應(yīng)用展望 |
| 5 本研究的目的及意義 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆與序列分析 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.1 淋巴細(xì)胞的體外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR擴(kuò)增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列測(cè)定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列測(cè)定及分析 |
| 3 討論 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表達(dá)、純化及活性鑒定 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重組蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重組蛋白純化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性檢測(cè) |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性檢測(cè) |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒臨床應(yīng)用 |
| 3 討論 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列測(cè)定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比較分析及進(jìn)化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重組質(zhì)粒的鑒定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重組蛋白表達(dá)及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重組蛋白純化結(jié)果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物學(xué)活性鑒定 |
| 3 討論 |
| 全文結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
| 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文 |
| 導(dǎo)師簡(jiǎn)介1 |
| 導(dǎo)師簡(jiǎn)介2 |
（2）Thermomyces dupontii脂肪酶高效制備及應(yīng)用研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 脂肪酶簡(jiǎn)介 |
| 1.2 微生物脂肪酶 |
| 1.2.1 細(xì)菌脂肪酶 |
| 1.2.2 真菌脂肪酶 |
| 1.3 脂肪酶異源表達(dá)概述 |
| 1.3.1 脂肪酶在大腸桿菌的重組表達(dá) |
| 1.3.2 脂肪酶在畢赤酵母的重組表達(dá) |
| 1.4 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)概述 |
| 1.4.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介 |
| 1.4.2 畢赤酵母表達(dá)元件簡(jiǎn)介 |
| 1.4.3 畢赤酵母表達(dá)宿主簡(jiǎn)介 |
| 1.4.4 酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白胞外分泌途徑 |
| 1.4.5 外源蛋白在畢赤酵母高效表達(dá)策略 |
| 1.5 脂肪酶溫度優(yōu)化 |
| 1.5.1 提升脂肪酶熱穩(wěn)定性 |
| 1.5.2 提升脂肪酶在低溫條件下的酶活性 |
| 1.6 脂肪酶應(yīng)用研究進(jìn)展 |
| 1.6.1 造紙領(lǐng)域 |
| 1.6.2 畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域 |
| 1.6.3 結(jié)構(gòu)脂領(lǐng)域 |
| 1.6.4 生物柴油領(lǐng)域 |
| 1.6.5 手性拆分合成生物醫(yī)藥中間體 |
| 1.7 本論文的研究背景、意義和內(nèi)容 |
| 1.7.1 研究背景和意義 |
| 1.7.2 研究?jī)?nèi)容 |
| 第二章 不同啟動(dòng)子對(duì)TDL在畢赤酵母表達(dá)的影響 |
| 2.1 材料與儀器 |
| 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.2 主要儀器與設(shè)備 |
| 2.1.3 培養(yǎng)基及溶液的配制 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 畢赤酵母X33 基因組提取 |
| 2.2.2 大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞制備 |
| 2.2.3 不同啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 2.2.4 畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.2.5 重組酵母工程菌種的構(gòu)建及篩選 |
| 2.2.6 重組工程菌的高密度發(fā)酵 |
| 2.2.7 分析檢測(cè)方法 |
| 2.3 結(jié)果和分析 |
| 2.3.1 TDL在不同甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下的表達(dá) |
| 2.3.2 TDL在不同組成型啟動(dòng)子下的表達(dá) |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 不同信號(hào)肽對(duì)TDL在畢赤酵母表達(dá)的影響 |
| 3.1 材料與儀器 |
| 3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.2 主要儀器與設(shè)備 |
| 3.1.3 培養(yǎng)基及溶液的配制 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 畢赤酵母X33 基因組提取 |
| 3.2.2 大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞制備 |
| 3.2.3 不同異源信號(hào)肽表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 3.2.4 同源信號(hào)肽表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 3.2.5 α-MF信號(hào)肽及其突變體表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 3.3 結(jié)果與分析 |
| 3.3.1 TDL在異源信號(hào)肽下的表達(dá) |
| 3.3.2 TDL在同源信號(hào)肽下的表達(dá) |
| 3.3.3 α-MF信號(hào)肽密碼子優(yōu)化對(duì)TDL表達(dá)的影響 |
| 3.3.4 α-MF信號(hào)肽刪減突變 |
| 3.3.5 α-MF增加序列突變 |
| 3.3.6 優(yōu)化信號(hào)肽蛋白酶Kex2 切割位點(diǎn) |
| 3.3.7 綜合搖瓶比較分析 |
| 3.3.8 重組菌D57-74高密度發(fā)酵 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第四章 組合策略提升重組TDL在畢赤酵母的表達(dá) |
| 4.1 材料與儀器 |
| 4.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.1.2 主要儀器與設(shè)備 |
| 4.1.3 培養(yǎng)基及溶液的配制 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.2.1 多拷貝重組TDL工程菌構(gòu)建及篩選 |
| 4.2.2 分子伴侶蛋白共表達(dá) |
| 4.2.3 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化 |
| 4.2.4 重組工程菌大規(guī)模發(fā)酵 |
| 4.3 結(jié)果和討論 |
| 4.3.1 TDL多拷貝重組工程菌構(gòu)建及篩選 |
| 4.3.2 單分子伴侶蛋白共表達(dá) |
| 4.3.3 雙分子伴侶蛋白共表達(dá) |
| 4.3.4 高密度發(fā)酵優(yōu)化 |
| 4.3.5 大規(guī)模高密度發(fā)酵培養(yǎng) |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第五章 理性設(shè)計(jì)優(yōu)化TDL溫度特性 |
| 5.1 材料與儀器 |
| 5.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 |
| 5.1.2 主要儀器與設(shè)備 |
| 5.1.3 培養(yǎng)基及溶液的配制 |
| 5.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 5.2.1 TDL結(jié)構(gòu)分析及分子建模 |
| 5.2.2 去糖基化降低TDL最適反應(yīng)溫度 |
| 5.2.3 去二硫鍵降低TDL最適反應(yīng)溫度 |
| 5.2.4 增加二硫鍵突變體提升重組TDL熱穩(wěn)定性 |
| 5.2.5 點(diǎn)突變提升重組TDL熱穩(wěn)定性 |
| 5.2.6 組合突變提升重組TDL熱穩(wěn)定性 |
| 5.3 結(jié)果和討論 |
| 5.3.1 TDL結(jié)構(gòu)分析及分子建模 |
| 5.3.2 去糖基化降低重組TDL最適反應(yīng)溫度 |
| 5.3.3 去二硫鍵降低重組TDL最適反應(yīng)溫度 |
| 5.3.4 理性設(shè)計(jì)二硫鍵提升TDL熱穩(wěn)定性 |
| 5.3.5 定點(diǎn)突變提升重組TDL熱穩(wěn)定性 |
| 5.3.6 組合突變 |
| 5.4 本章小結(jié) |
| 第六章 TDL及其突變體初步應(yīng)用研究 |
| 6.1 材料與儀器 |
| 6.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 |
| 6.1.2 主要儀器與設(shè)備 |
| 6.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 6.2.1 TDL及其突變體N55D在造紙脫墨的初步應(yīng)用 |
| 6.2.2 TDL及其組合突變體5 在肉雞養(yǎng)殖的初步應(yīng)用 |
| 6.3 結(jié)果與分析 |
| 6.3.1 TDL及其突變體N55D在造紙脫墨的初步應(yīng)用 |
| 6.3.2 TDL及其組合突變體5 在肉雞養(yǎng)殖的初步應(yīng)用 |
| 6.4 本章小結(jié) |
| 結(jié)論與展望 |
| 一、結(jié)論 |
| 二、本研究的創(chuàng)新點(diǎn) |
| 三、前景與展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
| 附件 |
（3）動(dòng)物源腸桿菌中碳青霉烯耐藥基因blaNDM的流行分布及分子傳播機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略詞表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 碳青霉烯類(lèi)抗生素 |
| 1.1.2 碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制 |
| 1.1.3 金屬 β-內(nèi)酰胺酶NDM研究進(jìn)展 |
| 1.2 研究的目的和意義 |
| 1.3 研究技術(shù)路線 |
| 第二章 動(dòng)物源產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌的流行情況及其特點(diǎn) |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 碳青霉烯不敏感菌株的分離結(jié)果 |
| 2.3.2 產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.3.3 碳青霉烯類(lèi)耐藥基因的檢測(cè) |
| 2.3.4 碳青霉烯耐藥基因陽(yáng)性菌的鑒定 |
| 2.3.5 藥物敏感度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 2.4.1 碳青霉烯不敏感菌株的分離、流行與分布情況 |
| 2.4.2 碳青霉烯耐藥基因的檢測(cè)情況 |
| 2.4.3 動(dòng)物源耐藥情況 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第三章 動(dòng)物源腸桿菌中bla_(NDM)基因分子傳播機(jī)制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 結(jié)果與分析 |
| 3.3.1 PFGE結(jié)果 |
| 3.3.2 接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.3 接合子質(zhì)粒酶切圖譜分析 |
| 3.3.4 接合子質(zhì)粒復(fù)制子分型結(jié)果 |
| 3.3.5 S1-PFGE結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 3.4.1 PFGE分析 |
| 3.4.2 攜帶bla_(NDM)基因質(zhì)粒分析 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第四章 動(dòng)物源bla_(NDM)陽(yáng)性腸桿菌基因組分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 結(jié)果與分析 |
| 4.3.1 基因組DNA片段化結(jié)果 |
| 4.3.2 待測(cè)序菌株DNA文庫(kù)構(gòu)建 |
| 4.3.3 食品動(dòng)物源bla_(NDM)陽(yáng)性腸桿菌測(cè)序分析 |
| 4.3.4 候鳥(niǎo)源bla_(NDM)陽(yáng)性腸桿菌測(cè)序分析 |
| 4.3.5 寵物源bla_(NDM)陽(yáng)性腸桿菌測(cè)序分析 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 小結(jié) |
| 第五章 全文討論與結(jié)論 |
| 5.1 全文討論 |
| 5.2 全文結(jié)論 |
| 5.3 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄A 發(fā)表文章及參加的相關(guān)學(xué)術(shù)會(huì)議 |
| 附錄B 攻讀博士期間所獲獎(jiǎng)項(xiàng) |
（4）四個(gè)乳酸菌素的原核表達(dá)及plnK對(duì)黃羽肉雞腸道菌群的影響（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 乳酸菌的概況 |
| 1.1 乳酸菌定義及分類(lèi) |
| 1.2 乳酸菌的特性 |
| 1.3 乳酸菌在畜牧業(yè)上的應(yīng)用 |
| 2 乳酸菌素 |
| 3 乳酸菌素的分類(lèi) |
| 3.1 羊毛硫細(xì)菌素(Class Ⅰ) |
| 3.2 非羊毛硫氨基酸的熱穩(wěn)定小分子多肽(ClassⅡ) |
| 3.3 大分子熱不穩(wěn)定肽(Class Ⅲ) |
| 4 影響乳酸菌素產(chǎn)量的因素 |
| 5 乳酸菌素的抑菌作用 |
| 6 乳酸菌素的應(yīng)用 |
| 6.1 乳酸菌素在食品保鮮中的應(yīng)用 |
| 6.2 乳酸菌素在醫(yī)療中的應(yīng)用 |
| 6.3 乳酸菌素在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用 |
| 6.4 乳酸菌素在動(dòng)物疾病中的應(yīng)用 |
| 7 乳酸菌素的研究趨勢(shì) |
| 8 宏基因組學(xué) |
| 8.1 宏基因組學(xué)概念 |
| 8.2 宏基因組學(xué)的研究方法 |
| 8.3 宏基因組學(xué)在腸道微生物上的研究進(jìn)展 |
| 9 本項(xiàng)目研究的目的和意義 |
| 第二章 乳酸菌素plnE、plnF、plnJ、plnK的原核表達(dá) |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 試驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 plnE蛋白的原核表達(dá) |
| 2.2 plnF蛋白的原核表達(dá) |
| 2.3 plnJ蛋白的原核表達(dá) |
| 2.4 plnK蛋白的原核表達(dá) |
| 2.5 四個(gè)重組蛋白濃度測(cè)定結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第三章 四個(gè)重組乳酸菌素體外抑菌效果的研究 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 試驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 不同濃度的pET-32a(+)-plnE重組乳酸菌素對(duì)指示菌的抑菌結(jié)果 |
| 2.2 不同濃度的pET-32a(+)-plnF重組乳酸菌素對(duì)指示菌的抑菌結(jié)果 |
| 2.3 不同濃度的pET-32a(+)-plnJ重組乳酸菌素對(duì)指示菌的抑菌結(jié)果 |
| 2.4 不同濃度的pET-32a(+)-plnK重組乳酸菌素對(duì)指示菌的抑菌結(jié)果 |
| 2.5 pET-32a(+)-plnE和pET-32a(+)-plnF重組乳酸菌素組合對(duì)指示菌的抑菌結(jié)果 |
| 2.6 pET-32a(+)-plnJ和pET-32a(+)-plnK重組乳酸菌素組合對(duì)指示菌的抑菌結(jié)果 |
| 2.7 牛津杯法檢測(cè)四個(gè)乳酸菌素對(duì)指示菌的抑菌結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第四章 乳酸菌素plnK對(duì)黃羽肉雞腸道菌群的影響 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1試驗(yàn)動(dòng)物及材料 |
| 1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) |
| 1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法 |
| 1.4 數(shù)據(jù)處理分析 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 乳酸菌素plnK對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響 |
| 2.2 乳酸菌素plnK對(duì)肉雞十二指腸黏膜SIgA含量及免疫細(xì)胞因子表達(dá)量的影響 |
| 2.3 乳酸菌素plnK對(duì)肉雞腸道菌群的影響 |
| 3 討論 |
| 3.1 乳酸菌素plnK對(duì)黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響 |
| 3.2 乳酸菌素plnK對(duì)黃羽肉雞腸道黏膜免疫功能的影響 |
| 3.3 乳酸菌素plnK對(duì)黃羽肉雞腸道菌群的影響 |
| 第五章 結(jié)論與展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 常用英文縮略詞表 |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（5）枯草芽孢桿菌黃曲霉毒素降解酶的分離純化、基因克隆及表達(dá)（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮寫(xiě)詞表(Abbreviations) |
| 第一章 緒論 |
| 1 研究目的和意義 |
| 2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 |
| 3 本課題的研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線 |
| 第二章 試驗(yàn)研究 |
| 試驗(yàn)一 飼料及飼料原料中黃曲霉毒素污染情況調(diào)查研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 試驗(yàn)二 枯草芽孢桿菌黃曲霉毒素降解酶的分離純化及鑒定 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 試驗(yàn)三 枯草芽孢桿菌黃曲霉毒素降解酶基因克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá) |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 試驗(yàn)四 重組大腸桿菌黃曲霉毒素降解酶(rBADE)酶學(xué)特性及降解產(chǎn)物致突變性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 試驗(yàn)五 枯草芽孢桿菌降解劑對(duì)采食黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮污染日糧蛋雞的作用效果 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 第三章 結(jié)論與建議 |
| 1 本研究的主要結(jié)論 |
| 2 本論文的創(chuàng)新點(diǎn) |
| 3 有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
（6）黃羽肉雞胰蛋白酶原的原核表達(dá)及體內(nèi)分布研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 禽類(lèi)消化酶的影響因素 |
| 2 胰蛋白酶原與胰蛋白酶 |
| 2.1 胰蛋白酶的結(jié)構(gòu) |
| 2.2 胰蛋白酶的分離純化 |
| 2.3 胰蛋白酶(原)的分子克隆 |
| 2.3.1 真菌胰蛋白酶(原)基因 |
| 2.3.2 無(wú)脊椎動(dòng)物胰蛋白酶(原)基因 |
| 2.3.3 脊椎動(dòng)物胰蛋白酶(原)基因 |
| 2.4 胰蛋白酶的應(yīng)用研究 |
| 2.4.1 胰蛋白酶在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用 |
| 2.4.2 胰蛋白酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用 |
| 2.4.3 胰蛋白酶在現(xiàn)代分子生物學(xué)中的應(yīng)用 |
| 2.4.4 胰蛋白酶在畜牧業(yè)方面的應(yīng)用 |
| 3 研究目的與意義 |
| 第二章 試驗(yàn)部分 |
| 試驗(yàn)一 黃羽肉雞胰蛋白酶原基因的克隆 |
| 1 序言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.1.2 載體和感受態(tài)細(xì)胞 |
| 2.1.3 主要試劑 |
| 2.1.4 主要儀器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.2.2 cDNA的合成及PCR擴(kuò)增 |
| 2.2.3 黃羽肉雞胰蛋白酶原基因cDNA的克隆 |
| 2.2.4 胰蛋白酶原基因序列比較及生物信息學(xué)分析 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 目的基因反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增、克隆和酶切鑒定 |
| 3.2 胰蛋白酶原基因的基本信息 |
| 3.3 黃羽肉雞TRY氨基酸序列預(yù)測(cè)及蛋白質(zhì)性質(zhì)分析 |
| 3.3.1 胰蛋白酶原基因信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.2 胰蛋白酶原基因糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.3 胰蛋白酶原基因磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.4 胰蛋白酶原疏水性、親水性及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.5 胰蛋白酶原二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 |
| 3.3.6 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果分析 |
| 3.3.7 氨基酸序列同源性分析 |
| 3.3.8 胰蛋白酶原遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 |
| 4 討論 |
| 試驗(yàn)二 肉雞胰蛋白酶原基因原核表達(dá)與多克隆抗體制備 |
| 1 序言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.1.2 載體和感受態(tài)細(xì)胞 |
| 2.1.3 主要試劑 |
| 2.1.4 主要儀器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.2.2 黃羽肉雞TRY基因原核表達(dá)載體 |
| 2.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.4 重組質(zhì)粒的鑒定 |
| 2.2.5 重組質(zhì)粒pET-32a-TRY誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化 |
| 2.2.6 重組質(zhì)粒pET-32a-TRY誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.2.7 融合蛋白的ProteinIsoTM Ni-NTA Resin親和層析純化 |
| 2.2.8 目的蛋白免疫印跡鑒定 |
| 2.2.9 多克隆抗體的制備與鑒定 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 TRY基因反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增結(jié)果 |
| 3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 |
| 3.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果分析 |
| 3.4 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果 |
| 3.5 重組質(zhì)粒pET-32a-TRY親和層析純化 |
| 3.6 目的蛋白Western-blot鑒定結(jié)果 |
| 3.7 多克隆抗體血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.8 多克隆抗體鑒定結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 4.1 黃羽肉雞TRY原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)、純化 |
| 4.2 兔抗雞胰蛋白酶原陽(yáng)性血清的制備及蛋白免疫印跡 |
| 試驗(yàn)三 黃羽肉雞胰蛋白酶原的組織分布研究 |
| 1 序言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.1.2 主要試劑 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) |
| 2.2.3 飼養(yǎng)管理 |
| 2.2.4 樣品采集與處理 |
| 2.2.5 免疫組化法定位研究 |
| 2.2.6 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)胰蛋白酶原組織分布 |
| 2.2.7 熒光定量PCR |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 胰蛋白酶原在黃羽肉雞體內(nèi)分布免疫組化初步定位 |
| 3.2 反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)胰蛋白酶原的組織分布情況 |
| 3.3 熒光定量PCR檢測(cè)胰蛋白酶原的組織分布情況 |
| 3.3.1 引物特異性分析 |
| 3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立結(jié)果 |
| 3.3.3 熒光定量PCR結(jié)果分析 |
| 4 討論 |
| 試驗(yàn)四 不同發(fā)育階段黃羽肉雞胰蛋白酶原基因表達(dá)研究 |
| 1 序言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.1.2 主要試劑 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) |
| 2.2.3 飼養(yǎng)管理 |
| 2.2.4 樣品采集與處理 |
| 2.2.5 免疫組化法定位研究 |
| 2.2.6 反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)胰蛋白酶原組織分布 |
| 2.2.7 熒光定量PCR法檢測(cè)胰蛋白酶原組織分布 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 免疫組化法初步定位黃羽肉雞發(fā)育過(guò)程中胰蛋白酶原基因在胰腺中的表達(dá) |
| 3.2 反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)黃羽肉雞發(fā)育過(guò)程中胰蛋白酶原基因的表達(dá) |
| 3.3 熒光定量PCR檢測(cè)胰蛋白酶原的表達(dá)結(jié)果分析 |
| 4 討論 |
| 第三章 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附表 |
| 致謝 |
（7）禽白血病病毒抗原/抗體ELISA檢測(cè)方法的建立及準(zhǔn)種分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目錄 |
| 插圖與附表清單 |
| 縮略詞表 |
| 第一章 引言 |
| 1 禽白血病概況 |
| 1.1 病原學(xué) |
| 1.2 流行病學(xué) |
| 1.3 臨床特征和病理變化 |
| 1.4 禽白血病的檢測(cè)和診斷 |
| 1.5 預(yù)防和控制 |
| 2. 病毒的準(zhǔn)種及其演變 |
| 2.1 準(zhǔn)種的特性 |
| 2.2 準(zhǔn)種的作用 |
| 2.3 準(zhǔn)種的研究方法 |
| 3 本研究的目的與意義 |
| 第二章 禽白血病病毒P27蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和多克隆抗體的制備 |
| 摘要 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 |
| 2.2 重組克隆載體的構(gòu)建與鑒定 |
| 2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定 |
| 2.4 P27蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.5 表達(dá)蛋白的純化 |
| 2.6 表達(dá)蛋白的WESTERN-BLOTTING鑒定 |
| 2.7 兔抗P27蛋白抗體的效價(jià)測(cè)定 |
| 2.8 兔抗P27蛋白抗體的純化 |
| 2.9 兔抗P27抗體的酶標(biāo)化結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第三章 禽白血病病毒抗原ELISA檢測(cè)方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 雙抗體夾心ELISA相關(guān)試驗(yàn)條件的確定 |
| 2.2 陰陽(yáng)性臨界值的確定 |
| 2.3 特異性試驗(yàn) |
| 2.4 敏感性試驗(yàn) |
| 2.5 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 2.6 符合率試驗(yàn) |
| 2.7 保存期試驗(yàn) |
| 2.8 臨床試驗(yàn) |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第四章 禽白血病病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 間接ELISA相關(guān)試驗(yàn)條件的確定 |
| 2.2 陰陽(yáng)性臨界值的確定 |
| 2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.6 符合率試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.7 保存期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第五章 禽弱毒疫苗中ALV的分離鑒定及其全基因組序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 三種活疫苗中ALV的分離鑒定 |
| 2.2 三株ALV全基因組的克隆測(cè)序 |
| 2.3 分離毒株GP85基因的序列分析與亞群鑒定 |
| 2.4 分離毒株與不同亞群參考毒株主要基因區(qū)域的同源性比較 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第六章 血管瘤病雞中AIV-J的分離鑒定及其準(zhǔn)種分析 |
| 摘要 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 病毒分離鑒定 |
| 2.2 血清抗體檢測(cè) |
| 2.3 ALV-J的準(zhǔn)種多樣性 |
| 2.4 氨基酸序列同源性比較 |
| 2.5 細(xì)胞傳代前后準(zhǔn)種比較 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第七章 結(jié)論 |
| 第八章 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
（8）畜禽補(bǔ)體C3d基因克隆及序列分析和重組雞C3d免疫佐劑效果研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐劑的研究進(jìn)展 |
| 綜述一 DNA 疫苗的研究進(jìn)展及其免疫應(yīng)答增強(qiáng)策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究進(jìn)展 |
| 1、核酸疫苗的研究歷史 |
| 2、核酸疫苗的組成和分類(lèi) |
| 2.1 核酸疫苗的組成 |
| 2.2 核酸疫苗的分類(lèi) |
| 3、DNA 疫苗的免疫機(jī)制 |
| 4、核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn) |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影響DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的選擇 |
| 5.2 載體及啟動(dòng)子的選擇 |
| 5.3 增強(qiáng)劑和佐劑的應(yīng)用 |
| 5.4 接種途徑和劑量 |
| 5.5 接種前動(dòng)物組織的預(yù)處理 |
| （二） DNA 疫苗免疫應(yīng)答增強(qiáng)策略 |
| 1、分子佐劑的應(yīng)用 |
| 1.1 細(xì)胞因子基因佐劑 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 補(bǔ)體佐劑 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍亂毒素（choleratoxin，CT）和大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白轉(zhuǎn)換域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模擬或增強(qiáng)MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活時(shí)間和捕捉處理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原處理能力 |
| 1.10 雙作用子的應(yīng)用 |
| 2、通過(guò)基因修飾改變抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、載體的優(yōu)化及選擇 |
| 3.1 質(zhì)粒載體 |
| 3.2 細(xì)菌載體 |
| 3.3 病毒載體 |
| 4、免疫方案的優(yōu)化 |
| 4.1 免疫途徑 |
| 4.2 免疫工具的選擇 |
| 4.3 免疫程序及組合免疫 |
| 5、展望 |
| 綜述二 補(bǔ)體系統(tǒng)概述及C3d 分子佐劑的研究進(jìn)展 |
| （三） 補(bǔ)體系統(tǒng)概述 |
| 1、補(bǔ)體成分的分類(lèi) |
| 1.1 補(bǔ)體系統(tǒng)的固有成分 |
| 1.2 補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子 |
| 1.3 補(bǔ)體受體 |
| 1.4 補(bǔ)體活性片段 |
| 2、補(bǔ)體系統(tǒng)的激活 |
| 2.1 經(jīng)典激活途徑 |
| 2.2 替代途徑 |
| 2.3 凝集素途徑 |
| （四） CR2-C3d 的結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征 |
| 2、C3d-CR2 結(jié)合介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)理 |
| 2.1 C3d-CR2 結(jié)合介導(dǎo)、增強(qiáng)B 細(xì)胞Ag 的內(nèi)化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 結(jié)合促進(jìn)B 細(xì)胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 結(jié)合促進(jìn)記憶性B 細(xì)胞的產(chǎn)生 |
| （五） C3d 分子佐劑的研究進(jìn)展 |
| 1、分子佐劑的應(yīng)用 |
| 2、C3d 的分子結(jié)構(gòu) |
| 3、C3d 分子的佐劑作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗體的水平 |
| 3.2 C3d 可以增強(qiáng)基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促進(jìn)抗HIV-1 衣殼蛋白抗體的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高體液免疫應(yīng)答的同時(shí)增強(qiáng)基因免疫誘導(dǎo)的HBV 特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答 |
| 3.5 C3d 可增強(qiáng)PPS514 的免疫原性、促進(jìn)Ig 類(lèi)別轉(zhuǎn)換 |
| 3.6 C3d 負(fù)調(diào)控HER-2/neu 基因免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答 |
| 3.7 C3d 增強(qiáng)hCGβ的免疫原性、轉(zhuǎn)變免疫應(yīng)答 |
| 3.8 C3d 與靶抗原共表達(dá)的免疫抑制效應(yīng) |
| 4、C3d 分子佐劑作用的可能機(jī)制 |
| 4.1 C3d 偶聯(lián)抗原可增強(qiáng)CR~(2+)細(xì)胞（B 細(xì)胞，F(xiàn)DC 等）對(duì)抗原的攝取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特異性識(shí)別產(chǎn)生抗原刺激信號(hào),同時(shí)又與 B 細(xì)胞表面的CR2 結(jié)合形成交聯(lián)橋，提供共刺激活化信號(hào)，促進(jìn)B 細(xì)胞活化，降低B細(xì)胞的活化閾 |
| 4.3 C3d 通過(guò)結(jié)合CR2、上調(diào)IL-4 和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、促進(jìn)抗體親合力成熟來(lái)增強(qiáng)基因免疫誘導(dǎo)的HBV 特異性免疫應(yīng)答 |
| 4.4 分子佐劑C3d 上調(diào)Raji 細(xì)胞協(xié)同刺激分子B7-1 和B7-2 的表達(dá) |
| 4.5 C3d 的佐劑作用依賴(lài)B 細(xì)胞CR2 受體，且相應(yīng)的抗原必須與C3d 偶聯(lián)在一起才能發(fā)揮作用 |
| （六） 本研究的目的及意義 |
| 第二部分 試驗(yàn)研究部分 |
| 一 不同畜禽補(bǔ)體C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 載體 |
| 1.1.3 試劑及試劑盒 |
| 1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.1.5 主要儀器 |
| 1.1.6 試驗(yàn)所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相關(guān)物品的處理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝臟總RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物設(shè)計(jì) |
| 1.2.3 RT- PCR 擴(kuò)增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受態(tài)細(xì)胞 |
| 1.2.5 PCR 產(chǎn)物與pMD18-T 的連接 |
| 1.2.6 連接物的轉(zhuǎn)化 |
| 1.2.7 重組質(zhì)粒的鑒定 |
| 1.2.8 測(cè)序 |
| 1.2.9 補(bǔ)體C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 補(bǔ)體C3d 基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 RT-PCR 擴(kuò)增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鑒定 |
| 2.3 補(bǔ)體C3d cDNA 的測(cè)序及序列分析 |
| 2.3.1 測(cè)序結(jié)果遞交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 軟件進(jìn)行C3d 基因序列比較分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 軟件進(jìn)行CR2 結(jié)合區(qū)氨基酸同源性比較 |
| 2.4 蛋白序列結(jié)構(gòu)及功能特征預(yù)測(cè) |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序?qū)3d 基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序?qū)3d 基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白功能推測(cè)分析 |
| 2.4.3 補(bǔ)體C3d 基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 |
| 2.4.4 補(bǔ)體C3d 基因編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 |
| 3 討論 |
| 二 雞補(bǔ)體C3d 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其重組蛋白的純化 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 載體與受體菌 |
| 1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.1.3 試劑 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑 |
| 1.1.5 包涵體純化的有關(guān)試劑 |
| 1.1.6 免疫轉(zhuǎn)印有關(guān)試劑和材料 |
| 1.1.7 儀器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 雞肝臟總RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、測(cè)序 |
| 1.2.3 C3d 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 1.2.4 重組質(zhì)粒的提取與初步篩選 |
| 1.2.5 pET-C3d 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 1.2.6 重組菌表達(dá)條件的優(yōu)化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳 |
| 1.2.8 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting 檢測(cè) |
| 1.2.9 重組表達(dá)蛋白的純化 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鑒定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表達(dá)載體的PCR 及酶切鑒定 |
| 2.3 重組蛋白的表達(dá) |
| 2.4 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)最佳濃度的確定 |
| 2.5 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)最佳作用時(shí)間的確定 |
| 2.6 目的蛋白的表達(dá)量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 結(jié)果 |
| 2.8 融合蛋白的純化 |
| 2.8.1 硫酸銨鹽析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝膠過(guò)濾層析 |
| 2.8.3 蛋白質(zhì)純度的鑒定 |
| 2.8.4 蛋白濃度的測(cè)定 |
| 3 討論 |
| 3.1 重組C3d 原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇 |
| 3.2 重組C3d 目的蛋白的表達(dá) |
| 3.3 重組C3d 目的蛋白的復(fù)性 |
| 3.4 重組C3d 目的蛋白的檢測(cè)鑒定 |
| 3.5 重組C3d 目的蛋白的分離提純 |
| 三 雞補(bǔ)體C3d 重組蛋白對(duì)大腸桿菌疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗體 |
| 1.1.2 SPF 雞血清及SPF 雞 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西蘭白兔 |
| 1.1.5 1%致敏綿羊紅細(xì)胞 |
| 1.1.6 主要試劑 |
| 1.2 C3d 佐劑大腸桿菌疫苗的制備 |
| 1.2.1 重組C3d 蛋白的分離純化 |
| 1.2.2 大腸桿菌抗原的制備 |
| 1.2.3 C3d 與大腸桿菌抗原的連接 |
| 1.3 C3d 佐劑疫苗的作用效果試驗(yàn) |
| 1.3.1 動(dòng)物試驗(yàn)免疫方案 |
| 1.3.2 抗體效價(jià)的檢測(cè)（間接ELISA 方法） |
| 1.3.3 總補(bǔ)體活性測(cè)定（微量板溶血法） |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 不同佐劑疫苗的效果比較 |
| 2.2 疫苗注射對(duì)補(bǔ)體總活性的影響 |
| 3 討論 |
| 四 雞補(bǔ)體C3d 重組蛋白對(duì)新城疫病毒滅活油乳苗的免疫增強(qiáng)作用研究 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳劑滅活苗 |
| 1.1.2 重組C3d 佐劑新城疫油乳劑滅活苗的制備 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 實(shí)驗(yàn)用雞 |
| 1.1.6 主要試劑及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重組C3d 蛋白的純化制備 |
| 1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組免疫及樣品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗體的檢測(cè) |
| 1.2.4 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn) |
| 1.2.6 數(shù)據(jù)處理 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 三組試驗(yàn)雞在免疫接種后不同時(shí)期HI 抗體的檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.2 三組試驗(yàn)雞在免疫接種后不同時(shí)期法氏囊B 淋巴細(xì)胞增殖情況 |
| 2.3 三組試驗(yàn)雞在免疫接種后不同時(shí)期胸腺T 淋巴細(xì)胞增殖情況 |
| 2.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 3.1 C3d 分子佐劑與淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn)（MTT 法） |
| 3.2 重組C3d 蛋白和滅活油乳苗的免疫協(xié)同作用 |
| 3.3 重組C3d 分子佐劑研究意義及現(xiàn)狀 |
| 五 雞補(bǔ)體C3d-p29 多聚體與新城疫 F 基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá) |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備 |
| 1.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 1.1.2 主要儀器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串聯(lián)體的構(gòu)建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的構(gòu)建 |
| 1.2.3 RT-PCR 擴(kuò)增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF) |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐劑F 基因疫苗的構(gòu)建 |
| 2.2 構(gòu)建P29 串聯(lián)體 |
| 2.2.1 單拷貝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串聯(lián)體的構(gòu)建 |
| 2.3 RT-PCR 擴(kuò)增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表達(dá)蛋白的檢測(cè)結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 3.1 DNA 疫苗佐劑研究的意義 |
| 3.2 抗原基因的選擇及C3d-P29 多聚體的構(gòu)建 |
| 3.3 脂質(zhì)體及影響其轉(zhuǎn)染CEF 細(xì)胞的因素 |
| 六 雞C3d-P29 重組質(zhì)粒特異性增強(qiáng)雞補(bǔ)體總活性與C3 含量的初步研究 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要儀器設(shè)備 |
| 1.1.2 主要試劑 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫注射 |
| 1.2.2 不同試驗(yàn)組雞血清補(bǔ)體總活性的測(cè)定 |
| 1.2.3 各試驗(yàn)組雞血清中總補(bǔ)體活性測(cè)定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗雞C3 21 肽抗體的制備 |
| 1.2.5 抗雞C3 21 肽抗體工作濃度的確定 |
| 1.2.6 C3 含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 |
| 1.2.7 各試驗(yàn)組雞血清補(bǔ)體C3 含量的測(cè)定 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 各試驗(yàn)組雞血清中補(bǔ)體總活性 |
| 2.1.1 溶血素效價(jià)的測(cè)定 |
| 2.1.2 各試驗(yàn)組雞血清中補(bǔ)體總活性的測(cè)定 |
| 2.2 兔抗雞C3 21 肽IgG 抗體工作濃度的確定 |
| 2.3 溶液中C3 含量與OD 值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線 |
| 2.4 各試驗(yàn)組雞血清中補(bǔ)體C3 的含量、 |
| 3. 討論 |
| 3.1 微量板溶血法測(cè)定動(dòng)物血清補(bǔ)體的效價(jià) |
| 3.2 影響補(bǔ)體效價(jià)測(cè)定的因素 |
| 3.3 補(bǔ)體總活性與動(dòng)物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗體的制備 |
| 3.5 補(bǔ)體C3 與動(dòng)物的抗病力 |
| 七 新城疫補(bǔ)體C3d 分子佐劑疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用試劑配制 |
| 1.1.2 制備新城疫油乳劑滅活苗用佐劑 |
| 1.1.3 新城疫油乳劑滅活苗的制備 |
| 1.1.4 ELISA 常用試劑 |
| 1.1.5 主要儀器設(shè)備 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重組質(zhì)粒的大量提取 |
| 1.2.2 質(zhì)粒的安全性檢驗(yàn) |
| 1.2.3 質(zhì)粒疫苗的體液免疫效果檢測(cè) |
| 1.2.4 攻毒保護(hù)試驗(yàn) |
| 1.2.5 病毒排放的檢測(cè) |
| 1.2.6 解剖檢查 |
| 1.2.7 重組質(zhì)粒疫苗的細(xì)胞免疫效果檢測(cè) |
| 1.2.8 重組雞補(bǔ)體C3d 質(zhì)粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表達(dá)重組C3d 蛋白（rChC3d）對(duì)外周血T 淋巴細(xì)胞增殖效果對(duì)比試驗(yàn) |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 安全性檢驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.2 血凝抑制抗體變化 |
| 2.3 間接ELISA 法檢測(cè)NDV 抗體最佳工作濃度的確定結(jié)果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雛雞體內(nèi)誘導(dǎo)抗體的檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.6 免疫雞攻毒后的病毒分離結(jié)果 |
| 2.7 重組質(zhì)粒疫苗細(xì)胞免疫效果的檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 與rChC3d對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞增殖效果對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意義 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫劑量的選擇 |
| 3.3 采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（MTT 法）進(jìn)行外周血T 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)效果的討論 |
| 3.4 本源動(dòng)物補(bǔ)體C3d 及抗原基因的選擇 |
| 3.5 C3d 的CR2 結(jié)合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐劑作用的可能機(jī)制 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄一 C3d 基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) |
| 附錄二 使用garnier 軟件對(duì)C3d 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 |
| 致謝 |
| 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文情況 |
（9）天府肉鴨α干擾素的原核表達(dá)及抗病毒活性研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 干擾素概述 |
| 2 干擾素的種類(lèi)及結(jié)構(gòu) |
| 3 干擾素的生物學(xué)活性及其機(jī)制 |
| 3.1 干擾素的抗病毒作用機(jī)理 |
| 3.2 干擾素的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理 |
| 3.3 干擾素抗腫瘤作用及機(jī)理 |
| 3.4 干擾素與神經(jīng)內(nèi)分泌之間的相互作用 |
| 4 病毒對(duì)干擾素的抵抗 |
| 5 禽類(lèi)干擾素研究進(jìn)展 |
| 6 研究目的及意義 |
| 第二章 天府肉鴨α干擾素基因的T克隆及生物信息學(xué)分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株/載體/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2 主要試劑及配制 |
| 1.3 主要儀器設(shè)備 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 引物設(shè)計(jì) |
| 2.2 鴨外周血有核細(xì)胞的分離培養(yǎng)及細(xì)胞總RNA的提取 |
| 2.3 鴨IFN-α基因的擴(kuò)增 |
| 2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化 |
| 2.5 PCR純化產(chǎn)物與克隆載體的連接 |
| 2.6 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.7 轉(zhuǎn)化 |
| 2.8 鴨IFN-α基因陽(yáng)性重組子的鑒定 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 鴨IFN-α基因的擴(kuò)增 |
| 3.2 鴨IFN-α基因克隆質(zhì)粒pMD18-T-DuIFNα的鑒定 |
| 3.3 生物信息學(xué)分析 |
| 4 討論 |
| 4.1 RNA提取 |
| 4.2 生物信息學(xué)分析 |
| 4.3 密碼子偏嗜性分析 |
| 第三章 鴨IFN-α基因的原核表達(dá)及抗病毒活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株/毒株/載體/試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2 主要試劑及配制 |
| 1.3 主要儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 天府肉鴨IFN-α基因的亞克隆 |
| 2.2 重組蛋白的表達(dá) |
| 2.3 鴨IFN-α成熟蛋白的純化 |
| 2.4 多克隆抗體的制備及效價(jià)檢測(cè) |
| 2.5 免疫兔血清的Western Blotting檢測(cè) |
| 2.6 抗體IgG的粗提和純化 |
| 2.7 重組鴨α干擾素包涵體溶解蛋白的復(fù)性 |
| 2.8 重組鴨α干擾素活性測(cè)定 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 天府肉鴨IFN-α基因的亞克隆 |
| 3.2 重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及條件優(yōu)化 |
| 3.3 鴨IFN-α成熟蛋白的純化 |
| 3.4 兔抗鴨α干擾素成熟蛋白多克隆抗體效價(jià)檢測(cè) |
| 3.5 抗體IgG的粗提和純化 |
| 3.6 天府肉鴨α干擾素成熟蛋白的抗病毒活性研究 |
| 4 討論 |
| 4.1 表達(dá)載體、宿主菌的選擇和融合表達(dá)的意義 |
| 4.2 重組蛋白的表達(dá)、純化 |
| 4.3 天府肉鴨α干擾素成熟蛋白的復(fù)性 |
| 4.4 天府肉鴨α干擾素成熟蛋白的抗病毒活性研究 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
（10）鴨α干擾素原（真）核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 縮略詞表 |
| 第一部分 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一章 干擾素研究進(jìn)展 |
| 一、干擾素的種類(lèi)和結(jié)構(gòu) |
| 二、干擾素生物學(xué)特點(diǎn) |
| 三、禽類(lèi)干擾素研究進(jìn)展 |
| 四、獸醫(yī)領(lǐng)域基因工程干擾素的應(yīng)用研究 |
| 第二章 佐劑及遺傳佐劑研究進(jìn)展 |
| 一、協(xié)同刺激分子(共刺激分子)佐劑 |
| 二、CpG DNA序列和脂質(zhì)體 |
| 三、細(xì)胞因子佐劑 |
| 四、影響遺傳佐劑效果的其他因素 |
| 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究 |
| 第三章 四川麻鴨α干擾素基因的克隆及序列分析 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 麻鴨 |
| 1.2 酶及試劑 |
| 1.3 主要儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 SDIFN-αORF基因的克隆 |
| 2.2 目的基因的序列測(cè)定與分析 |
| 3.結(jié)果與分析 |
| 3.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 |
| 3.2 nest-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 |
| 3.3 PCR和nest-PCR產(chǎn)物比較 |
| 3.4 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 |
| 3.5 重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果 |
| 3.6 IFN-α序列 |
| 3.7 序列分析 |
| 3.8 糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)分析 |
| 3.9 信號(hào)肽預(yù)測(cè) |
| 3.10 疏水性分析 |
| 3.11 跨膜區(qū)和高級(jí)結(jié)構(gòu)分析 |
| 3.12 同源性分析和進(jìn)化比較 |
| 4.討論 |
| 4.1 引物設(shè)計(jì) |
| 4.2 基因擴(kuò)增 |
| 4.3 T載體克隆 |
| 4.4 生物信息學(xué)分析 |
| 5、小結(jié) |
| 第四章 鴨α干擾素基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 四川麻鴨IFN-α原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建技術(shù)路線 |
| 2.2 SDIFN-α原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 2.3 重組質(zhì)粒的鑒定 |
| 2.4 pBV220-SDIFN-α原核表達(dá)菌株的初步表達(dá) |
| 2.5 鴨α-IFN包涵體純化及復(fù)性 |
| 2.6 采用細(xì)胞病變抑制法(DEF/VSV系統(tǒng))初步測(cè)定干擾素抗病毒活性 |
| 2.7 FQ-PCR檢測(cè)干擾素抗病毒活性 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 菌株P(guān)CR擴(kuò)增鑒定結(jié)果 |
| 3.2 pBV220-SDIFN-α質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 |
| 3.3 pBV220-SDIFN-α序列測(cè)定 |
| 3.4 pBV220-SDIFN-α的原核表達(dá)情況 |
| 3.5 表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性 |
| 4 討論 |
| 4.1 關(guān)于表達(dá)系統(tǒng)及表達(dá)質(zhì)粒的選擇 |
| 4.2 關(guān)于感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化 |
| 4.3 關(guān)于重組質(zhì)粒的鑒定 |
| 4.4 關(guān)于基因表達(dá) |
| 4.5 關(guān)于表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性測(cè)定 |
| 5 小結(jié) |
| 第五章 四川麻鴨α干擾素基因(SDIFN-α)真核表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 四川麻鴨IFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 2.2 pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒的單雙酶切鑒定 |
| 2.3 pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒序列測(cè)定 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 四川麻鴨IFN-α基因的獲取 |
| 3.2 pUC-SDIFN-α酶切鑒定結(jié)果 |
| 3.3 pcDNA-SDIFN-α酶切鑒定結(jié)果 |
| 3.4 pcDNA-SDIFN-α序列測(cè)定 |
| 4 討論 |
| 4.1 構(gòu)建SDIFN-α的真核表達(dá)重組體的意義 |
| 4.2 四川麻鴨IFN-α的真核表達(dá)載體的克隆 |
| 5、小結(jié) |
| 第六章 免疫組織化學(xué)檢測(cè)鴨α干擾素方法的建立及鴨α干擾素真核表達(dá)質(zhì)粒在免疫鴨體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2、實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α的大量提取 |
| 2.2 質(zhì)粒的純化 |
| 2.3 含pcDNA-SDIFN-α的基因槍子彈的制備 |
| 2.4 實(shí)驗(yàn)鴨免疫分組設(shè)計(jì) |
| 2.5 采樣時(shí)間與部位 |
| 2.6 兔抗鴨IFN高免血清的制備及其IgG提取純化 |
| 2.7 兔抗鴨IFN-IgG的檢測(cè)及分析 |
| 2.8 免疫組織化學(xué)法方法的建立 |
| 2.9 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 |
| 3、結(jié)果與分析 |
| 3.1 表達(dá)質(zhì)粒純化及檢測(cè) |
| 3.2 原核表達(dá)產(chǎn)物SDIFN—a抗原的制備 |
| 3.3 SDIFN—a蛋白的純化 |
| 3.4 瓊擴(kuò)檢測(cè)及分析 |
| 3.5 ELISA檢測(cè)及分析 |
| 3.6 Western-Blotting檢測(cè)及分析 |
| 3.7 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)及真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α體內(nèi)動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律 |
| 4、討論 |
| 4.1 質(zhì)粒提取及純化。 |
| 4.2 抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè) |
| 4.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)表達(dá)規(guī)律。 |
| 5、小結(jié) |
| 第七章 鴨α干擾素真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA-SDIFN-α免疫調(diào)節(jié)劑研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 質(zhì)粒的制備及純化 |
| 2.2 基因槍子彈的制備 |
| 2.3 動(dòng)物分組和免疫 |
| 2.4 血樣的采集和處理 |
| 2.5 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) |
| 2.6 CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè) |
| 2.7 血清IgG的檢測(cè) |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α以不同途徑、不同劑量與DPV/DVH弱毒作用后鴨外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效果 |
| 3.2 質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α以不同途徑、不同劑量與DVH弱毒作用鴨后激發(fā)外周血CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化 |
| 3.3 質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α以不同途徑、不同劑量與DPV弱毒作用鴨后血清抗體水平的動(dòng)態(tài)變化 |
| 4 討論 |
| 4.1 質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α作用鴨后對(duì)弱毒苗激發(fā)鴨外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響 |
| 4.2 質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α作用鴨后對(duì)疫苗免疫鴨的外周血CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響 |
| 4.3 質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α免疫途徑、劑量、時(shí)間對(duì)疫苗免疫效果的影響 |
| 4.4 a-干擾素抗病毒活性與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系 |
| 5、小結(jié) |
| 第三部分 結(jié)論: |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附表 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 |
| 附圖 免疫組織化學(xué)檢測(cè)圖譜 |
| 致謝 |
| 發(fā)表論文及作者簡(jiǎn)介 |
四、肉雞IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大腸桿菌中的表達(dá)（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表達(dá)及產(chǎn)物活性鑒定[D]. 宋世斌. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020(01)
- [2]Thermomyces dupontii脂肪酶高效制備及應(yīng)用研究[D]. 王建榮. 華南理工大學(xué), 2019(06)
- [3]動(dòng)物源腸桿菌中碳青霉烯耐藥基因blaNDM的流行分布及分子傳播機(jī)制研究[D]. 楊潤(rùn)時(shí). 華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019
- [4]四個(gè)乳酸菌素的原核表達(dá)及plnK對(duì)黃羽肉雞腸道菌群的影響[D]. 樊倩. 福建農(nóng)林大學(xué), 2017(01)
- [5]枯草芽孢桿菌黃曲霉毒素降解酶的分離純化、基因克隆及表達(dá)[D]. 賈如. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016(04)
- [6]黃羽肉雞胰蛋白酶原的原核表達(dá)及體內(nèi)分布研究[D]. 詹湉湉. 福建農(nóng)林大學(xué), 2016(04)
- [7]禽白血病病毒抗原/抗體ELISA檢測(cè)方法的建立及準(zhǔn)種分析[D]. 毛婭卿. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014(08)
- [8]畜禽補(bǔ)體C3d基因克隆及序列分析和重組雞C3d免疫佐劑效果研究[D]. 劉棟. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010(05)
- [9]天府肉鴨α干擾素的原核表達(dá)及抗病毒活性研究[D]. 韓清林. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010(04)
- [10]鴨α干擾素原（真）核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究[D]. 陳斌. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008(01)
標(biāo)簽：重組蛋白論文; 基因合成論文; 大腸桿菌論文; 質(zhì)粒載體論文; 問(wèn)題疫苗論文;