一、Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗與常規(guī)DNA疫苗的比較（論文文獻(xiàn)綜述）
李文桂,陳雅棠[1]（2019）在《重組Semliki森林病毒疫苗的研制現(xiàn)狀》文中指出Semliki森林病毒引起的Semliki腦炎是一種自然疫原性疾病。該病毒可誘導(dǎo)感染的宿主產(chǎn)生細(xì)胞、體液和黏膜免疫應(yīng)答,可通過分子生物學(xué)技術(shù)改造為理想的疫苗載體,從而表達(dá)病毒和細(xì)菌的多種蛋白。這些病原體包括流行性感冒病毒、馬流感病毒、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、豬瘟病毒、羅氏病病毒、乙型肝炎病毒、豬園環(huán)病毒Ⅱ型、布魯氏菌、肉毒梭菌等,本文對(duì)Semliki森林病毒介導(dǎo)的病原體疫苗的研制現(xiàn)狀加以闡述。
張瑞環(huán)[2]（2020）在《流行性腹瀉多表位復(fù)制子DNA疫苗的設(shè)計(jì)、制備及初步免疫評(píng)價(jià)》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理由病原微生物感染引發(fā)的細(xì)菌性腹瀉,是許多發(fā)展中國家常見的健康問題。特別是年齡在5歲以下的嬰幼兒腹瀉以及旅行者腹瀉,目前并沒有可用疫苗。臨床研究數(shù)據(jù)顯示單一致病菌疫苗,無法應(yīng)對(duì)病原菌的多樣性和多態(tài)性,導(dǎo)致無法引起對(duì)于細(xì)菌性腹瀉的整體保護(hù)。因此我們的主要研究內(nèi)容是開發(fā)新型安全,有效的聯(lián)合腹瀉疫苗制劑。核酸疫苗作為聯(lián)合疫苗載體具有便于實(shí)現(xiàn)多抗原聯(lián)合免疫、制備過程簡便快速,可同時(shí)誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫等優(yōu)勢(shì),但存在在大型動(dòng)物以及人類中的免疫應(yīng)答水平較低等缺點(diǎn)。因此本研究的目的為研發(fā)一種同時(shí)針對(duì)ETEC和Shigella兩種病原菌的多價(jià)DNA疫苗,研究內(nèi)容主要涉及多價(jià)DNA疫苗的設(shè)計(jì)和高效表達(dá)載體的選擇,因此,本研究開展了如下的工作,并取得相應(yīng)成效:首先,針對(duì)ETEC致病菌的主要致病因子LTB、CfaE、CssA,S.Sonnei致病菌的主要致病因子IPaB,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行B和T細(xì)胞表位的篩選,選擇16個(gè)優(yōu)勢(shì)表位包括線性B細(xì)胞表位（4個(gè)）、非線性B細(xì)胞表位（4個(gè)）、HTL表位（4個(gè)）以及CTL表位（4個(gè)）,理性設(shè)計(jì)MEG和MB多表位序列,通過3D結(jié)構(gòu)模擬及抗原性預(yù)測(cè),最終獲得抗原指數(shù)高達(dá)0.94的多表位序列。其次,選擇可高效表達(dá)外源蛋白的復(fù)制子載體pSFV,構(gòu)建重組質(zhì)粒pSFV-MEG和pSFV-MB作為DNA候選疫苗。在體外細(xì)胞中,對(duì)其進(jìn)行免疫熒光和細(xì)胞凋亡能力的初步檢測(cè)。結(jié)果表明,MEG和MB抗原蛋白可在真核細(xì)胞中正常表達(dá)。最后,利用脂質(zhì)體-聚合物雜化納米顆粒遞送系統(tǒng)（PLNPs）,制備DNA疫苗制劑,并在BALB/C小鼠中進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,候選疫苗pSFV-MEG/PLNPs,以100μg/次的劑量,經(jīng)三次免疫小鼠后,與PBS和空白PLNPs陰性對(duì)照組相比,可誘發(fā)小鼠血清中顯著的IgG抗體水平（P<0.01）,且相較于普通疫苗載體,pSFV疫苗載體在血清中誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的抗體水平,具有顯著性差異（P<0.05）;小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞中,CD4+T細(xì)胞比例增加,CD8+T細(xì)胞比例下降,CD4+T/CD8+T 比值增加,表明候選疫苗pSFV-MEG/PLNPs可激活機(jī)體的細(xì)胞免疫系統(tǒng)。因此證明pSFV-MEG/PLNPs可作為抗流行性腹瀉的候選疫苗。綜上,本研究利用生物信息學(xué)工具對(duì)流行性腹瀉主要致病菌進(jìn)行B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位篩選,經(jīng)過理性設(shè)計(jì),構(gòu)建復(fù)制子DNA疫苗表達(dá)載體（pSFV-MEG）,應(yīng)用脂質(zhì)體-聚合物雜化納米顆粒遞送系統(tǒng),制備相應(yīng)的DNA疫苗制劑,經(jīng)過抗體水平及細(xì)胞免疫水平檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pSFV-MEG/PLNPs疫苗可以誘發(fā)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫,因此可作為有潛力的候選疫苗,為解決細(xì)菌性腹瀉提供新的設(shè)計(jì)思路和研究基礎(chǔ)。
鄧瑤,管潔,殷霄,文波,陳紅,王文,譚文杰[3]（2015）在《表達(dá)丙型肝炎病毒多個(gè)融合抗原的復(fù)制型DNA疫苗在小鼠體內(nèi)免疫原性的研究》文中研究指明目的探索新型的基于丙型肝炎病毒（HCV）多個(gè)靶抗原的復(fù)制型DNA疫苗的免疫效果。方法本研究構(gòu)建了兩種表達(dá)基于HCV中國1b代表株（河北株）多個(gè)靶抗原的復(fù)制型DNA疫苗:pSCK-CE1E2Y（核心蛋白Core、包膜蛋白E1、E2抗原）和pSCK-H155（Core、E1、E2、非結(jié)構(gòu)蛋白NS3融合抗原）,蛋白印跡試驗(yàn)分析靶抗原表達(dá),皮內(nèi)電轉(zhuǎn)法免疫BAIB/c小鼠后評(píng)價(jià)其免疫應(yīng)答,采用表達(dá)異型（JFH1,2a型）HCV多聚蛋白的重組痘苗病毒接種的小鼠攻擊替代模型進(jìn)行保護(hù)效果分析。結(jié)果蛋白印跡試驗(yàn)表明DNA疫苗中靶抗原體外可有效表達(dá);兩種DNA疫苗均可誘導(dǎo)多抗原特異的抗體反應(yīng)及T細(xì)胞免疫應(yīng)答;未檢測(cè)到明顯的交叉免疫保護(hù)。結(jié)論兩種復(fù)制型DNA疫苗均可誘導(dǎo)針對(duì)多抗原的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答,但不能誘導(dǎo)有效的交叉保護(hù)。本研究為HCV新型疫苗研制提供了一定參考。
付強(qiáng),郭廣君,程立坤,王艷[4]（2014）在《兔病毒性出血癥DNA疫苗研究進(jìn)展》文中研究指明兔病毒性出血癥是養(yǎng)兔業(yè)最重要的疾病之一,其發(fā)病急,致死率高,可對(duì)養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,在疫苗研究方面,由于傳統(tǒng)組織滅活疫苗存在諸多缺點(diǎn),迫切需要研制新型疫苗。本文主要從兔病毒性出血癥DNA疫苗的構(gòu)建、免疫佐劑、臨床免疫途徑以及臨床使用的效果等方面進(jìn)行簡要介紹。
李盼,張亮,王宇,朱曉明,張巍,徐元基,于繼云,閻瑾琦[5]（2013）在《復(fù)制子熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pSVK-luc的構(gòu)建與應(yīng)用》文中研究說明目的為研究復(fù)制子DNA疫苗在生物活體內(nèi)的表達(dá)情況,構(gòu)建含有熒光素酶報(bào)告基因的復(fù)制子表達(dá)質(zhì)粒pSVK-luc。方法 PCR擴(kuò)增熒光素酶報(bào)告基因,克隆入DNA復(fù)制子載體pSVK,酶切鑒定和測(cè)序分析篩選陽性重組質(zhì)粒pSVK-luc;化學(xué)法轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法檢測(cè)熒光素酶基因在293T細(xì)胞中的表達(dá);利用基因電穿孔導(dǎo)入儀遞送重組質(zhì)粒至BALB/c小鼠股四頭肌,活體成像儀動(dòng)態(tài)觀測(cè)熒光素酶基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果 pSVK-luc經(jīng)相應(yīng)酶切和測(cè)序鑒定,與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致。流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光檢測(cè)均可見熒光素酶基因表達(dá);同時(shí)活體成像儀也能檢測(cè)到該基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。結(jié)論 pSVK-luc表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功將為復(fù)制子DNA疫苗體內(nèi)作用機(jī)制研究和體內(nèi)電穿孔遞送條件的優(yōu)化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
王春花,孫元,仇華吉[6]（2013）在《新型豬瘟疫苗研究進(jìn)展》文中研究指明豬瘟是由豬瘟病毒引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病。該病呈世界性分布,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,疫苗接種仍然是防控豬瘟的主要手段。雖然傳統(tǒng)的豬瘟弱毒疫苗（如C株）安全有效,但豬瘟的臨床表現(xiàn)發(fā)生了很大變化,呈現(xiàn)典型豬瘟和非典型豬瘟共存、隱性感染和持續(xù)感染并現(xiàn),免疫失敗的現(xiàn)象時(shí)有報(bào)道,且不能區(qū)分野毒感染和免疫接種。因此,研制安全、高效、能區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動(dòng)物（DIVA）的新型豬瘟疫苗極為必要。文中就近年來開發(fā)的核酸疫苗、病毒活載體疫苗、基于蛋白/肽的疫苗、基因缺失疫苗、嵌合瘟病毒疫苗等新型DIVA豬瘟疫苗作一綜述。
王偉[7]（2013）在《新型可復(fù)制型廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究》文中指出研究背景：繼預(yù)防性疫苗之后，伴隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的不斷深入發(fā)展，近年來治療性疫苗發(fā)展迅速。通過重新喚起機(jī)體對(duì)靶抗原的免疫應(yīng)答能力，治療性疫苗可以在患病個(gè)體誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，清除病原體或異常細(xì)胞，使疾病得以治愈。治療性疫苗已經(jīng)成為防治惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要技術(shù)手段。由于DNA疫苗具有抗原性特異、應(yīng)用安全及生產(chǎn)便捷的顯著優(yōu)點(diǎn)，作為一種特殊的高技術(shù)生物治療藥物，多種類型的DNA疫苗已經(jīng)進(jìn)入了臨床前期及臨床試驗(yàn)。針對(duì)惡性腫瘤治療中的核心難題―免疫耐受‖，基于自主研發(fā)的可復(fù)制型DNA疫苗載體系統(tǒng)，本課題組開展了治療性疫苗的免疫增效策略研究，并成功構(gòu)建了新型雙質(zhì)?？蓮?fù)制型抗腫瘤DNA疫苗。我們選擇在多種實(shí)體腫瘤中廣泛表達(dá)的兩種腫瘤抗原HCG和Survivin，并選擇與腫瘤血管新生關(guān)系密切的靶點(diǎn)VEGFR2，利用異種化抗原設(shè)計(jì)技術(shù)，構(gòu)建了抗腫瘤多靶點(diǎn)異種同源基因復(fù)合抗原，可以有效打破腫瘤對(duì)自身抗原的免疫耐受，激活高效的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，從而提高腫瘤臨床治愈率。研究目的：在實(shí)驗(yàn)室前期堅(jiān)實(shí)的工作基礎(chǔ)之上，構(gòu)建由CAVA及CAVE組成的可復(fù)制型雙質(zhì)粒DNA疫苗，通過肌肉注射聯(lián)合電脈沖的方法將得到的雙質(zhì)粒疫苗遞送到小鼠體內(nèi)，觀察疫苗的抑瘤效果并對(duì)其可能的免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步的探討。方法：1.利用胰蛋白酶灌注消化法分離收集人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical VeinEndothelial Cells, HUVEC），進(jìn)一步采用腫瘤細(xì)胞HepG2培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)HUVEC向腫瘤源性內(nèi)皮細(xì)胞（Tumor derived-Endothelial Cells, Td-EC）分化增殖。通過形態(tài)學(xué)觀察和熒光標(biāo)記Ⅷ因子相關(guān)抗原,鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞；利用RT-PCR檢測(cè)Td-EC中腫瘤血管內(nèi)皮標(biāo)志物（TEM）的表達(dá)。2.將小鼠VEGFR2胞外1-4IgG樣區(qū)域（mVEGFR2D1-4）及人β-hcg全長基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET-42a中，將得到的原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中并通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析法純化融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，Western blot鑒定純化后的目的蛋白，ELISA法檢測(cè)純化蛋白的抗原活性。3.利用前期成功構(gòu)建的質(zhì)粒pVAX1-mVEGFR2-GFc-hIL12及可復(fù)制型載體系統(tǒng)PSVK，構(gòu)建以異種化的mVEGFR2D1-4為靶抗原的可復(fù)制型DNA疫苗，命名為CAVE。4.將DNA疫苗CAVE與前期構(gòu)建好的CAVA采用電穿孔肌肉內(nèi)注射的方式免疫小鼠，觀察DNA疫苗的抑瘤效果，并對(duì)其相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制進(jìn)行初步的研究：采用ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清中的特異抗體滴度和血清中的細(xì)胞因子的水平；采用ELISPOT法檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性IFN-γ的分泌；采用海藻酸鹽包裹腫瘤細(xì)胞移植物評(píng)價(jià)抗血管生成情況；對(duì)腫瘤組織進(jìn)行CD31免疫組化染色觀察疫苗免疫后腫瘤毛細(xì)血管密度。結(jié)果：1.成功分離得到了HUVEC，并將其誘導(dǎo)成為具有良好生物學(xué)活性的具有腫瘤源內(nèi)皮細(xì)胞特性的Td-EC。2.成功誘導(dǎo)并純化出具有良好免疫原性的mVEGFR2D1-4/GST及人β-hcg/GST融合蛋白。3.成功構(gòu)建了可復(fù)制型DNA疫苗CAVE，并通過Western Blot檢測(cè)證實(shí)了其體外真核表達(dá)。4.觀察聯(lián)合應(yīng)用與單獨(dú)應(yīng)用兩種DNA疫苗免疫后的C57BL/6小鼠移植瘤生長趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比疫苗免疫組小鼠腫瘤生長受到顯著抑制，聯(lián)合應(yīng)用免疫組效果更為顯著。疫苗免疫組小鼠血清內(nèi)可檢測(cè)到特異性抗Survivin、β-hcg及VEGFR2抗體，脾臟內(nèi)可檢測(cè)到特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞；海藻酸鹽包裹腫瘤細(xì)胞移植物實(shí)驗(yàn)及腫瘤組織CD31免疫組化檢測(cè)證實(shí)CAVE能夠顯著抑制腫瘤組織毛細(xì)血管生成。結(jié)論：本研究所構(gòu)建的新型可復(fù)制型雙質(zhì)粒DNA疫苗與單獨(dú)應(yīng)用及對(duì)照組相比，在小鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，能夠抑制移植瘤的生長，為腫瘤的主動(dòng)免疫治療提供了一種新的選擇。
李盼[8]（2013）在《乙肝可復(fù)制型DNA疫苗低電壓電穿孔遞送與免疫活性研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理DNA疫苗在治療性疫苗研究領(lǐng)域的地位至關(guān)重要。關(guān)于DNA疫苗體內(nèi)遞送的研究發(fā)展很快，從最初的直接注射到基因槍接種，再發(fā)展到新近出現(xiàn)的電穿孔技術(shù)，質(zhì)粒DNA的體內(nèi)遞送效率顯著提高，這為DNA疫苗快速發(fā)展和應(yīng)用提供了有力的技術(shù)支持。其中電穿孔遞送兼?zhèn)涓咝?、安全、操作簡便和低成本等多?xiàng)特質(zhì)，成為DNA疫苗遞送的首選方案，但關(guān)于電穿孔遞送條件的深入研究目前還有待進(jìn)步完善。當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道電穿孔遞送DNA疫苗的常用脈沖電壓多集中在180v-900v的高壓區(qū)。在實(shí)際應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)高電壓遞送DNA疫苗質(zhì)粒，會(huì)對(duì)組織細(xì)胞造成定損傷；隨著免疫接種次數(shù)的增多，DNA疫苗在局部壞死組織的體內(nèi)遞送量也會(huì)逐漸降低；而且臨床試驗(yàn)時(shí)，患者對(duì)高電壓也會(huì)產(chǎn)生定恐懼不利于DNA疫苗的推廣應(yīng)用；所以本研究擬進(jìn)步探討低電壓下遞送DNA疫苗的可行性。首先，本研究選取攜帶螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的三種不同類型表達(dá)質(zhì)粒，作為我們研究體內(nèi)電穿孔遞送的模式質(zhì)粒。它們分別是：①pGL3-CMV，為本室前期保存，帶有螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的完整表達(dá)框，分子量約為5kb，可以作為小分子量質(zhì)粒的代表；②pEE14.1-luc，為本研究自主構(gòu)建，由于基礎(chǔ)載體分子量較大約為11kb，該質(zhì)粒構(gòu)建成功后分子量可達(dá)12.5kb，可以作為大分子量質(zhì)粒的代表；③pSVK-luc，也是本研究自主構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒，載體pSVK是基于塞姆利基森林病毒Semliki Forestvirus （SFV）改構(gòu)而成的可復(fù)制型表達(dá)載體，其表達(dá)特性與傳統(tǒng)DNA質(zhì)粒有顯著不同，該質(zhì)粒分子量約為13kb，可以作為復(fù)制子DNA疫苗質(zhì)粒的代表。重組質(zhì)粒pEE14.1-luc和pSVK-luc的構(gòu)建，以質(zhì)粒pGL3-CMV為模板擴(kuò)增熒光素酶報(bào)告基因，然后克隆入pEE14.1和pSVK載體中構(gòu)建而成，并采用Western blot、流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光和活體成像技術(shù)檢測(cè)重組質(zhì)粒在體內(nèi)外的表達(dá)情況。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pEE14.1-luc和pSVK-luc在體內(nèi)外均獲得高效表達(dá)。其次，將pGL3-CMV、pEE14.1-luc和pSVK-luc作為模式質(zhì)粒，以1μg和50μg兩個(gè)劑量分別接種BALB/c小鼠左右腿部肌肉，再在低電壓范圍內(nèi)選取30V、60V和120V三個(gè)脈沖電壓進(jìn)行刺激，接種后48h活體成像儀檢測(cè)小鼠股四頭肌內(nèi)熒光素酶表達(dá)量。兩次接種后，剝離不同脈沖電壓刺激后的小鼠股四頭肌肉組織進(jìn)行HE染色觀察肌肉組織的纖維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：①各質(zhì)粒在高劑量50μg電穿孔遞送時(shí)，60V和120V脈沖電壓刺激下DNA遞送量顯著高于30V遞送，但60V和120V的DNA遞送量無顯著性差異；在120V電壓刺激后，HE染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肌肉組織纖維出現(xiàn)明顯斷裂，溶脹，而在較低電壓組60V和30V的電壓刺激下未出現(xiàn)明顯組織纖維損傷，綜合比較，初步推斷60V低電壓下遞送三種類型質(zhì)粒DNA的表達(dá)效果均較優(yōu)，且局部組織細(xì)胞也無明顯損傷；②各質(zhì)粒在低劑量1μg電穿孔遞送時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)DNA質(zhì)粒pGL3-CMV、pEE14.1-luc均未檢測(cè)到熒光素酶基因表達(dá)，但可復(fù)制型大分子質(zhì)粒pSVK-luc在60V、120V脈沖電壓遞送下可見熒光素酶表達(dá)，初步推論可復(fù)制型質(zhì)粒在低劑量下接種存在定的優(yōu)勢(shì)。最后，為進(jìn)步驗(yàn)證低電壓下遞送DNA疫苗在實(shí)際應(yīng)用中的可行性，以本室前期構(gòu)建的乙肝可復(fù)制型DNA疫苗pSVK-HBVA及常規(guī)小分子DNA疫苗pVAX1-HBVA為研究對(duì)象，分別設(shè)立兩種疫苗的高（100μg）中（10μg）低（1μg）三個(gè)劑量組，免疫接種BALB/c小鼠，并在60v的低電壓下進(jìn)行電穿孔遞送，分別檢測(cè)兩種DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示：1、低電壓（60V）遞送乙肝DNA疫苗在體內(nèi)激起較強(qiáng)的細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答;2、60V電壓三次免疫接種過程順利，未見BALB/c小鼠股四頭肌肌肉組織僵硬現(xiàn)象，保證多次免疫遞送的成功；3，雖抗體滴度呈定的劑量依賴即隨著免疫劑量的升高，抗體滴度也逐步升高，但復(fù)制子DNA疫苗pSVK-HBVA在常規(guī)DNA疫苗1/100的劑量下，即可激活高效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯示出良好應(yīng)用潛質(zhì)。綜上所述，本研究以pGL3-CMV、pEE14.1-luc、pSVK-luc為模式質(zhì)粒，初步驗(yàn)證低電壓（60V）遞送DNA疫苗可行，又以低脈沖電壓（60V）遞送本室前期構(gòu)建乙肝可復(fù)制型DNA疫苗pSVK-HBVA和常規(guī)乙肝DNA疫苗pVAX1-HBVA，證實(shí)低電壓電穿孔遞送上述疫苗可激活體內(nèi)高水平的免疫應(yīng)答，且乙肝可復(fù)制子DNA疫苗在常規(guī)DNA疫苗1/100的劑量下，即可激活高效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，揭示了乙肝可復(fù)制型DNA疫苗的良好應(yīng)用前景和潛質(zhì)；同時(shí)，進(jìn)步驗(yàn)證DNA疫苗電穿孔低電壓體內(nèi)遞送的可行性，為DNA疫苗電穿孔免疫遞送提供重要參考數(shù)據(jù)更為電穿孔技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
梁欠欠[9]（2013）在《基于甲病毒復(fù)制子載體的豬繁殖與呼吸綜合征DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)》文中研究表明豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，以母豬繁殖障礙、仔豬呼吸道疾病以及斷奶仔豬高死亡率為特征的高度接觸性傳染病。目前世界上普遍用于預(yù)防PRRS的滅活苗和弱毒苗不能提供完全的保護(hù)或存在毒力返強(qiáng)和擴(kuò)毒等風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，復(fù)制子疫苗可高效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡，比常規(guī)的DNA疫苗具有更高的生物安全性。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制子載體pSCA1，重點(diǎn)開展修飾后的PRRSV主要抗原基因的研究，成功構(gòu)建出PRRS新型安全疫苗，并對(duì)其體外表達(dá)特性和小鼠體內(nèi)免疫效力進(jìn)行初步研究。我們首先通過RT-PCR從PRRSV FZ06A毒株中擴(kuò)增出ORF3、ORF5和ORF6基因，并進(jìn)行修飾，破壞ORF3的信號(hào)肽序列并連接VP22基因；刪除ORF5的非中和表位A，突變N34、N43和N51糖基化位點(diǎn)，添加Kozak序列或連接VP22基因；ORF6連接VP22基因；連接VPm5和VP6；得到Km5、VPm3、VPm5、VP6和V56基因。將修飾后基因插入復(fù)制子載體pSCA1。成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSCA-Km5、pSCA-VPm3、pSCA-VPm5、pSCA-VP6和pSCA-V56。轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)到目的基因的mRNA，IFA和Western顯示，細(xì)胞中均能檢測(cè)到目的蛋白。細(xì)胞凋亡試驗(yàn)中轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生核濃縮或裂解，說明復(fù)制子質(zhì)粒能引起轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡。為后續(xù)檢測(cè)需要，我們構(gòu)建并表達(dá)了截短的GP3、GP5和M蛋白，并制備了GP5的單抗腹水和M蛋白的兔多抗。結(jié)果顯示，純化后的蛋白具有較好的反應(yīng)原性，GP5單抗的效價(jià)可達(dá)1:105以上，M多抗效價(jià)可達(dá)1:256000以上。將復(fù)制子質(zhì)粒pSCA-Km5、pSCA-VPm3、pSCA-VPm5、pSCA-VP6、pSCA-V56、pSCA-VPm5-PEI和PBS免疫BABL/c小鼠。監(jiān)測(cè)免疫后血清中特異性抗體的水平、脾淋巴細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后分泌IL-4和IFN-γ的水平和增殖情況。結(jié)果顯示，pSCA-VPm3和pSCA-VP6在細(xì)胞免疫方面有較好的效果；pSCA-Km5、pSCA-VPm5主要誘導(dǎo)體液免疫。pSCA-V56組在誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫方面都能有較好的效果，但其抗體水平較pSCA-VPm5組低。PEI能增強(qiáng)復(fù)制子疫苗免疫效力，但誘導(dǎo)的特異性抗體在首免后7w突然降低，猜測(cè)可能和PEI對(duì)細(xì)胞的毒性有關(guān)。綜上所述，我們成功表達(dá)并純化出具有良好免疫原性的m3JD、m5和MJD，并進(jìn)行了GP5單抗腹水、MJD多克抗的制備和純化。成功構(gòu)建了復(fù)制子疫苗pSCA-Km5、pSCA-VPm3、pSCA-VPm5、pSCA-VP6、pSCA-V56，在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平對(duì)其表達(dá)特性和免疫效力進(jìn)行了初步研究，為PRRSV新型疫苗的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
李娜,孫元,仇華吉[10]（2010）在《豬瘟DNA疫苗研究進(jìn)展》文中研究說明自1990年DNA疫苗問世以來,已有許多研究者構(gòu)建了不同類型的DNA疫苗。這些載體能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生不同程度的特異性體液免疫和（或）細(xì)胞免疫。研究者們也在豬瘟DNA疫苗研究方面做出了很多努力并取得了一定的成果。以下從豬瘟DNA疫苗的構(gòu)建和評(píng)價(jià)、佐劑在豬瘟DNA疫苗中的應(yīng)用、豬瘟DNA疫苗與其他疫苗的聯(lián)合應(yīng)用以及目前豬瘟DNA疫苗存在的問題和解決途徑等方面做了比較全面的闡述。
二、Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗與常規(guī)DNA疫苗的比較（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗與常規(guī)DNA疫苗的比較（論文提綱范文）
（1）重組Semliki森林病毒疫苗的研制現(xiàn)狀（論文提綱范文）
| 1 重組SFV抗正粘病毒 |
| 1.1 流行性感冒病毒 |
| 1.2 馬流感病毒 |
| 2 重組SFV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒 |
| 2.1 Ⅰ型人類免疫缺陷病毒 |
| 2.2 猴免疫缺陷病毒 |
| 3 重組SFV抗黃病毒 |
| 3.1 豬瘟病毒 |
| 3.2 羅氏病病毒 |
| 4 重組SFV抗其他病毒 |
| 4.1 乙型肝炎病毒 |
| 4.2 豬園環(huán)病毒Ⅱ型 |
| 5 重組SFV抗細(xì)菌 |
| 5.1 布魯氏菌 |
| 5.2 肉毒梭菌 |
| 6 結(jié) 語 |
（2）流行性腹瀉多表位復(fù)制子DNA疫苗的設(shè)計(jì)、制備及初步免疫評(píng)價(jià)（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 細(xì)菌性腹瀉 |
| 1.1.1 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC) |
| 1.1.2 志賀氏痢疾桿菌Shigella |
| 1.2 核酸疫苗 |
| 1.2.1 常規(guī)DNA疫苗 |
| 1.2.2 復(fù)制子DNA疫苗 |
| 1.3 納米遞送載體 |
| 1.3.1 聚合物納米顆粒 |
| 1.3.2 脂質(zhì)體納米顆粒 |
| 1.3.3 脂質(zhì)體-聚合物雜化納米顆粒 |
| 1.4 研究目的與研究內(nèi)容 |
| 第二章 抗原表位的篩選及疫苗設(shè)計(jì) |
| 2.1 引言 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 抗原表位的篩選流程圖 |
| 2.2.2 基因序列和蛋白序列的獲取 |
| 2.2.3 表位預(yù)測(cè) |
| 2.2.4 疫苗設(shè)計(jì) |
| 2.2.5 疫苗3D結(jié)構(gòu)模擬(I-TASSER) |
| 2.2.6 多表位蛋白序列免疫原性分析 |
| 2.2.7 PAProC預(yù)測(cè)蛋白酶體切割位點(diǎn) |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 表位篩選結(jié)果 |
| 2.3.2 多表位氨基酸序列 |
| 2.3.3 免疫原性分析 |
| 2.3.4 蛋白酶體切割位點(diǎn) |
| 2.3.5 3D結(jié)構(gòu) |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及體外活性檢測(cè) |
| 3.1 引言 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 |
| 3.2.1 菌株與質(zhì)粒 |
| 3.2.2 MEG基因合成序列 |
| 3.2.3 儀器與設(shè)備 |
| 3.2.4 試劑與藥品 |
| 3.2.5 試劑的配制 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建 |
| 3.3.2 體外活性初步檢測(cè) |
| 3.4 結(jié)果與討論 |
| 3.4.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 3.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 |
| 3.4.3 目的蛋白檢測(cè) |
| 3.4.4 免疫熒光檢測(cè) |
| 3.4.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) |
| 3.5 本章小結(jié) |
| 第四章 DNA疫苗制劑制備及免疫評(píng)價(jià) |
| 4.1 引言 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 |
| 4.2.1 菌株及質(zhì)粒 |
| 4.2.2 動(dòng)物與飼養(yǎng)材料 |
| 4.2.3 試劑 |
| 4.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 |
| 4.2.5 相關(guān)試劑的配制 |
| 4.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.3.1 PLNPs的制備(納米沉淀法) |
| 4.3.2 PLNPs的表征 |
| 4.3.3 PLNPs抗DNase降解實(shí)驗(yàn) |
| 4.3.4 PLNPs的體外釋放 |
| 4.3.5 PLNPs細(xì)胞毒性檢測(cè)(MTT法) |
| 4.3.6 PLNPs溶血實(shí)驗(yàn) |
| 4.3.7 動(dòng)物免疫 |
| 4.3.8 血清、脾細(xì)胞懸液的收集與處理 |
| 4.3.9 血清中特異性抗體的檢測(cè) |
| 4.3.10 脾T淋巴細(xì)胞亞群分布 |
| 4.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析 |
| 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 4.4.1 PLNPs的制備與表征結(jié)果 |
| 4.4.2 PLNPs凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.4.3 PLNPs體外釋放曲線 |
| 4.4.4 PLNPs細(xì)胞毒性檢測(cè) |
| 4.4.5 DNA疫苗免疫學(xué)評(píng)價(jià) |
| 4.5 本章小結(jié) |
| 第五章 結(jié)論與展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
（4）兔病毒性出血癥DNA疫苗研究進(jìn)展（論文提綱范文）
| 1 兔瘟疫苗研發(fā)動(dòng)態(tài) |
| 2 DNA疫苗概述 |
| 3 DNA疫苗的載體 |
| 4 佐劑在兔瘟DNA疫苗中的應(yīng)用 |
| 5 疫苗效力檢測(cè) |
| 6 小結(jié) |
（6）新型豬瘟疫苗研究進(jìn)展（論文提綱范文）
| 1 核酸疫苗 |
| 1.1 DNA疫苗 |
| 1.2 甲病毒復(fù)制子載體DNA疫苗 |
| 2 病毒活載體疫苗 |
| 2.1 重組載體疫苗 |
| 2.2 嵌合病毒載體疫苗 |
| 3 基于蛋白/肽的疫苗 |
| 4 基于瘟病毒的疫苗 |
| 4.1 豬瘟病毒基因缺失弱毒疫苗 |
| 4.2 嵌合瘟病毒疫苗 |
| 5 問題與展望 |
（7）新型可復(fù)制型廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第一部分 腫瘤源性血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及其細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 小鼠 VEGFR2 胞外 1-4IgG 樣結(jié)構(gòu)域及β-hcg 蛋白的原核表達(dá)、純化及活性鑒定 |
| 第一節(jié) 小鼠 VEGFR2 胞外 1-4IgG 樣結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)、純化及活性鑒定 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 第二節(jié) β-hCG 的原核表達(dá)、純化及抗原活性檢測(cè) |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 新型廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒 DNA 疫苗抑瘤活性的初步研究 |
| 第一節(jié) 新型可復(fù)制型廣譜抗腫瘤血管生成 DNA 疫苗 CAVE 的構(gòu)建及體外表達(dá)驗(yàn)證 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 第二節(jié) 可復(fù)制型抗腫瘤 DNA 疫苗 CAVA 與 CAVE 聯(lián)合應(yīng)用抑瘤活性及免疫學(xué)作用機(jī)制研究 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 總結(jié) |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄：英文縮略詞表 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章 |
| 致謝 |
（8）乙肝可復(fù)制型DNA疫苗低電壓電穿孔遞送與免疫活性研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文縮略語 |
| 第一部分 前言 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 實(shí)驗(yàn)部分 |
| 第一章 熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒 pEE14.1-luc 和 pSVK-luc 的構(gòu)建與表達(dá) |
| 1. 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株與載體 |
| 1.1.2 化學(xué)試劑和酶 |
| 1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要儀器設(shè)備 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 pSVK-luc、pEE14.1-luc 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 |
| 1.2.1.1 pSVK-luc 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 1.2.1.2 PCR 回收產(chǎn)物與 pMDl8-simple-T 載體的連接反應(yīng) |
| 1.2.1.3 大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 1.2.1.4 大腸桿菌(E. coil)DH5α的轉(zhuǎn)化 |
| 1.2.1.5 重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-luc 的篩選與鑒定 |
| 1.2.1.5.1 重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-luc 的菌液 PCR 鑒定 |
| 1.2.1.5.2 重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-luc 的酶切鑒定 |
| 1.2.1.5.3 重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-luc 的 DNA 測(cè)序分析 |
| 1.2.1.6 重組質(zhì)粒 pSVK-luc 的構(gòu)建 |
| 1.2.1.6.1 基于塞姆利基森林病毒復(fù)制子載體 pSVK 空載體的酶切鑒定 |
| 1.2.1.6.2 重組質(zhì)粒 pSVK-luc 構(gòu)建 |
| 1.2.1.6.3 重組表達(dá)質(zhì)粒 pSVK-luc 的轉(zhuǎn)化和鑒定 |
| 1.2.2 重組質(zhì)粒 pEE14.1-luc 的構(gòu)建 |
| 1.2.2.1 熒光素酶基因片段（luc）的獲得 |
| 1.2.2.2 熒光素酶基因（luc）片段與 pEE14.1 載體的連接 |
| 1.3 體外檢測(cè)熒光素酶基因的表達(dá) |
| 1.3.1 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 |
| 1.3.1.1 293T 細(xì)胞的傳代培養(yǎng) |
| 1.3.1.2 293T 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 |
| 1.3.2 western blot 檢測(cè) pSVK-luc、pEE14.1-luc 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的檢測(cè) |
| 1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光法體外檢測(cè)熒光素酶基因的表達(dá) |
| 1.4 活體成像技術(shù)檢測(cè)重組質(zhì)粒 pSVK -luc、pEE14.1-luc 活體內(nèi)表達(dá) |
| 1.4.1 免疫用質(zhì)粒 pSVK -luc、pEE14.1-luc、pGL3-CMV 的大量提取 |
| 1.4.2 動(dòng)物免疫方案 |
| 2. 結(jié)果 |
| 2.1 熒光素酶基因 luc 的克隆 |
| 2.2 熒光素酶基因 luc 片段的回收 |
| 2.3 重組質(zhì)粒 pMD18-sample-T-luc 的鑒定 |
| 2.3.1 重組質(zhì)粒 pMD18-sample-T-luc 的 PCR 鑒定 |
| 2.3.2 重組 pMD18-sample-T-luc 載體的酶切鑒定 |
| 2.3.3 重組質(zhì)粒 DNA pMD18-sample-T-luc 的測(cè)序分析 |
| 2.4 塞姆利基森林病毒復(fù)制子載體（pSVK 空載體）的酶切鑒定 |
| 2.4.1 重組質(zhì)粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的鑒定 |
| 2.4.1.1 重組質(zhì)粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的 PCR 鑒定 |
| 2.4.1.2 重組 pSVK-luc 載體的酶切鑒定 |
| 2.4.1.3 重組質(zhì)粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的測(cè)序鑒定 |
| 2.5 Western blot 體外檢測(cè)熒光素酶基因的表達(dá) |
| 2.6 流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光體外檢測(cè)熒光素酶基因的表達(dá) |
| 2.6.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光素酶基因的表達(dá) |
| 2.6.2 免疫熒光法體外檢測(cè)熒光素酶基因的表達(dá) |
| 2.7 活體成像技術(shù)檢測(cè)重組質(zhì)粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 體內(nèi)表達(dá) |
| 3. 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二章 低電壓電穿孔體內(nèi)遞送疫苗質(zhì)粒條件的初步研究 |
| 1、材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 |
| 1.1.2 主要儀器設(shè)備 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 |
| 1.2.2 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 質(zhì)粒的大量提取 |
| 1.2.3 重組質(zhì)粒 pGL3-CMV、pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 的酶切鑒定 |
| 1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及 DNA 免疫策略 |
| 1.2.5 Xenogen 成像系統(tǒng)檢測(cè)螢光素酶在小鼠體內(nèi)的表達(dá) |
| 1.2.6 蘇木精-伊紅（HE）染色檢測(cè) BALB/c 小鼠大腿肌肉纖維結(jié)構(gòu) |
| 1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 2.結(jié)果 |
| 2.1 重組質(zhì)粒 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 的酶切鑒定 |
| 2.2 熒光素酶基因小鼠股四頭肌內(nèi)的表達(dá)量檢測(cè) |
| 2.3 蘇木精-伊紅（HE）染色法檢測(cè) BALB/c 小鼠大腿肌肉纖維結(jié)構(gòu) |
| 3. 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三章 低電壓體內(nèi)遞送乙肝 DNA 疫苗的初步藥效學(xué)分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.1.2 主要試劑及檢測(cè)試劑盒 |
| 1.1.3 主要的儀器設(shè)備 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫用質(zhì)粒的大量提取與純化 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及免疫策略 |
| 2.3 乙肝治療性疫苗 pVAX-HBVA、pSVK-HBVA 的免疫活性研究 |
| 2.3.1 ELISA 定量檢測(cè) BALB/c 小鼠血清中抗 HBcAg 抗體 |
| 2.3.2 ELISPOT 檢測(cè) BALB/c 小鼠 IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù) |
| 2.3.2.1 免疫小鼠脾臟單細(xì)胞懸液的制備 |
| 2.3.2.2 ELISPOT 法檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞 IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù) |
| 2.3.2.3 CCK-8 法檢測(cè)免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖 |
| 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 3. 結(jié)果 |
| 3.1 ELISA 定量檢測(cè) BALB/c 小鼠血清中抗 HBcAg 抗體 |
| 3.2 ELISPOT 檢測(cè)免疫小鼠 IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù) |
| 3.3 CCK8 檢測(cè)免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 結(jié)論與展望 |
| 第四部分 附錄 |
| 附錄一 碩士期間參加的研究課題和發(fā)表論文 |
| 附錄二 個(gè)人簡歷 |
| 致謝 |
（9）基于甲病毒復(fù)制子載體的豬繁殖與呼吸綜合征DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略表 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 豬繁殖與呼吸綜合征研究進(jìn)展 |
| 1.1.1 病毒分類和理化性質(zhì) |
| 1.1.2 病毒基因組結(jié)構(gòu) |
| 1.1.3 病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其功能 |
| 1.1.4 病毒的生物學(xué)特性 |
| 1.1.6 HP-PRRSV |
| 1.1.7 病毒感染與免疫 |
| 1.1.8 PRRSV 疫苗研究進(jìn)展 |
| 1.2 甲病毒復(fù)制子疫苗研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 概念 |
| 1.2.2 甲病毒復(fù)制子原理及特點(diǎn) |
| 1.2.3 復(fù)制子疫苗引起細(xì)胞凋亡的機(jī)理 |
| 1.3 本研究的目的和意義 |
| 第二章 PRRSV FZ06A 毒株 GP3、GP5 和 M 蛋白的截短表達(dá)及其抗體的制備 |
| 摘要 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 菌體、細(xì)胞和病毒 |
| 2.1.2 試劑及耗材 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及配制方法 |
| 2.1.4 主要儀器設(shè)備 |
| 2.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 引物設(shè)計(jì) |
| 2.2.2 PRRSV FZ06A 病毒 RNA 的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR 擴(kuò)增 GP3、GP5 和 M 蛋白基因 |
| 2.2.4 目的基因序列生物學(xué)初步分析 |
| 2.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 2.2.6 陽性質(zhì)粒的篩選與鑒定 |
| 2.2.7 轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株 |
| 2.2.8 PRRSV GP3、GP5 和 M 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析 |
| 2.2.9 Western blotting 鑒定重組蛋白 |
| 2.2.10 m3JD、m5、MJD 蛋白的純化 |
| 2.2.11 GP5 蛋白單抗腹水的制備與純化 |
| 2.2.12 M 蛋白多抗的制備與純化 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 RT-PCR 擴(kuò)增目的基因基因片段 |
| 2.3.2 目的基因序列分析 |
| 2.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 2.3.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.3.5 Western blotting 鑒定結(jié)果 |
| 2.3.6 蛋白純化結(jié)果 |
| 2.3.7 GP5 腹水制備及純化 |
| 2.3.8 M 蛋白多抗制備及純化 |
| 2.4 討論 |
| 第三章 基于甲病毒復(fù)制子的 PRRS DNA 疫苗的構(gòu)建及體外表達(dá)特性研究 |
| 摘要 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.1 菌體、細(xì)胞和病毒 |
| 3.1.2 試劑及耗材 |
| 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及配制方法 |
| 3.1.4 主要儀器設(shè)備 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 引物設(shè)計(jì) |
| 3.2.2 目的基因的初步修飾 |
| 3.2.3 VP22 基因與目的基因的連接 |
| 3.2.4 VPm5 與 VPm6 基因的連接 |
| 3.2.5 含修飾后目的基因的質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 3.2.6 含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的自殺性復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 3.2.7 大量提取構(gòu)建的自殺性復(fù)制子質(zhì)粒 |
| 3.2.8 殺性質(zhì)粒最佳轉(zhuǎn)染劑量及蛋白檢測(cè)時(shí)間的確定 |
| 3.2.9 自殺性復(fù)制子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BHK-21 細(xì)胞 |
| 3.2.10 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的基因 mRNA 的檢測(cè) |
| 3.2.11 Wstern blotting 檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白 |
| 3.2.12 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡檢測(cè) |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 |
| 3.3.1 基因修飾 |
| 3.3.2 添加 Kozak 序列 |
| 3.3.3 連接 VP22 基因 |
| 3.3.4 VPm5 與 VP6 基因的連接 |
| 3.3.5 含修飾后基因的復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 3.3.6 pSCA- EGFP 的構(gòu)建 |
| 3.3.7 最佳轉(zhuǎn)染劑量和最佳檢測(cè)時(shí)間的確定 |
| 3.3.9 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的基因 mRNA 的檢測(cè) |
| 3.3.10 IFA 檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平 |
| 3.3.11 Western blotting 檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平 |
| 3.3.12 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡檢測(cè) |
| 3.4 討論 |
| 第四章 基于甲病毒復(fù)制子的 PRRSV DNA 疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答 |
| 摘要 |
| 4.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.1.1 質(zhì)粒和試劑 |
| 4.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 4.1.3 試劑及配制方法 |
| 4.1.4 主要儀器設(shè)備 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組 |
| 4.2.2 復(fù)制子質(zhì)粒的提取和定量 |
| 4.2.3 動(dòng)物免疫前處理 |
| 4.2.4 動(dòng)物免疫程序 |
| 4.2.5 免疫小鼠 T 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) |
| 4.2.6 免疫小鼠 IFN-γ水平監(jiān)測(cè) |
| 4.2.7 免疫小鼠 IL-4 水平監(jiān)測(cè) |
| 4.2.8 免疫小鼠特異性抗體水平監(jiān)測(cè) |
| 4.2.9 免疫小鼠中和性抗體水平監(jiān)測(cè) |
| 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.3.1 復(fù)制子質(zhì)粒的提取和定量 |
| 4.3.2 免疫小鼠 T 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) |
| 4.3.3 免疫小鼠 IFN-γ水平監(jiān)測(cè) |
| 4.3.4 免疫小鼠 IL-4 水平監(jiān)測(cè) |
| 4.3.5 免疫小鼠特異性抗體水平監(jiān)測(cè) |
| 4.3.6 免疫小鼠中和性抗體水平監(jiān)測(cè) |
| 4.4 討論 |
| 第五章 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 作者簡歷 |
（10）豬瘟DNA疫苗研究進(jìn)展（論文提綱范文）
| 1 DNA疫苗概述 |
| 2 豬瘟DNA疫苗的構(gòu)建和評(píng)價(jià) |
| 2.1 常規(guī)DNA疫苗 |
| 2.2 新型DNA疫苗 |
| 2.3 新型給藥途徑和遞送工具 |
| 3 佐劑在豬瘟DNA疫苗中的應(yīng)用 |
| 4 豬瘟DNA疫苗與其他疫苗的聯(lián)合應(yīng)用 |
| 5 目前豬瘟DNA疫苗存在的問題和解決途徑 |
| 6 小結(jié) |
四、Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗與常規(guī)DNA疫苗的比較（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]重組Semliki森林病毒疫苗的研制現(xiàn)狀[J]. 李文桂,陳雅棠. 國外醫(yī)學(xué)(醫(yī)學(xué)地理分冊(cè)), 2019(03)
- [2]流行性腹瀉多表位復(fù)制子DNA疫苗的設(shè)計(jì)、制備及初步免疫評(píng)價(jià)[D]. 張瑞環(huán). 華東理工大學(xué), 2020(01)
- [3]表達(dá)丙型肝炎病毒多個(gè)融合抗原的復(fù)制型DNA疫苗在小鼠體內(nèi)免疫原性的研究[J]. 鄧瑤,管潔,殷霄,文波,陳紅,王文,譚文杰. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2015(03)
- [4]兔病毒性出血癥DNA疫苗研究進(jìn)展[J]. 付強(qiáng),郭廣君,程立坤,王艷. 湖北畜牧獸醫(yī), 2014(08)
- [5]復(fù)制子熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pSVK-luc的構(gòu)建與應(yīng)用[J]. 李盼,張亮,王宇,朱曉明,張巍,徐元基,于繼云,閻瑾琦. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2013(07)
- [6]新型豬瘟疫苗研究進(jìn)展[J]. 王春花,孫元,仇華吉. 生物工程學(xué)報(bào), 2013(07)
- [7]新型可復(fù)制型廣譜抗腫瘤雙質(zhì)粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究[D]. 王偉. 中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院, 2013(08)
- [8]乙肝可復(fù)制型DNA疫苗低電壓電穿孔遞送與免疫活性研究[D]. 李盼. 新疆大學(xué), 2013(S1)
- [9]基于甲病毒復(fù)制子載體的豬繁殖與呼吸綜合征DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)[D]. 梁欠欠. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2013(02)
- [10]豬瘟DNA疫苗研究進(jìn)展[J]. 李娜,孫元,仇華吉. 生物工程學(xué)報(bào), 2010(03)