一、組織工程技術(shù)體外重建角膜上皮層的實(shí)驗(yàn)研究（論文文獻(xiàn)綜述）
延亞云[1]（2021）在《基于光交聯(lián)水凝膠的體外角膜再生研究》文中指出角膜盲是第二大致盲眼病,絕大多數(shù)患者可通過(guò)移植健康的供體角膜來(lái)治愈,更嚴(yán)重的情況下,通過(guò)植入沒(méi)有生物活性的人工角膜來(lái)治療。然而供體角膜嚴(yán)重短缺以及人工角膜具有并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn),基于此,使用角膜組織工程技術(shù)手段構(gòu)建可行的角膜替代物是很有前景的角膜盲治療方法。選擇合適的生物支架材料和種子細(xì)胞是角膜組織工程迫切需要解決的兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。本論文首先通過(guò)甲基丙烯酸酐（MA）對(duì)明膠進(jìn)行改性,改善其熱穩(wěn)定性,制備了四種不同濃度（7%、10%、15%和30%）的甲基丙烯酸酯化明膠（GelMA）水凝膠,并對(duì)其理化、光學(xué)性質(zhì)以及生物相容性進(jìn)行了表征。結(jié)果表明,GelMA濃度越低,水凝膠的楊氏模量越小,親水性和光學(xué)性能越好。同時(shí)通過(guò)MTT檢測(cè)、活/死染色、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn),研究在不同濃度GelMA水凝膠上培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMMSCs）的細(xì)胞粘附性、活力和增值情況。此外,通過(guò)免疫熒光染色和角膜基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)來(lái)表征rBM-MSCs分化為角膜基質(zhì)樣細(xì)胞的能力,其中標(biāo)志物包括Keratocan、Lumican、ALDH1A1、α-SMA。體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明,7%濃度的GelMA水凝膠更有利于rBM-MSCs的生長(zhǎng)和增殖,然而30%GelMA水凝膠為rBM-MSCs分化為角膜基質(zhì)樣細(xì)胞提供了更好的動(dòng)態(tài)微環(huán)境。其次,同樣通過(guò)MA對(duì)透明質(zhì)酸進(jìn)行改性,合成甲基丙烯酸酯化透明質(zhì)酸（HAMA）水凝膠。將GelMA（10%w/v）和HAMA（0.5%w/v）混合以制備GelMA/HAMA雙網(wǎng)絡(luò)（DN）水凝膠。通過(guò)機(jī)械性能、光學(xué)性能、親水性、體外原位降解等表征實(shí)驗(yàn),研究GelMA、HAMA和DN水凝膠的理化性能差異,發(fā)現(xiàn)DN水凝膠在可見(jiàn)光區(qū)域是光學(xué)透明的,擁有超越GelMA和HAMA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的良好機(jī)械性能,且親水性與人體正常角膜相似。最后,對(duì)DN水凝膠進(jìn)行生物學(xué)性能測(cè)試。體外兔角膜上皮細(xì)胞（CEp Cs）培養(yǎng)結(jié)果顯示,在DN水凝膠上培養(yǎng)CEp Cs增值效果明顯,表明該水凝膠具有良好的細(xì)胞粘附性和優(yōu)異的生物相容性。通過(guò)免疫熒光染色來(lái)表征體外培養(yǎng)的CEp Cs中特異性標(biāo)志物角蛋白3（CK3）的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與GelMA、HAMA單網(wǎng)絡(luò)水凝膠相比,DN水凝膠更有利于維持CEp Cs在體外對(duì)CK3的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明,GelMA/HAMA DN水凝膠具有作為角膜上皮組織工程生物支架的潛力。
楊雪[2]（2020）在《血漿纖維蛋白膜負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞用于大鼠角膜堿燒傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究》文中提出據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì),全球有490萬(wàn)人患有雙側(cè)角膜盲,單側(cè)角膜盲的患病人數(shù)約為2300萬(wàn)人。對(duì)于嚴(yán)重的角膜損傷,進(jìn)行角膜移植是目前最有效的治療手段。但全世界捐贈(zèng)角膜數(shù)量有限,解決這種短缺的方法之一便是使用組織工程化全部或部分厚度的角膜移植物。組織工程種子細(xì)胞來(lái)源多為干細(xì)胞,其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）來(lái)源廣泛,使用方便,且免疫原性低,為種子細(xì)胞的首選?，F(xiàn)階段在角膜損傷的治療中多使用生物相容性好的羊膜作為支架材料來(lái)負(fù)載干細(xì)胞。目前研究中已發(fā)現(xiàn)通過(guò)體外間接接觸共培養(yǎng)的方式BMSCs可以向角膜上皮細(xì)胞分化,但在使用BMSCs治療角膜損傷時(shí),受到早期損傷部位微環(huán)境的影響,BMSCs在損傷部位很難存活;使用羊膜作為支架材料面臨材料來(lái)源有限,成本較高的問(wèn)題。為解決以上問(wèn)題,本課題進(jìn)行了以血漿纖維蛋白膜為支架負(fù)載BMSCs與角膜上皮細(xì)胞,作為組織工程角膜植片,對(duì)角膜損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究。研究工作主要包括以下內(nèi)容:1大鼠BMSCs及角膜上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定采用全骨髓貼壁法提取大鼠BMSCs,體外培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng),呈梭形,排列呈旋渦狀,具有方向性;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),所提取的大鼠BMSCs表面抗原CD90呈陽(yáng)性,CD34呈陰性,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。采用酶消化法對(duì)大鼠角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行分離提取,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈多角形,免疫熒光結(jié)果顯示所提取的細(xì)胞表達(dá)角膜上皮細(xì)胞的特異性蛋白CK12。2角膜上皮細(xì)胞對(duì)接觸共培養(yǎng)BMSCs的誘導(dǎo)分化使用CFSE對(duì)BMSCs進(jìn)行標(biāo)記,然后將BMSCs與角膜上皮細(xì)胞按照1:3、1:1、3:1的比例進(jìn)行7天接觸共培養(yǎng)。然后,流式細(xì)胞術(shù)分選出BMSCs后,采用qRT-PCR檢測(cè)BMSCs中角膜上皮細(xì)胞相關(guān)基因p63、CK12的mRNA水平。結(jié)果顯示,原本不表達(dá)p63、CK12基因的BMSCs在與角膜上皮細(xì)胞進(jìn)行接觸共培養(yǎng)后表達(dá)這兩種角膜上皮細(xì)胞相關(guān)基因,且隨著共培養(yǎng)體系中角膜上皮細(xì)胞比例的升高,BMSCs中這兩種角膜上皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)量均上升。這一結(jié)果表明受直接接觸共培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)BMSCs呈現(xiàn)向角膜上皮細(xì)胞分化的改變,且共培養(yǎng)體系中角膜上皮細(xì)胞的比例影響B(tài)MSCs的分化程度。3血漿纖維蛋白膜的制備與性能檢測(cè)3.1制備通過(guò)頸靜脈竇取血獲得大鼠全血,離心后取上層血漿,加入Ca2+促凝后獲得血漿凝膠,壓縮除去凝膠內(nèi)多余液體后凍干,獲得血漿纖維蛋白膜。3.2掃描電鏡觀察膜片結(jié)構(gòu)掃描電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),血漿纖維蛋白膜片表面微孔分布較為均勻,孔徑大小多分布在25～30μm,多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞附著與及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。3.3流變儀檢測(cè)所制膜片粘彈性對(duì)凍干復(fù)水的膜片與新鮮膜片分別進(jìn)行流變學(xué)檢測(cè),結(jié)果顯示二者的彈性模量G’均大于粘性模量G",且凍干復(fù)水膜片的G’與G"均大于新鮮膜片。這一結(jié)果表明凍干后復(fù)水的血漿纖維蛋白膜相較新鮮膜片有著更好的粘彈性,不易發(fā)生形變,即剛度更高,負(fù)載細(xì)胞后將其用于移植治療時(shí)操作更便利。3.4掃描電鏡觀察血漿纖維蛋白膜上細(xì)胞負(fù)載情況將分離培養(yǎng)的BMSCs和角膜上皮細(xì)胞接種于凍干復(fù)水的血漿纖維蛋白膜上,培養(yǎng)24h后,采用超臨界干燥技術(shù)獲得負(fù)載細(xì)胞的干燥膜片。對(duì)其進(jìn)行掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞均存在于膜片表面,表明所制備的血漿纖維蛋白膜片可以用做負(fù)載細(xì)胞的支架。4血漿纖維蛋白膜片負(fù)載BMSCs及角膜上皮細(xì)胞對(duì)大鼠角膜堿燒傷的治療4.1對(duì)大鼠堿燒傷后角膜損傷愈合情況的影響利用熒光素鈉染色法檢測(cè)了在角膜堿燒傷3、7天時(shí)大鼠角膜上皮損傷的愈合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著損傷后天數(shù)的增加,損傷組、空白膜片組與負(fù)載細(xì)胞膜片組的大鼠角膜上皮缺損率均有不同程度的減少;在3天和7天,角膜上皮細(xì)胞的缺損率均為損傷組>空白膜片治療組>負(fù)載細(xì)胞的膜片治療組,且各組之間的上皮缺損率均有顯著性差異（p<0.0001）。在角膜堿燒傷后第7、14天對(duì)角膜損傷部位進(jìn)行了 HE染色觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著天數(shù)的增加,三組大鼠角膜損傷部位的上皮及基質(zhì)結(jié)構(gòu)都有著不同程度的恢復(fù),其中空白膜片組與負(fù)載細(xì)胞膜片組角膜損傷部位結(jié)構(gòu)恢復(fù)更好,后者角膜損傷部位結(jié)構(gòu)恢復(fù)最好,在第14天時(shí)已接近正常角膜結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果表明,使用自制負(fù)載細(xì)胞膜片可以有效促進(jìn)角膜損傷的愈合。4.2對(duì)大鼠堿燒傷后炎癥反應(yīng)的影響采用免疫熒光染色方法檢測(cè)了大鼠角膜堿燒傷后7天、14天角膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9）,金屬蛋白酶組織抑制劑-1（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1,TIMP-1）,白介素-6(（Interleukin-6,IL-6）及腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),第7天和第14天負(fù)載細(xì)胞的膜片治療組與空白膜片治療組角膜中,這四種炎癥相關(guān)因子的表達(dá)相較于損傷組都有著不同程度的減少,負(fù)載細(xì)胞的膜片治療組角膜中這些炎癥相關(guān)因子的表達(dá)最少。這說(shuō)明纖維蛋白膜片可以減輕大鼠角膜堿燒傷后炎癥反應(yīng),在膜片負(fù)載細(xì)胞后對(duì)炎癥的抑制效果更好。4.3對(duì)大鼠堿燒傷后角膜纖維化的影響采用免疫熒光染色方法檢測(cè)了大鼠角膜堿燒傷后第7天、第14天角膜組織中平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）的表達(dá)。結(jié)果表明,第7天和第14天負(fù)載細(xì)胞的膜片治療組與空白膜片治療組角膜中α-SMA的表達(dá)相較于損傷組都有著明顯的減少,負(fù)載細(xì)胞的膜片治療組角膜中α-SMA的表達(dá)最少。這說(shuō)明纖維蛋白膜片可以抑制大鼠角膜堿燒傷后的角膜纖維化,在膜片負(fù)載細(xì)胞后抑制角膜纖維化的作用更強(qiáng)。4.4負(fù)載BMSCs及角膜上皮細(xì)胞的血漿纖維蛋白膜片中BMSCs在大鼠角膜堿燒傷部位的分化與植入利用 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-1-（2-deoxy-β-D-ribofuranosyl）uracil5-Bromouracil deoxyriboside,5-BrdU）標(biāo)記對(duì) BMSCs 進(jìn)行示蹤以檢測(cè) BMSCs 在損傷角膜組織的植入情況。結(jié)果顯示,在第7天沒(méi)有在角膜損傷部位檢測(cè)到BMSCs,但在第14天時(shí)在角膜損傷部位檢測(cè)到有少量BMSCs,且免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)BMSCs表達(dá)CK12。這表明以血漿纖維蛋白膜支架以及負(fù)載的角膜上皮細(xì)胞組成的微環(huán)境下,BMSCs在早期修復(fù)階段（7～21天）可以植入到損傷部位,并能夠向角膜上皮細(xì)胞分化?？傊?本課題將BMSCs與角膜上皮細(xì)胞裝載于自制的血漿纖維蛋白膜支架上制備了組織觀察細(xì)胞膜片,移植用于大鼠角膜堿燒傷時(shí),顯示出有效減輕角膜損傷部位炎癥反應(yīng),抑制角膜損傷部位的纖維化程度,加快角膜傷口愈合的作用,還發(fā)現(xiàn)部分BMSCs成功植入大鼠角膜損傷部位并向角膜上皮細(xì)胞分化。這些結(jié)果提示,該組織工程細(xì)胞膜片值得進(jìn)一步研究,或有望為角膜損傷提供新的治療方案,為構(gòu)建組織工程角膜提供新的組合方式。
覃嵐鳳[3]（2020）在《復(fù)合改性膠原膜及間充質(zhì)干細(xì)胞用于角膜修復(fù)的研究》文中指出角膜是眼睛最外層的透明組織,容易受到損傷而進(jìn)一步發(fā)展成角膜病,角膜病已成為我國(guó)的第二大類(lèi)致盲性角膜疾病。目前,角膜移植術(shù)是治療角膜盲的金標(biāo)準(zhǔn),然而全世界角膜供體的稀缺是影響手術(shù)治療的最大障礙,且移植術(shù)后的免疫排斥問(wèn)題也不可忽視。因此,迫切需要尋找到角膜再生修復(fù)替代材料并解決術(shù)后免疫排斥問(wèn)題。膠原作為天然角膜細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,在角膜再生修復(fù)方面應(yīng)用廣泛。然而膠原力學(xué)性能差（不耐手術(shù)縫合）的缺點(diǎn)限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。纖維素納米晶具有優(yōu)異的力學(xué)性能和較好的生物相容性,將纖維素納米晶復(fù)合到膠原中可得到具有良好力學(xué)性能和生物相容性的膠原基復(fù)合材料。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類(lèi)具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞,能促進(jìn)組織修復(fù)和抗免疫排斥反應(yīng),在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了極大的關(guān)注,在角膜損傷治療方面也有廣泛的研究。因此,本論文擬將復(fù)合改性膠原膜及間充質(zhì)干細(xì)胞用于角膜損傷后的再生修復(fù)。本研究以牛跟腱I型膠原作為基礎(chǔ)材料,通過(guò)向膠原溶液中加入不同質(zhì)量的纖維素納米晶的水分散液得到不同質(zhì)量比的膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜,其質(zhì)量比分別為0wt%,1 wt%,3 wt%,5 wt%,7 wt%和10 wt%。對(duì)不同質(zhì)量比的膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜進(jìn)行理化性能和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究,結(jié)果表明:纖維素納米晶的加入能夠有效增強(qiáng)膠原膜的力學(xué)強(qiáng)度,與純膠原膜相比,10 wt%CNCs的拉伸強(qiáng)度和彈性模量分別增加了3.5和2.7倍;且纖維素納米晶的加入不會(huì)對(duì)膠原膜本身的溶脹性能和透光性能產(chǎn)生影響,但復(fù)合膜的降解速率加快,而7 wt%CNCs與純膠原膜降解速率相似;體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,兔角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞在膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜上具有良好的粘附形態(tài)和細(xì)胞增殖,表明膠原基復(fù)合膜具有良好的生物相容性;體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和TGF-β1誘導(dǎo)下角膜基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)顯示,7 wt%CNCs能顯著加快劃痕的愈合以及抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化。因此,7 wt%CNCs各方面性能較好,能夠滿(mǎn)足角膜修復(fù)的需要,在角膜再生修復(fù)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。另外,本研究采用全骨髓貼壁法提取了兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過(guò)體外培養(yǎng)鑒定和共培養(yǎng)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞的分化以及在TGF-β1誘導(dǎo)下對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化的抑制作用,接下來(lái)將移植COL-GA和注射BMSCs用于角膜機(jī)械損傷修復(fù)的研究,結(jié)果表明:本研究提取的細(xì)胞經(jīng)鑒定為BMSCs;與角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的環(huán)境中,BMSCs向角膜上皮樣細(xì)胞分化,而在TGF-β1誘導(dǎo)條件下,與BMSCs共培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化行為被有效抑制;體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BMSCs能夠在一定程度上抑制角膜基質(zhì)的纖維化,移植COL-GA能夠加快并短時(shí)間內(nèi)維持完全的在上皮化過(guò)程,移植COL-GA和注射BMSCs聯(lián)合使用可一直維持完全再上皮化。綜上,本論文基于膠原材料力學(xué)性能差以及角膜損傷后基質(zhì)纖維化的問(wèn)題,通過(guò)引入不同含量的纖維素納米晶成功制了力學(xué)性能較好的膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜,研究膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的理化性能和生物學(xué)性能,提取并鑒定兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化和抗纖維化的潛能,最后將戊二醛熏蒸的純膠原膜與間充質(zhì)干細(xì)胞注射聯(lián)合用于角膜損傷后的修復(fù),為角膜再生修復(fù)研究提供理論參考,對(duì)角膜再生修復(fù)替代材料和角膜干細(xì)胞注射治療的發(fā)展具有重要的參考價(jià)值。
張璐[4]（2019）在《兔角膜基質(zhì)細(xì)胞及脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)構(gòu)建組織工程角膜移植的研究》文中提出[目 的]通過(guò)體外培養(yǎng)原代兔CSCs,以APCM為支架材料構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì),探討植入CSCs后的APCM在兔角膜深板層移植中的生長(zhǎng)情況,為后期組織角膜工程的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。[方 法]（1）體外分離培養(yǎng)原代兔CSCs并鑒定;（2）用經(jīng)慢病毒（LV Lentivirus）轉(zhuǎn)染的EFGP標(biāo)記兔CSCs,通過(guò)倒置熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀確定最佳感染時(shí)間及M0I值;（3）以APCM為支架材料,行兔角膜深板層移植,取新西蘭大白兔24只,分為3組。實(shí)驗(yàn)組:APCM+兔CSCs;對(duì)照組A:APCM組;對(duì)照組B:兔角膜原位縫合組;（4）各組術(shù)后1-4周、8周眼前段照相及熒光素染色;（5）術(shù)后1周、1個(gè)月、2個(gè)月前段OCT測(cè)角膜厚度;（6）術(shù)后2個(gè)月各組取材做冰凍切片免疫熒光及HE染色、GFP免疫組化檢測(cè)。[結(jié) 果]（1）成功分離培養(yǎng)出兔角膜基質(zhì)細(xì)胞;（2）經(jīng)LV-EGFP轉(zhuǎn)染的兔CSCs倒置熒光顯微鏡下觀察,吸出病毒液24h后即可觀察到綠色熒光,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),72h為最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間;流式細(xì)胞儀檢測(cè)在MOI=400時(shí),LV-EGFP對(duì)兔CSCs的存活率無(wú)影響;（3）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模后8周中,實(shí)驗(yàn)組角膜8點(diǎn)方位新生血管長(zhǎng)入角膜約2mm,角膜透明,未見(jiàn)明顯瘢痕,熒光素染色示植片中央?yún)^(qū)域有著色;對(duì)照組A角膜2點(diǎn)方位新生血管長(zhǎng)入角膜約3mm,植片中央?yún)^(qū)域熒光素著色;對(duì)照組B角膜7點(diǎn)方位新生血管長(zhǎng)入角膜約1mm,角膜透明,熒光素染色示角膜點(diǎn)狀著色;（4）眼前段OCT實(shí)驗(yàn)組角膜基質(zhì)信號(hào)較均勻,植片與植床緊密融合生長(zhǎng);對(duì)照組A角膜基質(zhì)層信號(hào)欠均勻,可見(jiàn)移植的APCM與原基質(zhì)間有明顯的界限,融合欠佳;對(duì)照組B基質(zhì)層灰度均勻,可見(jiàn)清晰的的上皮層,基質(zhì)層和內(nèi)皮層;（5）術(shù)后測(cè)各組中央角膜厚度分別為:323μm、166μm、324μm;（6）冰凍切片免疫熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)綠色熒光,對(duì)照組A/B均未見(jiàn)熒光;免疫組化實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)GFP表達(dá)陽(yáng)性,對(duì)照組A/B均為陰性。[結(jié) 論]注射有兔CSCs的APCM,可作為支架材料,體外構(gòu)建兔組織工程角膜,植片與原角膜植床融合生長(zhǎng)良好,結(jié)構(gòu)、功能更接近于兔自體角膜,可為臨床研究角膜移植提供良好的原料。
熊思佳[5]（2019）在《膠原膜表面圖案化及其調(diào)控角膜細(xì)胞行為的研究》文中認(rèn)為生物材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可以有效調(diào)控細(xì)胞的鋪展、增殖、遷移和分化等一系列行為,在組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,目前已引起極大的關(guān)注。對(duì)于角膜組織工程而言,天然角膜的基底膜表面及基質(zhì)層中均存在豐富的微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),是角膜功能行使的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此,將微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)應(yīng)用于角膜組織工程支架的構(gòu)建,研究材料表面微納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)角膜細(xì)胞的調(diào)控規(guī)律,不僅能加深人們對(duì)角膜細(xì)胞與其生長(zhǎng)的微環(huán)境之間相互作用的理解,還對(duì)體外構(gòu)建結(jié)構(gòu)和性能仿生的角膜修復(fù)材料,促進(jìn)角膜組織工程的發(fā)展具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究使用膠原作為基底材料,采用軟刻蝕與溶液澆注相結(jié)合的方法在膠原膜表面精確構(gòu)建了深度相同,寬度分別為25μm、50μm和100μm的三種微米級(jí)溝槽結(jié)構(gòu),采用掃描電子顯微鏡、接觸角測(cè)量?jī)x和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)等方法表征了微溝槽結(jié)構(gòu)對(duì)膠原膜理化性能的影響,并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了其對(duì)角膜上皮細(xì)胞的形態(tài)及行為的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),微溝槽結(jié)構(gòu)可使膠原膜的接觸角由53°下降至30°40°之間;微溝槽結(jié)構(gòu)還能提高膠原膜的離子滲透性能,溝槽寬度為100μm的膠原膜的離子滲透系數(shù)能達(dá)到1.3×10-6 cm2/s。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均能在微溝槽膠原膜上實(shí)現(xiàn)群體定向排列,取向程度最高可達(dá)80%。微溝槽膠原膜可促進(jìn)上皮細(xì)胞的定向遷移,溝槽越窄,定向遷移速度越快。此外,微溝槽結(jié)構(gòu)還能抑制基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化,隨溝槽寬度增加,抑制效果越顯著。本研究還模仿凸點(diǎn)結(jié)構(gòu)在膠原膜表面構(gòu)建了直徑分別為2μm、5μm和10μm有序微點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)及其組成的混合微點(diǎn)陣結(jié)構(gòu),并利用原子力顯微鏡、接觸角測(cè)量?jī)x和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等手段研究了微點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)對(duì)膠原膜理化性能及角膜細(xì)胞形態(tài)和行為的影響。結(jié)果表明,與平滑膠原膜相比,微點(diǎn)陣膠原膜的表面疏水性和表面粗糙度顯著增加;微點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)還能增加膠原膜的拉伸強(qiáng)度,10μm的微點(diǎn)陣膠原膜的力學(xué)強(qiáng)度可達(dá)1.8 MPa。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,微點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)能顯著改變角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),使細(xì)胞形狀由橢圓形、長(zhǎng)方形和梭形向三角形和星形轉(zhuǎn)變,細(xì)胞的面積和圓度降低,長(zhǎng)徑比增大;直徑為10μm的微點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞定向排列,取向度增加至40%;伴隨著細(xì)胞的形態(tài)變化,微點(diǎn)陣膠原膜上細(xì)胞的粘附效率和增殖速率呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢(shì)。綜上,本研究基于材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與細(xì)胞相互作用這一基本科學(xué)問(wèn)題,通過(guò)微納加工技術(shù)在膠原表面構(gòu)建了微溝槽和微點(diǎn)陣結(jié)構(gòu),研究其對(duì)膠原膜理化性能以及角膜細(xì)胞行為的影響規(guī)律,有助于進(jìn)一步理解材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與角膜細(xì)胞之間的相互作用,對(duì)角膜組織工程支架的設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)意義。
袁曉龍[6]（2015）在《利用魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架體外構(gòu)建組織工程全層人角膜的研究》文中認(rèn)為角膜是位于眼球最前壁的一層透明膜,具有一定的曲率半徑,在維持視功能和保護(hù)眼球方面發(fā)揮了不可替代的重要功能。人角膜由上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層構(gòu)成,其中,厚度約50μm的上皮層由6-8層人角膜上皮細(xì)胞（HCEP細(xì)胞）構(gòu)成,厚度約500μm的基質(zhì)層由人角膜基質(zhì)細(xì)胞（HCS細(xì)胞）和主要由膠原蛋白組成的高度有序的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成,厚度約5μm的內(nèi)皮層由單層人角膜內(nèi)皮細(xì)胞（HCE細(xì)胞）組成。角膜因位于眼表最前端,直接與外界接觸,故極易受到損傷和感染,一旦發(fā)生病變將會(huì)引起角膜混濁、視力下降甚至致盲。目前,臨床上治療角膜病盲的唯一有效手段是角膜移植。但遺憾的是,由于捐獻(xiàn)角膜數(shù)量的嚴(yán)重不足及捐獻(xiàn)角膜老化,致使絕大數(shù)角膜病盲患者無(wú)法通過(guò)角膜移植重見(jiàn)光明。近年來(lái)角膜組織工程技術(shù)的快速發(fā)展,使組織工程角膜的體外構(gòu)建成為可能,而組織工程角膜作為捐獻(xiàn)角膜的等效替代物,則是目前從根本上解決捐獻(xiàn)角膜高度匱乏問(wèn)題、使眾多角膜病盲患者恢復(fù)視功能的唯一希望。如何獲得足量正常的種子細(xì)胞和生物相容性理想的載體支架一直是制約組織工程角膜規(guī)?；w外構(gòu)建的兩大因素,已成為角膜組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在種子細(xì)胞方面,目前的研究主要集中在干細(xì)胞、轉(zhuǎn)染組織細(xì)胞系和原代組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)上,但由于體外培養(yǎng)條件、倫理或潛在致瘤性等多種限制,目前仍無(wú)法滿(mǎn)足組織工程角膜規(guī)?；瘶?gòu)建對(duì)種子細(xì)胞的需求。近年來(lái),本實(shí)驗(yàn)室成功建立了非轉(zhuǎn)染無(wú)致瘤性的HCE、HCS和HCEP的三種組織細(xì)胞系,并以其為種子細(xì)胞先后進(jìn)行了組織工程人角膜內(nèi)皮、基質(zhì)和上皮的體外構(gòu)建研究,達(dá)到了較為理想的動(dòng)物移植效果,使利用非轉(zhuǎn)染人角膜組織細(xì)胞系規(guī)?；瘶?gòu)建組織工程角膜成為可能。在載體支架方面,目前的研究主要集中在天然生物材料、人工合成高分子材料和生物大分子復(fù)合材料方面。鑒于天然生物材料或多或少地受到其病原體攜帶風(fēng)險(xiǎn)和來(lái)源的限制、人工合成高分子材料還存在有生物相容性不理想等缺陷,學(xué)者們便逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到生物大分子復(fù)合材料的研發(fā)方面。在生物大分子復(fù)合材料的研究中,膠原蛋白由于具有來(lái)源廣泛、在進(jìn)化上高度保守、免疫原性低且生物相容性理想等諸多優(yōu)勢(shì),已被廣泛用于各種載體支架材料的制備研究,且利用人膠原蛋白復(fù)合支架成功構(gòu)建出了組織工程角膜,但遺憾的是,所制備出的膠原蛋白復(fù)合支架仍然存在有力學(xué)性能欠佳、體內(nèi)降解速度過(guò)快和制備成本較高等缺陷。近年來(lái),高效無(wú)毒交聯(lián)劑及其交聯(lián)技術(shù)的快速發(fā)展以及非酶解/完整分子魚(yú)類(lèi)膠原蛋白制備技術(shù)的建立,為利用魚(yú)類(lèi)膠原蛋白制備組織工程角膜載體支架創(chuàng)造了條件。本文在前期研究工作的基礎(chǔ)上,首次利用本實(shí)驗(yàn)室自主分離純化的非酶解/完整分子魚(yú)類(lèi)膠原蛋白啟動(dòng)了魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的制備研究,進(jìn)而以其為載體支架、以非轉(zhuǎn)染無(wú)致瘤性的三種組織細(xì)胞系作為種子細(xì)胞進(jìn)行了組織工程全層人角膜（TE-flHC）的體外構(gòu)建研究,旨在建立魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的制備與TE-flHC體外構(gòu)建的技術(shù)工藝,獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)、屬性和功能蛋白表達(dá)正常的TE-flHC。為了利用魚(yú)類(lèi)膠原蛋白制備出生物相容性理想的載體支架,本文采用本實(shí)驗(yàn)室業(yè)已純化的孔鰩魚(yú)皮膠原蛋白,選用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺（EDC/NHS）交聯(lián)劑和自制模具,進(jìn)行了魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的制備和鑒定。魚(yú)類(lèi)膠原蛋白的鑒定結(jié)果顯示,所純化的孔鰩魚(yú)皮膠原蛋白純度高,在SDS-PAGE電泳中無(wú)雜帶,存在形式分別為單股α鏈、雙股α鏈和三股α鏈,單α鏈的分子量約為120 kDa, Gly含量約占總氨基酸含量的32.34%,符合膠原蛋白的分子量和氨基酸組成的基本特征,為未被降解的膠原蛋白完整分子,可用于魚(yú)類(lèi)膠原蛋白復(fù)合支架的制備。在對(duì)所純化膠原蛋白進(jìn)行鑒定之后,本文以所得魚(yú)膠原蛋白為原料,采用自制裝置并通過(guò)EDC/NHS交聯(lián)改性制備出了魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架。含水量測(cè)定結(jié)果顯示,60mg/mL、80 mg/mL和100mg/mL膠原蛋白支架的含水量分別為90.53%±0.06%、89.88%±0.03%和86.34.%±0.11%；透明度與透光率結(jié)果顯示,上述三種膠原蛋白支架均具有良好的透明度,其透光率分別為91.15±2.36%、89.77±2.30%和86.09±2.31%；力學(xué)性能檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),增加膠原蛋白支架的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率隨膠原蛋白的濃度升高而提高。冰凍切片HE染色和掃描電鏡結(jié)果表明,100 mg/mL膠原蛋白支架相對(duì)于60 mg/mL和80 mg/mL膠原蛋白支架,其組織結(jié)構(gòu)較為致密,膠原纖維連續(xù),孔徑大小均勻,內(nèi)部結(jié)構(gòu)最佳。以上結(jié)果說(shuō)明,所制備的魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架具有良好的光學(xué)性能、力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu),可望用作TE-flHC體外構(gòu)建的載體支架。為了獲得足量的人角膜種子細(xì)胞,本文首先對(duì)業(yè)已建立的三種非轉(zhuǎn)染人角膜組織細(xì)胞系進(jìn)行了擴(kuò)增培養(yǎng)和鑒定。形態(tài)觀察和生長(zhǎng)曲線(xiàn)的鑒定結(jié)果顯示,HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞仍分別保持有上皮樣、成纖維樣和多角形內(nèi)皮樣的形態(tài)特征,其群體倍增時(shí)間分別為38.5h、37.6 h和36.2 h；染色體鑒定結(jié)果顯示,這三種細(xì)胞的特征染色體數(shù)目均為2n=46條；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCEP細(xì)胞仍保持有其標(biāo)志蛋白——角蛋白3/12以及功能蛋白——緊密連接蛋白（ZO-1）,整聯(lián)蛋白131、間隙連接蛋白-43、鈉鉀泵和乙醛脫氫酶的陽(yáng)性表達(dá)；HCS細(xì)胞仍保持有其標(biāo)志蛋白——波形蛋白以及功能蛋白——整聯(lián)蛋白p1、間隙連接蛋白-43、鈉鉀泵和乙醛脫氫酶（ALDH）的陽(yáng)性表達(dá)；HCS細(xì)胞仍保持有標(biāo)志蛋白——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體蛋白（FLK-1）以及功能蛋白——整聯(lián)蛋白β5,緊密連接蛋白（ZO-1）,間隙連接蛋白-43和鈉鉀泵的陽(yáng)性表達(dá)。這些結(jié)果表明,體外擴(kuò)增培養(yǎng)的三種人角膜組織細(xì)胞在形態(tài)、增殖能力、染色體特征以及功能蛋白表達(dá)方面仍然具有典型的原有屬性和發(fā)揮形成細(xì)胞連接和穿膜運(yùn)輸?shù)臐撃?可作為種子細(xì)胞用于TE-flHC的體外構(gòu)建。為了驗(yàn)證所制備的魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的生物相容性,本文在獲得足量的人角膜種子細(xì)胞后,利用MTT法、RT-PCR和免疫組織化學(xué)等方法檢測(cè)了支架對(duì)三種人角膜組織細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖調(diào)控基因表達(dá)以及功能蛋白表達(dá)的影響作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架浸提液對(duì)體外培養(yǎng)的HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞的細(xì)胞活力沒(méi)有顯著影響（P>0.05）。RT-PCR結(jié)果表明,支架對(duì)三種種子細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖基因的表達(dá)水平也沒(méi)有顯著影響（P>0.05）。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,HCEP細(xì)胞在接種于支架表面后仍能保持其標(biāo)志蛋白——角蛋白3/12、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白p1、ZO-1和間隙連接蛋白-43以及功能蛋白——鈉鉀泵和ALDH的陽(yáng)性表達(dá)；HCS細(xì)胞在接種于支架表面后仍能保持其標(biāo)志蛋白——波形蛋白、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白β1和間隙連接蛋白-43、以及功能蛋白——鈉鉀泵和ALDH的陽(yáng)性表達(dá)；HCE細(xì)胞在接種于支架表面后仍能保持其標(biāo)志蛋白——FLK-1、細(xì)胞連接形成蛋白——整聯(lián)蛋白β5、ZO-1和間隙連接蛋白-43、以及功能蛋白——鈉鉀泵的陽(yáng)性表達(dá)。這些結(jié)果表明,所制備的魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架對(duì)三種人角膜組織細(xì)胞不僅沒(méi)有毒性,而且對(duì)其生長(zhǎng)增殖調(diào)控基因、標(biāo)志蛋白及功能蛋白的表達(dá)沒(méi)有任何影響作用,與三種人角膜組織細(xì)胞具有理想的生物相容性,可以作為載體支架用于TE-flHC的體外構(gòu)建。在獲得足量正常的三種人角膜組織細(xì)胞和生物相容性理想的魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架后,本文以三種人角膜組織細(xì)胞為種子細(xì)胞、以魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架為載體支架,進(jìn)行了TE-flHC的體外構(gòu)建和鑒定研究。我們?cè)趦?yōu)化種子細(xì)胞的接種天數(shù)后,分別將HCS細(xì)胞、HCE細(xì)胞和HCEP細(xì)胞接種于魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架,通過(guò)浸沒(méi)培養(yǎng)或液氣-液界面培養(yǎng)數(shù)天后成功構(gòu)建TE-flHC,并通過(guò)外觀觀察、透明度檢測(cè)、冰凍切片HE染色、熒光標(biāo)記物檢測(cè)、茜素紅染色、透射電鏡、掃描電鏡和免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)其透光性能、組織結(jié)構(gòu)及種子細(xì)胞的蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行鑒定。透光性能檢測(cè)結(jié)果表明,構(gòu)建的TE-flHC具有良好的透光率與透明度,具有類(lèi)似正常角膜的高透光性能。熒光標(biāo)記物檢測(cè)與HE染色結(jié)果表明,三種人角膜細(xì)胞分界明顯,HCEP細(xì)胞在支架表面形成5至8層復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)；HCS細(xì)胞均勻分布于支架內(nèi)部；HCE細(xì)胞形成完整的細(xì)胞單層結(jié)構(gòu)。茜素紅染色結(jié)果表明,細(xì)胞密度為2750±260個(gè)/mm2,相當(dāng)于30歲成年人的角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明,HCEP細(xì)胞具有豐富的微絨毛結(jié)構(gòu),角膜上皮細(xì)胞與魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的連接處存在致密的基底膜,并且細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-支架之間結(jié)合緊密；HCS細(xì)胞呈纖維樣,形態(tài)伸展,與魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架連接緊密；HCE細(xì)胞平整連續(xù),形成了由完整的單層結(jié)構(gòu),與正常角膜內(nèi)皮層相似。以上結(jié)果說(shuō)明構(gòu)建的TE-flHC具有類(lèi)似于正常角膜的解剖結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,三種人角膜組織細(xì)胞均能維持其原有屬性,并且形成了緊密連接、錨定連接和通訊連接,具有正常角膜相似的進(jìn)行膜泡運(yùn)輸和抗UV氧化損傷的功能。綜上所述,本文利用孔鰩皮膠原蛋白制備出了光學(xué)性能、力學(xué)性能和組織結(jié)構(gòu)良好且與HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞具有理想生物相容性的魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架,進(jìn)而以膠原蛋白支架為載體支架,以屬性正常、增殖能力旺盛及功能蛋白表達(dá)正常的非轉(zhuǎn)染HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞為種子細(xì)胞,成功體外構(gòu)建出了與正常角膜結(jié)構(gòu)、屬性與功能相似的組織工程全層角膜。本文研究結(jié)果,對(duì)于魚(yú)類(lèi)膠原蛋白在組織工程領(lǐng)域的高質(zhì)化應(yīng)用具有重要意義,為我國(guó)數(shù)百萬(wàn)、全世界有數(shù)千萬(wàn)角膜病盲患者早日通過(guò)TE-flHC移植重見(jiàn)光明帶來(lái)希望。
龐鑫[7]（2015）在《組織工程人后板層半角膜體外構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究》文中認(rèn)為角膜（Cornea）是位于眼球表面的一層透明組織,是維持正常視功能的重要結(jié)構(gòu),由于位于眼表的最外層,因而極易受到損傷和感染,致使角膜病是引起視力下降甚至致盲的主要因素,目前主要依賴(lài)于角膜移植手術(shù)進(jìn)行治療。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國(guó)現(xiàn)有角膜病盲患者300余萬(wàn),均需要通過(guò)角膜移植進(jìn)行治療,但因捐獻(xiàn)角膜數(shù)量有限和供體角膜老化,每年能接受手術(shù)治療的患者只有1000余人,絕大多數(shù)患者因得不到可用的供體角膜而無(wú)法接受角膜移植和復(fù)明。目前,體外構(gòu)建的組織工程角膜（Tissue-engineered human cornea）作為捐獻(xiàn)角膜的替代物,是解決供體角膜匱乏的主要途徑,已成為眾多角膜病盲患者重見(jiàn)光明的希望。組織工程角膜體外構(gòu)建的核心要素是種子細(xì)胞（Seeder cells）、載體支架（Carrier scaffold）和信號(hào)分子（Signaling molecules）。組織工程角膜的體外構(gòu)建,要求種子細(xì)胞必須能夠持續(xù)保持細(xì)胞固有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、旺盛的增殖能力、穩(wěn)定的遺傳性能和發(fā)揮固有功能的潛能,要求載體支架必須具有與天然角膜類(lèi)似的光學(xué)性能、三維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)、生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度。獲得足量正常的種子細(xì)胞和生物相容性理想的的載體支架是開(kāi)展組織工程角膜體外構(gòu)建研究的前提條件。人角膜在組織結(jié)構(gòu)上由上皮層（Epithelium）、前彈力層（Bowman’s membrane）、基質(zhì)層（Stroma）、后彈力層（Descemet’ membrane）和內(nèi)皮層（Endothelium）構(gòu)成。其中,人角膜基質(zhì)（Human cornea stroma, HCS）由交錯(cuò)排列的200-250個(gè)膠原板層結(jié)構(gòu)和散在分布的HCS細(xì)胞組成,占角膜厚度的90%,在角膜厚度和透明度維持中具有關(guān)鍵作用；而人角膜內(nèi)皮（Human cornea endothelium, HCE）位于角膜最內(nèi)層、由連接緊密的單層HCE細(xì)胞鑲嵌而成,是角膜和前房的天然屏障,通過(guò)泵-漏機(jī)制維持角膜透明度并為角膜供養(yǎng)/氧,在角膜厚度和透明度維持中具有決定性作用。在角膜受到深度創(chuàng)傷和感染時(shí),往往會(huì)傷及深層HCS和HCE,即后板層半角膜,輕者引起角膜水腫和角膜內(nèi)皮失代償,重者甚至致盲。目前后板層半角膜的治療方法主要是通過(guò)單層HCS和HCE的多次角膜移植手術(shù),不僅增加了手術(shù)創(chuàng)傷和感染的風(fēng)險(xiǎn),而且在角膜愈合和移植瘢痕殘留方面也存在有諸多缺陷。因此,體外構(gòu)建出可用于移植的組織工程人后板層半角膜（Tissue-engineered posterior hemicornea, TE-pHC）已成為學(xué)者們新的研究熱點(diǎn)。本文研究目的就是利用本實(shí)驗(yàn)室自主建立的非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性的HCE細(xì)胞系和HCS細(xì)胞系作為種子細(xì)胞,以帶后彈力層的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)（acellular porcine corneal stromata with Descemet’ membrane, aPCS-DM）為載體支架,進(jìn)行TE-pHC的體外構(gòu)建研究,旨在獲得與活體角膜后半層組織結(jié)構(gòu)高度近似的TE-pHC。為了獲得足量正常的TE-pHC種子細(xì)胞,本文首先對(duì)非轉(zhuǎn)染無(wú)致瘤性HCS和HCE組織細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行了體外擴(kuò)增培養(yǎng),并對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖活性、染色體屬性以及細(xì)胞標(biāo)志蛋白和功能蛋白的表達(dá)進(jìn)行了鑒定。光鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn),體外擴(kuò)增培養(yǎng)的第1批65代HCE細(xì)胞形成匯合單層時(shí)呈多角形的六邊形內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài),第28批63代HCS細(xì)胞形態(tài)呈梭型,仍然具有其原有細(xì)胞的形態(tài)特征；生長(zhǎng)與增殖活性的檢測(cè)結(jié)果顯示,HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為48.54 h和38.28 h,仍保持有旺盛的體外增殖能力；染色體組型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),這兩種細(xì)胞的特征性染色體數(shù)目均為2n=46條,仍具有人類(lèi)染色體的特征；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞仍分別保持有HCE細(xì)胞標(biāo)志蛋白——人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（FLK-1）和HCS細(xì)胞標(biāo)志蛋白——波形蛋白的陽(yáng)性表達(dá),表明兩種細(xì)胞仍保持有HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的固有屬性。對(duì)HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞功能蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),HCE細(xì)胞仍保持有細(xì)胞連接形成蛋白——緊密連接蛋白1（ZO-1）、間隙連接蛋白-43（CX-43）和整聯(lián)蛋白βv/β5以及膜運(yùn)輸?shù)鞍住狽a+/K+-ATPase的陽(yáng)性表達(dá),而HCS細(xì)胞保持有CX-43和整聯(lián)蛋白β1以及Na+/K+-ATPase和乙醛脫氫酶3（ALDH3）的陽(yáng)性表達(dá),證明這兩種細(xì)胞均仍然保持有形成細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間細(xì)胞連接和執(zhí)行膜運(yùn)輸功能的潛能,且HCS細(xì)胞保持有抗紫外損傷的潛能。上述鑒定結(jié)果證明,第65代HCE細(xì)胞和第63代HCS細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)中的形態(tài)、染色體屬性和細(xì)胞屬性正常,增殖能力旺盛,并依然保持有形成細(xì)胞連接和執(zhí)行膜運(yùn)輸功能的潛能,符合作為組織工程角膜種子細(xì)胞的各項(xiàng)條件,可以被用于TE-pHC體外構(gòu)建的種子細(xì)胞。為了獲得形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然角膜類(lèi)似的TE-pHC載體支架,本文以新鮮豬角膜為材料進(jìn)行了aPCS-DM支架的制備和鑒定。我們利用凍融循環(huán)聯(lián)合核酸酶消化的方法進(jìn)行脫細(xì)胞處理,經(jīng)核黃素交聯(lián)及風(fēng)干處理,獲得了aPCS-DM載體支架。用于構(gòu)建TE-pHC前,分別對(duì)光學(xué)性能、組織結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和機(jī)械性能進(jìn)行了檢測(cè)和評(píng)價(jià)。光學(xué)性能檢測(cè)結(jié)果顯示,aPCS的透明度和透光率近似于天然角膜,具有良好的光學(xué)性能。組織學(xué)檢查結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理后aPCS膠原板層仍保持排列規(guī)則且結(jié)構(gòu)致密,后彈力層完整且表面平整,異種細(xì)胞在處理過(guò)程中被去除；理化性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示,含水量略高于天然角膜,aPCS中DNA殘留量低且符合醫(yī)用生物材料標(biāo)準(zhǔn),糖胺聚糖分布與天然角膜相似。生物力學(xué)性能檢測(cè)結(jié)果顯示,aPCS在生物力學(xué)性能上與天然角膜無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明,本文制備的aPCS-DM支架具有良好的光學(xué)性能,三維組織結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與天然角膜高度近似,生物力學(xué)性能優(yōu)良,滿(mǎn)足作為構(gòu)建TE-pHC的載體支架材料的要求。為了進(jìn)一步檢測(cè)載體支架與兩種細(xì)胞的生物相容性,本文對(duì)aPCS支架進(jìn)行了細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)和接種細(xì)胞后的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。利用HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性的檢測(cè)結(jié)果顯示,制備的aPCS無(wú)細(xì)胞毒性作用。接種HCS細(xì)胞和HCE細(xì)胞后aPCS的的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)胞在載體支架內(nèi)部和后彈力層表面均能陽(yáng)性表達(dá)其標(biāo)志蛋白、連接形成蛋白和功能蛋白。上述結(jié)果綜合表明,aPCS支架不僅無(wú)細(xì)胞毒性,還能夠?yàn)榧?xì)胞的黏附、增殖和功能表達(dá)提供合適的三維空間結(jié)構(gòu),具備良好的生物相容性,是作為T(mén)E-pHC體外構(gòu)建的理想支架材料。在已獲得種子細(xì)胞和載體支架的前提下,為了構(gòu)建具有功能的TE-pHC,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了TE-pHC的體外構(gòu)建并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。本文通過(guò)比較HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的不同接種方式和摸索細(xì)胞接種時(shí)間建贏了TE-pHC的構(gòu)建技術(shù)路線(xiàn)：微量注射的方法將HCS細(xì)胞接種于aPCS支架的基質(zhì)中,培養(yǎng)24 h后將接種過(guò)HCS細(xì)胞的植片后彈力層面向上直接法接種HCE細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)至4天,從而構(gòu)建出TE-pHC.對(duì)TE-pHC進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)和功能檢查,茜素紅染色結(jié)果說(shuō)明HCE細(xì)胞在后彈力層面形成連續(xù)的單層,細(xì)胞密度為2910±420個(gè)／mm2的密度,相當(dāng)于健康成人30歲左右的內(nèi)皮細(xì)胞密度；H&E染色結(jié)果顯示HCS細(xì)胞在注射點(diǎn)附近支架黏附并伸展,向周?chē)鷶U(kuò)散分布,HCE細(xì)胞連續(xù)完整單層與后彈力層結(jié)合緊密; TE-pHC的電鏡結(jié)果顯示,HCE細(xì)胞在aPCS后彈力層上形成的單層細(xì)胞表面平整,細(xì)胞與細(xì)胞連接緊密,兩種細(xì)胞與支架材料間均形成連接結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示構(gòu)建的TE-pHC中HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞標(biāo)志蛋白、連接形成蛋白和功能蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性。上述結(jié)果表明構(gòu)建的TE-pHC在組織結(jié)構(gòu)上近似于人角膜后板層,HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞功能蛋白正常表達(dá),具有發(fā)揮后板層生物學(xué)功能的潛能。綜上所述,本文利用在體外擴(kuò)增培養(yǎng)中的形態(tài)、染色體屬性和細(xì)胞屬性正常,增殖能力旺盛的非轉(zhuǎn)染HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞,以光學(xué)性能優(yōu)良,組織結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與天然角膜高度近似,生物相容性和機(jī)械力學(xué)性能良好的aPCS-DM為載體支架,經(jīng)體外構(gòu)建5天后即可獲得形態(tài)組織結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能與活體角膜后板層高度近似的TE-pHC,具有發(fā)揮其生物學(xué)功能的潛能。這些研究結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)在體外成功構(gòu)建的TE-pHC,既可作為體外角膜實(shí)驗(yàn)的良好模型,又兼具后板層半角膜移植等效替代物的應(yīng)用前景。TE-pHC體外構(gòu)建技術(shù)的建立及形態(tài)結(jié)構(gòu)正常TE-pHC的獲得,為其替代捐獻(xiàn)角膜用于后板層角膜異常病變的臨床治療創(chuàng)造條件,也可替代組織工程人全層角膜用于角膜緣完好的全層角膜異常患者的穿透性板層移植,不僅科學(xué)意義重大,社會(huì)意義和應(yīng)用價(jià)值重大,為組織工程角膜的臨床應(yīng)用奠定了體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
馬西亞[8]（2014）在《組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建及其動(dòng)物移植試驗(yàn)》文中研究表明人角膜內(nèi)皮層（HCE）由單層的六角形人角膜內(nèi)皮細(xì)胞（HCE細(xì)胞）鑲嵌而成，是前房房水和角膜基質(zhì)之間的滲漏性屏障，HCE細(xì)胞質(zhì)膜上所擁有的諸多膜運(yùn)輸?shù)鞍淄ㄟ^(guò)發(fā)揮“泵”功能使整個(gè)角膜處于半脫水狀態(tài)，在維持角膜正常厚度和其透明性進(jìn)而保障眼睛發(fā)揮正常視功能方面具有不可替代的作用。遺憾的是，成人的HCE細(xì)胞喪失了增殖能力，而且數(shù)量還在逐年減少，HCE單層完整性的維持只能靠鄰近HCE細(xì)胞的擴(kuò)大和移行來(lái)實(shí)現(xiàn)。一旦受到病原體感染、機(jī)械損傷和非生理性脅迫等，HCE細(xì)胞死亡的速率更快，輕者會(huì)造成不可逆角膜病變——角膜內(nèi)皮功能失代償（corneal endothelial dysfunction），重者將會(huì)致盲——角膜內(nèi)皮盲（primary corneal endotheliopathy），角膜內(nèi)皮病盲在因角膜病變所導(dǎo)致的視力障礙中位于第二位。角膜移植是目前治療角膜內(nèi)皮病盲的唯一辦法，因HCE異常僅僅是由于HCE細(xì)胞數(shù)量不足造成的，故絕大多數(shù)角膜內(nèi)皮病盲患者均可通過(guò)角膜移植而治愈，但由于捐獻(xiàn)角膜數(shù)量的高度匱乏，致使可用于角膜移植的供體角膜材料嚴(yán)重不足，眾多角膜內(nèi)皮病盲患者無(wú)法通過(guò)角膜移植重見(jiàn)光明。目前，組織工程人角膜內(nèi)皮（tissue-engineered human corneal endothelium,TE-HCE）被公認(rèn)為是治療角膜內(nèi)皮病盲的天然HCE的等效替代物，已成為廣大角膜內(nèi)皮病盲患者恢復(fù)視力和復(fù)明的唯一希望。但迄今為止，仍沒(méi)有可用于臨床HCE移植的TE-HCE產(chǎn)品問(wèn)世。本文在前期研究工作的基礎(chǔ)上，利用表型、核型和功能蛋白表達(dá)正常且沒(méi)有致瘤性的人角膜內(nèi)皮單克隆細(xì)胞株細(xì)胞（monoclonal human corneal endothelial cells, mcHCE細(xì)胞）為種子細(xì)胞，以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化去上皮層修飾羊膜（modifieddenuded-epithelium amniotic membrane, mdAM）為載體支架，在體外重建出了形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)正常的TE-HCE，并利用家貓和獼猴進(jìn)行了動(dòng)物角膜的穿透性后板層角膜移植試驗(yàn)，旨在獲得可使移植動(dòng)物角膜長(zhǎng)期維持透明的TE-HCE，為可用于臨床HCE移植的TE-HCE新產(chǎn)品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。用于TE-HCE體外重建的種子細(xì)胞為來(lái)自非轉(zhuǎn)染無(wú)致瘤性HCE細(xì)胞系（utHCEC01）的第38代mcHCE細(xì)胞。在用作種子細(xì)胞開(kāi)展TE-HCE體外重建之前，分別對(duì)其細(xì)胞屬性、功能蛋白的表達(dá)以及致瘤性進(jìn)行了檢測(cè)和鑒定。檢測(cè)結(jié)果顯示，第38代mcHCE細(xì)胞呈近似六角形的多邊形內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài)，透明度高，形態(tài)大小均一，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為41.07h，染色體數(shù)目為2n=46條，表明該細(xì)胞株細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分裂增殖能力旺盛；第38代mcHCE細(xì)胞仍維持有標(biāo)志蛋白——人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（Flk1）和人IV型膠原蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，表明該細(xì)胞株細(xì)胞保持有HCE細(xì)胞的固有屬性；細(xì)胞連接蛋白的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，第38代mcHCE細(xì)胞仍保持有緊密連接蛋白1（ZO-1）、N-鈣粘蛋白（N-Cadherin）、間隙連接蛋白-43（CX-43）和整聯(lián)蛋白αv/β5（Integrinαv/β5）的陽(yáng)性表達(dá)，表明該細(xì)胞株細(xì)胞具有在細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間形成細(xì)胞連接的潛能；第38代mcHCE細(xì)胞還維持有細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)鞍住薔a+/K+ATPase、人氯離子通道蛋白-2（hCLCN2）、 Na+/HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hSLC4）和人水孔通道蛋白-1（AQP1）的陽(yáng)性表達(dá)，表明該細(xì)胞株細(xì)胞具有發(fā)揮正常膜運(yùn)輸功能的潛能；第38代mcHCE細(xì)胞在裸鼠皮下接種后沒(méi)有腫瘤出現(xiàn)，證實(shí)該細(xì)胞株細(xì)胞沒(méi)有致瘤性。綜合上述檢測(cè)和鑒定結(jié)果，證明第38代mcHCE細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、屬性和功能正常，且沒(méi)有致瘤性，可以被用作TE-HCE體外重建的種子細(xì)胞。本文利用胰酶-EDTA倒置消化法對(duì)去上皮層羊膜進(jìn)行薄化處理，再使用專(zhuān)用信號(hào)分子包被，制得薄化mdAM。在用作載體支架進(jìn)行TE-HCE體外重建之前，分別對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及其與第38代mcHCE細(xì)胞的生物相容性進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，薄化mdAM只有基底膜和致密層組成，且上皮面光滑平整；厚度均一，平均厚度約為28.47μm；透明度和透光率良好，可見(jiàn)光區(qū)的透光率在90%以上；重金屬含量符合國(guó)家對(duì)可吸收植入型醫(yī)用生物材料的要求。薄化mdAM無(wú)熱源和眼刺激性；皮下植入后無(wú)炎癥反應(yīng)且降解速度比瑞濟(jì)生物羊膜快；且與第38代mcHCE細(xì)胞具有良好的生物相容性。綜上所述，薄化mdAM具有良好的理化和生物學(xué)性能，安全性高，且與mcHCE細(xì)胞生物相容性良好，可以被用作TE-HCE體外重建的載體支架。本文以上述mcHCE細(xì)胞為種子細(xì)胞、以薄化mdAM為載體支架，用含20%FBS的DMEM/F12（1:1）完全培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下進(jìn)行了TE-HCE的體外重建。每24h茜素紅染色結(jié)果顯示，重建96h后種子細(xì)胞便可在載體支架上形成完整連續(xù)的細(xì)胞層，細(xì)胞與細(xì)胞間著色清晰，細(xì)胞呈近似六角形內(nèi)皮樣形態(tài)，細(xì)胞密度為3487±99.04個(gè)/mm2；組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示，體外重建96h所得的TE-HCE具有完整連續(xù)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞單層，多角形細(xì)胞中具有一定數(shù)量的線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與載體支架間具有多處細(xì)胞連接樣結(jié)構(gòu)，與正常HCE的組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)相似。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，體外重建96h所得的TE-HCE仍維持有細(xì)胞緊密連接蛋白1（ZO-1）、N-鈣粘蛋白（N-Cadherin）、間隙連接蛋白-43（CX-43）和整聯(lián)蛋白αv/β5（Integrinαv/β5）的陽(yáng)性表達(dá)，表明體外重建96h所得的TE-HCE具有形成緊密連接復(fù)合體進(jìn)而形成前房房水與角膜基質(zhì)間滲漏性屏障的潛能。綜上所述，體外重建96h所得TE-HCE具有與正常HCE相似的形態(tài)特征、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，可以作為正常HCE的等效替代物，被認(rèn)為可以用于角膜內(nèi)皮病盲的臨床治療。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)所重建的TE-HCE在體內(nèi)是否具有正常HCE的生理功能。本文選用自身角膜內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有增殖能力的家貓和獼猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。首先撕除實(shí)驗(yàn)眼的后彈力層和內(nèi)皮層，然后進(jìn)行帶DiI熒光標(biāo)記的TE-HCE和mdAM（對(duì)照組）的后板層角膜移植。移植后用裂隙燈顯微鏡、角膜測(cè)厚儀和眼壓計(jì)跟蹤觀察其透明度、厚度和眼壓的變化情況，并在家貓移植104天，獼猴移植181天時(shí)取材進(jìn)行DiI熒光標(biāo)記、茜素紅染色及細(xì)胞密度、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的離體鑒定，此外家貓還進(jìn)行了房水蛋白變化的鑒定。結(jié)果顯示，家貓和獼猴TE-HCE移植眼的角膜均未出現(xiàn)水腫和排斥等不良反應(yīng)，角膜厚度逐漸下降，并逐漸恢復(fù)透明；而mdAM實(shí)驗(yàn)眼，角膜水腫嚴(yán)重且不透明；但TE-HCE移植眼、mdAM移植眼和正常對(duì)照眼的眼壓在觀察期間均在上下波動(dòng)，沒(méi)有明顯的相關(guān)性。離體檢測(cè)結(jié)果顯示，家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜中央移植區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞均帶有DiI熒光標(biāo)記，且形態(tài)大小均一，多為六角形鑲嵌內(nèi)皮樣形態(tài)，細(xì)胞密度分別為2573.33±0.59個(gè)/mm2和2780.00±0.77個(gè)/mm2，與他們各自正常對(duì)照眼的形態(tài)和細(xì)胞密度相近，而mdAM移植眼角膜中央移植區(qū)均沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞，這表明，家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜中央移植區(qū)的內(nèi)皮細(xì)胞均來(lái)自所植入的TE-HCE，且具有與正常對(duì)照眼相似的形態(tài)特征和細(xì)胞密度。家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜的組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照眼角膜相似，但獼猴TE-HCE移植眼角膜在移植181天后HCE細(xì)胞仍沒(méi)有分泌形成新的后彈力層。家貓TE-HCE移植眼和正常對(duì)照眼房水蛋白的二維電泳的分析結(jié)果顯示，TE-HCE移植眼與正常對(duì)照眼房水蛋白分離斑點(diǎn)的重復(fù)性較好，匹配的Corr系數(shù)達(dá)到0.8以上。綜上所述，TE-HCE在家貓和獼猴體內(nèi)具有正常HCE的生理功能，能夠維持家貓和獼猴移植角膜的正常厚度和長(zhǎng)期透明性。綜上所述，利用表型、核型和功能蛋白表達(dá)正常且沒(méi)有致瘤性的mcHCE細(xì)胞為種子細(xì)胞，以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化mdAM為載體支架，在體外重建96h后即可獲得形態(tài)特征和組織結(jié)構(gòu)近似正常HCE的TE-HCE，且移植到自身角膜內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)增殖能力且撕除后彈力層和內(nèi)皮層的家貓和獼猴角膜上后，能夠重塑出形態(tài)特征、細(xì)胞密度、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)與正常HCE基本一致的角膜內(nèi)皮細(xì)胞單層，且能夠維持家貓和獼猴移植角膜的正常厚度及長(zhǎng)期透明性。這些研究結(jié)果表明該TE-HCE可以作為天然HCE的等效替代物，用于角膜內(nèi)皮病盲的臨床治療，為眾多角膜病盲患者重建光明帶來(lái)希望，這在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。
刁金美[9]（2014）在《基于脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的組織工程全層人角膜的體外重建、鑒定及其在動(dòng)物移植中的作用研究》文中研究指明角膜是位于眼表的透明組織，主要行使屈光的功能。由于角膜直接與外界環(huán)境接觸，因此極易受到機(jī)械外傷、熱灼傷以及微生物的感染，導(dǎo)致角膜病的發(fā)生，嚴(yán)重者甚至失明。角膜移植是唯一的治療方法。但是，目前所需的供體角膜數(shù)量嚴(yán)重匱乏，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足臨床的需要。隨著角膜組織工程的興起與發(fā)展，組織工程人角膜（Tissue-engineered Human Cornea，TE-HC）有望成為捐獻(xiàn)角膜的等效替代物，從而解決供體不足的問(wèn)題，為角膜病盲患者帶來(lái)復(fù)明的希望。TE-HC體外重建的核心要素主要包括兩方面：一是能夠獲得足量的、形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能正常的人角膜種子細(xì)胞；二是制備出與種子細(xì)胞具有良好生物相容性的載體支架。目前用于TE-HC的種子細(xì)胞主要有胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）、原代培養(yǎng)細(xì)胞、成體干細(xì)胞（adult stem cells,ASC）以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞； ESC應(yīng)用引起的倫理問(wèn)題、原代培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量限制、ASC誘導(dǎo)分化率低以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞的潛在致瘤性風(fēng)險(xiǎn)，限制了這些細(xì)胞在角膜組織工程中的應(yīng)用；載體支架主要有天然生物材料、天然高分子材料以及合成高分子材料。天然高分子材料構(gòu)建的載體支架存在的機(jī)械性能缺陷、合成高分子材料的生物相容性較差限制了其作為組織工程角膜載體支架的應(yīng)用。因此尋找理想的角膜種子細(xì)胞以及載體支架材料成為體外成功重建TE-HC的關(guān)鍵因素。本文采用的非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性的HCEP（human corneal epithelium, HCEP）細(xì)胞、基質(zhì)（human corneal stroma, HCS）細(xì)胞以及內(nèi)皮（human corneal endothelium, HCE）細(xì)胞，具有角膜細(xì)胞的正常屬性及功能，并且體外增殖能力強(qiáng)，短時(shí)間內(nèi)即可獲得大量的細(xì)胞，從而作為理想的種子細(xì)胞解決了TE-HC體外重建的種子細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題。而在載體支架方面，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期的研究、探索及優(yōu)化，制備出了具有透光率高、生物相容性好的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)（acellular porcine corneal stroma, aPCS），成為體外重建TE-HC的理想載體支架材料。為了進(jìn)一步鑒定HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞的屬性、功能蛋白的表達(dá)以及是否具有潛在的致瘤性，本文對(duì)第70代的HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞進(jìn)行了復(fù)蘇、擴(kuò)增培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果顯示，復(fù)蘇的第70代HCEP細(xì)胞和HCE細(xì)胞均呈典型上皮細(xì)胞型，而HCS細(xì)胞呈典型成纖維細(xì)胞型。HCEP細(xì)胞、HCE細(xì)胞的細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密相靠、互相銜接，排列呈現(xiàn)“鋪路石”狀，具有連接成片的能力，而HCS細(xì)胞排列呈流線(xiàn)型。HCEP細(xì)胞、HCE細(xì)胞以及HCS細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為39.6h、38.6h和36.5h，三種細(xì)胞的活力良好，增殖分裂旺盛，特征性染色體數(shù)目仍均為2n=46。功能蛋白的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，HCEP細(xì)胞能夠表達(dá)HCEP特異性標(biāo)志蛋白---角蛋白3和12，以及鈉鉀泵和整聯(lián)蛋白，表明該細(xì)胞仍具有角膜上皮的表型，且具有形成完整HCEP結(jié)構(gòu)的潛能；HCS細(xì)胞能夠表達(dá)HCS特異性標(biāo)志蛋白---波形蛋白,以及乙醛酸脫氫酶ALDH3A1及整聯(lián)蛋白，表明該細(xì)胞仍具有角膜基質(zhì)細(xì)胞的潛能；而HCE細(xì)胞能夠表達(dá)鈉鉀泵、緊密連接蛋白ZO-1及整聯(lián)蛋白，表明該細(xì)胞仍具有角膜內(nèi)皮的表型，且具有形成完整HCE結(jié)構(gòu)的潛能。致瘤性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，這三種角膜種子細(xì)胞安全性好，均無(wú)致瘤性。因此，HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞可作為體外重建TE-HC的理想種子細(xì)胞。為了獲得理想的載體支架，本文以帶后彈力層的豬角膜為研究材料，應(yīng)用0.5%脫氧膽酸鈉及0.04%原釩酸鈉聯(lián)合DNA-RNA酶對(duì)豬角膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，通過(guò)風(fēng)干的方法制備出理想的aPCS載體支架材料，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)功能鑒定和生物相容性研究。石蠟切片HE染色和冰凍切片DAPI染色結(jié)果顯示，aPCS無(wú)任何細(xì)胞殘留；阿利新蘭染色結(jié)果顯示胞外基質(zhì)糖胺聚糖（GAG）的分布與對(duì)照相似；而掃描電鏡結(jié)果顯示aPCS后彈力層面及基質(zhì)面光滑平整；透射電鏡結(jié)果顯示構(gòu)成aPCS膠原板層的膠原纖維排列整齊規(guī)則。為了檢測(cè)aPCS的生物相容性，我們制備了aPCS浸提液，并進(jìn)行了浸提液對(duì)HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞的細(xì)胞活力及細(xì)胞毒性的檢測(cè)，結(jié)果顯示aPCS浸提液對(duì)三種細(xì)胞的生長(zhǎng)均無(wú)影響，不影響細(xì)胞的增殖，也不引起細(xì)胞的凋亡，沒(méi)有對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。因此，aPCS可以作為體外重建TE-HC的理想載體支架。為了建立TE-HC體外規(guī)?；亟ǖ募夹g(shù)工藝條件，在獲得了理想的種子細(xì)胞和載體支架材料后，我們進(jìn)行了TE-HC的體外重建研究。首先采用微量注射的方法將HCS細(xì)胞接種于aPCS支架的基質(zhì)中，然后將其置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h；其次，將接種過(guò)HCS細(xì)胞的植片放于插入式培養(yǎng)皿中，后彈力層面朝上，將HCE細(xì)胞接種于aPCS的后彈力層面，培養(yǎng)24h后反轉(zhuǎn)植片，后彈力層朝下，接種HCEP細(xì)胞，采用氣-液界面培養(yǎng)方法持續(xù)培養(yǎng)5d，從而重建出了TE-HC，并對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞功能蛋白表達(dá)進(jìn)行了鑒定。茜素紅染色結(jié)果顯示HCE細(xì)胞在后彈力層面形成了連續(xù)的細(xì)胞單層；石蠟切片HE染色結(jié)果顯示aPCS支架內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞伸展良好，與支架材料結(jié)合緊密；而HCEP細(xì)胞在aPCS支架基質(zhì)層表面形成了6-7層的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)，類(lèi)似于正常角膜的結(jié)構(gòu)；免疫組化染色結(jié)果顯示TE-HC的HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白、功能蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性，與正常細(xì)胞的表型和功能相同。上述結(jié)果表明以帶后彈力層的aPCS為載體支架、以第70代HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞為種子細(xì)胞體外成功重建出了TE-HC，具有與活體角膜相似的組織結(jié)構(gòu)，其種子細(xì)胞具有功能蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，表明可能具有全角膜的生物學(xué)功能。為了鑒定體外重建TE-HC的生物學(xué)功能，本文選用新西蘭兔和比格犬進(jìn)行了TE-HC的穿透性角膜移植實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)過(guò)裂隙燈顯微鏡觀察、角膜厚度以及眼壓測(cè)定等方法來(lái)評(píng)估在體TE-HC的透明度、厚度和新生血管等特征。結(jié)果顯示，新西蘭兔術(shù)后前10d，角膜水腫，眼壓偏高；第20d，水腫狀況減輕，眼壓恢復(fù)正常；第30d，角膜部分透明。比格犬移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在術(shù)后前期，植片水腫，眼壓升高，但是30d后，角膜重新上皮化，眼壓恢復(fù)正常，角膜水腫減輕，但是還是未恢復(fù)到正常角膜厚度，目前我們已觀察至270d，發(fā)現(xiàn)角膜新生血管情況好轉(zhuǎn)，但是術(shù)眼角膜厚度還是高于正常角膜。綜上所述，本文以具有正常屬性和功能的第70代HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞以及HCE細(xì)胞為種子細(xì)胞，以具有良好生物相容性的aPCS為載體支架，體外重建了形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能屬性與活體角膜相似的TE-HC，并進(jìn)行了新西蘭兔和比格犬的穿透性角膜移植實(shí)驗(yàn)，雖然在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有達(dá)到我們預(yù)想的理想情況，但是卻為我們提供了后續(xù)TE-HC重建的參數(shù)，在此基礎(chǔ)上，接下來(lái)我們將對(duì)TE-HC的重建方法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，從而最終能夠?qū)崿F(xiàn)成功重建出可應(yīng)用于臨床角膜移植的TE-HC。
劉楊[10]（2014）在《膠原基角膜修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)仿生構(gòu)建與功能化研究》文中研究說(shuō)明角膜移植是目前治療角膜病致盲唯一有效的方法，角膜修復(fù)材料的匱乏極大地限制了角膜病治療的普及和開(kāi)展本論文致力于具有較好理化性能和生物學(xué)性能的膠原基角膜修復(fù)材料的研究此外，術(shù)后的細(xì)菌感染及炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致角膜移植失敗最主要的原因之一，因此研究在角膜修復(fù)的同時(shí)還具有廣譜抗菌效果的功能化角膜修復(fù)材料也是本文的重點(diǎn)所在與常見(jiàn)的角膜修復(fù)材料相比，本文構(gòu)建的結(jié)構(gòu)仿生膠原基材料具有以下優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)良的力學(xué)性能和光學(xué)性能合適的保濕性能易于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)透過(guò)的性能可控的孔洞和層狀結(jié)構(gòu)以及良好的體外和體內(nèi)生物相容性等負(fù)載抗菌藥物后的功能化角膜修復(fù)材料能夠在一周內(nèi)具有較好的抗革蘭氏陰性細(xì)菌和陽(yáng)性細(xì)菌的效果，并且能夠較好地實(shí)現(xiàn)受損角膜組織的修復(fù)本文對(duì)膠原基角膜修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)仿生構(gòu)建與抗菌功能化進(jìn)行了深入的研究和探討1膠原基角膜修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)仿生構(gòu)建研究角膜修復(fù)材料需要具有較為合適的理化性能和生物學(xué)性能，而這些性能與材料的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)類(lèi)似于天然角膜組織的仿生結(jié)構(gòu)有利于材料較好較快地實(shí)現(xiàn)受損組織的修復(fù)本研究采用物理或化學(xué)手段經(jīng)不同的制備工藝研制出了一系列的膠原基膜材料（1）膠原-明膠-透明質(zhì)酸（CGH631）復(fù)合膜材料具有較好的抗張強(qiáng)度親疏水性和生物相容性，但是不能耐受手術(shù)線(xiàn)縫合（2）通過(guò)離子瀝濾技術(shù)在膠原膜材料內(nèi)部引入了納米級(jí)的孔洞，這些微孔的存在改變了膠原膜材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而提高了材料的耐縫合性能；造孔劑含量在2.5%和5.0%之間的膠原膜材料具有較為合適的理化性能和生物學(xué)性能，可以作為膠原基角膜修復(fù)材料研究的基底材料（3）通過(guò)控制高分子溶液的成膜過(guò)程構(gòu)建出具有不同層狀仿生結(jié)構(gòu)的膠原基角膜修復(fù)材料，結(jié)果顯示這些材料具有類(lèi)似于天然角膜的理化性能和生物相容性，具有不同層間結(jié)構(gòu)的材料能夠針對(duì)角膜組織的不同部位進(jìn)行替代和修復(fù)（4）通過(guò)冷凍干燥技術(shù)在結(jié)構(gòu)仿生膜的基礎(chǔ)上構(gòu)建了具有微粗糙表面結(jié)構(gòu)的膠原基角膜修復(fù)材料（FD-Col膜），F(xiàn)D-Col膜比光滑膜材料表面具有更多的蛋白吸附和細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，角膜上皮細(xì)胞在FD-Col膜表面的上皮化過(guò)程要快于自然風(fēng)干膜的光滑表面；材料在兔眼表的上皮化過(guò)程在14天內(nèi)基本完成，明顯快于具有光滑表面結(jié)構(gòu)的材料2膠原基角膜修復(fù)材料的抗菌功能化研究本研究創(chuàng)造性地通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方法在膠原膜上負(fù)載了眼科手術(shù)中常用的光譜抗生素小分子Tobramycin，得到了能夠在一周內(nèi)具有藥物緩釋效果的抗菌功能化角膜修復(fù)材料膠原-妥布霉素膜（Col-Tob） Col-Tob膜保持了較好的光學(xué)性能，力學(xué)性能，保濕性能和生物相容性在PBS中浸泡了7天后的Col-Tob膜仍然對(duì)臨床上常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌金黃色葡萄球菌和陰性細(xì)菌大腸桿菌具有很好的抗菌效果人角膜上皮細(xì)胞能夠較好地在Col-Tob材料表面粘附鋪展生長(zhǎng)和增殖，一周后有23層細(xì)胞緊密地粘合在Col-Tob膜的表面動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Col-Tob膜能夠耐受手術(shù)線(xiàn)的縫合，在植入后能夠較好地與剩余正常角膜組織結(jié)合，眼表沒(méi)有發(fā)生細(xì)菌感染和炎癥反應(yīng)；術(shù)后一個(gè)月后，傷口完全愈合，眼表完成角膜上皮化過(guò)程；Col-Tob膜材料板層移植三個(gè)月后沒(méi)有出現(xiàn)明顯的新生血管和圓錐形角膜現(xiàn)象，起到了較好的修復(fù)效果
二、組織工程技術(shù)體外重建角膜上皮層的實(shí)驗(yàn)研究（論文開(kāi)題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問(wèn)題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問(wèn)題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫(xiě)法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過(guò)程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁(yè)面大小,采用多級(jí)分層頁(yè)表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁(yè)表轉(zhuǎn)換過(guò)程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過(guò)主支變革、控制研究對(duì)象來(lái)發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過(guò)調(diào)查文獻(xiàn)來(lái)獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過(guò)具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來(lái)分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過(guò)創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來(lái)間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、組織工程技術(shù)體外重建角膜上皮層的實(shí)驗(yàn)研究（論文提綱范文）
（1）基于光交聯(lián)水凝膠的體外角膜再生研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 緒論 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 角膜的結(jié)構(gòu) |
| 1.3 角膜的功能 |
| 1.4 角膜的損傷與修復(fù) |
| 1.4.1 角膜的損傷與疾病 |
| 1.4.2 臨床上的角膜修復(fù)方法 |
| 1.5 角膜組織工程概述 |
| 1.5.1 角膜組織工程適用的生物支架材料 |
| 1.5.2 角膜組織工程適用的種子細(xì)胞 |
| 1.5.3 角膜組織工程面臨的挑戰(zhàn)與應(yīng)用前景 |
| 1.6 本論文的研究目的、意義及內(nèi)容 |
| 第2章 甲基丙烯酸酯化明膠(GelMA)水凝膠的制備及其理化性能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 主要試劑及儀器 |
| 2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 |
| 2.3 結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 GelMA水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu) |
| 2.3.2 平衡水含量和酶降解 |
| 2.3.3 力學(xué)表征 |
| 2.3.4 接觸角和光學(xué)性質(zhì)表征 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第3章 GelMA水凝膠用于角膜基質(zhì)再生的生物學(xué)性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要試劑和儀器 |
| 3.2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBM-MSCs)的黏附 |
| 3.2.3 支架中rBM-MSCs的活力和形態(tài) |
| 3.2.4 支架中rBM-MSCs的增殖 |
| 3.2.5 誘導(dǎo)分化rBM-MSCs |
| 3.2.6 qRT-PCR檢測(cè)rBM-MSCs中角膜基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá) |
| 3.2.7 免疫熒光檢測(cè)rBM-MSCs中Lumican的表達(dá) |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 rBM-MSCs對(duì)于GelMA水凝膠的黏附與存活 |
| 3.3.2 rBM-MSCs在GelMA水凝膠表面的形態(tài) |
| 3.3.3 支架中rBM-MSCs的增殖情況 |
| 3.3.4 rBM-MSCs中的角膜基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的基因表達(dá) |
| 3.3.5 rBM-MSCs中Lumican的表達(dá) |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第4章 GelMA/HAMA雙網(wǎng)絡(luò)(DN)水凝膠用于角膜上皮再生的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要試劑和儀器 |
| 4.2.2 GelMA、HAMA的合成 |
| 4.2.3 核磁共振氫譜(~1H-NMR)和傅里葉紅外光譜檢測(cè)(FTIR) |
| 4.2.4 GelMA、HAMA和GelMA/HAMA雙網(wǎng)絡(luò)(DN)水凝膠的合成 |
| 4.2.5 DN水凝膠的理化性能檢測(cè) |
| 4.2.6 兔角膜上皮細(xì)胞(CEpCs)的培養(yǎng) |
| 4.2.7 DN水凝膠生物學(xué)性能檢測(cè) |
| 4.3 結(jié)果 |
| 4.3.1 GelMA和HAMA的~1H-MNR和FTIR的表征 |
| 4.3.2 GelMA/HAMA DN水凝膠的合成 |
| 4.3.3 GelMA/HAMA DN水凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu) |
| 4.3.4 GelMA/HAMA DN水凝膠的機(jī)械性能 |
| 4.3.5 GelMA/HAMA DN水凝膠的溶脹和保水性能 |
| 4.3.6 GelMA/HAMA DN水凝膠的光學(xué)性質(zhì)和親水性 |
| 4.3.7 GelMA/HAMA DN水凝膠的體外降解特性 |
| 4.3.8 CEpCs對(duì)于GelMA/HAMA DN水凝膠的增殖 |
| 4.3.9 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝膠上的生存力 |
| 4.3.10 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝膠上的形態(tài) |
| 4.3.11 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝膠上CK3的表達(dá) |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第5章 結(jié)論與展望 |
| 5.1 結(jié)論 |
| 5.2 展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
（2）血漿纖維蛋白膜負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞用于大鼠角膜堿燒傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符號(hào)說(shuō)明 |
| 第一章 前言 |
| 1 角膜結(jié)構(gòu) |
| 2 角膜損傷 |
| 3 角膜損傷的治療方式 |
| 4 干細(xì)胞 |
| 5 細(xì)胞支架 |
| 6 本課題設(shè)計(jì)思路與擬解決問(wèn)題 |
| 第二章 大鼠BMSCs及角膜上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 |
| 1 材料 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2 主要試藥 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定 |
| 2.2 角膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 |
| 3.2 BMSCs表面標(biāo)記物的鑒定 |
| 3.3 角膜上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 |
| 3.4 角膜上皮細(xì)胞的鑒定 |
| 4 討論 |
| 第三章 角膜上皮細(xì)胞對(duì)接觸共培養(yǎng)BMSCs的誘導(dǎo)分化 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要試藥 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 BMSCs與角膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 BMSCs與角膜上皮細(xì)胞不同比例接觸共培養(yǎng)7天后,BMSCs中角膜細(xì)胞相關(guān)基因△Ct值結(jié)果 |
| 3.2 BMSCs與角膜上皮細(xì)胞不同比例接觸共培養(yǎng)7天后,BMSCs中角膜上皮細(xì)胞相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量 |
| 4 討論 |
| 第四章 血漿纖維蛋白膜的制備與性能檢測(cè) |
| 1 材料 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2 主要試藥 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 血漿纖維蛋白膜的制備 |
| 2.3 血漿纖維蛋白膜的超微結(jié)構(gòu)表征 |
| 2.4 血漿纖維蛋白膜流變性檢測(cè) |
| 2.5 血漿纖維蛋白膜負(fù)載細(xì)胞 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 血漿纖維蛋白膜的制備 |
| 3.2 血漿纖維蛋白膜形貌 |
| 3.3 血漿纖維蛋白膜流變學(xué)檢測(cè) |
| 3.4 血漿纖維蛋白膜負(fù)載細(xì)胞觀察 |
| 4 討論 |
| 第五章 負(fù)載BMSCs及角膜上皮細(xì)胞的血漿纖維蛋白膜片對(duì)大鼠角膜堿燒傷的治療 |
| 1 材料 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2 主要試藥 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 制備負(fù)載BMSCs和角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜片 |
| 2.2 負(fù)載BMSCs與角膜細(xì)胞的血漿纖維蛋白膜片治療大鼠角膜堿燒傷 |
| 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 熒光素鈉染色觀察上皮缺損恢復(fù)情況 |
| 3.2 HE染色觀察角膜結(jié)構(gòu)恢復(fù)情況 |
| 3.3 免疫熒光染色檢測(cè)角膜損傷的治療情況 |
| 4 討論 |
| 總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文 |
| 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表 |
（3）復(fù)合改性膠原膜及間充質(zhì)干細(xì)胞用于角膜修復(fù)的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 角膜組織與角膜病 |
| 1.2.1 角膜的結(jié)構(gòu)與功能 |
| 1.2.2 角膜病 |
| 1.3 角膜損傷修復(fù) |
| 1.3.1 角膜上皮的損傷修復(fù) |
| 1.3.2 角膜基質(zhì)的損傷修復(fù) |
| 1.4 角膜再生修復(fù)替代材料 |
| 1.4.1 羊膜 |
| 1.4.2 角膜脫細(xì)胞基質(zhì) |
| 1.4.3 膠原 |
| 1.4.4 明膠 |
| 1.4.5 絲蛋白 |
| 1.5 MSCs的概述及其用于角膜損傷修復(fù) |
| 1.5.1 MSCs的來(lái)源與特性 |
| 1.5.2 MSCs的培養(yǎng)與鑒定 |
| 1.5.3 MSCs的轉(zhuǎn)分化作用 |
| 1.5.4 MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用 |
| 1.5.5 MSCs的新生血管調(diào)節(jié)作用 |
| 1.6 本文的研究目的、意義以及內(nèi)容 |
| 第二章 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的制備與表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料與設(shè)備 |
| 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 |
| 2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 |
| 2.3 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的制備 |
| 2.3.1 膠原溶液的制備 |
| 2.3.2 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的制備 |
| 2.4 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的理化性能表征 |
| 2.4.1 形貌表征 |
| 2.4.2 粗糙度測(cè)定 |
| 2.4.3 溶脹性能測(cè)定 |
| 2.4.4 力學(xué)性能測(cè)定 |
| 2.4.5 透光性測(cè)定 |
| 2.4.6 體外降解速率測(cè)定 |
| 2.4.7 接觸角測(cè)定 |
| 2.5 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的細(xì)胞生物學(xué)表征 |
| 2.5.1 角膜細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 2.5.2 角膜細(xì)胞的接種 |
| 2.5.3 角膜細(xì)胞的粘附 |
| 2.5.4 角膜細(xì)胞的形態(tài) |
| 2.5.5 角膜細(xì)胞的增殖 |
| 2.5.6 角膜上皮細(xì)胞的體外劃痕實(shí)驗(yàn) |
| 2.5.7 角膜基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化研究 |
| 2.5.8 數(shù)據(jù)分析 |
| 2.6 結(jié)果與討論 |
| 2.6.1 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的形貌 |
| 2.6.2 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的溶脹性能 |
| 2.6.3 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的力學(xué)性能 |
| 2.6.4 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的透光性能 |
| 2.6.5 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的體外降解速率 |
| 2.6.6 膠原基纖維素納米晶復(fù)合膜的親疏水性 |
| 2.6.7 角膜細(xì)胞的粘附 |
| 2.6.8 角膜細(xì)胞的形態(tài) |
| 2.6.9 角膜細(xì)胞的增殖 |
| 2.6.10 角膜上皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) |
| 2.6.11 角膜基質(zhì)細(xì)胞肌成纖維分化 |
| 2.7 本章小結(jié) |
| 第三章 改性膠原膜及BMSCs用于角膜損傷修復(fù)的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料與設(shè)備 |
| 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 |
| 3.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 |
| 3.3 BMSCs的分離培養(yǎng)鑒定與體外研究 |
| 3.3.1 BMSCs的原代及傳代培養(yǎng) |
| 3.3.2 BMSCs表面抗原的鑒定 |
| 3.3.3 BMSCs體外誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化 |
| 3.3.4 BMSCs體外共培養(yǎng)分化為角膜上皮樣細(xì)胞 |
| 3.3.5 BMSCs體外共培養(yǎng)抑制肌成纖維細(xì)胞分化相關(guān)因子的分泌 |
| 3.3.6 數(shù)據(jù)分析 |
| 3.4 膠原基膜聯(lián)合BMSCs用于角膜損傷修復(fù) |
| 3.4.1 膠原基膜和BMSCs的制備 |
| 3.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 3.4.3 角膜板層移植 |
| 3.4.4 裂隙燈觀察 |
| 3.4.5 熒光素鈉染色 |
| 3.4.6 OCT觀察 |
| 3.5 結(jié)果與討論 |
| 3.5.1 BMSCs的形態(tài)觀察 |
| 3.5.2 BMSCs表面抗原的鑒定 |
| 3.5.3 BMSCs體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的分化 |
| 3.5.4 BMSCs體外共培養(yǎng)分化為角膜上皮樣細(xì)胞 |
| 3.5.5 BMSCs共培養(yǎng)抑制肌成纖維細(xì)胞分化相關(guān)因子的分泌 |
| 3.5.6 白光拍照觀察 |
| 3.5.7 裂隙燈觀察 |
| 3.5.8 上皮化進(jìn)程觀察 |
| 3.5.9 OCT觀察 |
| 3.6 本章小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
| 附件 |
（4）兔角膜基質(zhì)細(xì)胞及脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)構(gòu)建組織工程角膜移植的研究（論文提綱范文）
| 縮略詞表(以字母順序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間獲得的學(xué)術(shù)成果 |
| 致謝 |
（5）膠原膜表面圖案化及其調(diào)控角膜細(xì)胞行為的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 角膜與角膜組織工程 |
| 1.3 角膜組織工程支架材料 |
| 1.3.1 脫細(xì)胞角膜基質(zhì) |
| 1.3.2 羊膜 |
| 1.3.3 膠原 |
| 1.3.4 明膠 |
| 1.3.5 絲蛋白 |
| 1.3.6 殼聚糖 |
| 1.3.7 其它人工合成高分子材料 |
| 1.4 表面圖案化及其制備方法 |
| 1.4.1 光刻 |
| 1.4.2 軟刻蝕 |
| 1.4.3 熱壓印 |
| 1.4.4 蘸筆納米刻蝕 |
| 1.5 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)角膜細(xì)胞的調(diào)控作用 |
| 1.5.1 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)角膜上皮細(xì)胞的調(diào)控作用 |
| 1.5.2 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用 |
| 1.5.3 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控作用 |
| 1.6 本文的研究目的、意義以及研究?jī)?nèi)容 |
| 第二章 微溝槽膠原膜的構(gòu)建及理化性能表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 |
| 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 |
| 2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 |
| 2.3 微溝槽膠原膜的制備 |
| 2.3.1 硅片模板的制備 |
| 2.3.2 PDMS模板的制備 |
| 2.3.3 膠原膜的制備 |
| 2.4 微溝槽膠原膜的理化性能表征 |
| 2.4.1 形貌觀察 |
| 2.4.2 接觸角測(cè)定 |
| 2.4.3 溶脹性能測(cè)定 |
| 2.4.4 透光性能測(cè)定 |
| 2.4.5 離子滲透性能測(cè)定 |
| 2.4.6 體外降解速率測(cè)定 |
| 2.4.7 力學(xué)性能測(cè)定 |
| 2.4.8 數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)與分析 |
| 2.5 結(jié)果與討論 |
| 2.5.1 微溝槽膠原膜的形貌 |
| 2.5.2 微溝槽膠原膜的接觸角 |
| 2.5.3 微溝槽膠原膜的溶脹性能 |
| 2.5.4 微溝槽膠原膜的透光性能 |
| 2.5.5 微溝槽膠原膜的離子滲透性能 |
| 2.5.6 微溝槽膠原膜的體外降解速率 |
| 2.5.7 微溝槽膠原膜的力學(xué)性能 |
| 2.6 本章小結(jié) |
| 第三章 微溝槽膠原膜對(duì)角膜細(xì)胞行為的影響 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 |
| 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 |
| 3.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 |
| 3.3 微溝槽膠原膜的細(xì)胞生物學(xué)表征 |
| 3.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 3.3.2 細(xì)胞的接種 |
| 3.3.3 接種細(xì)胞后膠原膜的形貌觀察 |
| 3.3.4 接種細(xì)胞后膠原膜的透光性能測(cè)定 |
| 3.3.5 細(xì)胞的形態(tài)及取向觀察 |
| 3.3.6 細(xì)胞的增殖與粘附 |
| 3.3.7 細(xì)胞的遷移 |
| 3.3.8 標(biāo)志基因的表達(dá)水平檢測(cè) |
| 3.3.9 標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平檢測(cè) |
| 3.3.10 數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)與分析 |
| 3.4 結(jié)果與討論 |
| 3.4.1 細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)膠原膜形貌及透光性能的影響 |
| 3.4.2 角膜細(xì)胞的取向 |
| 3.4.3 角膜細(xì)胞的增殖 |
| 3.4.4 角膜細(xì)胞的粘附 |
| 3.4.5 角膜上皮細(xì)胞的遷移 |
| 3.4.6 角膜基質(zhì)細(xì)胞的分化 |
| 3.5 本章小結(jié) |
| 第四章 微點(diǎn)陣膠原膜對(duì)角膜細(xì)胞行為的影響 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 |
| 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 |
| 4.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 |
| 4.3 微點(diǎn)陣膠原膜的制備 |
| 4.4 微點(diǎn)陣膠原膜的理化性能表征 |
| 4.4.1 形貌觀察 |
| 4.4.2 接觸角測(cè)定 |
| 4.4.3 表面粗糙度測(cè)定 |
| 4.4.4 溶脹性能測(cè)定 |
| 4.4.5 力學(xué)性能測(cè)定 |
| 4.5 微點(diǎn)陣膠原膜的細(xì)胞生物學(xué)表征 |
| 4.5.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及接種 |
| 4.5.2 細(xì)胞的形態(tài)及取向觀察 |
| 4.5.3 細(xì)胞的形態(tài)定量分析 |
| 4.5.4 細(xì)胞的增殖與粘附 |
| 4.5.5 數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)與分析 |
| 4.6 結(jié)果與討論 |
| 4.6.1 微點(diǎn)陣膠原膜的形貌 |
| 4.6.2 微點(diǎn)陣膠原膜的粗糙度 |
| 4.6.3 微點(diǎn)陣膠原膜的親疏水性 |
| 4.6.4 微點(diǎn)陣膠原膜的溶脹性能 |
| 4.6.5 微點(diǎn)陣膠原膜的力學(xué)性能 |
| 4.6.6 角膜細(xì)胞的形態(tài)觀察 |
| 4.6.7 角膜細(xì)胞的粘附 |
| 4.6.8 角膜細(xì)胞的增殖 |
| 4.7 本章小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
| 附件 |
（6）利用魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架體外構(gòu)建組織工程全層人角膜的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 角膜的解剖學(xué)特征與生理功能 |
| 1.1 角膜的解剖學(xué)特征 |
| 1.1.1 上皮層 |
| 1.1.2 前彈力層 |
| 1.1.3 基質(zhì)層 |
| 1.1.4 后彈力層 |
| 1.1.5 內(nèi)皮層 |
| 1.1.6 角膜緣 |
| 1.2 角膜的生理功能 |
| 1.2.1 屏障功能 |
| 1.2.2 透光功能 |
| 1.2.3 屈光功能 |
| 2 角膜病變及治療 |
| 3 組織工程角膜研究進(jìn)展 |
| 3.1 組織工程角膜種子細(xì)胞的研究 |
| 3.1.1 角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells) |
| 3.1.2 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells) |
| 3.1.3 角膜上皮細(xì)胞(corneal epithelial cells) |
| 3.1.4 口腔黏膜上皮細(xì)胞(oral mucosa epithelial cell) |
| 3.1.5 角膜基質(zhì)細(xì)胞(corneal stromal cells) |
| 3.1.6 角膜內(nèi)皮細(xì)胞(corneal endothelial cells) |
| 3.2 組織工程角膜載體支架材料的研究 |
| 3.2.1 天然生物材料 |
| 3.2.2 人工合成高分子材料 |
| 3.2.3 生物大分子復(fù)合材料 |
| 3.3 組織工程全層角膜體外構(gòu)建研究進(jìn)展 |
| 4 本文的研究目的和意義 |
| 第二章 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的制備及其鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)耗材 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.5 主要試劑配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 魚(yú)膠原蛋白鑒定 |
| 2.1.1 魚(yú)膠原蛋白分子量檢測(cè) |
| 2.1.2 魚(yú)膠原蛋白氨基酸組成分析 |
| 2.2 交聯(lián)條件優(yōu)化 |
| 2.2.1 交聯(lián)濃度優(yōu)化 |
| 2.2.2 交聯(lián)時(shí)間優(yōu)化 |
| 2.2.3 冰凍切片 |
| 2.2.4 HE染色 |
| 2.3 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的制備 |
| 2.4 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架理化性質(zhì)檢測(cè) |
| 2.4.1 外觀觀察 |
| 2.4.2 透光率 |
| 2.4.3 含水量檢測(cè) |
| 2.4.4 力學(xué)性能檢測(cè) |
| 2.4.5 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架組織結(jié)構(gòu)檢測(cè) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 魚(yú)膠原蛋白鑒定 |
| 3.1.1 分子量檢測(cè) |
| 3.1.2 氨基酸分析 |
| 3.2 EDC/NHS交聯(lián)條件優(yōu)化 |
| 3.2.1 交聯(lián)濃度優(yōu)化 |
| 3.2.2 交聯(lián)時(shí)間優(yōu)化 |
| 3.3 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的鑒定 |
| 3.3.1 透光性能檢測(cè) |
| 3.3.2 含水量檢測(cè) |
| 3.3.3 力學(xué)性能檢測(cè) |
| 3.3.4 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的組織結(jié)構(gòu) |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 第三章 人角膜組織細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)及其鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)耗材 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.5 主要試劑配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞及HCE細(xì)胞的復(fù)蘇及擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.1.1 細(xì)胞的復(fù)蘇 |
| 2.1.2 細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.2 HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞及HCE細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定 |
| 2.3 HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞及HCE細(xì)胞的染色體組型分析 |
| 2.4 HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞及HCE細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞及HCE細(xì)胞的生長(zhǎng)特性 |
| 3.2 HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞及HCE細(xì)胞的染色體組型分析 |
| 3.2.1 HCEP細(xì)胞的染色體組型 |
| 3.2.2 HCS細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)與核型分析 |
| 3.2.3 HCE細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)與核型分析 |
| 3.3 HCEP細(xì)胞、HCS細(xì)胞及HCE細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 第四章 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的生物相容性研究 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)耗材 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.5 主要試劑配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的制備和滅菌處理 |
| 2.1.1 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的制備 |
| 2.1.2 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的滅菌處理 |
| 2.2 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架浸提液制備 |
| 2.3 人角膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)與接種 |
| 2.3.1 人角膜細(xì)胞體外培養(yǎng) |
| 2.3.2 接種前魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的處理 |
| 2.3.3 HCEP細(xì)胞的CFSE標(biāo)記與接種 |
| 2.3.4 HCS細(xì)胞的DiI標(biāo)記與接種 |
| 2.3.5 HCE細(xì)胞的Celltrace標(biāo)記與接種 |
| 2.4 生物相容性檢測(cè) |
| 2.4.1 細(xì)胞活力檢測(cè) |
| 2.4.2 RT-PCR檢測(cè) |
| 2.4.3 熒光標(biāo)記物觀察 |
| 2.4.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) |
| 2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架浸提液對(duì)種子細(xì)胞的細(xì)胞活力影響 |
| 3.2 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架中種子細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖基因的表達(dá)情況 |
| 3.3 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架中種子細(xì)胞標(biāo)志蛋白與功能蛋白表達(dá)情況 |
| 3.3.1 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架中HCEP細(xì)胞標(biāo)志蛋白與功能蛋白表達(dá)情況 |
| 3.3.2 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架中HCS細(xì)胞標(biāo)志蛋白與功能蛋白表達(dá)情況 |
| 3.3.3 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架中HCE細(xì)胞標(biāo)志蛋白與功能蛋白表達(dá)情況 |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 第五章 體外構(gòu)建組織工程全層人角膜的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)耗材 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.5 主要試劑配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的制備和火菌處理 |
| 2.1.1 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架制備 |
| 2.1.2 魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的滅菌處理 |
| 2.2 種子細(xì)胞接種天數(shù)的優(yōu)化 |
| 2.2.1 接種前魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架的處理 |
| 2.2.2 HCEP細(xì)胞的CFSE標(biāo)記與接種天數(shù)優(yōu)化 |
| 2.2.3 HCS細(xì)胞的Dil標(biāo)記與接種天數(shù)優(yōu)化 |
| 2.2.4 HCE細(xì)胞的Celltrace標(biāo)記與接種天數(shù)優(yōu)化 |
| 2.2.5 冰凍切片與HE檢測(cè) |
| 2.2.6 細(xì)胞標(biāo)記物熒光觀察 |
| 2.3 TE-flHC的體外構(gòu)建 |
| 2.4 體外構(gòu)建的TE-flHC的鑒定 |
| 2.4.1 光學(xué)透明度與透光率 |
| 2.4.2 冰凍切片與HE檢測(cè) |
| 2.4.3 TE-flHC內(nèi)皮的茜素紅染色 |
| 2.4.4 細(xì)胞標(biāo)記物焚光觀察 |
| 2.4.5 掃描電鏡檢測(cè) |
| 2.4.6 透射電鏡檢測(cè) |
| 2.4.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 種子細(xì)胞接種大數(shù)的優(yōu)化 |
| 3.1.1 HCEP細(xì)胞接種天數(shù)優(yōu)化 |
| 3.1.2 HCS細(xì)胞接種天數(shù)優(yōu)化 |
| 3.1.3 HCE細(xì)胞接種天數(shù)優(yōu)化 |
| 3.2 TE-flHC的透光性能檢測(cè) |
| 3.3 TE-flHC組織結(jié)構(gòu)觀察 |
| 3.4 TE-flHC的超微結(jié)構(gòu)觀察 |
| 3.5 TE-flHC的生物學(xué)功能檢測(cè) |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
（7）組織工程人后板層半角膜體外構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 角膜基本結(jié)構(gòu) |
| 1.1 角膜上皮層 |
| 1.2 角膜前彈力層 |
| 1.3 角膜基質(zhì)層 |
| 1.4 角膜后彈力層 |
| 1.5 角膜內(nèi)皮層 |
| 2 組織工程角膜概述 |
| 3 組織工程角膜種子細(xì)胞的研究概述 |
| 3.1 原代或傳代細(xì)胞 |
| 3.2 成體干細(xì)胞 |
| 3.3 胚胎干細(xì)胞 |
| 3.4 永生化細(xì)胞系 |
| 4 組織工程角膜載體支架的研究概述 |
| 4.1 天然材料 |
| 4.1.1 羊膜 |
| 4.1.2 脫細(xì)胞角膜基質(zhì) |
| 4.2 生物大分子材料 |
| 4.2.1 膠原 |
| 4.2.2 絲素蛋白 |
| 4.2.3 纖維蛋白 |
| 4.2.4 殼聚糖 |
| 4.3 人工合成高分子材料 |
| 4.4 細(xì)胞片技術(shù) |
| 5 脫細(xì)胞角膜在組織工程角膜中的應(yīng)用 |
| 5.1 脫細(xì)胞方法 |
| 5.1.1 物理方法 |
| 5.1.2 化學(xué)方法 |
| 5.1.3 滲透溶液法 |
| 5.1.4 生物方法 |
| 5.1.5 螫合劑 |
| 5.1.6 醇類(lèi) |
| 5.2 脫細(xì)胞角膜在組織工程角膜構(gòu)建中的應(yīng)用 |
| 5.2.1 角膜基質(zhì)細(xì)胞的接種 |
| 5.2.2 角膜基質(zhì)細(xì)胞的接種 |
| 6 本文研究目的及意義 |
| 第二章 人角膜內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)及其鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的復(fù)蘇和體外擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.1.1 HCE細(xì)胞和HCS的復(fù)蘇 |
| 2.1.2 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.2 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的生長(zhǎng)特性測(cè)定 |
| 2.3 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的染色體組型分析 |
| 2.4 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的免疫化學(xué)檢測(cè) |
| 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 HCE細(xì)胞的形態(tài)觀察 |
| 3.2 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞生長(zhǎng)特性 |
| 3.3 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞的染色體核型分析 |
| 3.4 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá) |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 第三章 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架的制備及鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 主要儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架的制備 |
| 2.1.1 豬角膜的取材 |
| 2.1.2 豬角膜的脫細(xì)胞處理與保存 |
| 2.2 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)光學(xué)性能檢查 |
| 2.2.1 形態(tài)觀察 |
| 2.2.2 透光率檢測(cè) |
| 2.3 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)組織結(jié)構(gòu)學(xué)檢查 |
| 2.3.1 石蠟切片與H&E染色 |
| 2.3.1.1 石蠟切片制作 |
| 2.3.1.2 H&E染色 |
| 2.3.2 透射電鏡觀察 |
| 2.3.3 掃描電鏡觀察 |
| 2.4 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)成分分析 |
| 2.4.1 含水量測(cè)定 |
| 2.4.2 冰凍切片與DAPI染色 |
| 2.4.3 DNA含量檢測(cè) |
| 2.4.4 阿利新蘭染色 |
| 2.5 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)生物力學(xué)性能測(cè)試 |
| 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的理化性質(zhì)鑒定 |
| 3.1.1 外觀觀察 |
| 3.1.2 透光率 |
| 3.2 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)檢查 |
| 3.2.1 H&E染色結(jié)果 |
| 3.2.2 透射電鏡觀察結(jié)果 |
| 3.2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果 |
| 3.3 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的成分 |
| 3.3.1 含水量測(cè)定 |
| 3.3.2 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)DAPI染色結(jié)果 |
| 3.3.3 DNA定量檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.4 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)阿利新蘭染色結(jié)果 |
| 3.4 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的生物力學(xué)檢查結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 第四章 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架的生物相容性研究 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 主要儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 aPCS浸提液對(duì)HCE細(xì)胞及HCS細(xì)胞毒性檢測(cè) |
| 2.1.1 浸提液制備 |
| 2.1.2 形態(tài)學(xué)觀察 |
| 2.1.3 增殖能力檢測(cè) |
| 2.2 接種于aPCS支架上的HCE細(xì)胞及HCS細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè) |
| 2.2.1 HCS細(xì)胞的接種 |
| 2.2.2 HCS細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) |
| 2.2.3 HCE細(xì)胞的接種 |
| 2.2.4 HCE細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) |
| 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 aPCS浸提液對(duì)HCE細(xì)胞及HCS細(xì)胞活力影響作用分析 |
| 3.1.1 HCE細(xì)胞和HCS細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià) |
| 3.1.2 增殖能力檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.2 接種于aPCS支架的HCE細(xì)胞及HCS細(xì)胞屬性和功能蛋白表達(dá) |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 第五章 體外構(gòu)建組織工程人角膜后板層的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.4 主要試劑配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 組織工程人后板層半角膜接種HCE細(xì)胞條件摸索 |
| 2.1.1 HCE細(xì)胞的接種方法的比較 |
| 2.1.1.1 HCE細(xì)胞溫敏培養(yǎng)板法 |
| 2.1.1.2 HCE細(xì)胞直接接種法 |
| 2.1.1.3 接種HCE細(xì)胞的aPCS茜素紅染色 |
| 2.1.2 aPCS接種HCE細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間摸索 |
| 2.2 組織工程人后板層半角膜接種HCS細(xì)胞條件摸索 |
| 2.2.1 HCS細(xì)胞的接種方法的比較 |
| 2.2.1.1 HCS細(xì)胞的DiI細(xì)胞標(biāo)記 |
| 2.2.1.2 HCS細(xì)胞直接接種法 |
| 2.2.1.3 HCS細(xì)胞注射接種法 |
| 2.2.1.4 HCS細(xì)胞標(biāo)記的熒光觀察 |
| 2.2.2 aPCS接種HCE細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間摸索 |
| 2.3 組織工程人后板層半角膜的體外構(gòu)建 |
| 2.4 體外構(gòu)建組織工程人后板層半角膜的鑒定 |
| 2.4.1 TE-pHC內(nèi)皮的茜素紅染色 |
| 2.4.2 冰凍切片的細(xì)胞熒光標(biāo)記觀察 |
| 2.4.3 石蠟切片H&E染色 |
| 2.4.4 TE-pHC的免疫組織化學(xué)檢測(cè) |
| 2.4.5 TE-pHC的透射電鏡觀察 |
| 2.4.6 TE-pHC的掃描電鏡觀察 |
| 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 aPCS接種HCE細(xì)胞的摸索 |
| 3.1.1 HCE細(xì)胞接種方式的比較 |
| 3.1.2 HCE細(xì)胞在后彈力層面形成單層情況 |
| 3.1.3 HCE細(xì)胞的分布與定位 |
| 3.2 aPCS接種HCS細(xì)胞的摸索 |
| 3.2.1 HCS細(xì)胞接種方式的比較 |
| 3.2.2 HCS細(xì)胞在aPCS支架中的分布情況 |
| 3.3 體外構(gòu)建TE-pHC的鑒定 |
| 3.3.1 TE-pHC的內(nèi)皮單層茜素紅染色 |
| 3.3.2 細(xì)胞熒光標(biāo)記觀察和H&E染色 |
| 3.3.3 TE-pHC的免疫組織化學(xué)檢測(cè) |
| 3.3.4 TE-pHC的掃描電鏡檢測(cè) |
| 3.3.5 TE-pHC的透射電鏡檢測(cè) |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
| 在校期間發(fā)表論文 |
（8）組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建及其動(dòng)物移植試驗(yàn)（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 組織工程人角膜內(nèi)皮的研究綜述 |
| 1 角膜內(nèi)皮與角膜內(nèi)皮異常 |
| 1.1 角膜內(nèi)皮的形態(tài)特征及超微結(jié)構(gòu) |
| 1.2 角膜內(nèi)皮的細(xì)胞密度 |
| 1.3 角膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力 |
| 1.3.1 不同物種的角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖力 |
| 1.3.2 不同年齡段的角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖力 |
| 1.3.3 角膜中央和周邊的內(nèi)皮細(xì)胞增殖力 |
| 1.3.4 角膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖力的體內(nèi)調(diào)控 |
| 1.4 角膜內(nèi)皮的生理功能 |
| 1.4.1 角膜內(nèi)皮的滲漏屏障功能 |
| 1.4.2 角膜內(nèi)皮的主動(dòng)液泵功能 |
| 1.5 角膜內(nèi)皮異常 |
| 2 組織工程人角膜內(nèi)皮的誕生 |
| 3 組織工程人角膜內(nèi)皮種子細(xì)胞的研究概述 |
| 3.1 成體干細(xì)胞（前體細(xì)胞） |
| 3.2 永生化人角膜細(xì)胞系 |
| 3.3 非轉(zhuǎn)染的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞 |
| 4 組織工程人角膜內(nèi)皮載體支架的研究概述 |
| 4.1 天然生物膜 |
| 4.1.1 脫細(xì)胞角膜基質(zhì) |
| 4.1.2 后彈力層膜 |
| 4.1.3 晶狀體前囊膜 |
| 4.1.4 羊膜 |
| 4.2 生物大分子 |
| 4.2.1 明膠 |
| 4.2.2 膠原 |
| 4.2.3 絲素蛋白 |
| 4.3 合成材料 |
| 4.4 生物大分子與合成材料共混膜 |
| 4.5 細(xì)胞片層 |
| 5 組織工程人角膜內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的評(píng)價(jià)方法 |
| 5.1 組織工程人角膜內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的體外評(píng)價(jià)方法 |
| 5.2 組織工程人角膜內(nèi)皮功能的體外評(píng)價(jià)方法 |
| 5.3 組織工程人角膜內(nèi)皮功能的在體評(píng)價(jià)方法 |
| 5.3.1 移植動(dòng)物模型的選擇 |
| 5.3.2 移植后在體評(píng)價(jià)方法 |
| 5.3.3 移植后離體評(píng)價(jià)方法 |
| 6 組織工程角膜內(nèi)皮體外重建中的問(wèn)題與難點(diǎn) |
| 7 本文的研究目的與意義 |
| 第二章 組織工程人角膜內(nèi)皮種子細(xì)胞的培養(yǎng)及其鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.5 常用溶液的配方 |
| 1.5.1 D-Hanks 平衡鹽溶液 |
| 1.5.2 PBS 緩沖液 |
| 1.5.3 胰酶-EDTA 消化液 |
| 1.5.4 吉姆薩染液（母液） |
| 2 方法 |
| 2.1 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng) |
| 2.1.1 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇 |
| 2.1.2 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.2 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性檢測(cè) |
| 2.3 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的染色體標(biāo)本制作與組型分析 |
| 2.4 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的免疫化學(xué)檢測(cè) |
| 2.5 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的致瘤性檢測(cè) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特征 |
| 3.2 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性 |
| 3.3 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的染色體核型 |
| 3.4 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá) |
| 3.5 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能蛋白的表達(dá) |
| 3.5.1 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的表達(dá) |
| 3.5.2 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)鞍椎谋磉_(dá) |
| 3.6 單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的致瘤性 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 第三章 薄化去上皮層修飾羊膜載體支架的制備及其鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.4 常用溶液的配方 |
| 1.4.1 PBS 緩沖液（見(jiàn)第二章） |
| 1.4.2 D-Hanks 平衡鹽溶液（見(jiàn)第二章） |
| 1.4.3 胰酶-EDTA 消化液（見(jiàn)第二章） |
| 1.4.4 5 mg/mL MTT 溶液 |
| 1.4.5 浸提液Ⅰ |
| 1.4.6 浸提液Ⅱ |
| 1.4.7 0.2%茜素紅液 |
| 1.4.8 石蠟切片及 HE 染色所需溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 新鮮羊膜的制備與保存 |
| 2.1.1 胎盤(pán)的取材 |
| 2.1.2 新鮮羊膜的剝離及清洗 |
| 2.1.3 新鮮羊膜的保存 |
| 2.2 去上皮層羊膜的制備 |
| 2.3 去上皮層羊膜的薄化處理 |
| 2.4 薄化去上皮層羊膜的修飾 |
| 2.5 薄化去上皮層修飾羊膜的理化性質(zhì)檢測(cè) |
| 2.5.1 厚度檢測(cè) |
| 2.5.2 透明度檢測(cè) |
| 2.5.3 透光率檢測(cè) |
| 2.5.4 重金屬檢測(cè) |
| 2.6 薄化去上皮層修飾羊膜的生物學(xué)性質(zhì)檢測(cè) |
| 2.6.1 薄化去上皮層修飾羊膜的石蠟切片及 HE 染色 |
| 2.6.2 薄化去上皮層修飾羊膜的熱源性檢測(cè) |
| 2.6.3 薄化去上皮層修飾羊膜的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè) |
| 2.6.4 薄化去上皮層修飾羊膜的眼刺激試驗(yàn) |
| 2.6.5 薄化去上皮層修飾羊膜的皮下植入實(shí)驗(yàn) |
| 2.7 薄化去上皮層修飾羊膜與單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生物相容性研究 |
| 2.7.1 薄化去上皮層修飾羊膜浸提液的細(xì)胞毒性檢測(cè) |
| 2.7.2 薄化去上皮層修飾羊膜與單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸的實(shí)驗(yàn) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 薄化去上皮層修飾羊膜的制備與修飾 |
| 3.2 薄化去上皮層修飾羊膜的理化性質(zhì) |
| 3.2.1 薄化去上皮層修飾羊膜的厚度 |
| 3.2.2 薄化去上皮層修飾羊膜的透明度 |
| 3.2.3 薄化去上皮層修飾羊膜的透光率 |
| 3.2.4 薄化去上皮層修飾羊膜的重金屬含量 |
| 3.3 薄化去上皮層修飾羊膜的生物學(xué)評(píng)價(jià) |
| 3.3.1 薄化去上皮層修飾羊膜的組織結(jié)構(gòu) |
| 3.3.2 薄化去上皮層修飾羊膜的熱源性 |
| 3.3.3 薄化去上皮層修飾羊膜的細(xì)菌內(nèi)毒素含量 |
| 3.3.4 薄化去上皮層修飾羊膜的眼刺激實(shí)驗(yàn) |
| 3.3.5 薄化去上皮層修飾羊膜的大鼠皮下植入實(shí)驗(yàn) |
| 3.4 薄化去上皮層修飾羊膜與單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生物相容性研究 |
| 3.4.1 薄化去上皮層修飾羊膜浸提液的細(xì)胞毒性 |
| 3.4.2 薄化去上皮層修飾羊膜與單克隆人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的直接接觸實(shí)驗(yàn) |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 第四章 組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建及其鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.4 常用溶液的配方 |
| 1.4.1 PBS 緩沖液（見(jiàn)第二章） |
| 1.4.2 D-Hanks 平衡鹽溶液（見(jiàn)第二章） |
| 1.4.3 胰酶-EDTA 消化液（見(jiàn)第二章） |
| 1.4.4 0.2%茜素紅液（見(jiàn)第三章） |
| 2 方法 |
| 2.1 組織工程人角膜內(nèi)皮種子細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.2 薄化去上皮層修飾羊膜的制備與修飾 |
| 2.3 組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建 |
| 2.4 組織工程人角膜內(nèi)皮的鑒定 |
| 2.4.1 形態(tài)觀察 |
| 2.4.2 茜素紅染色和細(xì)胞密度計(jì)數(shù) |
| 2.4.3 免疫熒光化學(xué)檢測(cè) |
| 2.4.4 石蠟切片及 HE 染色 |
| 2.4.5 掃描電鏡檢測(cè) |
| 2.4.6 透射電鏡檢測(cè) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 形態(tài)特征 |
| 3.2 茜素紅染色 |
| 3.3 細(xì)胞密度 |
| 3.4 石蠟切片及 HE 染色結(jié)果 |
| 3.5 免疫熒光檢測(cè) |
| 3.6 掃描電鏡檢測(cè) |
| 3.7 透射電鏡檢測(cè) |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 第五章 組織工程人角膜內(nèi)皮的家貓移植 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.4 常用溶液的配方 |
| 1.4.1 DiI 工作液 |
| 2 方法 |
| 2.1 組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建 |
| 2.2 組織工程人角膜內(nèi)皮的家貓后板層角膜內(nèi)皮移植 |
| 2.3 移植家貓的護(hù)理和觀察 |
| 2.4 移植家貓術(shù)后的在體檢測(cè) |
| 2.5 移植家貓術(shù)后的離體檢測(cè) |
| 2.5.1 DiI 熒光標(biāo)記檢測(cè) |
| 2.5.2 茜素紅染色 |
| 2.5.3 石蠟切片切片及 HE 染色 |
| 2.5.4 掃描電鏡檢測(cè) |
| 2.5.5 透射電鏡檢測(cè) |
| 2.5.6 房水的二維電泳檢測(cè) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 體外重建的組織工程人角膜內(nèi)皮 |
| 3.2 移植家貓術(shù)后的在體檢測(cè) |
| 3.2.1 裂隙燈顯微鏡檢測(cè) |
| 3.2.2 角膜厚度檢測(cè) |
| 3.2.3 眼壓檢測(cè) |
| 3.4 移植家貓術(shù)后的離體鑒定 |
| 3.4.1 DiI 熒光標(biāo)記檢測(cè) |
| 3.4.2 茜素紅染色 |
| 3.4.3 石蠟切片及 HE 染色 |
| 3.4.4 掃描電鏡檢測(cè) |
| 3.4.5 透射電鏡檢測(cè) |
| 3.4.6 房水二維電泳檢測(cè) |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 第六章 組織工程人角膜內(nèi)皮的獼猴移植 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.4 常用溶液的配方 |
| 1.4.1 DiI 工作液 |
| 2 方法 |
| 2.1 組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建 |
| 2.2 組織工程人角膜內(nèi)皮的獼猴后板層角膜內(nèi)皮移植 |
| 2.3 移植獼猴的護(hù)理和觀察 |
| 2.4 移植獼猴術(shù)后的在體檢測(cè) |
| 2.5 移植獼猴術(shù)后的離體檢測(cè) |
| 2.5.1 DiI 熒光標(biāo)記檢測(cè) |
| 2.5.2 茜素紅染色 |
| 2.5.3 石蠟切片切片及 HE 染色 |
| 2.5.4 掃描電鏡檢測(cè) |
| 2.5.5 透射電鏡檢測(cè) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 體外重建的組織工程人角膜內(nèi)皮 |
| 3.2 移植獼猴術(shù)后的在體檢測(cè) |
| 3.2.1 裂隙燈顯微鏡檢測(cè) |
| 3.2.2 角膜厚度檢測(cè) |
| 3.2.3 眼壓檢測(cè) |
| 3.3 移植獼猴術(shù)后的離體檢測(cè) |
| 3.3.1 DiI 熒光標(biāo)記 |
| 3.3.2 茜素紅染色 |
| 3.3.3 石蠟切片及 HE 染色 |
| 3.3.4 掃描電鏡檢測(cè) |
| 3.3.5 透射電鏡檢測(cè) |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
| 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及專(zhuān)利 |
（9）基于脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的組織工程全層人角膜的體外重建、鑒定及其在動(dòng)物移植中的作用研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 組織工程角膜的研究概述 |
| 1 角膜的結(jié)構(gòu)與功能 |
| 1.1 角膜的解剖結(jié)構(gòu) |
| 1.2 角膜的生理功能 |
| 1.2.1 屏障功能 |
| 1.2.2 屈光功能 |
| 1.3 角膜疾病及治療 |
| 2 組織工程學(xué)概述 |
| 2.1 組織工程學(xué)的建立與發(fā)展 |
| 2.2 組織工程的基本原理 |
| 2.3 組織工程的研究方向 |
| 2.3.1 組織工程種子細(xì)胞研究 |
| 2.3.2 組織工程支架材料研究 |
| 3 組織工程角膜的研究進(jìn)展 |
| 3.1 組織工程角膜種子細(xì)胞的研究進(jìn)展 |
| 3.1.1 胚胎干細(xì)胞研究 |
| 3.1.2 成體干細(xì)胞研究 |
| 3.1.3 其他類(lèi)型細(xì)胞研究 |
| 3.2 組織工程角膜載體支架材料 |
| 3.2.1 天然材料 |
| 3.2.2 合成材料 |
| 4 本文的研究目的和意義 |
| 第二章 組織工程人全層角膜種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)耗材 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.5 溶液配方 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 HCEP 細(xì)胞、HCS 細(xì)胞及 HCE 細(xì)胞的復(fù)蘇及擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.1.1 細(xì)胞的復(fù)蘇 |
| 2.1.2 細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.2 HCEP 細(xì)胞、HCS 細(xì)胞及 HCE 細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定 |
| 2.3 HCEP 細(xì)胞、HCS 細(xì)胞及 HCE 細(xì)胞的染色體組型分析 |
| 2.4 HCEP 細(xì)胞、HCS 細(xì)胞及 HCE 細(xì)胞的免疫熒光染色 |
| 2.5 細(xì)胞的致瘤性檢驗(yàn) |
| 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 HCEP 細(xì)胞、HCS 細(xì)胞及 HCE 細(xì)胞的生長(zhǎng)特性 |
| 3.2 HCEP 細(xì)胞、HCS 細(xì)胞及 HCE 細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)與核型分析 |
| 3.3 HCEP 細(xì)胞、HCS 細(xì)胞及 HCE 細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) |
| 3.4 HCEP 細(xì)胞、HCS 細(xì)胞及 HCE 細(xì)胞的致瘤性檢驗(yàn) |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 第三章 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的制備及其鑒定 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)耗材 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.5 主要溶液配方 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 aPCS 的制備 |
| 2.2 aPCS 理化性能的檢測(cè) |
| 2.2.1 透光率檢測(cè) |
| 2.2.2 含水量檢測(cè) |
| 2.2.3 冰凍及石蠟切片 |
| 2.2.4 HE 染色 |
| 2.2.5 DAPI 染色 |
| 2.2.6 阿利新蘭染色 |
| 2.2.7 電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) |
| 2.3 aPCS 與角膜種子細(xì)胞的生物相容性研究 |
| 2.3.1 浸提液制備 |
| 2.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè) |
| 2.3.3 細(xì)胞毒性檢測(cè) |
| 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 aPCS 外觀 |
| 3.2 aPCS 理化性能 |
| 3.3 aPCS 與種子細(xì)胞的生物相容性 |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 第四章 體外重建組織工程人全角膜的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)耗材 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.5 常用溶液配方 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 TE-HC 的體外重建 |
| 2.1.1 TE-HC 載體支架 aPCS 的制備 |
| 2.1.2 TE-HC 種子細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.1.3 TE-HC 種子細(xì)胞的收集 |
| 2.1.4 TE-HC 的體外重建 |
| 2.2 體外重建 TE-HC 的鑒定 |
| 2.2.1 TE-HC 的光學(xué)透明度 |
| 2.2.2 TE-HC 內(nèi)皮的茜素紅染色 |
| 2.2.3 石蠟切片 HE 染色 |
| 2.2.4 TE-HC 的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) |
| 2.2.5 TE-HC 的電鏡觀察 |
| 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 TE-HC 的光學(xué)透明度 |
| 3.2 TE-HC 內(nèi)皮的茜素紅染色 |
| 3.3 石蠟切片 HE 染色 |
| 3.4 TE-HC 的電鏡超微結(jié)構(gòu) |
| 3.5 TE-HC 的免疫組織化學(xué)檢測(cè) |
| 4 討論 |
| 5 小結(jié) |
| 第五章 組織工程全層人角膜的動(dòng)物移植研究 |
| 1 材料與用品 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)耗材 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)藥品 |
| 1.5 常用溶液配方 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 TE-HC 的體外重建 |
| 2.1.1 TE-HC 載體支架 aPCS 的制備 |
| 2.1.2 TE-HC 種子細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng) |
| 2.1.3 TE-HC 種子細(xì)胞的收集 |
| 2.1.4 TE-HC 種子細(xì)胞的標(biāo)記 |
| 2.1.5 TE-HC 的體外重建 |
| 2.2 穿透性角膜移植及檢測(cè) |
| 2.2.1 穿透性角膜移植手術(shù) |
| 2.2.2 術(shù)后護(hù)理 |
| 2.2.3 術(shù)后在體檢測(cè) |
| 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 標(biāo)記種子細(xì)胞的 TE-HC 的體外重建 |
| 3.2 角膜厚度 |
| 3.3 眼壓 |
| 3.4 裂隙燈觀察 |
| 4 討論 |
| 5 本章小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
| 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（10）膠原基角膜修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)仿生構(gòu)建與功能化研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符號(hào)表 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 角膜組織的結(jié)構(gòu)和功能 |
| 1.1.1 角膜的結(jié)構(gòu) |
| 1.1.2 角膜的功能 |
| 1.2 組織工程化人工角膜 |
| 1.2.1 以羊膜為載體的組織工程化人工角膜 |
| 1.2.2 以人工合成聚合物材料為載體的組織工程化人工角膜 |
| 1.2.3 以天然高分子生物材料為載體的組織工程化人工角膜 |
| 1.2.4 以脫細(xì)胞角膜為載體的組織工程化人工角膜 |
| 1.2.5 摒棄支架材料的細(xì)胞片工程技術(shù) |
| 1.3 膠原的性能及其在組織工程材料中的應(yīng)用 |
| 1.3.1 膠原的性能 |
| 1.3.2 膠原在組織工程材料中的應(yīng)用 |
| 1.4 常見(jiàn)的角膜移植手術(shù) |
| 1.4.1 穿透性角膜移植術(shù) |
| 1.4.2 板層角膜移植術(shù) |
| 1.4.3 治療性角膜移植術(shù) |
| 1.4.4 其他角膜移植聯(lián)合手術(shù) |
| 1.5 本論文研究目的和意義以及研究?jī)?nèi)容 |
| 第二章 膠原-明膠-透明質(zhì)酸復(fù)合膜的制備及其性能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 |
| 2.2.2 膠原-明膠-透明質(zhì)酸復(fù)合膜的制備 |
| 2.2.3 膠原-明膠-透明質(zhì)酸復(fù)合膜的性能表征 |
| 2.2.4 膠原-明膠-透明質(zhì)酸復(fù)合膜的細(xì)胞實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.5 兔眼角膜板層移植實(shí)驗(yàn) |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 交聯(lián)反應(yīng)機(jī)理 |
| 2.3.2 CGH 膜的力學(xué)性能 |
| 2.3.3 CGH 膜的親疏水性 |
| 2.3.4 CGH 膜的吸水性能 |
| 2.3.5 CGH 膜在 PBS 溶液中的形貌變化 |
| 2.3.6 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在 CGH631 膜中的透過(guò)率 |
| 2.3.7 CGH631 膜在 PBS 溶液和甘油中的透光率 |
| 2.3.8 角膜上皮細(xì)胞在 CGH631 膜上的生長(zhǎng)與形貌 |
| 2.3.9 CGH631 膜的毒性試驗(yàn) |
| 2.3.10 CGH631 膜的角膜板層移植實(shí)驗(yàn) |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 具有良好韌性的多孔膠原膜修復(fù)材料的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要設(shè)備 |
| 3.2.2 多孔膠原膜的制備 |
| 3.2.3 多孔膠原膜的性能表征 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 3.3.1 多孔膠原膜的力學(xué)性能分析 |
| 3.3.2 SEM 分析 |
| 3.3.3 離子和小分子在多孔膠原膜的擴(kuò)散系數(shù) |
| 3.3.4 多孔膠原膜的飽和吸水率 |
| 3.3.5 多孔膠原膜的光學(xué)性能 |
| 3.3.6 多孔膠原膜的生物相容性 |
| 3.3.7 多孔膠原膜的組織學(xué)切片觀察 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第四章 負(fù)載妥布霉素的膠原基抗菌角膜修復(fù)材料的制備及理化性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要設(shè)備 |
| 4.2.2 抗菌功能化膠原膜的制備 |
| 4.2.3 抗菌功能化膠原膜的理化性能表征 |
| 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 4.3.1 化學(xué)交聯(lián)載藥 |
| 4.3.2 Col 和 Col-Tob 膜的 XPS 分析 |
| 4.3.3 Col 和 Col-Tob 膜的紅外光譜分析 |
| 4.3.4 Col 和 Col-Tob 膜的吸水率 |
| 4.3.5 Col 和 Col-Tob 膜的透光率 |
| 4.3.6 Col 和 Col-Tob 膜的力學(xué)性能 |
| 4.3.7 妥布霉素的負(fù)載量與緩釋過(guò)程 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第五章 負(fù)載妥布霉素的膠原基角膜修復(fù)材料的抗菌性能及生物相容性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 實(shí)驗(yàn)部分 |
| 5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要設(shè)備 |
| 5.2.2 載藥膠原膜的抗菌性能研究 |
| 5.2.3 載藥膠原膜的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究 |
| 5.2.4 載藥膠原膜的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 |
| 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 5.3.1 金黃色葡萄球菌在 Col 和 Col-Tob 膜上的生長(zhǎng) |
| 5.3.2 抗金黃色葡萄球菌定量結(jié)果 |
| 5.3.3 大腸桿菌在 Col 和 Col-Tob 膜上的生長(zhǎng) |
| 5.3.4 抗大腸桿菌定量結(jié)果 |
| 5.3.5 角膜上皮細(xì)胞在 Col-Tob 膜上的生長(zhǎng)與形貌 |
| 5.3.6 Col-Tob 膜上的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) |
| 5.3.7 Col-Tob 膜的組織學(xué)切片觀察 |
| 5.3.8 Col-Tob 膜在兔眼表的板層移植手術(shù) |
| 5.3.9 板層角膜移植的術(shù)后觀察 |
| 5.3.10 術(shù)后三個(gè)月裂隙燈觀察 |
| 5.4 本章小結(jié) |
| 第六章 層狀結(jié)構(gòu)仿生膠原角膜修復(fù)材料的制備與研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料與實(shí)驗(yàn)方法 |
| 6.2.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 |
| 6.2.2 層狀結(jié)構(gòu)膠原膜的制備 |
| 6.2.3 層狀結(jié)構(gòu)膠原膜的性能表征 |
| 6.2.4 層狀結(jié)構(gòu)膠原膜的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 |
| 6.3 層狀結(jié)構(gòu)膠原膜的性能表征結(jié)果 |
| 6.3.1 膠原溶液凝膠化過(guò)程中的氣泡 |
| 6.3.2 膠原膜的表面和截面結(jié)構(gòu)觀察 |
| 6.3.3 吸水厚度變化與吸水率 |
| 6.3.4 光學(xué)性能 |
| 6.3.5 力學(xué)性能 |
| 6.3.6 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在 Col CC91 CC82 和 CC73 膜中的透過(guò)率 |
| 6.3.7 人角膜上皮細(xì)胞在 Col CC91 CC82 和 CC73 膜上的生長(zhǎng) |
| 6.3.8 人角膜上皮細(xì)胞在 Col CC91 CC82 和 CC73 膜上的增殖試驗(yàn) |
| 6.3.9 人角膜基質(zhì)細(xì)胞在 Col CC91 CC82 和 CC73 膜上的增殖試驗(yàn) |
| 6.3.10 疏松 Col 膜和致密 CC73 膜的組織學(xué)切片 |
| 6.3.11 兔眼表 Col 膜的層間移植和 CC73 膜的板層移植過(guò)程 |
| 6.3.12 兔眼表 Col 膜的層間移植術(shù)后觀察 |
| 6.3.13 兔眼表 CC73 膜的板層移植術(shù)后觀察 |
| 6.4 本章小結(jié) |
| 第七章 具有微粗糙表面結(jié)構(gòu)的膠原角膜修復(fù)材料的研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料與實(shí)驗(yàn)部分 |
| 7.2.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與主要設(shè)備 |
| 7.2.2 具有微粗糙表面結(jié)構(gòu)的膠原膜的制備 |
| 7.2.3 具有微粗糙表面結(jié)構(gòu)的膠原膜的性能表征 |
| 7.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 7.3.1 AD-Col 和 FD-Col 膜的表面結(jié)構(gòu) |
| 7.3.2 AD-Col 和 FD-Col 膜的吸水率與吸水厚度變化 |
| 7.3.3 AD-Col 和 FD-Col 膜的光學(xué)性能 |
| 7.3.4 AD-Col 和 FD-Col 的力學(xué)性能 |
| 7.3.5 離子和小分子在 AD-Col 和 FD-Col 膜中的擴(kuò)散系數(shù) |
| 7.3.6 人角膜上皮細(xì)胞在 AD-Col 和 FD-Col 膜上的生長(zhǎng) |
| 7.3.7 人角膜上皮細(xì)胞在 AD-Col 和 FD-Col 膜上的增殖試驗(yàn) |
| 7.3.8 FD-Col 膜在兔眼表的板層移植 |
| 7.3.9 FD-Col 膜板層角膜移植的術(shù)后觀察 |
| 7.3.10 FD-Col 移植后兩個(gè)月裂隙燈觀察 |
| 7.4 本章小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 論文創(chuàng)新性 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
| 附件 |
四、組織工程技術(shù)體外重建角膜上皮層的實(shí)驗(yàn)研究（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]基于光交聯(lián)水凝膠的體外角膜再生研究[D]. 延亞云. 太原理工大學(xué), 2021(01)
- [2]血漿纖維蛋白膜負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與角膜上皮細(xì)胞用于大鼠角膜堿燒傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 楊雪. 山東大學(xué), 2020(04)
- [3]復(fù)合改性膠原膜及間充質(zhì)干細(xì)胞用于角膜修復(fù)的研究[D]. 覃嵐鳳. 華南理工大學(xué), 2020
- [4]兔角膜基質(zhì)細(xì)胞及脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)構(gòu)建組織工程角膜移植的研究[D]. 張璐. 昆明醫(yī)科大學(xué), 2019(06)
- [5]膠原膜表面圖案化及其調(diào)控角膜細(xì)胞行為的研究[D]. 熊思佳. 華南理工大學(xué), 2019
- [6]利用魚(yú)類(lèi)膠原蛋白支架體外構(gòu)建組織工程全層人角膜的研究[D]. 袁曉龍. 中國(guó)海洋大學(xué), 2015(07)
- [7]組織工程人后板層半角膜體外構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 龐鑫. 中國(guó)海洋大學(xué), 2015(07)
- [8]組織工程人角膜內(nèi)皮的體外重建及其動(dòng)物移植試驗(yàn)[D]. 馬西亞. 中國(guó)海洋大學(xué), 2014(01)
- [9]基于脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的組織工程全層人角膜的體外重建、鑒定及其在動(dòng)物移植中的作用研究[D]. 刁金美. 中國(guó)海洋大學(xué), 2014(01)
- [10]膠原基角膜修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)仿生構(gòu)建與功能化研究[D]. 劉楊. 華南理工大學(xué), 2014(01)
標(biāo)簽：角蛋白論文; 角膜圓錐論文; 角膜外傷論文; 生物技術(shù)論文; 膠原蛋白論文;