一、頭頸部鱗狀細胞癌DNA含量與臨床生物學行為的關(guān)系（論文文獻綜述）
周俊林[1]（2021）在《犬尿氨酸對口腔鱗癌腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞募集及分化的調(diào)節(jié)作用》文中提出背景OSCC又稱為口腔鱗癌（Oral Squamous Cell Carcinoma,口腔鱗狀細胞癌）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。OSCC具有局部浸潤率高、轉(zhuǎn)移能力強,且后期易復發(fā)的特點。TAMs（tumor associate macrophages,腫瘤相關(guān)巨噬細胞）在TME（tumor microenvironment,腫瘤微環(huán)境）的調(diào)控中占據(jù)重要地位,OSCC的發(fā)生、進展和局部轉(zhuǎn)移與TME有關(guān),但其具體機制尚不清楚。TME能夠促進TAMs產(chǎn)生M2型巨噬細胞,從而促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。吲哚胺2,3-雙加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase1,IDO1）是人體中能夠?qū)⒈匦璋被嵘彼岱纸鉃槿虬彼幔↙-Kynurenine,KYN）的一種限速酶。近年來有研究表明,KYN能夠促進腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移,并且參與了免疫逃逸的過程。目前國內(nèi)外關(guān)于KYN等代謝物在OSCC中相應的細胞功能及其分子機制的相關(guān)研究報道較少,而且其在OSCC腫瘤微環(huán)境的具體機制尚未明確。因此本研究課題主要是探究了OSCC患者的癌組織與其癌旁組織之間差異性代謝物,結(jié)合這些差異代謝物在OSCC的生長與轉(zhuǎn)移過程中的功能與作用,并進一步說明了在OSCC的腫瘤微環(huán)境中惡性腫瘤細胞與TAMs之間的交互調(diào)控作用及其潛在可能發(fā)生的機制,為OSCC的免疫治療代謝重編程工作奠定了實驗基礎(chǔ)和提供了潛在的治療策略。目的及方法1、基于LC-MS/MS（Liquid Chromatograph Triple Quadrupole Mass Spectrometer,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)）檢測方法對收集到的10例OSCC患者的癌組織和癌旁組織樣本的組織進行非靶向氨基酸代謝組學研究。通過多維統(tǒng)計分析,研究癌組織與癌旁組織樣本之間的代謝產(chǎn)物的差異,篩選出具有顯著差異的代謝物。利用ELISA實驗對16例OSCC患者術(shù)前、術(shù)后的血漿樣本和18例健康志愿者的血漿樣本進行驗證,判斷其對頭頸部腫瘤的診斷效能,判斷其用于診斷OSCC的評價指標作用。2、外源性分別加入0.06μmol/L、0.6μmol/L、6μmol/L的KYN/ACE（N-acetylserotonin,N-乙酰-5-羥色胺）對CAL27細胞進行干預。通過CCK-8（Cell counting kit-8,細胞計數(shù)試劑盒8）和平板克隆形成實驗檢測KYN/ACE對CAL27細胞增殖情況的影響及Transwell實驗檢測其對CAL27細胞轉(zhuǎn)移能力的影響。3、通過IDO1的siRNA對CAL27細胞進行轉(zhuǎn)染。Real-time PCR實驗檢測CAL27細胞中轉(zhuǎn)染siRNA后對IDO1基因表達的影響。通過CCK-8實驗檢測抑制IDO1目的基因表達后對CAL27細胞增殖能力的影響,Transwell實驗檢測抑制IDO1目的基因表達后對CAL27細胞遷移能力的影響。4、刺激THP-1細胞,獲得M0型、M1型和M2型巨噬細胞,進行形態(tài)學分析和Real-time PCR鑒定其表型。將M0巨噬細胞與含1μmol/L的KYN/ACE的CAL27細胞懸浮液建立一個共培養(yǎng)的細胞體系。而后通過Transwell實驗檢測KYN或者ACE對M0巨噬細胞遷移情況,以及Real-time PCR檢測其對M0巨噬細胞分化的影響。結(jié)果1、基于LC-MS/MS檢測癌組織與癌旁組織標本,我們發(fā)現(xiàn)在KYN、ACE等代謝物均在色氨酸代謝通路中檢測到,且KYN和ACE在OSCC癌組織中較癌旁組織相比明顯增加,它們的ROC分別為1和0.99,具有較高的靈敏度和特異性,但在ELISA實驗中并未發(fā)現(xiàn)OSCC患者的術(shù)前和術(shù)后以及健康人的血漿中KYN的濃度差異。2、CCK-8檢測加入KYN條件培養(yǎng)基實驗組的OD值與對照組沒有顯著差異,但是平板克隆結(jié)果顯示加入KYN的條件培養(yǎng)基的實驗組克隆形成數(shù)較對照組增加,且具有一定的濃度依賴性,但是加入ACE的條件培養(yǎng)基CCK-8檢測和平板克隆與對照組相比均未發(fā)現(xiàn)顯著差異。Transwell實驗結(jié)果顯示,在下室中加入KYN和ACE的CAL27細胞較陰性對照組相比,其遷移數(shù)量增多,其中最佳濃度為0.6μmol/L。CCK-8結(jié)果和Transwell實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染IDO1的siRNA后CAL27細胞OD值較對照組明顯降低且細胞遷移數(shù)量明顯減少。3、形態(tài)學分析和Real-time-qPCR結(jié)果表明我們成功誘導了M0型、M1型和M2型巨噬細胞。Transwell實驗結(jié)果顯示KYN能夠促進M0型巨噬細胞向CAL27細胞遷移,而后Real-time PCR鑒定M0型巨噬細胞的分化表型,發(fā)現(xiàn)加入KYN能夠促進M0型向M2型分化。ACE沒有促進M0巨噬細胞募集和分化的作用。結(jié)論1、KYN和ACE在OSCC患者的癌組織中較癌旁組織相比代謝水平明顯增加,且這兩種代謝物在口腔鱗癌組織中表達具有較高的靈敏度和特異性,但是在血漿中沒有檢測到相同的結(jié)果。2、IDO1調(diào)控的KYN代謝途徑能夠促進CAL27細胞的增殖和遷移。3、KYN能夠促進M0型巨噬細胞的遷移,并使其產(chǎn)生向M2型巨噬細胞分化的趨勢。
杜華珊[2]（2021）在《STING對宮頸癌增殖、遷移和侵襲能力的作用及機制的研究》文中研究說明研究背景:宮頸癌是最常見的婦科癌癥之一。每年全球大約有57萬新發(fā)病例,31萬死亡病例。大約95%的宮頸癌病例是由高危人類乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染引起的。盡管已有預防高危型HPV的疫苗,宮頸癌對婦女來說仍然是一場健康危機。因此,有必要為宮頸癌的預防和治療提供新的視角。干擾素基因刺激因子（STING）是一種跨膜蛋白,是細胞質(zhì)DNA傳感通路的重要分子。越來越多的證據(jù)表明,STING通路除了能保護宿主免受多種致病性攻擊外,在癌癥中也起著至關(guān)重要的作用。在結(jié)直腸癌、卵巢癌、黑色素瘤中,與抗腫瘤T細胞啟動和I型干擾素相關(guān)的STING信號被嚴重抑制以逃避免疫監(jiān)視。STING在胃癌組織中低表達,與腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床病理分期和生存率有關(guān)。敲除STING可促進胃癌細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲。此外,多項研究表明,STING激動劑可以作為單藥或聯(lián)合手術(shù)治療、放化療、免疫治療發(fā)揮抗腫瘤作用,彌補傳統(tǒng)療法的不足。研究目的:目前,尚不清楚STING在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用。本研究檢測了人角質(zhì)形成細胞、宮頸上皮永生化細胞以及四種宮頸癌細胞系中STING的表達情況。通過構(gòu)建沉默STING和過表達STING的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞系,進行細胞生物學行為實驗探討STING對于宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響和相關(guān)調(diào)控機制。此外,通過構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型進行體內(nèi)實驗對體外實驗的結(jié)果進行驗證,為宮頸癌預防和宮頸癌復發(fā)或轉(zhuǎn)移的治療提供新的思路。研究方法:第1部分:STING對宮頸癌增殖、遷移、侵襲能力影響的體外實驗1、通過qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細胞Ha Ca T、宮頸上皮永生化細胞H8、四種宮頸癌細胞系（He La、Si Ha、C33A、Ca Ski）的STING m RNA和蛋白表達情況;2、構(gòu)建沉默STING的sh RNA慢病毒載體。選擇He La、Si Ha細胞系作為沉默STING的轉(zhuǎn)染細胞系。設計構(gòu)建STING基因的過表達慢病毒載體,轉(zhuǎn)染C33A細胞系。鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中STING的表達情況;3、通過CCK8實驗、平板克隆實驗、細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗探究STING對于宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力的影響。第2部分:STING調(diào)控宮頸癌細胞生物學行為信號通路的探索1、下調(diào)STING表達后,采用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測β-catenin的總蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,檢測Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表達水平;2、上調(diào)STING表達后,采用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測β-catenin的總蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,檢測Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表達水平;3、應用免疫共沉淀實驗檢測STING是否與β-catenin結(jié)合;4、下調(diào)STING表達的同時聯(lián)用β-catenin通路抑制劑,采用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測β-catenin的總蛋白、活化蛋白以及核蛋白中的含量,檢測Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表達水平;5、下調(diào)STING表達的同時聯(lián)用β-catenin通路抑制劑,通過CCK8實驗、平板克隆實驗和Transwell小室實驗探究下調(diào)STING表達對宮頸癌生物學行為的影響能否被β-catenin通路抑制劑所逆轉(zhuǎn)。第3部分:沉默STING對宮頸癌細胞增殖能力影響的體內(nèi)實驗1、使用vector He La、sh STING-He La細胞系構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型,探究移植瘤沉默STING對裸鼠體重影響;2、通過測量裸鼠移植瘤體積和繪制腫瘤生長曲線驗證下調(diào)STING表達對于宮頸癌細胞體內(nèi)增殖能力的影響;3、腫瘤組織進行HE染色,探究下調(diào)STING表達是否影響腫瘤組織病理形態(tài);4、腫瘤組織進行免疫組化染色,驗證沉默STING的He La細胞在體內(nèi)成瘤后是否仍保持沉默STING的特征;5、通過免疫組化染色Ki67探究沉默STING對于移植瘤增殖能力的影響。研究結(jié)果:第1部分:1、qRT-PCR及蛋白質(zhì)免疫印跡實驗顯示在人角質(zhì)形成細胞、宮頸上皮永生化細胞、4種宮頸癌細胞系中STING表達水平有差異。與正常細胞相比,HPV陰性宮頸癌細胞系C33A中的STING表達降低,其余三種HPV陽性宮頸癌細胞系（He La、Si Ha、Ca Ski）STING表達升高;2、成功合成了靶向STING的sh RNA并篩選出干擾效率最高的sh RNA片段。成功構(gòu)建并驗證沉默STING基因的He La和Si Ha穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的STING蛋白、m RNA水平與對照組相比均存在顯著統(tǒng)計學差異。STING過表達慢病毒載體構(gòu)建成功,成功構(gòu)建并驗證過表達STING基因的C33A穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的STING蛋白、m RNA水平與對照組相比均存在顯著統(tǒng)計學差異;3、STING表達下調(diào)后,He La及Si Ha細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力增強。過表達STING基因后,C33A細胞體外增殖、克隆形成、遷移和侵襲的能力明顯下降。第2部分:1、沉默STING后,Western blot顯示β-catenin蛋白總表達量及活化的β-catenin蛋白表達量、細胞核β-catenin蛋白含量明顯增加,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表達水平也隨之升高;2、STING過表達后,Western blot顯示β-catenin蛋白總表達量及活化的β-catenin蛋白表達量、細胞核β-catenin蛋白含量明顯減少,Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表達水平也隨之明顯降低;3、免疫共沉淀實驗顯示內(nèi)源性STING可與β-catenin結(jié)合;4、沉默STING的同時聯(lián)用β-catenin通路抑制劑,顯示β-catenin蛋白總表達量及活化的β-catenin蛋白表達量、Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）表達水平與單純沉默STING組比較明顯降低;5、沉默STING的同時聯(lián)用β-catenin通路抑制劑顯示細胞體外增殖速度、克隆形成能力、遷移和侵襲的能力明顯低于單純沉默STING組。第3部分:1、裸鼠接種移植瘤后,sh STING-He La組裸鼠體重呈低于vector-He La組趨勢,但趨勢無統(tǒng)計學意義;2、sh STING-He La組腫瘤體積和生長速度明顯大于對照組;3、HE染色顯示vector-He La組形成的腫瘤病灶中細胞排列緊密、胞核深染、細胞形態(tài)呈卵圓形;sh STING-He La組形成的腫瘤病灶中細胞排列紊亂、血管組織較豐富;4、免疫組化染色顯示體外構(gòu)建的sh STING-He La細胞系成瘤后,STING低水平表達特征保留;5、免疫組化染色顯示sh STING-He La組Ki67表達水平高于vector He La組Ki67表達水平。研究結(jié)論:1、不同類型的宮頸癌細胞STING表達水平不同,但STING的細胞生物學作用相同。STING可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲,在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起抑癌基因作用;2、STING下調(diào)宮頸癌Wnt/β-catenin信號通路中總β-catenin蛋白、活化β-catenin蛋白、核β-catenin蛋白以及Wnt通路下游靶基因（cyclin D1,c-Myc,MMP9）蛋白表達水平;3、Wnt/β-catenin通路抑制劑ICG001可顯著逆轉(zhuǎn)沉默STING導致的宮頸癌細胞中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白質(zhì)的表達上調(diào)。4、Wnt/β-catenin通路抑制劑ICG001可顯著逆轉(zhuǎn)沉默STING導致的宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的上調(diào)。5、STING通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。6、沉默STING對宮頸癌細胞體內(nèi)增殖能力有促進作用。
揭穎慧[3]（2021）在《舌鱗狀細胞癌的circRNAs表達譜及circARNTL2生物學功能研究》文中研究表明背景與目的:高通量測序的飛速發(fā)展使得越來越多的環(huán)狀RNAs（circular RNAs,circ RNAs）被研究發(fā)現(xiàn)。文獻報道circ RNAs在多種人類腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。然而,circ RNAs在舌鱗狀細胞癌（Tongue Squamous Cell Carcinoma,TSCC）方面的研究甚少。本課題研究致力于探索TSCC中circ RNAs的表達譜及circ ARNTL2對TSCC細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和細胞周期等生物學行為的影響。材料與方法:本研究通過高通量測序和生物信息學技術(shù)分析6對TSCC癌組織和癌旁組織差異表達的circ RNAs。選擇收錄于circ Base數(shù)據(jù)庫,在癌組織中表達上調(diào)且表達差異大的4條基因,通過RT-q PCR在20對TSCC患者標本中進行驗證。隨后,采用RT-q PCR在TSCC細胞系中檢測circ ARNTL2的表達情況。通過Random 6 mers primers和Oligo d T primers逆轉(zhuǎn)錄實驗、RNase R實驗和Sanger測序檢驗circ ARNTL2成環(huán)特性。RNA核質(zhì)分離實驗檢測circ ARNTL2在細胞質(zhì)和細胞核中的表達情況。卡方檢驗統(tǒng)計分析circ ARNTL2的表達量與TSCC患者臨床病理因素的相關(guān)性。受試者工作曲線（receiver operating curve,ROC）評估circ ARNTL2作為TSCC生物標志物的診斷價值。si RNA瞬時轉(zhuǎn)染CAL27和SCC9細胞,并選擇敲降效果最為明顯的si RNA進行體外功能實驗。干擾circ ARNTL2后,CCK8實驗檢測細胞增殖能力;平板克隆實驗檢測克隆形成能力;活死細胞染色檢測細胞活力;劃痕實驗和Transwell小室遷移實驗檢測細胞遷移能力;Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和周期。蛋白免疫印跡（Western Blot,WB）實驗檢測相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果:高通量測序結(jié)果顯示差異表達的circ RNAs共有276個（差異倍數(shù)≥2,p<0.05）,其中上調(diào)的有68個,下調(diào)的有208個。RT-q PCR結(jié)果顯示相較于癌旁組織,circ ARNTL2在TSCC癌組織中表達量上調(diào)最為明顯（p=0.0009）且在CAL27和SCC9細胞中表達上調(diào)（p<0.05）。Random 6 mers primers和Oligo d T primers逆轉(zhuǎn)錄實驗發(fā)現(xiàn)circ ARNTL2在Random 6 mers primer逆轉(zhuǎn)后表達量遠大于Oligo d T primer逆轉(zhuǎn)后表達量（p<0.001）。RNase R實驗證明circ ARNTL2耐受RNase R消化。Sanger測序確定circ ARNTL2存在反向剪切序列。RNA核質(zhì)分離實驗發(fā)現(xiàn)circ ARNTL2在細胞質(zhì)中的表達量高于細胞核。卡方檢驗發(fā)現(xiàn)circ ARNTL2的表達情況與TNM分期（p=0.015）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（p=0.014）相關(guān)。ROC曲線中AUC為0.8115,靈敏度為72.73%,特異度為88.64%。沉默circ ARNTL2后,CAL27和SCC9細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強（p<0.05）,細胞凋亡率升高（p<0.05）,細胞周期阻滯在S期（p<0.05）。干擾circ ARNTL2增加剪切caspase-3蛋白含量（p<0.05）,同時提高E-鈣粘蛋白和降低N-鈣粘蛋白表達量（p<0.05）。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建TSCC中circ RNAs的表達譜,篩選出circ ARNTL2在TSCC組織和細胞系中表達上調(diào)。證實了circ ARNTL2的成環(huán)特性,確定circ ARNTL2主要位于細胞質(zhì)中。circ ARNTL2可能參與TSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期,作為潛在的生物標志物,對TSCC具有一定的診斷價值。circ ARNTL2促進TSCC細胞增殖、遷移和侵襲,抑制細胞凋亡,影響細胞周期,在TSCC發(fā)生發(fā)展過程中起到促癌基因樣的作用。
甘瑞環(huán)[4]（2021）在《NOTCH信號通路異常表達及突變對口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響及分子機制研究》文中認為目的口腔鱗狀細胞癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一,罹患口腔鱗狀細胞癌的患者的言語、進食及面部美觀等均會受到嚴重的影響。近年來口腔鱗狀細胞癌的發(fā)病率和死亡率并沒有得到顯著的改善,同時導致口腔鱗狀細胞癌進展的病因目前尚未明確。NOTCH信號通路自發(fā)現(xiàn)至今,已經(jīng)有許多的研究報道指出它的異常表達和突變會對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。本研究根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)NOTCH1在頭頸部鱗癌中突變率高達18%。NOTCH信號通路的異常表達對口腔鱗狀細胞癌的進展究竟有怎樣的影響?NOTCH信號通路的異常表達是否與NOTCH信號通路的突變有關(guān)?NOTCH信號通路的突變是否能夠影響口腔鱗狀細胞癌的進展?以上這些問題目前均未明確。因此,本課題研究的目的是探索NOTCH信號通路表達下調(diào)后,對口腔鱗狀細胞癌進展的影響,分析人群中口腔鱗狀細胞癌的突變頻率和分布的情況,進一步研究NOTCH信號通路突變體對口腔鱗狀細胞癌細胞功能的影響,為臨床尋找口腔鱗狀細胞癌的治療靶點提供實驗研究基礎(chǔ)。方法1.NOTCH信號通路異常表達對口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的影響一方面,采用si RNA干擾法分別抑制NOTCH1和NOTCH2在口腔鱗狀細胞癌細胞株中的表達,接著運用Real-time PCR和Western blot技術(shù)分別檢測NOTCH1、NOTCH2基因在口腔鱗狀細胞癌細胞中表達情況;運用CCK-8實驗和平板克隆形成實驗分別檢測口腔鱗狀細胞癌細胞增殖情況的改變;利用Annexin V-PI雙染法檢測細胞凋亡的改變,PI單染法檢測細胞周期的改變;利用劃痕愈合實驗及Transwell小室實驗觀察細胞遷移和侵襲能力的變化;最后利用干細胞成球培養(yǎng),檢測腫瘤細胞自我更新能力的改變。另一方面,運用NOTCH信號通路抑制劑:FLI-06、RO-4929097分別處理293T細胞,檢測兩種抑制劑對NOTCH信號通路活化的影響。接著運用半對數(shù)濃度稀釋法,將它們分別作用于四種口腔鱗狀細胞癌細胞株CAL-27,TCA-8113,SCC-9和WSU-HN30,處理72小時后利用CCK-8法檢測450nm處的吸光光度值,并計算IC50。最后,將兩種NOTCH信號通路抑制劑運用于口腔鱗狀細胞癌腫瘤干細胞球體,分別觀察NOTCH信號通路抑制劑對口腔鱗狀細胞癌細胞自我更新能力的影響,以及對已形成腫瘤干細胞球體的滲透破壞能力;運用Real-time PCR檢測NOTCH信號通路抑制劑對腫瘤干細胞相關(guān)基因表達的影響。2.NOTCH信號通路突變與口腔鱗狀細胞癌的關(guān)聯(lián)研究首先,收集15對口腔鱗狀細胞癌組織及癌旁組織標本,提取DNA后進行全外顯子測序,并進行生物信息學分析,了解NOTCH信號通路在口腔鱗狀細胞癌中的突變分布情況,從中篩選出NOTCH信號通路突變位點。其次,通過COSMIC數(shù)據(jù)庫篩選出NOTCH1在頭頸部鱗癌或所有腫瘤中的高頻突變位點。最后,利用Sanger測序在更數(shù)量的口腔鱗狀細胞癌組織、癌旁組織、病人血液及健康人血液的DNA樣本中檢測NOTCH基因的點突變的分布情況。收集患者臨床資料,包括性別、年齡、術(shù)前放化療、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的臨床分期等,分析其與NOTCH突變的關(guān)聯(lián)性。利用Real-time PCR檢測突變的口腔鱗狀細胞癌組織和未突變的口腔鱗狀細胞癌組織中NOTCH1的表達情況。3.NOTCH1定點突變對口腔鱗狀細胞癌細胞功能的影響利用基因定點突變試劑盒構(gòu)建NOTCH1定點突變質(zhì)粒,構(gòu)建后的質(zhì)粒經(jīng)Sanger測序檢測是否構(gòu)建成功。將空白對照、野生型和突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細胞、人食管鱗癌KYSE-150細胞和口腔鱗狀細胞癌SCC-9細胞后,利用Western blot檢測NOTCH1表達情況的改變;細胞增殖能力的變化運用CCK-8實驗和平板克隆實驗進行檢測;劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力的變化;利用雙熒光素酶報告實驗檢測NOTCH1的點突變對NOTCH信號通路活化的影響;Realtime PCR檢測NOTCH1點突變后對NOTCH信號通路下游基因表達的影響。結(jié)果1.NOTCH信號通路異常表達對口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的影響NOTCH1的表達下調(diào)后口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力均隨之下調(diào)、細胞凋亡增多、細胞周期受阻滯于G2期,口腔鱗狀細胞癌腫瘤細胞自我更新能力同樣受抑制。當NOTCH2表達下調(diào)后,口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力同樣受到抑制、細胞凋亡增多。運用NOTCH信號通路抑制劑處理口腔鱗狀細胞癌細胞株,FLI-06在口腔鱗狀細胞癌細胞株中的IC50值分別為:CAL-27為3.8-7.8μM;TCA-8113為3.1-3.8μM;WSU-HN30為5.0-7.7μM;SCC-9為0.6-4.3μM,而RO-4929097直接作用于口腔鱗狀細胞癌細胞株后對細胞的增殖沒有抑制作用。但是,將FLI-06和RO-4929097分別作用于口腔鱗狀細胞癌腫瘤干細胞后,發(fā)現(xiàn)兩種抑制劑在較低濃度時均能抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的自我更新能力,FLI-06還可滲透腫瘤干細胞球破壞腫瘤干細胞球體的完整性,但RO-4929097對腫瘤干細胞球滲透破壞能力較差。2.NOTCH信號通路突變與口腔鱗狀細胞癌的關(guān)聯(lián)研究外顯子測序結(jié)果顯示:在15對口腔鱗狀細胞癌樣本中分別檢測到1個NOTCH1錯義突變位點NOTCH1-G484D;1個NOTCH2錯義突變位點NOTCH2-N2265K;1個NOTCH3錯義突變位點NOTCH3-T1751A。從COSMIC腫瘤突變數(shù)據(jù)庫中選擇了NOTCH1-T194P,NOTCH1-T311P,NOTCH1-D573A,NOTCH1-L1600P及NOTCH1-L1678P這5個位點。在更大樣本量的口腔鱗狀細胞癌組織和癌旁組織標本中對以上8個突變位點進行Sanger測序分析。結(jié)果顯示:在口腔鱗狀細胞癌中NOTCH1-484位點存在G>D,G>R,G>C,G>S,G>A這5種類型的錯義突變,將它們的突變例數(shù)進行合并計算,得出該位點在口腔鱗狀細胞癌中的突變率為11.0%,癌旁組織中的突變率為2.3%,但在口腔鱗狀細胞癌患者血液樣品和健康人血液樣品中均未檢測到突變。NOTCH1-L1678P位點在口腔鱗狀細胞癌組織中的突變率為17%,在癌旁組織中的突變率為1.2%,病人血液樣本中未檢測到突變,健康人血液樣品中突變率為2.8%。在口腔鱗狀細胞癌樣本中未發(fā)現(xiàn)NOTCH1-T194P,NOTCH1-T311P、NOTCH1-D573A、NOTCH1-L1600P、NOTCH2-N2265K及NOTCH3-T1751A位點存在突變。在接受過術(shù)前放療的患者中NOTCH1-484位點的突變率升高。NOTCH1的m RNA的表達水平在突變的口腔鱗狀細胞癌組織中較野生型的口腔鱗狀細胞癌組織中稍有升高,但差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。3.NOTCH1定點突變對口腔鱗狀細胞癌細胞功能的影響成功構(gòu)建NOTCH1-G484A,NOTCH1-G484C,NOTCH1-G484D,NOTCH1-G484R,NOTCH1-G484S和NOTCH1-L1678P點突變質(zhì)粒。Western blot檢測野生型和突變型質(zhì)粒在293T細胞、KYSE-150細胞和SCC-9細胞中均有表達。野生型的NOTCH1過表達能夠促進293T,KYSE-150和SCC-9細胞的增殖,但是突變型和野生型的NOTCH1對293T、KYSE-150和SCC-9細胞的生長能力的影響沒有明顯的差異（P>0.05）。野生型和突變型的NOTCH1對KYSE-150細胞的遷移能力的影響無明顯差異（P>0.05）。雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)NOTCH1-L1678P突變后NOTCH信號通路被活化,而NOTCH1-G484A,NOTCH1-G484C,NOTCH1-G484D,NOTCH1-G484R,NOTCH1-G484S發(fā)生突變后NOTCH信號通路失活。Real-time PCR顯示NOTCH1-L1678P突變后,NOTCH信號通路下游基因HES5表達升高。結(jié)論NOTCH1和NOTCH2在口腔鱗狀細胞癌中起著促癌基因的作用。在口腔鱗狀細胞癌組織中檢測到NOTCH1-G484A,NOTCH1-G484C,NOTCH1-G484D,NOTCH1-G484R,NOTCH1-G484S和NOTCH1-L1678P突變率較高,可能會對口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。其中,NOTCH1-L1678P為激活性突變,可通過NOTCH-HES5途徑激活NOTCH信號通路,而NOTCH1-G484A,NOTCH1-G484C,NOTCH1-G484D,NOTCH1-G484R,NOTCH1-G484S位點的突變對NOTCH信號通路活化沒有影響。NOTCH信號通路的突變與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),NOTCH的突變可影響信號通路的活化,其中具體的機制有待于深入的探討。
李磊[5]（2021）在《ANXA1在下咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達及功能相關(guān)性研究》文中認為目的:探討膜聯(lián)蛋白A1（ANXA1）在下咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達,分析其與下咽癌患者的臨床病理特征之間的關(guān)系和患者預后之間的關(guān)系,研究ANXA1在Fa Du細胞中的生物功能,并初步探討ANXA1在下咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用機制。方法:通過對3例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和3例淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者的下咽鱗狀細胞癌組織標本進行RNA測序得到了差異表達基因（DEm RNAs）;采用q RT-PCR和Western blotting方法對目的基因ANXA1表達進行了驗證;通過免疫組化法對74例下咽鱗狀細胞癌組織和正常粘膜組織中的ANXA1表達進行染色,根據(jù)染色結(jié)果分析其與臨床病理學參數(shù)的關(guān)系和患者預后的關(guān)系。采用小干擾RNA沉默的方法對Fa Du細胞中的ANXA1基因進行敲低處理,使用CCK-8染色和細胞集落形成實驗檢測細胞增殖,采用Transwell法對細胞遷移和侵襲進行檢測,采用流式細胞術(shù)對細胞凋亡和細胞周期進行分析。通過生物信息學方法對DEm RNAs進行了GOBP、KEGG和PPI分析,尋找ANXA1的可能作用機制。在下咽癌Fa Du細胞株和下咽鱗狀細胞癌組織中,通過q RT-PCR和Western blotting方法對ANXA1的作用靶基因Yap1進行了驗證,采用Pearson相關(guān)統(tǒng)計方法對ANXA1與Yap1表達的相關(guān)性進行分析。通過體外細胞挽救實驗對ANXA1與Yap1的作用機制進行了進一步驗證。結(jié)果:在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組的下咽鱗狀細胞癌組織樣本中共鑒定出了698個DEm RNAs,其中包括278個上調(diào)基因和420個下調(diào)基因,ANXA1是其中之一;進一步的驗證實驗證實,ANXA1在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移下咽鱗狀細胞癌組織中的m RNA的表達和蛋白質(zhì)的表達與正常癌旁粘膜組織和不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移下咽鱗狀細胞癌組織相比較,表達明顯下調(diào);免疫組化法分析也表明,ANXA1在正常粘膜上皮中高表達,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達明顯低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中的表達（P<0.05）;ANXA1的表達與下咽鱗狀細胞癌的臨床病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期相關(guān)（P<0.05）,而與患者年齡、性別和腫瘤分期無關(guān)（P>0.05）;ANXA1的低表達與患者預后差有關(guān)（P<0.05）。沉默ANXA1后,Fa Du細胞的增殖能力,侵襲遷移能力增加,細胞凋亡減少,細胞周期中G0/G1期細胞明顯減少,而S期細胞明顯增加。上皮細胞分化、細胞增殖調(diào)節(jié)和細胞凋亡過程的負調(diào)節(jié)生物學過程被顯著富集。與癌癥相關(guān)的Hippo通路被高度富集,Yap1是這一途徑中的一個關(guān)鍵因素。進一步的分析發(fā)現(xiàn),Yap1與ANXA1參與了大多數(shù)相同的生物過程。通過對蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡分析,表明ANXA1和Yap1是這些生物學過程的中樞基因,并且彼此密切相關(guān)。在Fa Du細胞中沉默ANXA1的表達后,Yap1的m RNA的表達和蛋白質(zhì)的表達明顯被下調(diào)。同時,在下咽鱗狀細胞癌組織中,Yap1在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的m RNA的表達和蛋白質(zhì)的表達明顯低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中的表達,并且ANXA1的m RNA的表達與Yap1的m RNA的表達成正相關(guān)性（P<0.0001）。體外細胞挽救實驗證實,過表達Yap1可以逆轉(zhuǎn)沉默ANXA1的效果。結(jié)論:檢測ANXA1的表達可以有效地預測下咽鱗狀細胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預后,為預測下咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了新的分子標志物。ANXA1可能通過調(diào)節(jié)Yap1的表達來抑制下咽鱗狀細胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,這為研究下咽癌淋巴轉(zhuǎn)移的機制提供了理論基礎(chǔ)。
李東杰[6]（2021）在《基于微陣列比較基因組雜交技術(shù)對喉鱗癌全基因組染色體拷貝數(shù)變異的整合分析》文中認為喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）是頭頸部常見的惡性腫瘤,發(fā)病率高,約占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%,其死亡率高、預后較差。然而近年來LSCC患者5年生存率及生活質(zhì)量并無提高,其發(fā)病率亦呈逐年升高趨勢,并且逐漸年輕化,嚴重破壞患者的發(fā)音、呼吸及吞咽三大功能,威脅患者的生存質(zhì)量和生存期。對于LSCC的治療,較晚期患者往往以犧牲喉的功能為代價來延長生命。LSCC是一種基因機制復雜的腫瘤類型,目前其病因和發(fā)病機制尚不明確,且尚缺乏用于指導診斷、治療及預后的特異性腫瘤標志物。因此探究LSCC的發(fā)生機理,分析LSCC發(fā)生的分子機制以及找出LSCC的分子標志物對于LSCC的早期診斷及治療越來越重要。遺傳不穩(wěn)定性如染色體不穩(wěn)定性與LSCC的發(fā)生密切有關(guān)?？截悢?shù)變異（Copy Number Variations,CNVs）是人類基因組內(nèi)從1Kb到數(shù)個Mb不等的DNA片段拷貝數(shù),包括DNA片段的刪除、插入、復制和復合多位點的變異等類型。CNVs是造成個體表型差異的重要遺傳基礎(chǔ),其在人類基因組中分布廣泛,極大地豐富了基因組遺傳變異的多樣性。在人類腫瘤中,CNV是可能導致原癌基因的活化和抑癌基因的鈍化的重要原因,這些基因在參與調(diào)控細胞生長、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等機制方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Array-CGH（Microarray comparative genomic hybrization）是一種高通量的基因組檢測技術(shù),一次實驗就能對基因組的變化進行整體檢測,并且能篩查出全部染色體的微重復、微缺失和非整倍體等變異,可成為篩選腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、耐藥等相關(guān)候選基因的研究靶點,對于尋找原癌基因和抑癌基因,監(jiān)測腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程及判斷預后有重要的分子遺傳學意義。在本研究中,我們通過array-CGH檢測獲得了LSCC的全基因組的缺失及擴增圖譜。同時研究染色體畸變與臨床病理特征的關(guān)系,通過整合GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫分析獲得各染色體異常數(shù)據(jù),進而對與LSCC發(fā)生及發(fā)展相關(guān)的基因進行篩選,為研究LSCC發(fā)生及發(fā)展提供相關(guān)候選基因。目的:通過array-CGH分析LSCC腫瘤組織的全基因組染色體的缺失及擴增圖譜,探討LSCC染色體水平拷貝數(shù)變異,并分析染色體CNVs與喉鱗癌臨床及病理特征之間的關(guān)系,結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫分析獲得差異表達基因數(shù)據(jù),進而對與LSCC發(fā)生及發(fā)展相關(guān)的基因進行篩選,為研究LSCC發(fā)生及發(fā)展提供相關(guān)候選基因。方法:我們使用Agilent公司的基因芯片對66例LSCC進行array-CGH檢測,使用Cytogenomics 4.0對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析,同時分析染色體CNVs與臨床及病理特征之間的關(guān)系,結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫分析獲得差異表達基因,同時繪制火山圖及熱圖,進而對與LSCC發(fā)生及發(fā)展相關(guān)的基因進行整合分析篩選獲得LSCC候選靶基因,通過免疫組織化學進一步分析候選基因在癌組織及癌旁組織中的表達,以及其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果:（1）本次研究的66例LSCC標本中,經(jīng)array-CGH檢測均有不同數(shù)目及大小的基因組CNVs（擴增、丟失、重復和純合缺失）。66例LSCC中所檢測到的基因組不平衡頻率較高的染色體片段包括9個重復片段:3q26.1-qter,5pter-p12,7p22.3p14.1,8p12p11.22,8q24.13q24.3,11q13.2q13.4,12pter-p12.2,18pter-p11.31和20p13p12.1,以及5個缺失片段:3pter-p21.32,4q28.1-q35.2,5q13.2-qter,9pter-p21.3以及13 monosomy。3q26.32q27.2區(qū)域重復頻率最高,其中最小重疊區(qū)域（smallest region of overlap,SRO）包含SOX2,EIF4G1,FXR1,DVL3,DCUN1D1和IGF2BP2等基因。8號染色體上有兩個高度擴增片段,其中長臂8p11.2和短臂8q24.21,分別包含ADAM2和CCDC26基因。本實驗中檢測到4個純合子缺失片段,其所覆蓋NEIL3,CSMD1,CDKN2A和PCDH20等可能的抑癌基因。（2）根據(jù)臨床特征及病理特點,高頻染色體片段變異與淋巴結(jié)分期、腫瘤分期統(tǒng)計無相關(guān)性,3q26.1-qter、5pter-p12重復以及5q13.2-qter缺失在吸煙組與非吸煙組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（3）整合GEO數(shù)據(jù)庫差異表達基因分析確定SOX2、EIF4G1、FXR1、DVL3、DCUN1D1、IGF2BP2、CCDC26以及CDKN2A、SPINK5、PCDH20、CSMD1、NEIL3候選基因。（4）PCDH20、NEIL3、DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2在喉癌和癌旁組織高表達率比較差異均有統(tǒng)計學意義,PCDH20表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙史負相關(guān),NEIL3表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負相關(guān),DCUN1D1表達與TNM分期正相關(guān),EIF4G1、IGF2BP2表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。結(jié)論:（1）本次研究的66例LSCC組織標本中,經(jīng)array-CGH檢測均有不同數(shù)目及大小片段的基因組CNVs（擴增、丟失、重復和純合缺失）。（2）在LSCC中所檢測到的高頻擴增及純合子缺失片段中含有重要相關(guān)癌基因以及抑癌基因。（3）特定染色體片段的重復及缺失與吸煙史存在一定相關(guān)性,部分篩選基因的表達與臨床病理參數(shù)相關(guān)。（4）結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫差異表達基因的整合分析可推定LSCC相關(guān)候選靶基因,為進一步研究LSCC的分子發(fā)生機制提供參考。
王寧[7]（2021）在《長鏈非編碼RNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌中的表達及功能研究》文中認為研究背景及目的喉癌是一種高度侵襲性的頭頸部惡性腫瘤。喉鱗狀細胞癌（laryngal squamous cell carcinoma,LSCC）占所有喉癌病例的 90%以上。生活在空氣污染嚴重地區(qū)的人和長期抽煙喝酒的人屬于高危人群。手術(shù)是早期喉鱗狀細胞癌的首選治療方法,支撐喉鏡下二氧化碳激光切除和喉部分切除術(shù)可取得較好的臨床效果。近年來,雖然開放根治手術(shù)、化療、放療和分子靶向治療在喉鱗狀細胞癌的治療方面取得了很大進展,但遺憾的是,晚期喉鱗狀細胞癌的5年生存率仍然較低,嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。根據(jù)分子生物學理論,生物遺傳信息的傳遞是按照中心法則以遺傳編碼的形式進行的。脫氧核糖核酸（DNA）是攜帶生物遺傳信息的基因片段。核糖核酸（RNA）只是作為脫氧核糖核酸序列和編碼蛋白之間的載體。DNA攜帶遺傳信息,被轉(zhuǎn)錄成一部分RNA,具有蛋白質(zhì)編碼的功能的RNA攜帶遺傳信息翻譯和合成蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),人類基因組中不到2%的基因可以編碼蛋白質(zhì),而至少90%的基因組序列不具有蛋白質(zhì)編碼的功能。而這些不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA被稱為非編碼RNA（non-codingRNA,ncRNA）。LncRNA是一種轉(zhuǎn)錄本超過200bp的核糖核酸分子,與信使RNA一樣,它們可以由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄。作為非編碼RNA,lncRNA本身不具有編碼蛋白質(zhì)的功能,僅其中一小部分可以編碼一些短的多肽,并通過這些多肽發(fā)揮作用。以往的研究表明,lncRNAs可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。LncRNAs可以在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后和蛋白質(zhì)翻譯等不同水平影響腫瘤染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周期調(diào)節(jié)、DNA甲基化、和翻譯、組蛋白修飾等多種生物學功能。研究人員發(fā)現(xiàn)越來越多的腫瘤的lncRNA有這些重要調(diào)控功能,包括乳腺癌、非小細胞肺癌、胰腺惡性腫瘤、骨肉瘤、肝細胞癌、白血病等。LncRNA在一系列惡性腫瘤中的異常表達,間接提示lncRNA可能具有促癌和抑癌雙重作用,但其在中的作用和機制仍不甚清楚。因此,研究lncRNAs與喉鱗狀細胞癌的關(guān)系,將有助于更好地了解喉鱗狀細胞癌的分子生物學機制,并有助于開發(fā)新的治療靶點,為喉鱗狀細胞癌的早期診斷和個體化治療提供新的指導策略,具有重要意義。LncRNA TRPM2-AS 是 TRPM2 的反義 lncRNA,全長 875nt,位于chr21q22.3位點。最近的一些研究表明,lncRNA TRPM2-AS在幾種腫瘤中經(jīng)常表達上調(diào),如前列腺癌、肝癌和肺癌等。然而,迄今為止,lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌中的表達水平和潛在功能仍然很大程度上是未研究的。因此,探討lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌中的功能及作用機制,對于喉鱗狀細胞癌的標志物篩選、分子診斷和靶向治療將具有重要意義。本研究分為3個部分:（1）應用qRT-PCR檢測lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌及相應癌旁組織中的相對表達量,并對其表達水平與臨床特征進行分析。（2）通過qRT-PCR的方法檢測lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌不同細胞系A(chǔ)MC-HN-8和Tu-177和正常人支氣管上皮細胞系16HBE中的表達情況,并通過核、漿RNA分離實驗結(jié)合qRT-PCR的方法對lncRNA TRPM2-AS進行亞細胞定位。通過構(gòu)建si-TRPM2-AS和pcDNA3.1-TRPM2-AS,調(diào)控lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌細胞系中的表達水平。通過MTT細胞增殖實驗、Transwell遷移及侵襲實驗,檢測lncRNA TRPM2-AS對喉鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。（3）用生物信息學方法預測lncRNA TRPM2-AS與miR-138在喉鱗狀細胞癌中的相互作用。通過qRT-PCR的方法檢測miR-138在喉鱗狀細胞癌中的表達;通過MTT細胞增殖實驗檢測胞增殖,Transwell遷移及侵襲實驗檢測細胞的遷移及侵襲能力,利用Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達水平,并用雙熒光素酶報告基因分析驗證其相互作用。第一部分長鏈非編碼RNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義研究目的檢測77例喉鱗狀細胞癌患者腫瘤組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA TRPM2-AS的相對表達量,并進一步分析lncRNA TRPM2-AS的表達量與喉鱗狀細胞癌患者的腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期等臨床特征之間的關(guān)系。研究方法收集2015年10月至2019年12月在山東大學齊魯醫(yī)院耳鼻咽喉科（青島）確診并接受根治性手術(shù)的77例喉鱗狀細胞癌患者的腫瘤組織及相應的癌旁組織。分別從腫瘤組織和癌旁組織中提取RNA,用qRT-PCR檢測喉鱗狀細胞癌和相應癌旁組織中的lncRNA TRPM2-AS相對表達量。統(tǒng)計分析其表達量與腫瘤患者各種臨床特征的關(guān)系。LncRNA TRPM2-AS的表達量與臨床病理特征的關(guān)系用Chi-square或Fisher檢驗評估。通過t檢驗比較兩組實驗數(shù)據(jù)的差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果qRT-PCR結(jié)果示lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌組織中的相對表達量為（1.8636±0.3957）明顯高于lncRNA TRPM2-AS在癌旁組織中的表達量（0.9996±0.1479,P<0.05）。高表達水平的lncRNA TRPM2-AS與T分期（P=0.037）、更晚的臨床分期（P=0.023）顯著相關(guān)。研究結(jié)論我們研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TRPM2-AS（P<0.05）在喉鱗狀細胞癌中呈高表達狀態(tài),表明TRPM2-AS是該腫瘤中的癌基因。進一步研究lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌患者中的可能臨床價值,發(fā)現(xiàn)lncRNA TRPM2-AS的表達水平與喉鱗狀細胞癌的T分期、臨床分期明顯相關(guān)。由此說明,lncRNA TRPM2-AS可能參與并促進了喉鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展。第二部分長鏈非編碼RNA TRPM2-AS對喉鱗狀細胞癌細胞生物學行為的影響研究目的研究lncRNA TRPM2-AS對喉鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移及侵襲等細胞生物學功能的影響。研究方法（1）通過qRT-PCR的方法檢測lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌不同細胞系A(chǔ)MC-HN-8和Tu-177和正常人支氣管上皮細胞系16HBE中的表達情況,并通過核、漿RNA分離實驗結(jié)合qRT-PCR的方法對lncRNA TRPM2-AS進行亞細胞定位。（2）通過構(gòu)建 si-TRPM2-AS 和 pcDNA3.1-TRPM2-AS,調(diào)控 lncRNA TRPM2-AS 在喉鱗狀細胞癌細胞系中的表達水平。（3）通過MTT細胞增殖實驗、Transwell遷移及侵襲實驗,檢測lncRNA TRPM2-AS對喉鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。研究結(jié)果（1）lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)MC-HN-8、Tu-177的表達水平高于正常16HBE細胞系,且主要位于細胞的胞漿中。（2）通過si-TRPM2-AS可明顯敲低lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)MC-HN-8中的表達水平,而過表達載體pcDNA3.1-TRPM2-AS可明顯上調(diào)喉鱗狀細胞癌細胞系Tu-177中l(wèi)ncRNA TRPM2-AS的表達水平。（3）體外實驗證實在喉鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)MC-HN-8中敲低lncRNA TRPM2-AS,可明顯抑制AMC-HN-8細胞的增殖、遷移及侵襲能力。而在喉鱗狀細胞癌細胞系Tu-177中過表達lncRNA TRPM2-AS,可明顯促進Tu-177細胞的增殖、遷移及侵襲能力。研究結(jié)論（1）lncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌細胞系A(chǔ)MC-HN-8、Tu-177中表達增高,且主要表達于細胞漿中。（2）lncRNA TRPM2-AS可促進喉鱗狀細胞癌細胞系Tu-177細胞的增殖、遷移及侵襲能力。提示lncRNA TRPM2-AS可能作為促癌基因促進了喉鱗狀細胞癌的增殖、遷移和侵襲。第三部分 長鏈非編碼RNA TRPM2-AS與miR-138喉鱗狀細胞癌細胞中的相互作用研究目的檢測喉鱗狀細胞癌患者腫瘤組織及癌旁組織中miR-138的相對表達量,分析lncRNA TRPM2-AS與miR-138在喉鱗狀細胞癌細胞中的相互作用。研究方法用生物信息學方法預測lncRNA TRPM2-AS與miR-138在喉鱗狀細胞癌中的相互作用。通過qRT-PCR的方法檢測miR-138在喉鱗狀細胞癌中的表達;通過MTT細胞增殖實驗檢測胞增殖,Transwell遷移及侵襲實驗檢測細胞的遷移及侵襲能力,利用Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達水平,并用雙熒光素酶報告基因分析驗證其相互作用。研究結(jié)果（1）轉(zhuǎn)染了 TRPM2-AS-WT質(zhì)粒的HEK293T細胞的熒光素酶活性被miR-138模擬物顯著降低。與鄰近的正常組織相比,喉鱗狀細胞癌組織中miR-138的表達顯著降低。在喉鱗狀細胞癌組織中l(wèi)ncRNA TRPM2-AS和miR-138的表達之間有密切的負相關(guān)（r=-0.269,P=0.018）。miR-138模擬物可顯著降低HEK293T細胞中SOX4-WT質(zhì)粒的熒光素酶活性。（2）敲低lncRNA TRPM2-AS導致AMC-HN-8細胞中SOX4蛋白表達減少和EMT損傷,表現(xiàn)為上皮標志物（E-cadherin）表達增加和間充質(zhì)標志物（N-cadherin,Vimentin）表達減少。此外,通過與miR-138模擬物共轉(zhuǎn)染,過度表達lncRNA TRPM2-AS的Tu-177細胞中SOX4蛋白水平的增加和EMT的增強得到有效抑制。（3）修復miR-138可阻斷l(xiāng)ncRNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌細胞中的作用。miR-138的異位表達逆轉(zhuǎn)了 lncRNA TRPM2-AS對Tu-177細胞遷移和侵襲的促進作用。通過MTT法,我們還注意到miR-138的恢復部分逆轉(zhuǎn)了過度表達lncRNA TRPM2-AS的Tu-177細胞的增殖增強。研究結(jié)論（1）喉鱗狀細胞癌組織中miR-138的表達顯著低于癌旁正常組織。喉鱗狀細胞癌中l(wèi)ncRNA TRPM2-AS和miR-138的表達呈顯著負相關(guān)。（2）體外實驗表明,lncRNA TRPM2-AS過表達促進了喉鱗狀細胞癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,而lncRNA TRPM2-AS低表達對喉鱗狀細胞癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有抑制作用。（3）lncRNA TRPM2-AS被證實是喉鱗狀細胞癌細胞miR-138的ceRNA。lncRNA TRPM2-AS部分通過miR-138/Sox4軸在喉鱗狀細胞癌中發(fā)揮致癌作用。
劉濤[8]（2021）在《長鏈非編碼RNA RASSF8-AS1競爭性結(jié)合miR-664b-3p調(diào)控TLE1表達影響喉鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程》文中研究說明喉癌是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤之一,其主要病理類型為喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）。根據(jù)其原發(fā)部位的不同,主要分為聲門型、聲門上型和聲門下型喉癌,聲門型喉癌最為常見。2018年,全世界喉癌的新發(fā)病例是177,422例,約占總的全身惡性腫瘤新發(fā)病例的1%左右,其導致的死亡病例為94,771例,且近年來,全球的喉癌發(fā)病率在逐年上升。隨著人們對生活質(zhì)量要求的不斷提升和科學技術(shù)的發(fā)展,人們對于喉功能保留、重建有了更高的向往與追求,喉癌的治療方案也在不斷的豐富和改進。然而,最新的調(diào)查顯示喉癌患者的總體生存率并沒有得到明顯提升,甚至有下降的趨勢,晚期喉癌的預后仍不甚理想。臨床上,復發(fā)和轉(zhuǎn)移成為限制喉癌患者預后的主要因素,大約有60%的患者在確診時已經(jīng)到了晚期。因此,探討研究喉鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的分子機制已尤為重要。近些年來,隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展,研究人員發(fā)現(xiàn)在人類的RNA中只有不到2%的RNA能夠進行編碼蛋白質(zhì),多數(shù)RNA難以編碼蛋白質(zhì),這類不能編碼蛋白質(zhì)的基因稱為非編碼RNA（non-codingRNA,ncRNA）。長鏈非編碼RNA（long non-codingRNA,lncRNA）是非編碼RNA的一類,它的長度大于200個核苷酸,它能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控層面參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,同時它與腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。本研究通過對表達譜基因芯片進行分析,篩選出了LSCC組織與其臨近正常組織中具有差異性表達的lncRNAs,其中l(wèi)ncRNA RASSF8-AS1在喉癌組織中表達顯著下調(diào),這引起了我們的關(guān)注。微小RNA（microRNA,miRNA）是一類含有18-25個核苷酸的的非編碼RNA,它可以通過與它的靶向mRNA分子的3’UTR（3’untranslated region,3’非編碼區(qū)）特異性的結(jié)合,抑制mRNA的合成或直接將其降解掉,在轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平參與基因的調(diào)控。近些年,lncRNA與miRNA相互作用的研究備受關(guān)注,特別是競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenousRNA,ceRNA）機制尤其成為人們現(xiàn)在研究的熱點問題,為闡明兩者之間的關(guān)系提供了一種新的思路。IncRNA能夠作為ceRNA分子,競爭性的結(jié)合特定的某個或多個miRNA,從而減少miRNA對其下游靶基因的調(diào)控作用。本實驗旨在探討RASSF8-AS1通過競爭性結(jié)合miR-664b-3p,進而調(diào)節(jié)I型分裂蛋白轉(zhuǎn)導素樣增強子（Transducin-like enhancer of split 1,TLE1）的表達,從而影響喉鱗狀細胞癌的惡性生物學行為,這樣的一種分子機制。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:第一部分RASSF8-AS1的篩選及其在喉鱗狀細胞癌中的表達情況目的:運用表達譜基因芯片分析技術(shù),篩選出LSCC癌組織與其臨近正常組織中表達具有差異性的lncRNAs,選取表達下調(diào)的lncRNA RASSF8-AS1作為研究對象,分析RASSF8-AS1在喉鱗狀細胞癌組織及細胞中的表達水平,并分析其表達水平與LSCC患者臨床病理特征是否存在相關(guān)性。方法:1.對4例LSCC患者的喉癌組織及其對應的臨近正常組織進行表達譜芯片檢測,篩選出差異表達的lncRNAs。2.采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）技術(shù)檢測RASSF8-AS1在72例LSCC患者癌組織及其對應的臨近正常組織中的差異性表達情況。3.采用q RT-PCR技術(shù)檢測RASSF8-AS1在4株LSCC細胞系TU686、TU177、TU212以及AMC-HN-8以及正常對照組中的差異性表達情況。4.通過基因表達譜相互作用分析網(wǎng)站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）分析RASSF8-AS1在多種腫瘤組織及其正常對照組中的差異性表達情況。5.對RASSF8-AS1在喉癌患者組織中的的相對表達量與其臨床病理學特征,如TNM臨床分期、病理分化程度、頸部淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、年齡、吸煙以及飲酒等進行相關(guān)性分析。結(jié)果:1.表達譜芯片分析技術(shù)篩選出（Fold change≥2）3073個差異表達的lncRNA,這其中有1967個lncRNA在LSCC組織中表達上調(diào),有1106個在LSCC組織中表達下調(diào)。2.從上述差異基因中選擇RASSF8-AS1作為研究對象,q RT-PCR結(jié)果顯示在72例喉鱗狀細胞癌患者癌組織中RASSF8-AS1的相對表達量顯著低于其相對應的臨近正常組織。（t=5.615,P<0.01）。3.RASSF8-AS1在TU686細胞系中的相對表達量顯著低于正常對照組（P<0.01）,同樣在TU177細胞（P<0.01）、TU212細胞（P<0.01）以及AMC-HN-8細胞中（P<0.01）也得出相同結(jié)果。4.GEPIA分析結(jié)果顯示:RASSF8-AS1在多種腫瘤瘤組織中的表達量較正常組織中的顯著降低。5.RASSF8-AS1在LSCC癌組織中的表達量與LSCC患者的TNM臨床分期、病理分化程度和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其在低分化組、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組以及TNM分期的Ⅲ、Ⅳ期組中呈現(xiàn)低表達（P<0.05）,而與患者的年齡、有無飲酒及吸煙無明顯相關(guān)性（P>0.05）。第二部分RASSF8-AS1對喉鱗狀細胞癌細胞生物學功能的影響目的:通過體外實驗,探討RASSF8-AS1對喉鱗狀細胞癌細胞生物學功能的影響。方法:1.構(gòu)建RASSF8-AS1的過表達載體pc DNA3.1-RASSF8-AS1,并將其與空載質(zhì)粒pc DNA3.1分別轉(zhuǎn)染LSCC細胞系TU686和TU177細胞中去,并采用q RT-PCR的方法檢測過表達效率。2.在體外細胞實驗中,設置pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1兩組,采用Transwell小室遷移、侵襲實驗來驗證以上兩組對LSCC癌細胞遷移以及侵襲能力影響。3.在體外細胞實驗中,設置pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1兩組,采用MTS以及克隆形成實驗驗證以上兩組對LSCC癌細胞增殖能力影響。結(jié)果:1.LSCC細胞系TU686和TU177分別轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pc DNA3.1-RASSF8-AS1或空載pc DNA3.1后,利用q RT-PCR檢測,目的基因表達量明顯高于空載質(zhì)粒組（P<0.01）,過表達RASSF8-AS1的細胞株建立完成。2.體外細胞實驗:Transwell小室遷移以及侵襲實驗證明轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后LSCC細胞系TU686和TU177細胞的遷移以及侵襲能力均較轉(zhuǎn)染pc DNA3.1組顯著降低,且結(jié)果有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。3.體外細胞實驗:MTS以及細胞克隆實驗證明轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后LSCC細胞系TU686和TU177細胞的增殖能力均較轉(zhuǎn)染pc DNA3.1組顯著降低,且結(jié)果有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。第三部分RASSF8-AS1靶向miRNA的選擇、鑒定及miR-664b-3p對喉鱗狀細胞癌細胞生物學功能的影響目的:探討RASSF8-AS1與靶向miRNA（miR-664b-3p）之間的調(diào)控關(guān)系,以及miR-664b-3p對LSCC細胞生物學功能的影響。方法:1.利用細胞漿、核RNA分離試劑盒,分別提取LSCC細胞系A(chǔ)MC-HN-8、TU177、TU212以及TU686的細胞核以及細胞漿RNA,用q RT-PCR的技術(shù)方法檢測RASSF8-AS1的亞細胞定位。2.通過生物學信息預測軟件Target Scan（http://www.targetscan.org/）以及DIANA（http://www.microrna.gr/micro TCDS）預測RASSF8-AS1的靶向miRNA,并確定其結(jié)合位點。3.構(gòu)建pmir GLO-RASSF8-AS1-WT和pmir GLO-RASSF8-AS1-MUT型質(zhì)粒,應用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘赥U177細胞及工具細胞293T中驗證RASSF8-AS1與miR-664b-3p兩者之間的靶向結(jié)合關(guān)系。4.在喉癌細胞系TU177中應用基于MS2結(jié)合序列-MS2結(jié)合蛋白（MS2bs-MS2bp）的RNA免疫共沉淀技術(shù)（RIP）進一步驗證RASSF8-AS1與miR-664b-3p之間的結(jié)合關(guān)系。5.通過q RT-PCR的技術(shù)方法檢測在LSCC細胞系TU686以及TU177中分別轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1后miR-664b-3p表達量的變化情況。6.應用Pearson方法對72例喉癌患者癌組織中RASSF8-AS1以及miR-664b-3p的相對表達量進行相關(guān)性分析。7.通過q RT-PCR的技術(shù)方法驗證miR-664b-3p在72例LSCC患者癌組織及其相對應的臨近正常組織中的表達量的差異性情況。8.合成miR-664b-3p的類似物miR-664b-3p-mimic及抑制物miR-664b-3p-inhibitor,并將它們分別轉(zhuǎn)染到LSCC細胞系TU686和TU177中,采用q RT-PCR的技術(shù)方法檢測miR-664b-3p的表達量。9.采用Transwell小室遷移、侵襲實驗驗證上調(diào)及下調(diào)miR-664b-3p后對LSCC癌細胞遷移以及侵襲能力的影響。采用MTS以及克隆形成實驗驗證上調(diào)及下調(diào)miR-664b-3p后對LSCC癌細胞增殖能力的影響。10.采用Transwell小室遷移、侵襲實驗以及MTS實驗、克隆形成實驗檢測LSCC細胞系TU686及TU77中轉(zhuǎn)染miR-664b-3p-mimic,及共轉(zhuǎn)染miR-664b-3p-mimic+pc DNA3.1-RASSF8-AS1后對LSCC細胞遷移、侵襲以及增殖能力的影響。結(jié)果:1.RASSF8-AS1在TU177、TU686、TU212以及AMC-HN-8,4株喉癌細胞系的細胞核、漿中都有表達,在漿中的表達量略多于核中。2.通過生物信息學預測顯示miR-664b-3p與RASSF8-AS1具有潛在的結(jié)合位點,并分析出其結(jié)合位點。3.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示在TU177細胞及工具細胞293T中與共轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒比較,共轉(zhuǎn)染pmir GLO-RASSF8-AS1-WT質(zhì)粒及miR-664b-3p-mimic可顯著降低熒光素酶的活性（P<0.01）,與此相反,共轉(zhuǎn)染了pmir GLO-RASSF8-AS1-WT型質(zhì)粒和miR-664b-3p-inhibitor之后熒光素酶的活性得到了明顯增強（P<0.01）,當對pmir GLO-RASSF8-AS1-WT進行突變后,各組的熒光素酶活性沒有明顯變化（P>0.05）。4.RNA免疫共沉淀技術(shù)（RIP）實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染了pc DNA3.1-RASSF8-AS1-MS2（12x）質(zhì)粒組所富集的miR-664b-3p含量顯著高于轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1-MS2（12x）-MUT質(zhì)粒組,兩者之間的q RT-PCR結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。5.q RT-PCR結(jié)果顯示,在LSCC細胞系TU686以及TU177中分別轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1后對miR-664b-3p的表達量進行比較,發(fā)現(xiàn)過表達RASSF8-AS1后與對照組相比miR-664b-3p的表達明顯降低,結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。6.Pearson統(tǒng)計分析結(jié)果顯示在72例喉癌患者癌組織中RASSF8-AS1與miR-664b-3p的相對表達量密切相關(guān),且兩者成負相關(guān)（r=-0.5099,P<0.01）。7.miR-664b-3p在72例喉鱗狀細胞癌患者癌組織中的表達量顯著高于其相對應的臨近正常組織。（t=4.542,P<0.01）。8.q RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-664b-3p-mimic可有效上調(diào)miR-664b-3p在LSCC細胞系TU686及TU177中的表達水平,而在轉(zhuǎn)染miR-664b-3p-inhibitor可顯著下調(diào)miR-664b-3p在LSCC細胞系TU686及TU177中的表達水平（P<0.01）。9.體外實驗證實,過表達miR-664b-3p可顯著促進LSCC細胞系TU686及TU177的遷移、侵襲以及增殖的能力（P<0.01）,下調(diào)miR-664b-3p可明顯抑制TU686及TU177細胞的遷移、侵襲以及增殖的能力（P<0.01）。10.在TU686及TU177細胞中,共轉(zhuǎn)染RASSF8-AS1后部分逆轉(zhuǎn)了過表達miR-664b-3p對TU686及TU177細胞的遷移、侵襲以及增殖能力的促進作用。（P<0.01）第四部分miR-664b-3p在喉鱗癌中靶向調(diào)控的mRNA篩選、鑒定以及TLE1對喉鱗狀細胞癌細胞生物學功能的影響目的:探討miR-664b-3p與其靶向mRNA:TLE1兩者之間的調(diào)控關(guān)系,以及TLE1對LSCC細胞生物學功能的影響。方法:1.通過生物學信息預測軟件Target Scan（http://www.targetscan.org/）以及DIANA（http://www.microrna.gr/micro TCDS）預測miR-664b-3p的靶向mRNA,并確定其結(jié)合位點。2.分別轉(zhuǎn)染miR-664b-3p-mimic以及miR-664b-3p-inhibitor到LSCC細胞系TU686和TU177中,采用q RT-PCR的技術(shù)方法檢測上調(diào)以及下調(diào)miR-664b-3p后TLE1在mRNA水平表達量的變化情況。3.分別轉(zhuǎn)染miR-664b-3p-mimic以及miR-664b-3p-inhibitor到LSCC細胞系TU686和TU177中,采用western blot的方法檢測上調(diào)以及下調(diào)miR-664b-3p后TLE1的蛋白水平的變化情況。4.采用q RT-PCR技術(shù)檢測TLE1在72例LSCC患者癌組織及其對應的臨近正常組織中的表達情況。5.應用Pearson相關(guān)統(tǒng)計方法對72例喉癌患者癌組織中TLE1以及miR-664b-3p的相對表達量進行相關(guān)性分析。6.構(gòu)建pmir GLO-TLE1-WT以及pmir GLO-TLE1-MUT型質(zhì)粒,在TU177細胞及293T細胞中,應用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸LE1以及miR-664b-3p兩者之間的結(jié)合關(guān)系進行驗證。7.通過q RT-PCR的技術(shù)方法驗證上調(diào)RASSF8-AS1后TLE1在LSCC細胞系TU686及TU177細胞中的表達量的變化。8.分別轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1以及pc DNA3.1到LSCC細胞系TU686和TU177中,采用western blot的技術(shù)方法檢測上調(diào)RASSF8-AS1后TLE1的蛋白水平的變化情況。9.采用Transwell小室遷移、侵襲實驗以及MTS實驗、克隆形成實驗檢測LSCC細胞系TU686及TU77中轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1,及共轉(zhuǎn)染sh-TLE1+pc DNA3.1-RASSF8-AS1后對LSCC細胞遷移、侵襲以及增殖能力的影響。結(jié)果:1.通過生物信息學預測顯示miR-664b-3p與TLE1具有潛在的結(jié)合位點,并分析出其結(jié)合位點。2.q RT-PCR結(jié)果顯示,在LSCC細胞系TU686以及TU177中分別轉(zhuǎn)染miR-664b-3p-mimic及miR-664b-3p-inhibitor后對TLE1的表達量進行比較,發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-664b-3p后與正常對照組相比TLE1的表達明顯下降,而下調(diào)miR-664b-3p后,TLE1的表達明顯增加,且結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。3.Western blot結(jié)果顯示,在LSCC細胞系TU686以及TU177中分別轉(zhuǎn)染miR-664b-3p-mimic及miR-664b-3p-inhibitor后對TLE1的蛋白表達量進行比較,發(fā)現(xiàn)過上調(diào)miR-664b-3p后與正常對照組相比TLE1的蛋白表達水平明顯下降,而下調(diào)miR-664b-3p后TLE1的蛋白量水平明顯增加,且結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。4.TLE1在72例喉鱗狀細胞癌患者癌組織中的表達量顯著低于其相對應的臨近正常組織（t=5.345,P<0.01）。5.Pearson統(tǒng)計分析結(jié)果顯示在72例喉癌患者癌組織中TLE1與miR-664b-3p的相對表達量密切相關(guān),且兩者成負相關(guān)（r=-0.4906,P<0.01）。6.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示在TU177細胞及293T細胞中,與共轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒比較,共轉(zhuǎn)染pmir GLO-TLE1-WT質(zhì)粒及miR-664b-3p-mimic可顯著降低熒光素酶的活性（P<0.01）,與此相反,共轉(zhuǎn)染了pmir GLO-TLE1-WT型質(zhì)粒和miR-664b-3p-inhibitor之后熒光素酶的活性得到了明顯增強（P<0.01）,當對pmir GLO-TLE1-WT進行突變后,各組的熒光素酶活性沒有明顯變化（P>0.05）。7.q RT-PCR結(jié)果顯示:分別pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1到LSCC細胞系TU686及TU177中去,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后可顯著上調(diào)LSCC細胞系TU686及TU177中TLE1的mRNA水平的表達,且結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。8.Western blot結(jié)果顯示:將pc DNA3.1-RASSF8-AS1及pc DNA3.1分別轉(zhuǎn)染到TU686及TU177細胞中去,轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-RASSF8-AS1后可顯著提高LSCC細胞系TU686及TU177中TLE1的蛋白表達水平,且結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。9.在TU686及TU177細胞中,共轉(zhuǎn)染sh-TLE1后部分逆轉(zhuǎn)了pc DNA3.1-RASSF8-AS1對TU686及TU177細胞的遷移、侵襲以及增殖能力的抑制作用。結(jié)論:1.在喉鱗狀細胞癌組織以及細胞中,RASSF8-AS1表達顯著下調(diào),且RASSF8-AS1在癌組織中的表達量與LSCC患者的TNM臨床分期、病理分化程度和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2.過表達RASSF8-AS1可以抑制LSCC細胞的遷移、侵襲以及增殖能力,這提示RASSF8-AS1參與了喉鱗癌的進展過程。3.RASSF8-AS1與miR-664b-3p在LSCC中的表達呈負相關(guān)性,且過表達RASSF8-AS1會減弱miR-664b-3p的促癌作用。4.RASSF8-AS1通過miR-664b-3p調(diào)控TLE1的表達,進而抑制LSCC細胞的體外遷移、侵襲以及增殖的能力。
陳鵬[9]（2021）在《陜西漢族非編碼RNA基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌風險相關(guān)性及MIR17HG與其microRNAs在結(jié)直腸癌中的作用研究》文中指出目的:通過非編碼RNA基因多態(tài)性篩選出陜西漢族結(jié)直腸癌易感人群,篩選與結(jié)直腸癌發(fā)生密切相關(guān)microRNA,并對其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用進行探討,為臨床預防及早期診斷結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。方法:1.設計一項包括514例CRC患者和510例健康對照的病例-對照關(guān)聯(lián)研究,選取9個lnc RNAs基因[MIR137HG、MIR143HG（CARMN）、MIR3142HG、LINC-PINT、MIR124-1HG、MIR675HG（H19）、MIR17HG、MIR497HG和MIR133A1HG]、7個miRNAs基因（MIR577、MIR608、MIR675、MIR192、MIR618、MIR492和MIR423）及GREM1基因的49個SNPs,采用Agena Mass ARRAY基因分型技術(shù),對所篩選的SNPs位點進行基因分型,通過卡方檢驗、logistic回歸分析在遺傳模型和分層分析下這些位點與中國陜西漢族人群CRC發(fā)病風險及臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。并進行單倍型分析及MDR分析尋找預測CRC風險的最佳模型。2.分析MIR17HG及miR-17-92a簇在CRC病例及對照組的組織及血液中的表達。從TCGA和GDC數(shù)據(jù)庫下載腫瘤RNA-seq數(shù)據(jù),分析MIR17HG的mRNA表達。在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載生存數(shù)據(jù)用于生存分析,下載miRNA-seq表達量數(shù)據(jù)用于分析不同疾病分期的差異。從SRA和GEO數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)用于健康人和患者血清及不同臨床分期患者血清中游離miR-17-92a簇的豐度比較。3.納入未經(jīng)過任何治療的陜西漢族病例50例,健康對照50例,用RT-qPCR對其血清中miR-17-92a簇的microRNAs表達進行檢測,用ROC曲線判斷這些microRNAs在診斷結(jié)直腸癌病例中的作用。4.用hsa-miR-18a-5p mimics和hsa-miR-18a-5p inhibitor對結(jié)直腸癌HCT116和SW480進行處理,研究hsa-miR-18a-5p對結(jié)直腸癌細胞的作用。利用shortest path算法分析蛋白互作網(wǎng)絡中各基因與表達差異基因之間的網(wǎng)絡關(guān)系,篩選結(jié)直腸癌的候選關(guān)鍵靶基因并進行初步驗證。結(jié)果:1.rs73376930與增加中國陜西漢族CRC發(fā)病風險相關(guān);而rs7549905、rs7318578、rs633727和rs58658771與降低中國陜西漢族CRC發(fā)病風險相關(guān)。單倍型GA較CA（rs3024270和rs2075744）、單倍型CT較TA（rs4779584和rs58658771）、單倍型AA較AG（rs2293581和rs73376930）均與降低CRC風險相關(guān)。含5個SNPs位點的模型（rs9440302,rs353300,rs1582417,rs157928,rs3024270）為預測CRC最佳模型,其交叉檢驗一致性為9/10,平衡精確性為:0.719,可預測患CRC的風險OR為6.65（95%CI:4.96-8.91）。2.MIR17HG在CRC組織中高表達,在Ⅳ期病例及黑種人中最高。miR-17-92a簇在CRC組織及血清中高表達,hsa-miR-20a-5p表達量最高。3.在陜西漢族結(jié)直腸癌病例血清中hsa-miR-18a-5p和has-miR-92a-1相對表達量高于正常人群。hsa-miR-18a-5p表達量與臨床分期相關(guān)。血清hsa-miR-18a-5p+CEA+AFP診斷早期結(jié)直腸癌的AUC=0.899（95%CI:0.836-0.962,P<0.001）,靈敏度=0.88,特異性=0.738,優(yōu)于單一指標。4.hsa-miR-18a-5p能降低CRC細胞的增殖、克隆形成能力,增加細胞凋亡的發(fā)生。用最短距離算法評估hsa-miR-18a-5p可能的11個靶基因,hsa-miR-18a-5p可能通過靶向LIF起到抑制CRC發(fā)展的作用。結(jié)論:1.非編碼RNA基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌風險相關(guān)。含五個SNPs的模型可以預測CRC的發(fā)病風險。2.MIR17HG與結(jié)直腸癌發(fā)生密切相關(guān)。MIR17HG及其microRNAs在CRC組織中高表達,表達量與臨床分期及種族相關(guān)。miR-17-92a簇在CRC血清中高表達。3.在陜西漢族CRC血清中hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-92a-3p表達量增加,hsa-miR-18a-5p+CEA+AFP在診斷早期結(jié)直腸癌中具有優(yōu)越性。4.hsa-miR-18a-5p的高表達能降低結(jié)直腸癌細胞的增殖、克隆形成能力,促進細胞凋亡的發(fā)生。
盛曉麗[10]（2021）在《HTR7致喉鱗狀細胞癌患者不良預后的相關(guān)機制研究》文中研究指明研究目的喉鱗狀細胞癌在我國的發(fā)病率仍較高,致殘率高,嚴重影響了患者的生存治療和生命。目前仍需要有效并且特異性高的生物標志物以提高早期診斷。雖然近幾年來靶向藥物在腫瘤等疾病的治療中的作用研究較多,但尚缺乏有效治療喉癌的靶向藥物。G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是目前研究最多的藥物靶點,GPCRs是否可能作為頭頸鱗癌基因治療的藥物靶點目前尚未見研究涉及。關(guān)于GPCRs與在喉癌腫瘤組織中的表達水平如何,以及GPCRs是否可以調(diào)控喉癌細胞的生物學行為及其機制,目前尚未見文獻報道。本研究是基于TCGA數(shù)據(jù)庫中喉癌數(shù)據(jù)文件的分析發(fā)現(xiàn)5羥色胺受體7（HTR7）,GPCRs家族的一員,在喉鱗狀細胞癌腫瘤組織中表達明顯增高。通過系列實驗研究,擬分析喉鱗狀細胞癌標本中HTR7是否呈現(xiàn)表達異常,以及其表達水平是否與喉癌患者的預后相關(guān),探討HTR7在喉鱗狀細胞癌細胞生物學行為中是否發(fā)揮作用及可能的調(diào)控機制,從而為喉癌的早期診斷以及靶向治療提供實驗室依據(jù)。研究方法1.隨機選取我科喉鱗狀細胞癌標本庫中的8對新鮮喉癌及癌旁組織,進行q-PCR和Western blot實驗分析HTR7的表達情況;對113名喉鱗狀細胞癌患者的組織標本進行免疫組化染色分析HTR7蛋白在喉癌組織標本中的表達情況,并將免疫組化染色結(jié)果與患者的預后進行相關(guān)性分析。2.構(gòu)建過表達HTR7和敲減HTR7表達的細胞,進行MTT實驗、平板克隆形成實驗、BrdU增殖實驗、soft agar assay實驗及裸鼠成瘤模型實驗,分析HTR7表達水平不同的情況下喉癌細胞的生物學行為的變化。3.我們通過GSEA分析發(fā)現(xiàn),HTR7表達水平與PI3K/Akt信號通路的下游蛋白表達正相關(guān)。于是行FOXO熒光素酶報告基因?qū)嶒?了解HTR7過表達是否可以激活PI3K/Akt通路;將喉癌細胞株進行HTR7過表達或敲減,進行q-PCR及Western blot實驗,研究PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的變化;在HTR7過表達的細胞株中抑制PI3K/Akt通路,觀察細胞的生物學行為變化。結(jié)果1.使用8對新鮮喉癌組織及癌旁正常組織進行q-PCR和Western blot實驗,發(fā)現(xiàn)喉癌組織中HTR7 mRNA和蛋白水平均表達增高。使用113對喉癌患者腫瘤標本及癌旁正常組織進行免疫組化,發(fā)現(xiàn)喉癌組織較癌旁正常組織的HTR7表達明顯增高,對喉癌組織中HTR7的表達情況與患者的預后進行生存分析發(fā)現(xiàn),HTR7高表達的患者較低表達的患者生存時間明顯縮短,單因素和多因素COX回歸分析提示喉癌組織中HTR7高表達是導致喉癌患者不良預后的獨立影響因素。2.MTT實驗、平板克隆形成實驗、BrdU增殖實驗、soft agar assay實驗表明,HTR7過表達可以促進喉癌細胞的增殖生長,敲減HTR7的表達可以抑制喉癌細胞的增殖;裸鼠成瘤模型實驗顯示,HTR7過表達的細胞株在裸鼠內(nèi)成瘤速度快、瘤體體積較大,而敲減HTR7的細胞株在裸鼠內(nèi)成瘤速度較慢、瘤體體積較小。3.FOXO熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)HTR7高表達可以激活PI3K/Akt信號通路,通過細胞實驗發(fā)現(xiàn),HTR7過表達促進Akt的磷酸化,可以增加P13K/Akt信號通路的下游靶基因 BCL2L1、BCL2A1、BIRC5、BCL2、XIAP、CCNE2、CCND2、CDK2、CDK4和BAD的表達;通過平板克隆實驗和soft agar assay實驗,發(fā)現(xiàn)HTR7過表達的細胞株中通過抑制/干擾Akt的表達能夠抑制PI3K/Akt通路活性,能夠抑制喉癌細胞的增殖和生長。結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)HTR7在喉癌組織中高表達,HTR7高表達與喉癌患者的不良預后相關(guān),HTR7促進喉癌細胞的增殖和生長是可能是通過激活PI3K/Akt信號通路實現(xiàn)的。因此HTR7有可能作為預測喉癌患者預后的標志物,并且有可能成為喉癌基因靶向治療的藥物靶點。
二、頭頸部鱗狀細胞癌DNA含量與臨床生物學行為的關(guān)系（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細分析其設計過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關(guān)系。
文獻研究法：通過調(diào)查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學理論和實踐的需要提出設計。
定性分析法：對研究對象進行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。
跨學科研究法：運用多學科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。
功能分析法：這是社會科學用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、頭頸部鱗狀細胞癌DNA含量與臨床生物學行為的關(guān)系（論文提綱范文）
（1）犬尿氨酸對口腔鱗癌腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞募集及分化的調(diào)節(jié)作用（論文提綱范文）
| 英文縮略詞及說明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 口腔鱗癌組織與血漿樣本的代謝組學分析 |
| 引言 |
| 1 實驗對象 |
| 2 實驗步驟 |
| 3 實驗結(jié)果 |
| 4 結(jié)論 |
| 5 討論 |
| 第二部分 色氨酸代謝產(chǎn)物對口腔鱗癌細胞增殖和遷移的影響 |
| 引言 |
| 1 實驗對象 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結(jié)果 |
| 4 結(jié)論 |
| 5 討論 |
| 第三部分 犬尿氨酸對巨噬細胞募集和分化的影響 |
| 引言 |
| 1 實驗對象 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結(jié)果 |
| 4 結(jié)論 |
| 5 討論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻 |
| 綜述 代謝物對頭頸部腫瘤的腫瘤微環(huán)境的調(diào)控以及代謝組學的相關(guān)研究進展 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
（2）STING對宮頸癌增殖、遷移和侵襲能力的作用及機制的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略詞表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 綜述 cGAS-STING信號在癌癥免疫和免疫治療中的作用 |
| 2.1 CGAS-STING信號通路抗腫瘤機制 |
| 2.1.1 細胞質(zhì)DNA如何積聚? |
| 2.1.2 cGAS-STING通路消除癌細胞機制 |
| 2.2 CGAS-STING通路在治療中的應用 |
| 2.2.1 單藥治療 |
| 2.2.2 STING激動劑聯(lián)合療法 |
| 2.3 STING免疫療法:一把雙刃劍 |
| 2.4 結(jié)論 |
| 第3章 STING對宮頸癌增殖、遷移、侵襲能力影響的體外實驗 |
| 3.1 實驗材料 |
| 3.1.1 主要儀器設備 |
| 3.1.2 主要試劑 |
| 3.1.3 主要試劑配制 |
| 3.2 實驗流程 |
| 3.3 實驗方法 |
| 3.3.1 細胞來源和細胞培養(yǎng)條件 |
| 3.3.2 細胞復蘇 |
| 3.3.3 細胞換液 |
| 3.3.4 細胞傳代 |
| 3.3.5 細胞凍存 |
| 3.3.6 細胞計數(shù) |
| 3.3.7 Trizol法提取HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki細胞的RNA |
| 3.3.8 RNA逆轉(zhuǎn)錄 |
| 3.3.9 定量實時聚合酶鏈式反應(real-time quantitativepolymerase chain reaction, qRT-PCR) |
| 3.3.10 HaCaT、H8、HeLa、SiHa、C33A、CaSki細胞的蛋白樣品制備 |
| 3.3.11 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(Western Blot,WB) |
| 3.3.12 短發(fā)夾RNA慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)導 |
| 3.3.13 過表達慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 |
| 3.3.14 Trizol法提取vector HeLa、shSTING-Hela、vectorSiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STING細胞的RNA |
| 3.3.15 RNA逆轉(zhuǎn)錄 |
| 3.3.16 定量實時聚合酶鏈式反應 |
| 3.3.17 vector HeLa、shSTING-Hela、vector SiHa、shSTING-SiHa、vector C33A、C33A-STNG細胞的蛋白樣品制備 |
| 3.3.18 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 |
| 3.3.19 宮頸癌細胞增殖實驗 |
| 3.3.20 宮頸癌細胞平板克隆實驗 |
| 3.3.21 宮頸癌細胞劃痕實驗 |
| 3.3.22 宮頸癌細胞Transwell小室遷移實驗 |
| 3.3.23 宮頸癌細胞侵襲實驗 |
| 3.3.24 統(tǒng)計分析 |
| 3.4 實驗結(jié)果 |
| 3.4.1 STING在人角質(zhì)形成細胞、宮頸上皮永生化細胞以及四種宮頸癌細胞系中的表達 |
| 3.4.2 穩(wěn)定的沉默STING細胞系、STING過表達細胞系的鑒定 |
| 3.4.3 STING沉默或過表達對宮頸癌細胞系細胞增殖和克隆形成的影響 |
| 3.4.4 STING沉默或過表達對宮頸癌細胞遷移能力的影響 |
| 3.4.5 STING沉默或過表達對宮頸癌細胞侵襲能力的影響 |
| 3.5 討論 |
| 3.6 小結(jié) |
| 第4章 STING調(diào)控宮頸癌細胞生物學行為信號通路的探索 |
| 4.1 實驗材料 |
| 4.1.1 實驗設備 |
| 4.1.2 實驗試劑 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 實驗流程 |
| 4.3 實驗方法 |
| 4.3.1 細胞培養(yǎng)、凍存、傳代、計數(shù) |
| 4.3.2 總蛋白提取和免疫印跡實驗 |
| 4.3.3 核蛋白提取和免疫印跡實驗 |
| 4.3.4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,co-IP)和免疫印跡實驗 |
| 4.3.5 細胞培養(yǎng)、凍存、傳代、計數(shù) |
| 4.3.6 總蛋白提取和免疫印跡實驗 |
| 4.3.7 CCK8實驗 |
| 4.3.8 平板克隆 |
| 4.3.9 Transwell小室遷移 |
| 4.3.10 Transwell小室侵襲 |
| 4.3.11 統(tǒng)計學方法 |
| 4.4 實驗結(jié)果 |
| 4.4.1 STING對經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的作用 |
| 4.4.2 過表達STING對經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的影響 |
| 4.4.3 STING調(diào)控宮頸癌Wnt/β-catenin信號通路機制探討 |
| 4.4.4 β-catenin通路抑制劑對沉默STING介導的宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲作用的影響(rescue實驗) |
| 4.5 討論 |
| 4.6 小結(jié) |
| 第5章 沉默STING促進宮頸癌細胞增殖的體內(nèi)實驗 |
| 5.1 實驗材料 |
| 5.1.1 實驗設備 |
| 5.1.2 實驗試劑 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.1.4 實驗動物 |
| 5.2 實驗流程 |
| 5.3 實驗方法 |
| 5.3.1 細胞的復蘇、傳代及培養(yǎng) |
| 5.3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 5.3.3 裸鼠體重測量 |
| 5.3.4 裸鼠移植瘤組織大小的測量 |
| 5.3.5 腫瘤組織脫水及包埋 |
| 5.3.6 蘇木精和伊紅染色技術(shù)(Hematoxylin and eosin dyeingtechniques,HE) |
| 5.3.7 免疫組織化學染色技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC) |
| 5.3.8 統(tǒng)計學方法 |
| 5.4 實驗結(jié)果 |
| 5.4.1 沉默STING的宮頸癌細胞移植瘤對裸鼠體重的影響 |
| 5.4.2 沉默STING對裸鼠移植瘤體積的影響 |
| 5.4.3 裸鼠腫瘤組織HE染色結(jié)果 |
| 5.4.4 裸鼠腫瘤組織STING免疫組化染色結(jié)果 |
| 5.4.5 裸鼠腫瘤組織免疫組化Ki67染色結(jié)果 |
| 5.5 討論 |
| 5.6 小結(jié) |
| 第6章 全文結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 作者簡介及在學期間所取得的科研成果 |
| 致謝 |
（3）舌鱗狀細胞癌的circRNAs表達譜及circARNTL2生物學功能研究（論文提綱范文）
| 附錄：英文縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 circARNTL2 在 TSCC 中的差異表達及其臨床病理特征 |
| 1.1 實驗材料 |
| 1.2 實驗方法 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 結(jié)論 |
| 2 circARNTL2 在體外對 TSCC 生物學行為的影響 |
| 2.1 實驗材料 |
| 2.2 實驗方法 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 結(jié)論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻 |
| 綜述 circRNAs 在口腔鱗狀細胞癌中的作用和研究進展 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
（4）NOTCH信號通路異常表達及突變對口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響及分子機制研究（論文提綱范文）
| 附錄 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 NOTCH信號通路異常表達對口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的影響 |
| 1.材料 |
| 1.1 細胞株及培養(yǎng)條件 |
| 1.2 質(zhì)粒 |
| 1.3 主要實驗試劑 |
| 1.4 主要試劑的配制 |
| 1.5 主要實驗儀器 |
| 2 方法 |
| 2.1 口腔鱗狀細胞癌細胞株的培養(yǎng) |
| 2.2 口腔鱗狀細胞癌細胞株SCC-9和WSU-HN30 的轉(zhuǎn)染 |
| 2.3 CCK8 細胞增殖曲線 |
| 2.4 平板克隆實驗 |
| 2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 |
| 2.6 流式細胞儀檢測細胞周期 |
| 2.7 提取總蛋白 |
| 2.8 蛋白免疫印跡(Western Blot) |
| 2.9 細胞總RNA提取和定量 |
| 2.10 實時熒光定量PCR |
| 2.11 細胞劃痕實驗 |
| 2.12 細胞Transwell實驗 |
| 2.13 腫瘤干細胞成球培養(yǎng) |
| 2.14 雙熒光素酶報告質(zhì)粒分析 |
| 2.15 統(tǒng)計分析方法 |
| 3.結(jié)果 |
| 3.1 NOTCH1 表達下調(diào)對野生型口腔鱗狀細胞癌細胞功能的影響 |
| 3.2 NOTCH2 表達下調(diào)對野生型口腔鱗狀細胞癌細胞株細胞功能的影響 |
| 3.3 NOTCH信號通路抑制劑對野生型口腔鱗狀細胞癌細胞腫瘤細胞自我更新能力的影響 |
| 4.討論 |
| 5.小結(jié) |
| 第二章 NOTCH信號通路突變與口腔鱗狀細胞癌的關(guān)聯(lián)研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要試劑 |
| 1.2 主要設備 |
| 1.3 主要試劑配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 口腔鱗狀細胞癌樣本收集 |
| 2.2 外周血樣本收集 |
| 2.3 外周血樣本處理和保存 |
| 2.4 樣本量估計 |
| 2.5 組織DNA提取 |
| 2.6 高通量測序 |
| 2.7 生物信息學分析 |
| 2.8 PCR擴增 |
| 2.9 Sanger測序 |
| 2.10 統(tǒng)計分析方法 |
| 3.結(jié)果 |
| 3.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析頭頸部鱗狀細胞癌中NOTCH信號通路突變情況 |
| 3.2 NOTCH信號通路在口腔鱗狀細胞癌組織中的突變情況 |
| 3.3 NOTCH信號通路突變在口腔鱗狀細胞癌樣本中Sanger測序結(jié)果 |
| 3.4 NOTCH1 基因點突變與口腔鱗狀細胞癌患者臨床資料分析及對NOTCH1 基因表達的影響 |
| 4.討論 |
| 5.小結(jié) |
| 第三章 NOTCH1 定點突變對口腔鱗狀細胞癌細胞功能的影響 |
| 1.材料 |
| 1.1 細胞株及培養(yǎng)條件 |
| 1.2 質(zhì)粒 |
| 1.3 主要實驗試劑 |
| 1.4 主要試劑的配制 |
| 1.5 主要實驗儀器 |
| 2 方法 |
| 2.1 口腔鱗狀細胞癌細胞株的培養(yǎng) |
| 2.2 質(zhì)粒保種 |
| 2.3 質(zhì)粒擴增與抽提 |
| 2.4 定點突變質(zhì)粒構(gòu)建 |
| 2.5 細胞的轉(zhuǎn)染 |
| 2.6 CCK8 細實驗 |
| 2.7 平板克隆實驗 |
| 2.8 提取總蛋白 |
| 2.9 蛋白免疫印跡(Western Blot) |
| 2.10 細胞總RNA提取和定量 |
| 2.11 實時熒光定量PCR |
| 2.12 細胞劃痕實驗 |
| 2.13 細胞Transwell實驗 |
| 2.14 轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶活性檢測 |
| 2.15 Sanger測序 |
| 2.16 統(tǒng)計分析方法 |
| 3.結(jié)果 |
| 3.1 構(gòu)建NOTCH1 定點突變質(zhì)粒 |
| 3.2 NOTCH1 定點突變后對口腔鱗狀細胞癌細胞生物學功能影響 |
| 3.3 NOTCH1 定點突變后對NOTCH信號通路活化的影響 |
| 4.討論 |
| 5.小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 綜述 NOTCH信號通路在頭頸部鱗癌中作用研究進展 |
| 參考文獻 |
| 在讀期間取得的成績 |
| 致謝 |
（5）ANXA1在下咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達及功能相關(guān)性研究（論文提綱范文）
| 英漢縮略語名詞對照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 ANXA1 在下咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的異常表達及臨床意義 |
| 前言 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第二部分 ANXA1 功能相關(guān)性探討 |
| 前言 |
| 1 實驗材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻 |
| 文獻綜述 ANXA1在腫瘤轉(zhuǎn)移中的研究 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 攻讀碩士期間發(fā)表的論文 |
（6）基于微陣列比較基因組雜交技術(shù)對喉鱗癌全基因組染色體拷貝數(shù)變異的整合分析（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文縮略詞對照表 |
| 第1章 緒論 |
| 1.1 Array-CGH的研究進展 |
| 1.1.1 CGH技術(shù)概述 |
| 1.1.2 Array-CGH技術(shù)的發(fā)展 |
| 1.1.3 Array-CGH的基本原理 |
| 1.1.4 Array-CGH的應用 |
| 1.1.5 Array-CGH的優(yōu)勢及局限 |
| 1.1.6 Array-CGH的前景與展望 |
| 1.2 拷貝數(shù)變異(CNVs) |
| 1.2.1 CNVs概述 |
| 1.2.2 CNVs的檢測方法 |
| 1.2.3 CNVs與腫瘤 |
| 1.2.4 CNVs研究展望 |
| 1.3 喉癌的分子遺傳學研究進展 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 喉癌與CNVs |
| 1.3.3 喉癌相關(guān)基因 |
| 1.3.4 展望 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究對象 |
| 2.1.1 研究樣品采集 |
| 2.1.2 臨床信息采集 |
| 2.1.3 研究樣品的保存 |
| 2.2 實驗儀器及試劑 |
| 2.2.1 實驗儀器及耗材 |
| 2.2.2 主要試劑 |
| 2.2.3 試劑配置 |
| 2.3 實驗方法 |
| 2.3.1 喉癌腫瘤組織標本基因組DNA提取 |
| 2.3.2 喉癌基因組DNA質(zhì)量檢驗 |
| 2.3.3 喉癌基因組DNA和對照DNA標記 |
| 2.3.4 Array-CGH樣品雜交 |
| 2.3.5 Array-CGH基因芯片的洗滌 |
| 2.3.6 Array-CGH基因芯片的掃描 |
| 2.3.7 Array-CGH數(shù)據(jù)分析 |
| 2.3.8 GEO數(shù)據(jù)提取 |
| 2.3.9 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)處理 |
| 2.3.10 繪制火山圖和熱圖 |
| 2.3.11 RT-PCR檢測基因表達 |
| 2.3.12 免疫組織化學染色 |
| 2.3.13 統(tǒng)計學分析 |
| 第3章 實驗結(jié)果 |
| 3.1 喉癌DNA微陣列比較基因組雜交分析 |
| 3.1.1 病例資料分析 |
| 3.1.2 Array-CGH結(jié)果分析 |
| 3.1.3 基因組不平衡與臨床病理特征的相關(guān)性 |
| 3.2 基于GEO數(shù)據(jù)庫HNSCC差異表達基因的篩選 |
| 3.2.1 GEO數(shù)據(jù)庫差異表達基因分析 |
| 3.2.2 篩選LSCC相關(guān)候選基因 |
| 3.3 檢測基因在喉癌中的表達及臨床意義 |
| 3.4 免疫組化結(jié)果分析 |
| 3.4.1 PCDH20、NEIL3、SPINK5、CDKN2A在喉癌組織中表達情況 |
| 3.4.2 喉癌組織PCDH20、NEIL3、SPINK5、CDKN2A表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 |
| 3.4.3 DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2 在喉癌組織中表達情況 |
| 3.4.4 喉癌組織DCUN1D1、EIF4G1、IGF2BP2表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 |
| 第4章 討論 |
| 第5章 結(jié)論 |
| 參考文獻 |
| 作者簡介及在讀期間取得的科研成果 |
| 致謝 |
（7）長鏈非編碼RNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌中的表達及功能研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符號說明 |
| 前言 |
| 第一部分 長鏈非編碼RNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌中表達及臨床意義 |
| 材料與方法 |
| 實驗結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 附表 |
| 附圖 |
| 第二部分 長鏈非編碼RNA TRPM2-AS對喉鱗狀細胞癌細胞生物學行為的影響 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 附圖 |
| 第三部分 長鏈非編碼RNA TRPM2-AS與miR-138在喉鱗狀細胞癌細胞中的相互作用 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 附圖 |
| 參考文獻 |
| 綜述 長鏈非編碼RNA及信號通路在喉鱗狀細胞癌中的研究進展 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄 |
| 學位論文評閱及答辯情況表 |
| Paperl: Long non-coding RNA TRPM2-AS promotes cell migration and invasion by serving as a ceRNA of miR- 138 and inducing SOX4-mediated EMT in laryngeal squamous cell carcinoma |
| Paper 2: Research advances of long non-coding RNAs in laryngeal squamous cell carcinoma |
（8）長鏈非編碼RNA RASSF8-AS1競爭性結(jié)合miR-664b-3p調(diào)控TLE1表達影響喉鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文縮寫 |
| 引言 |
| 第一部分 RASSF8-AS1 的篩選及其在喉鱗狀細胞癌中的表達情況 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻 |
| 第二部分 RASSF8-AS1 對喉鱗狀細胞癌細胞生物學功能的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻 |
| 第三部分 RASSF8-AS1 靶向miRNA的選擇、鑒定及miR-664b-3p對喉鱗狀細胞癌細胞生物學功能的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻 |
| 第四部分 miR-664b-3p在喉鱗癌中靶向調(diào)控的mRNA篩選、鑒定以及TLE1 對喉鱗狀細胞癌細胞生物學功能的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻 |
| 結(jié)論 |
| 綜述 長鏈非編碼RNA在頭頸部惡性腫瘤中的研究進展 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（9）陜西漢族非編碼RNA基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌風險相關(guān)性及MIR17HG與其microRNAs在結(jié)直腸癌中的作用研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略語對照表 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 結(jié)直腸癌(CRC)簡述 |
| 1.2 microRNAs與CRC關(guān)系 |
| 1.3 LncRNAs與CRC關(guān)系 |
| 1.4 結(jié)直腸癌的早篩 |
| 1.4.1 目前用于平均風險人群的CRC篩查主要包括以下方法 |
| 1.4.2 microRNAs可作為腫瘤的早期篩查指標 |
| 1.5 MIR17HG及其在結(jié)直腸癌中的作用 |
| 1.6 本課題的研究目標和意義 |
| 第二章 LncRNAs,miRNAs及GREM1基因多態(tài)性與中國陜西漢族結(jié)直腸癌風險的相關(guān)性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 研究對象 |
| 2.2.2 主要儀器及試劑 |
| 2.2.3 實驗方法 |
| 2.2.4 統(tǒng)計分析方法 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.3.1 參與者的基本特征 |
| 2.3.2 HWE檢驗結(jié)果 |
| 2.3.3 等位基因分布及與CRC風險的關(guān)系 |
| 2.3.4 遺傳模型下SNPs與CRC風險的關(guān)系 |
| 2.3.5 SNPs與CRC風險相關(guān)分層分析 |
| 2.3.6 SNPs與CRC臨床特征相關(guān)性 |
| 2.3.7 單倍型與CRC風險的關(guān)系 |
| 2.3.8 多個SNPs交互作用的MDR分析 |
| 2.4 討論 |
| 2.4.1 MIR137HG和MIR577多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.2 MIR143HG多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.3 MIR3142HG多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.4 LINC-PINT多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.5 MIR124-1HG多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.6 MIR608多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.7 H19和MIR675多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.8 MIR192、MIR618和MIR492多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.9 MIR17HG多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.10 GREM1 多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.4.11 MIR497HG、MIR423和MIR133A1HG多態(tài)性與CRC的關(guān)系 |
| 2.5 結(jié)論 |
| 第三章 MIR17HG及其編碼的micro RNAs在結(jié)直腸癌中的表達及臨床信息關(guān)聯(lián)的生物信息學分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 研究對象 |
| 3.2.2 研究方法 |
| 3.2.3 統(tǒng)計方法 |
| 3.3 研究結(jié)果 |
| 3.3.1 MIR17HG的泛癌分析 |
| 3.3.2 MIR17HG在結(jié)直腸癌中的表達與臨床預后分析 |
| 3.3.3 miR-17-92a簇在結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中的表達及臨床預后分析 |
| 3.3.4 miR-17-92a簇在結(jié)直腸癌病例與健康對照,病例不同分期中血清中的表達及預后分析 |
| 3.4 討論 |
| 3.4.1 miR-17-92a簇在大多數(shù)腫瘤及CRC中高表達 |
| 3.4.2 miR-17-92a簇的microRNAs在大多數(shù)腫瘤及結(jié)直腸癌組織中高表達 |
| 3.4.3 miR-17-92a簇的microRNAs在CRC病例血清中高表達 |
| 3.5 結(jié)論 |
| 第四章 miR-17-92簇在結(jié)直腸癌病例與健康人群血清中的表達分析及診斷作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 研究對象 |
| 4.2.2 主要儀器和試劑 |
| 4.2.3 實驗方法 |
| 4.2.4 統(tǒng)計學方法 |
| 4.3 研究結(jié)果 |
| 4.3.1 研究對象基本特征 |
| 4.3.2 病例組與對照組血清學指標 |
| 4.3.3 血清中microRNA的相對表達量 |
| 4.3.4 CEA、AFP、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-92a-1診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線 |
| 4.3.5 CEA、AFP、hsa-miR-18a-5p聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線 |
| 4.3.6 各指標與結(jié)直腸癌分期的相關(guān)性分析 |
| 4.3.7 hsa-miR-18a-5p、CEA對早期結(jié)直腸的診斷的ROC曲線 |
| 4.3.8 各指標區(qū)分早晚結(jié)直腸癌的ROC曲線 |
| 4.4 討論 |
| 4.4.1 糖蛋白癌胚抗原和甲胎蛋白 |
| 4.4.2 miR-17-92a簇作為血清腫瘤診斷標志物的應用 |
| 4.4.3 hsa-miR-18a-5p作為血清腫瘤診斷標志物的應用 |
| 4.5 結(jié)論 |
| 第五章 hsa-miR-18a-5p對結(jié)直腸癌細胞生物學功能的影響及候選靶基因分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.2.1 實驗材料 |
| 5.2.2 主要儀器及試劑 |
| 5.2.3 實驗方法 |
| 5.2.4 統(tǒng)計方法 |
| 5.3 結(jié)果 |
| 5.3.1 hsa-miR-18a-5p在結(jié)直腸癌細胞系中表達上調(diào) |
| 5.3.2 結(jié)直腸癌細胞中hsa-miR-18a-5p干預效果 |
| 5.3.3 hsa-miR-18a-5p差異表達對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響 |
| 5.3.4 hsa-miR-18a-5p差異表達對結(jié)直腸癌細胞克隆形成能力的影響 |
| 5.3.5 hsa-miR-18a-5p差異表達對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響 |
| 5.3.6 結(jié)直腸癌表達差異基因及功能注釋 |
| 5.3.7 hsa-miR-18a-5p靶基因及其預后分析 |
| 5.3.8 關(guān)鍵靶基因分析 |
| 5.3.9 靶基因LIF與hsa-miR-18a-5p結(jié)合位點預測 |
| 5.3.10 Western Blot檢測LIF與hsa-miR-18a-5p表達關(guān)系 |
| 5.3.11 LIF功能預測 |
| 5.4 討論 |
| 5.4.1 hsa-miR-18a-5p促進腫瘤發(fā)生發(fā)展 |
| 5.4.2 hsa-miR-18a-5p抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展 |
| 5.4.3 在不同發(fā)育階段和不同組織學亞型的同一器官的癌癥中已觀察到hsa-miR-18a的相反作用 |
| 5.4.4 hsa-miR-18a-5p抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展 |
| 5.5 結(jié)論 |
| 結(jié)語和展望 |
| 參考文獻 |
| 附錄1:基因與泛癌的相關(guān)性 |
| 附錄2:HCT116細胞鑒定證明 |
| 致謝 |
| 攻讀博士期間的科研成果 |
| 個人簡歷 |
（10）HTR7致喉鱗狀細胞癌患者不良預后的相關(guān)機制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 背景與前言 |
| 第一章 喉鱗癌組織標本中HTR7的表達情況及與患者預后的相關(guān)性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第二章 HTR7調(diào)控喉癌細胞增殖的體內(nèi)及體外實驗研究 |
| 1 材料與方法 |
| 2.結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第三章 HTR7調(diào)控喉癌細胞增殖的機制研究 |
| 1.主要儀器和試劑 |
| 2.方法 |
| 3.結(jié)果 |
| 4.討論 |
| 本文結(jié)論 |
| 本文不足及展望 |
| 參考文獻 |
| 附錄1 中英文對照縮略詞 |
| 附錄2 實驗所用儀器和器皿 |
| 附錄3 實驗所用試劑和耗材 |
| 附錄4 主要溶液配制 |
| 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文及主持的科研項目 |
| 致謝 |
四、頭頸部鱗狀細胞癌DNA含量與臨床生物學行為的關(guān)系（論文參考文獻）
- [1]犬尿氨酸對口腔鱗癌腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞募集及分化的調(diào)節(jié)作用[D]. 周俊林. 福建醫(yī)科大學, 2021(02)
- [2]STING對宮頸癌增殖、遷移和侵襲能力的作用及機制的研究[D]. 杜華珊. 吉林大學, 2021(01)
- [3]舌鱗狀細胞癌的circRNAs表達譜及circARNTL2生物學功能研究[D]. 揭穎慧. 福建醫(yī)科大學, 2021(02)
- [4]NOTCH信號通路異常表達及突變對口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響及分子機制研究[D]. 甘瑞環(huán). 福建醫(yī)科大學, 2021
- [5]ANXA1在下咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達及功能相關(guān)性研究[D]. 李磊. 重慶醫(yī)科大學, 2021(01)
- [6]基于微陣列比較基因組雜交技術(shù)對喉鱗癌全基因組染色體拷貝數(shù)變異的整合分析[D]. 李東杰. 吉林大學, 2021(01)
- [7]長鏈非編碼RNA TRPM2-AS在喉鱗狀細胞癌中的表達及功能研究[D]. 王寧. 山東大學, 2021(11)
- [8]長鏈非編碼RNA RASSF8-AS1競爭性結(jié)合miR-664b-3p調(diào)控TLE1表達影響喉鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程[D]. 劉濤. 河北醫(yī)科大學, 2021(02)
- [9]陜西漢族非編碼RNA基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌風險相關(guān)性及MIR17HG與其microRNAs在結(jié)直腸癌中的作用研究[D]. 陳鵬. 西北大學, 2021(12)
- [10]HTR7致喉鱗狀細胞癌患者不良預后的相關(guān)機制研究[D]. 盛曉麗. 南方醫(yī)科大學, 2021(02)
標簽：鱗狀細胞癌論文; 細胞系論文; 細胞增殖論文; 基因合成論文; 細胞轉(zhuǎn)染論文;