一、應(yīng)用序列培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)鼠囊胚的效果觀察（論文文獻(xiàn)綜述）
朱純宇[1]（2021）在《甘草素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎氧化損傷影響的研究》文中認(rèn)為隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)哺乳動(dòng)物體外受精及胚胎體外發(fā)育研究的日益深入,動(dòng)物生物技術(shù)也開始備受關(guān)注。體外胚胎培養(yǎng)非常重要,然而,在體外胚胎生產(chǎn)與體內(nèi)相比更加困難。在體外胚胎生產(chǎn)過(guò)程中,容易受到各種因素影響并產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS）,破壞ROS平衡,從而使胚胎發(fā)生氧化損傷,氧化損傷影響胚胎發(fā)育,最終導(dǎo)致胚胎凋亡。氧化損傷是影響胚胎體外發(fā)育的關(guān)鍵因素,因此減少胚胎體外發(fā)育中的氧化損傷對(duì)研究胚胎體外發(fā)育機(jī)制和動(dòng)物胚胎工程具有重大意義。改善和優(yōu)化體外培養(yǎng)體系將會(huì)有效促進(jìn)體外優(yōu)質(zhì)胚胎的生產(chǎn),同時(shí)可以更好地貢獻(xiàn)于胚胎生物工程技術(shù)和人類疾病動(dòng)物模型上的應(yīng)用。本論文旨在探究抗氧化劑甘草素（Liquiritigenin,LQ）對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎氧化損傷的影響,從抗氧化角度,闡明中藥LQ在哺乳動(dòng)物早期胚胎體外培養(yǎng)上的潛在機(jī)制,并為進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和研究思路。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)四個(gè)試驗(yàn)組,即對(duì)照組（KSOM）、LQ處理組（LQ+KSOM）、H2O2處理組（H2O2+KSOM）、H2O2+LQ處理組（H2O2+LQ+KSOM）,利用0、10、20、30、40、50μmol/L的甘草素處理昆明小白鼠的早期胚胎,比較不同試驗(yàn)組2-細(xì)胞率、4-細(xì)胞率和囊胚率,篩選出最適甘草素的濃度。收集上述四個(gè)試驗(yàn)組昆明小白鼠囊胚,利用DCFH-DA檢測(cè)小鼠囊胚內(nèi)ROS水平,利用CMF2HC檢測(cè)小鼠囊胚內(nèi)GSH水平,利用JC-1熒光染色法檢測(cè)小鼠囊胚線粒體膜電位水平,最后對(duì)抗氧化酶相關(guān)基因（SOD1、CAT、GPx-1）、凋亡相關(guān)基因（BCL-2、Bax、Fas、Fas L、Caspase-3）、全能性相關(guān)基因（Oct-4）進(jìn)行q RT-PCR反應(yīng),檢測(cè)m RNA表達(dá)水平,以此來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)LQ對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎氧化損傷的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下:1、20μmol/L的LQ處理組2-細(xì)胞發(fā)育率、4-細(xì)胞發(fā)育率、囊胚發(fā)育率（P<0.05）均高于其他濃度組,因此在小鼠體外胚胎培養(yǎng)的最適濃度為20μmol/L。2、H2O2處理組的ROS水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05）,極顯著高于LQ處理組（P<0.01）,但添加LQ以后,LQ降低了H2O2誘導(dǎo)的小鼠囊胚內(nèi)ROS水平,與對(duì)照組水平相似。3、H2O2處理組的GSH水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）,極顯著低于LQ處理組（P<0.01）,但添加LQ以后,LQ升高了H2O2誘導(dǎo)的小鼠囊胚內(nèi)GSH水平,與對(duì)照組水平相似。4、H2O2+LQ處理組比H2O2處理組顯著增加線粒體膜電位（P<0.05）,并抑制其凋亡。5、添加LQ可以上調(diào)抗氧化酶相關(guān)基因SOD1、CAT、GP1的m RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,增強(qiáng)抗氧化作用。6、添加LQ可以上調(diào)抗凋亡基因BCL-2的表達(dá)水平,下調(diào)促凋亡相關(guān)基因Bax、Fas、Fas L、Caspase-3的表達(dá)水平,減少胚胎凋亡。7、添加LQ可以提高全能性基因Oct-4的m RNA表達(dá)水平,促進(jìn)胚胎發(fā)育。綜上所述,在體外培養(yǎng)小鼠胚胎過(guò)程中添加20μmo L/L的LQ,有效降低了H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠胚胎的ROS水平、提高了GSH水平和線粒體膜電位水平。從分子角度,LQ調(diào)節(jié)了抗氧化酶相關(guān)基因、凋亡相關(guān)基因和全能性相關(guān)基因,從而有效緩解了H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎的氧化損傷,對(duì)小鼠體外優(yōu)質(zhì)胚胎生產(chǎn)具有一定促進(jìn)作用。
劉默凝[2]（2021）在《烏骨綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立》文中指出多能干細(xì)胞（Pluripotent stem cells,PSCs）在成年個(gè)體中具有向所有細(xì)胞類型分化的潛力,具有無(wú)限的自我更新能力。哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞通常被分為三種類型:胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells,ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）和成體多能干細(xì)胞。誘導(dǎo)并建立烏骨綿羊iPSCs可為摸索綿羊ESCs體外培養(yǎng)條件奠定科學(xué)基礎(chǔ)。在家畜中,只有豬獲得了不依賴外源基因的iPSCs,牛、山羊、綿羊暫未見相關(guān)報(bào)道,對(duì)于家畜iPSCs的誘導(dǎo)還需進(jìn)一步深入探索。本實(shí)驗(yàn)首先建立烏骨綿羊體細(xì)胞耳成纖維細(xì)胞系,使用不同轉(zhuǎn)錄因子體系對(duì)烏骨綿羊體細(xì)胞進(jìn)行重編程,嘗試獲得具有強(qiáng)發(fā)育潛能或者定向發(fā)育潛能的綿羊iPSCs。隨后對(duì)獲得的烏骨綿羊iPSCs從細(xì)胞形態(tài)、核型、內(nèi)源性多能基因表達(dá)、體內(nèi)外三胚層分化能力以及發(fā)育潛能等方面進(jìn)行研究,結(jié)果如下:（1）本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織塊培養(yǎng)法從出生后15日齡的烏骨綿羊耳部皮膚成功分離雌、雄性兩個(gè)烏骨綿羊成纖維細(xì)胞系,獲得的細(xì)胞系核型正常（2n=54）、生長(zhǎng)曲線符合正常細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律（S型）、無(wú)支原體污染,可作為誘導(dǎo)烏骨綿羊iPSCs的起始細(xì)胞系。（2）以piggyBac+Tet-on載體為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)并構(gòu)建PB-TRE-sLargeT（SV40 Large T）、PB-TRE-hTERT和PB-TRE-sLhT（sLargeT和hTERT）三個(gè)表達(dá)載體,并通過(guò)電轉(zhuǎn)染的方法整合至烏骨綿羊成纖維細(xì)胞基因組,在添加1.0μg/m L Doxycycline的條件下成功表達(dá)相應(yīng)外源基因,證明三個(gè)載體可用于后續(xù)烏骨綿羊iPSCs的誘導(dǎo)。（3）X8（b OSMK+pNhL+sLhT）誘導(dǎo)體系、B9-LT（b OSMK+pNhL+hRL+sLargeT）誘導(dǎo)體系和10a（b OSMK+pNhL+hRL+sLhT）誘導(dǎo)體系均可誘導(dǎo)雄性烏骨綿羊成體細(xì)胞重編程,并且SV40 Large T可提高piggyBac+TET-on載體誘導(dǎo)的烏骨綿羊iPSCs重編程效率;本實(shí)驗(yàn)共建立了344個(gè)細(xì)胞克隆形態(tài)類似小鼠或人PSCs的烏骨綿羊iPSCs細(xì)胞系,其中X8誘導(dǎo)體系121個(gè)、B9-LT誘導(dǎo)體系134個(gè)、10a誘導(dǎo)體系89個(gè);由X8誘導(dǎo)體系獲得內(nèi)源性O(shè)CT4激活程度最高的細(xì)胞系:X8-4,命名為:siPSC-4。（4）本實(shí)驗(yàn)建立的烏骨綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系siPSC-4可穩(wěn)定傳代49代,核型正常（2n=54,31/40,77.5%）,內(nèi)源性O(shè)CT4表達(dá)穩(wěn)定,免疫熒光檢測(cè)表達(dá)多能性基因OCT4、SOX2、NANOG和REX1,具有體外三胚層的分化能力并可在體內(nèi)形成具有中、內(nèi)胚層分化的畸胎瘤;此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,STO飼養(yǎng)層細(xì)胞有助于siPSC-4內(nèi)源基因OCT4的持續(xù)表達(dá),在Feeder Free培養(yǎng)條件下,siPSC-4內(nèi)源OCT4的表達(dá)量下降;另外小鼠和人類na（?）vePSCs的干細(xì)胞培養(yǎng)液2i、t2i、4i、5i以及小鼠拓展多功能干細(xì)胞（Expanded potential pluripotent stem cells,EPSCs）培養(yǎng)液不能維持siPSC-4的正常生長(zhǎng),最終細(xì)胞全部凋亡;（5）本實(shí)驗(yàn)建立的siPSC-4可參與小鼠和綿羊早期胚胎的發(fā)育,在15%（3/20）小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner cell mass,ICM）、26%（6/24）綿羊囊胚ICM中可檢測(cè)到td-tomato標(biāo)記的siPSC-4細(xì)胞;本研究首次使用piggyBac+TET-on轉(zhuǎn)座系統(tǒng)表達(dá)外源轉(zhuǎn)錄因子（bovine OCT4、SOX2、KLF4、c MYC,porcine NANOG,human LIN28,SV40 Large T和human TERT）將雄性烏骨綿羊成體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。獲得表達(dá)多能基因、具備體外三胚層分化能力的烏骨綿羊iPSCs,為進(jìn)一步研究綿羊全能胚胎干細(xì)胞的建系提供了優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)材料。
段乳俠[3]（2021）在《小鼠囊胚微囊泡誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究》文中提出研究背景微囊泡（Microvesicles,MV）是細(xì)胞釋放的直徑100-1000 nm的脂質(zhì)雙分子膜性囊泡,它們選擇性地包裝源細(xì)胞的多種生物活性物質(zhì),如脂質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、特異性及非特異性蛋白、DNA、m RNA、microRNA、lnc RNA、circ RNA等[1],介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)的傳遞。近來(lái)研究表明,囊胚能夠分泌微囊泡且作用于受體細(xì)胞,改變受體細(xì)胞功能和行為[2]。在哺乳動(dòng)物中,妊娠的建立需要通過(guò)胚胎發(fā)出懷孕識(shí)別信號(hào),然后胚胎植入和胎盤形成[3]。胚胎植入是囊胚與母體子宮內(nèi)膜相互“對(duì)話”的結(jié)果,囊胚在原癌基因、粘附分子等的調(diào)控下有序侵襲母體子宮內(nèi)膜,在此過(guò)程中,子宮內(nèi)膜在各種細(xì)胞因子、雌激素、孕激素和粘附因子組成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的精確調(diào)控下,產(chǎn)生對(duì)胚胎的容受性[4]。在此期間,子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生了明顯的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化,以適應(yīng)胚胎的著床。其主要特征是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）,即上皮細(xì)胞首先失去極性和細(xì)胞間黏附,然后獲得侵襲和遷移能力,最終轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型[4]。細(xì)胞間的交流傳統(tǒng)上認(rèn)為是通過(guò)直接細(xì)胞間接觸或通過(guò)細(xì)胞分泌的信號(hào)分子傳遞信息進(jìn)行。近來(lái)研究顯示,MV在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移也是一種重要細(xì)胞通訊方式[5],且微囊泡的信使功能主要依賴來(lái)源細(xì)胞的表型[6]。因此,我們推測(cè),囊胚微囊泡參與囊胚與子宮內(nèi)膜細(xì)胞對(duì)話,且與子宮內(nèi)膜上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能存在一定聯(lián)系。因此,本課題采用孕3.5天BABL/C小鼠囊胚和子宮內(nèi)膜原代細(xì)胞為材料,建立囊胚微囊泡與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)體系,分析植入前囊胚M(jìn)V對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。驗(yàn)證囊胚微囊泡誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可能性,為胚胎植入過(guò)程中MV通訊提供依據(jù)。研究目的1.建立一種小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞原代分離和純化的優(yōu)化方法。2.驗(yàn)證小鼠囊胚微囊泡誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象和可能機(jī)制。研究方法1.用不同的酶和不同純化方法處理子宮內(nèi)膜組織得到子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,用形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)鑒定子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞特征性蛋白Cytokeratin-8的表達(dá),以檢測(cè)細(xì)胞純度,建立一種小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞原代分離和純化的優(yōu)化方法。2.取孕3.5天BABL/C孕鼠子宮,收集囊胚,經(jīng)超高速離心結(jié)合密度梯度離心分離純化MV,透射電子顯微鏡觀察其形態(tài),納米顆粒跟蹤儀測(cè)定其尺寸分布,WB分析其特征性蛋白Tsg101與CD63的表達(dá)。建立囊胚M(jìn)V與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（mEEC）共培養(yǎng)模型,ECIS實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)120 h內(nèi)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞侵襲力的動(dòng)態(tài)變化。取12 h、36 h、48 h、60 h、84 h、120 h作為時(shí)間節(jié)點(diǎn),將植入前囊胚M(jìn)V與mEE細(xì)胞共培養(yǎng)組與mEE細(xì)胞對(duì)照組的電阻值進(jìn)行比較分析。q PCR分析MV miRNA組成,通過(guò)對(duì)這些miRNA及其靶基因的生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)了可能對(duì)受體細(xì)胞侵襲有促進(jìn)作用的miRNA和和誘導(dǎo)EMT的可能機(jī)制。3.以PKH26對(duì)囊胚M(jìn)V染色示蹤,建立植入前囊胚M(jìn)V與mEE細(xì)胞的共培養(yǎng)體系,分別設(shè)置0 h、48 h、96 h組別。采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)植入前囊胚M(jìn)V進(jìn)入mEE細(xì)胞的過(guò)程。通過(guò)Western-blot實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mEE細(xì)胞對(duì)E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)。并采用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)E-cadherin、Vimentin蛋白相對(duì)量化分析。研究結(jié)果1.兩種方法中,上皮細(xì)胞分離后成團(tuán),貼壁較慢,將5×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中,24 h后,細(xì)胞可長(zhǎng)至80%爬片,使用胰蛋白酶消化均不可傳代培養(yǎng)。形態(tài)學(xué)及上皮細(xì)胞特異性抗體Cytokeratin-8鑒定為上皮細(xì)胞。流式細(xì)胞儀鑒定Dispase Ⅱ與胰酶消化后差速貼壁純化（方法A）所提上皮細(xì)胞純度為80%,膠原酶I與DNase消化后過(guò)篩純化（方法B）所提上皮細(xì)胞純度為60%,方法A可簡(jiǎn)單、高效地培養(yǎng)出原代上皮細(xì)胞,且具備上皮細(xì)胞生物學(xué)特性,是一種良好的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞原代分離和純化的方法。2.孕3.5天囊胚處理后通過(guò)超高速離心結(jié)合密度梯度離心分離出一種直徑主要約在200 nm的球形微囊泡,并表達(dá)微囊泡特征蛋白Tsg101和CD63。ECIS結(jié)果顯示mEE細(xì)胞與小鼠囊胚M(jìn)V共培養(yǎng)至12 h、24 h、36 h其侵襲力與mEE細(xì)胞對(duì)照組相比較無(wú)明顯差異（P>0.05）,當(dāng)培養(yǎng)至48 h、60 h時(shí),實(shí)驗(yàn)組mEE細(xì)胞的侵襲力明顯高于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）,當(dāng)培養(yǎng)至84 h、120 h時(shí),實(shí)驗(yàn)組mEE細(xì)胞的侵襲力極顯著高于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.01）。PCR結(jié)果顯示植入前囊胚M(jìn)V中有224個(gè)與侵襲相關(guān)的miRNA,占總侵襲相關(guān)miRNA的近一半,80個(gè)miRNA可以促進(jìn)侵襲。盡管抑制侵襲的miRNA在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì),但一些促進(jìn)侵襲的miRNA在MV中已經(jīng)有了高水平的表達(dá),如miR-346、miR-21。提示小鼠囊胚M(jìn)V誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EMT可能是MV攜帶miRNA-21靶向PTEN激活PI3K/AKT通路調(diào)控的。3.植入前囊胚M(jìn)V與mEE細(xì)胞共培養(yǎng)0 h,mEE細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有PKH26標(biāo)記的MV,共培養(yǎng)96 h,有大量的MV聚集在mEE細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞核周邊。且相比于共培養(yǎng)0 h,共培養(yǎng)96 h的mEE細(xì)胞對(duì)PKH26標(biāo)記的MV的攝取率顯著升高（P<0.01）。與此同時(shí),E-caderhin蛋白在mEE細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05,P<0.01）,Vimentin蛋白在mEE細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05,P<0.01）。結(jié)論1.采用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶共同消化子宮組織再經(jīng)差速貼壁純化獲得子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞原代的培養(yǎng)方法可簡(jiǎn)單、高效地培養(yǎng)出原代上皮細(xì)胞,是一種良好的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞原代分離和純化的優(yōu)化方法。2.植入前囊胚M(jìn)V與mEE細(xì)胞共培養(yǎng)體系確定了植入前囊胚M(jìn)V是能夠促進(jìn)mEE細(xì)胞侵襲能力的,且能夠影響mEE細(xì)胞E-caderhin蛋白、Vimentin蛋白的表達(dá)?；谛∈竽遗進(jìn)V含有的miRNA種類以及特性,此結(jié)果提示mEE細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)進(jìn)而向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可能性是與小鼠囊胚攜帶著miRNA-21靶向PTEN激活PI3K/AKT通路調(diào)控的。
賀霞[4]（2020）在《小分子化合物組合重編程小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為胚外內(nèi)胚層樣細(xì)胞》文中提出利用小分子化合物已成功實(shí)現(xiàn)了體細(xì)胞向誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）的轉(zhuǎn)變,經(jīng)證實(shí)在該過(guò)程中產(chǎn)生了一種不可缺少的中間階段細(xì)胞,即化學(xué)誘導(dǎo)胚外內(nèi)胚層樣細(xì)胞（chemical induced extraembryonic endoderm-like,ciXEN）,它們?cè)诨虮磉_(dá)模式和分化潛能上與胚胎源性胚外內(nèi)胚層細(xì)胞（embryo-derived extraembryonic endoderm,eXEN）極為相似。但是ciXEN細(xì)胞的其它生物學(xué)特性和小分子化合物對(duì)ciXEN細(xì)胞體外維持培養(yǎng)的影響還尚未有系統(tǒng)性報(bào)道。本研究以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）為起始細(xì)胞,利用小分子化合物組合,獲得無(wú)外源基因整合的ciXEN細(xì)胞;通過(guò)基因組測(cè)序、qPCR分析、免疫熒光、懸滴培養(yǎng)和代謝模式分析等驗(yàn)證ciXEN細(xì)胞的生物學(xué)特性;此外,通過(guò)去除培養(yǎng)液中的小分子化合物和bFGF驗(yàn)證其對(duì)ciXEN細(xì)胞體外維持培養(yǎng)的影響。1.利用小分子化合物組合重編程MEFs獲得ciXEN細(xì)胞不同數(shù)量起始細(xì)胞經(jīng)小分子化合物組合的持續(xù)處理,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞逐漸聚集成團(tuán)并最終形成邊緣清晰的克隆;對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)以4×104個(gè)MEFs進(jìn)行重編程時(shí)獲得的細(xì)胞克隆數(shù)最多,基質(zhì)膠能將克隆形成率提高31.47±3.86倍,且這些細(xì)胞克隆呈Sox17和Foxa2雙陽(yáng)性。挑取的細(xì)胞克隆重新貼壁后,從其中能長(zhǎng)出大量上皮樣細(xì)胞。小分子化合物組合消除了成纖維細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)而獲得了胚外內(nèi)胚層細(xì)胞基因表達(dá)譜,同時(shí)該過(guò)程伴隨著間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化。ciXEN細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)程中胚外內(nèi)胚層標(biāo)記物、上皮相關(guān)基因、Sox2和Cxcr4表達(dá)量增加,而間質(zhì)標(biāo)記基因和成纖維細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)水平下降,且E-cadherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平與其mRNA表達(dá)水平相一致。此外,該小分子化合物組合作用于小鼠新生成纖維細(xì)胞（mouse neonatal fibroblasts,MNFs）后,細(xì)胞聚集形成了排列松散的克隆,并證實(shí)3×104個(gè)MNFs是最適起始細(xì)胞密度;另外這些MNFs源性克隆亦呈Sox17和Foxa2雙陽(yáng)性。這些結(jié)果表明該小分子化合物組合能實(shí)現(xiàn)MEFs向ciXEN細(xì)胞的重編程,也適用于MNFs向ciXEN細(xì)胞重編程。2.ciXEN細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定對(duì)細(xì)胞克隆中長(zhǎng)出的上皮樣細(xì)胞進(jìn)行體外傳代擴(kuò)增,取第5代ciXEN細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。形態(tài)學(xué)上,低密度時(shí)ciXEN細(xì)胞呈強(qiáng)折光性短梭形而高密度時(shí)ciXEN細(xì)胞則成上皮樣。ciXEN細(xì)胞表面有微絨毛,其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)異于MEFs。對(duì)第5代ciXEN細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)ciXEN細(xì)胞的胚外內(nèi)胚層標(biāo)記基因、上皮標(biāo)記基因、Sox2和Cxcr4的表達(dá)水平明顯高于MEFs而成纖維細(xì)胞標(biāo)記基因和間質(zhì)基因的mRNA水平則顯著低于MEFs,但不表達(dá)Nanog和Oct4。且ciXEN細(xì)胞中E-cadherin、Gata4、Foxa2、Sox17、Sox2和vimentin表達(dá)呈陽(yáng)性而Oct4和Nanog表達(dá)呈陰性,這與western blot結(jié)果相一致。ciXEN細(xì)胞具有強(qiáng)增殖能力,能體外擴(kuò)增至少30代并維持細(xì)胞核型穩(wěn)定,低代次和高代次ciXEN細(xì)胞的形態(tài)保持不變。在基因表達(dá)上,它們維持著胚外內(nèi)胚層標(biāo)記物、上皮相關(guān)標(biāo)記基因和Sox2的高水平表達(dá),而不表達(dá)多潛能相關(guān)基因和成纖維細(xì)胞標(biāo)記物。此外,ciXEN細(xì)胞不僅能體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為臟壁內(nèi)胚層,還能自發(fā)分化為外胚層和內(nèi)胚層源性細(xì)胞,尤其是能分化成功能性肝細(xì)胞。對(duì)ciXEN細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深入分析時(shí),發(fā)現(xiàn)ciXEN細(xì)胞的產(chǎn)生過(guò)程涉及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重塑,同時(shí)還伴隨著能量代謝的重塑。然而經(jīng)系列代謝相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)ciXEN細(xì)胞不依賴糖酵解供能,且在小分子化合物組合重編程過(guò)程中添加促進(jìn)糖酵解的PS48并未增加細(xì)胞克隆形成率。上述結(jié)果表明ciXEN細(xì)胞尚未達(dá)到多潛能階段且保留一定間質(zhì)記憶,具有高度增殖能力和向臟壁內(nèi)胚層和功能性肝細(xì)胞分化的可塑性;此外ciXEN細(xì)胞的產(chǎn)生過(guò)程伴隨著能量代謝的重塑,但細(xì)胞的代謝模式并未轉(zhuǎn)變成糖酵解。3.研究小分子化合物和bFGF對(duì)ciXEN細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響去除ciXEN細(xì)胞維持培養(yǎng)液中的小分子化合物和bFGF后,細(xì)胞形態(tài)呈圓形上皮樣,且誘導(dǎo)胚外內(nèi)胚層樣（induced extraembryonic endoderm-like cells,iXEN）細(xì)胞仍維持胚外內(nèi)胚層基因和上皮基因的高表達(dá)而不表達(dá)間質(zhì)基因和成纖維細(xì)胞基因,這與免疫熒光結(jié)果和western blot結(jié)果達(dá)成一致。此外,去除小分子化合物和bFGF后培養(yǎng)的iXEN細(xì)胞仍能向功能性肝細(xì)胞分化。這些結(jié)果表明小分子化合物和bFGF不是ciXEN細(xì)胞體外維持培養(yǎng)所必不可少的成分。
程蕊[5]（2020）在《基于“嫉妒不孕”理論探討心理應(yīng)激對(duì)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及早期胚胎發(fā)育的影響》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的（1）通過(guò)觀察不同程度心理應(yīng)激刺激下雌性小鼠體重、曠場(chǎng)試驗(yàn)及糖水偏好試驗(yàn),證實(shí)心理應(yīng)激小鼠模型制備成功,促排卵收集卵母細(xì)胞,檢測(cè)卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）濃度、超氧化物歧化酶2（SOD2）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）m RNA水平,以研究不同程度心理應(yīng)激對(duì)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響;（2）小鼠體內(nèi)受精,收集受精卵進(jìn)行體外培養(yǎng),通過(guò)檢測(cè)不同程度心理應(yīng)激刺激后小鼠早期胚胎2細(xì)胞率、8細(xì)胞率、囊胚形成率、囊胚孵出率、囊胚分級(jí),以及囊胚凋亡程度,以研究不同程度心理應(yīng)激對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響。基于心理應(yīng)激與中醫(yī)肝郁理論的緊密聯(lián)系,為臨床從肝郁-心理應(yīng)激角度治療女性生殖功能下降提供新思路。方法實(shí)驗(yàn)一心理應(yīng)激對(duì)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的研究選取4～5周齡健康雌性未孕的ICR小鼠80只,隨機(jī)分為4組,即正常組,心理應(yīng)激強(qiáng)、中、弱刺激組,每組20只。正常組不給予任何干預(yù),實(shí)驗(yàn)組按照心理應(yīng)激模型制備方法,給予不同程度且不可預(yù)知性刺激,連續(xù)刺激6周。刺激前后分別記錄各組小鼠的體重;刺激后各組小鼠在曠場(chǎng)中隨機(jī)5分鐘內(nèi)小鼠的靜止時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)總距離、中央活動(dòng)時(shí)間、外周活動(dòng)時(shí)間的變化;以及刺激后各組小鼠的糖水偏好指數(shù),以證實(shí)心理應(yīng)激小鼠模型制備成功。造模成功后,對(duì)小鼠促排卵獲取卵母細(xì)胞,采用化學(xué)熒光法測(cè)定小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS濃度,應(yīng)用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法測(cè)定卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT、GSH-Px三種抗氧化酶m RNA水平,以研究不同程度心理應(yīng)激對(duì)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響。實(shí)驗(yàn)二心理應(yīng)激對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)一心理應(yīng)激小鼠造模成功后,進(jìn)行體內(nèi)受精,次日晨檢陰栓后收集并處理受精卵,顯微鏡下觀察各組小鼠的受精卵數(shù)、2細(xì)胞胚胎數(shù)、8細(xì)胞胚胎數(shù)、囊胚數(shù)及形態(tài)評(píng)分,記錄各組小鼠早期胚胎2細(xì)胞率、8細(xì)胞率、囊胚形成率、囊胚孵出率、囊胚分級(jí),采用原位脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）測(cè)定各組小鼠囊胚的凋亡程度,以研究不同程度心理應(yīng)激對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（<sub>x±s）表示,方差齊時(shí)組間比較采用單因素方差分析（one-way anova）,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)組間比較采用Welch’s anova,組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)。等級(jí)資料組間比較及組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)一1.刺激前后各組小鼠體重的比較刺激前,4組小鼠體重比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;刺激6周后,心理應(yīng)激強(qiáng)、中、弱刺激組小鼠體重均低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中、弱刺激組小鼠體重高于強(qiáng)刺激組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2.刺激6周后各組小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果的比較刺激6周后,心理應(yīng)激強(qiáng)、中、弱刺激組小鼠的靜止時(shí)間和外周活動(dòng)時(shí)間均高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中、弱刺激組小鼠的靜止時(shí)間低于強(qiáng)刺激組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;刺激6周后,心理應(yīng)激強(qiáng)、中、弱刺激組小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、中央活動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)總距離均低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中、弱刺激組小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)總距離高于強(qiáng)刺激組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中刺激組小鼠的中央活動(dòng)時(shí)間高于強(qiáng)刺激組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3.刺激6周后各組小鼠糖水偏好指數(shù)的比較刺激6周后,心理應(yīng)激強(qiáng)、中、弱刺激組小鼠的糖水偏好指數(shù)均低于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4.各組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的比較心理應(yīng)激強(qiáng)、中、弱刺激組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS濃度均高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且隨著刺激強(qiáng)度的增加,小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS濃度升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5.各組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT、GSH-Px表達(dá)水平的比較心理應(yīng)激強(qiáng)、中、弱刺激組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT、GSH-Px表達(dá)水平均低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且隨著刺激強(qiáng)度的增加,小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT、GSH-Px表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)二1.各組小鼠早期胚胎發(fā)育的比較4組小鼠的2細(xì)胞率、8細(xì)胞率和囊胚形成率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩兩比較顯示,心理應(yīng)激強(qiáng)刺激組小鼠的2細(xì)胞率低于正常組,強(qiáng)、中刺激組小鼠的8細(xì)胞率、囊胚形成率均低于正常組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;中、弱刺激組小鼠的2細(xì)胞率、8細(xì)胞率、囊胚形成率均高于強(qiáng)刺激組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;4組小鼠的囊胚孵出率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。2.各組小鼠囊胚分級(jí)結(jié)果的比較4組小鼠的囊胚分級(jí)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。正常組、心理應(yīng)激強(qiáng)、中刺激組小鼠的囊胚均以4級(jí)為主,弱刺激組小鼠的囊胚以2級(jí)和4級(jí)為主。兩兩比較顯示,強(qiáng)、中刺激組小鼠的囊胚分級(jí)與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3.各組小鼠囊胚凋亡程度的比較心理應(yīng)激強(qiáng)、中、弱刺激組小鼠的囊胚凋亡熒光強(qiáng)度均高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且隨著刺激強(qiáng)度的增加,小鼠的囊胚凋亡熒光強(qiáng)度增強(qiáng),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論1.心理應(yīng)激導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,引發(fā)卵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),損傷卵母細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng),降低卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT、GSH-Px三種抗氧化酶的含量,從而損害卵母細(xì)胞功能。2.心理應(yīng)激導(dǎo)致小鼠早期胚胎發(fā)育能力減退,降低小鼠早期胚胎2細(xì)胞率、8細(xì)胞率及囊胚形成率,影響各級(jí)囊胚占比,進(jìn)而影響囊胚發(fā)育進(jìn)程,并增強(qiáng)囊胚凋亡程度,從而使胚胎質(zhì)量下降。3.心理應(yīng)激造成卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,降低早期胚胎發(fā)育潛能,進(jìn)而導(dǎo)致不孕癥的發(fā)生,與中醫(yī)“嫉妒不孕”學(xué)說(shuō)存在共通性。通過(guò)此研究為臨床從肝郁-心理應(yīng)激角度治療女性不孕癥提供新的思路和方法,并為中醫(yī)“情志致病”理論在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式下的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
王旗[6]（2020）在《納米金非侵入性介導(dǎo)外源基因進(jìn)入小鼠早期胚胎細(xì)胞的研究》文中研究表明將特定的外源基因?qū)胝婧思?xì)胞中,并整合到受體細(xì)胞基因組中得到穩(wěn)定表達(dá)的技術(shù),稱為基因?qū)?它是改變生物遺傳性狀的根本途徑。目前,顯微注射是目前使用較為廣泛的基本技術(shù),它的優(yōu)勢(shì)是基因?qū)胄Ч鄬?duì)穩(wěn)定,成功率也比較高。但是,實(shí)現(xiàn)這些優(yōu)點(diǎn)需要熟練的技術(shù)人員和擁有昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器。同時(shí),在顯微鏡下通過(guò)精細(xì)的操作來(lái)避免卵母細(xì)胞的損傷和精確的控制DNA注射量來(lái)確保卵母細(xì)胞的安全都是有相當(dāng)困難的,并且只能夠一個(gè)接一個(gè)的進(jìn)行注射,處理樣品的數(shù)量有限。因此,傳統(tǒng)的將外源基因物質(zhì)轉(zhuǎn)入胚胎細(xì)胞的方法已不能滿足當(dāng)前研究的要求,特別是利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯和RNA干擾進(jìn)行基因沉默等技術(shù)的進(jìn)步,也迫切的需要一種新的方法來(lái)取代傳統(tǒng)的技術(shù)方法。本研究使用聚乙烯亞胺（PEI）包裹的金納米粒子（AuNPs）負(fù)載質(zhì)粒DNA成功的構(gòu)建出了一種行之有效的基因載體系統(tǒng),在盡量減輕胚胎細(xì)胞所受傷害的同時(shí)降低了技術(shù)難度。本研究將小鼠受精卵在含有AuNPs@PEI@DNA載體復(fù)合物（APD）的KSOM培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)至囊胚形成后植入假孕母鼠體內(nèi),從而獲得轉(zhuǎn)基因后代。通過(guò)熒光觀察,證實(shí)了GFP在早期胚胎細(xì)胞中的表達(dá),并且通過(guò)分析基因分型、免疫熒光檢測(cè)和DNA測(cè)序鑒定等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),證明GFP序列確實(shí)整合到了后代個(gè)體的染色體中并得到表達(dá)。此外,TUNEL試驗(yàn)和囊胚細(xì)胞分化分析表明APD對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育具有良好的安全性。這些結(jié)果表明,AuNPs基因載體作為傳統(tǒng)顯微注射的替代技術(shù),無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備和熟練的技術(shù)人員,就可以簡(jiǎn)單有效地將外源基因物質(zhì)導(dǎo)入小鼠早期胚胎細(xì)胞中,將極大地促進(jìn)生命科學(xué)各個(gè)方面的研究。
楊碩[7]（2020）在《TP、ALC和NAC組合處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎氧化損傷的保護(hù)作用》文中提出在體外胚胎培養(yǎng)環(huán)節(jié),易產(chǎn)生過(guò)量的活性氧,過(guò)多的活性氧會(huì)使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,引發(fā)細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究驗(yàn)證三種抗氧化劑茶多酚（TP）、乙酰左旋肉堿（ALC）和N-乙酰-L半胱氨酸（NAC）組合使用,是否通過(guò)Keap1-Nrf2通路,調(diào)節(jié)下游基因表達(dá),對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠體外胚胎產(chǎn)生抗氧化作用,并抑制細(xì)胞凋亡。將TP（5μM）、ALC（10 μM）和NAC（10 μM）最適濃度組合添加到培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)分為四組:對(duì)照組,抗氧化劑組,H2O2處理組,H2O2+抗氧化劑處理組。首先通過(guò)對(duì)上述四組的胚胎相關(guān)指標(biāo)（如2-細(xì)胞發(fā)育率、4-細(xì)胞發(fā)育率和囊胚發(fā)育率）的觀測(cè),來(lái)驗(yàn)證TP、ALC和NAC三種抗氧化劑組合使用對(duì)胚胎早期發(fā)育的影響。收集四組昆明小鼠囊胚,利用DCFHDA測(cè)定上述四組小鼠胚胎囊胚期ROS水平,利用CMF2HC對(duì)上述四組小鼠胚胎囊胚期GSH表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。然后利用Western-Blot手段對(duì)小鼠囊胚期胚胎Keap1-Nrf2通路中相關(guān)蛋白Keap1及Nrf2的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定,及利用RT-qPCR對(duì)Keap1-Nrf2通路下游基因SOD1,GPX1,CAT的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。之后利用JC-1法對(duì)囊胚期胚胎的線粒體膜電位進(jìn)行測(cè)定,用TUNEL法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。并且對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2,Bax,Caspase-3及全能性基因OCT-4的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。得到如下結(jié)果:（1）對(duì)于TP、ALC和NAC組合添加對(duì)氧化損傷小鼠胚胎早期發(fā)育的影響,各處理組之間卵裂率、四細(xì)胞率無(wú)顯著差異,H2O2處理組的囊胚率顯著低于對(duì)照組（P<0.05）,在培養(yǎng)基中添加組合抗氧化劑之后,恢復(fù)到對(duì)照組相似的水平。（2）H2O2處理組的ROS水平顯著高于單獨(dú)添加抗氧化劑組（P<0.05）,GSH水平顯著低于單獨(dú)添加抗氧化劑組（P<0.05）,處理組ROS水平顯著低于其他組（P<0.05）,GSH水平顯著高于其他組（P<0.05）,H2O2+抗氧化劑處理組的ROS和GSH的表達(dá)量恢復(fù)至對(duì)照組的水平。（3）TP、ALC和NAC對(duì)胚胎氧化損傷的保護(hù)作用是通過(guò)激活Keap1-Nrf2通路來(lái)產(chǎn)生的,經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎在培養(yǎng)基中添加組合抗氧化劑之后,細(xì)胞漿內(nèi)的Keap1及Nrf2和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的蛋白表達(dá)水平恢復(fù)至對(duì)照組的水平,下游基因SOD1,GPX1,CAT的表達(dá)同樣顯示出相似的趨勢(shì)。（4）添加組合抗氧化劑組相比于H2O2處理組的囊胚顯著增加了線粒體膜電位極性（P<0.05）,降低細(xì)胞內(nèi)凋亡指數(shù)（P<0.05）,恢復(fù)至對(duì)照組的水平。（5）添加組合抗氧化劑之后,囊胚中的胚胎多能性相關(guān)基因OCT4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（P<0.05）,抗凋亡基因Bcl-2的轉(zhuǎn)錄上調(diào),促凋亡基因Bax,Caspase-3的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。以上結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中組合添加三種抗氧化劑（TP、ALC、NAC）,會(huì)通過(guò)Keap1-Nrf2通路,調(diào)節(jié)小鼠囊胚期胚胎下游基因表達(dá),對(duì)小鼠體外胚胎產(chǎn)生抗氧化作用,并抑制凋亡。
賀一博[8]（2020）在《黃芪總黃酮對(duì)氧化損傷小鼠胚胎凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響》文中研究說(shuō)明黃芪是一種已經(jīng)用了兩千多年的中藥,可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力、抗衰老、抗應(yīng)激、保肝、利尿、有較廣泛的抗菌作用。而黃芪總黃酮（TFA）則是黃芪的主要成分。在之前的研究中已經(jīng)知道黃芪總黃酮可以清除人體內(nèi)的自由基、保護(hù)心腦血管、抗癌、抗菌的作用并且降低小鼠早期胚胎內(nèi)的ROS水平。本實(shí)驗(yàn)在之前的研究上繼續(xù)研究TFA在細(xì)胞和基因?qū)用嫔蠈?duì)昆明小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響,TFA對(duì)體外培養(yǎng)小鼠囊胚的ROS水平、GSH（谷胱甘肽）水平、和對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)的影響。本試驗(yàn)采取了之前研究中TFA的最適濃度為75 mg/L,將實(shí)驗(yàn)分為三組對(duì)照組（C組）、H2O2處理組（H組）、H2O2+最適濃度TFA組（TH組）。進(jìn)行了囊胚形態(tài)比較,三組發(fā)育率的比較,通過(guò)DCFH-DA熒光染色測(cè)定三組小鼠囊胚的ROS水平、GSH水平、線粒體膜電位水平（JC-1）,利用RTq-PCR測(cè)定Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2、FAS、FASL、Cy-c 基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示:1、在TFA對(duì)胚胎的發(fā)育率的影響中,TH組與C組在2細(xì)胞與4細(xì)胞時(shí)期的發(fā)育率沒(méi)有明顯差異而顯著高于H組（p<0.05）,而在囊胚期TH組顯著低于C組（p<0.05）且顯著高于H組（p<0.05）;2、在TFA對(duì)胚胎ROS水平的影響中,TH組與C組無(wú)顯著差異且顯著低于H 組（p<0.05）;3、在TFA對(duì)胚胎GSH水平的影響中,TH組與C組無(wú)顯著差異且顯著高于H 組（p<0.05）;4、在TFA對(duì)胚胎JC-1水平的影響中,TH組顯著高于H組且顯著低于C組（p<0.05）;5、在TFA對(duì)小鼠囊胚相關(guān)抗氧化酶基因的影響中,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表達(dá)量TH組與C組無(wú)顯著差異且顯著低于H組（p<0.01）,Bcl-2/Bax基因的表達(dá)量TH組顯著低于H組且顯著高于C組（p<0.01）,Cy-c的基因表達(dá)量TH組與C組無(wú)顯著差異且顯著低于H組（p<0.01）,FAS/FASL基因的表達(dá)量TH組與C組無(wú)顯著差異且顯著低于H組（p<0.01）。綜上述結(jié)果顯示,黃芪總黃酮可以降低氧化損傷小鼠早期胚胎的ROS的水平而增高了 GSH和線粒體膜電位的水平,在基因?qū)用嬲{(diào)節(jié)了凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。從而保護(hù)了胚胎細(xì)胞,降低了氧化損傷。
邵紅蓮[9]（2020）在《小鼠植入后胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系的建立以及應(yīng)用》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理小鼠作為研究哺乳動(dòng)物胚胎早期發(fā)育的模型,已有40多年的歷史,它是目前研究最廣泛和透徹的模式動(dòng)物。哺乳動(dòng)物著床前后的很多重要事件在小鼠上做了深入研究,而植入后胚胎發(fā)育的相關(guān)機(jī)制一直是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注熱點(diǎn)。通過(guò)建立小鼠胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系,可以使我們更深入的研究小鼠植入后胚胎發(fā)育的相關(guān)機(jī)制,也可以作為其他哺乳動(dòng)物胚胎體外培養(yǎng)體系的建立以及優(yōu)化提供參考依據(jù)。然而,EPS細(xì)胞的產(chǎn)生為哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞的研究提供一個(gè)新的思路,為生物技術(shù)和再生醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)化研究提供了一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞平臺(tái)。該論文結(jié)合小鼠胚胎體外培養(yǎng)體系的建立,制備EPS細(xì)胞與小鼠早期胚胎嵌合體,通過(guò)體外延時(shí)培養(yǎng)技術(shù),研究了人鼠嵌合體的發(fā)育情況,通過(guò)小鼠胚胎胚層marker OCT4,GATA6和CDX2鑒定與EPS細(xì)胞共表達(dá)。揭示了EPS細(xì)胞在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中也能維持良好的細(xì)胞干性,并通過(guò)單細(xì)胞RNA-seq測(cè)序及生物信息分析技術(shù)對(duì)嵌合的EPS細(xì)胞進(jìn)行t-SNE分析得出EPS細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄組水平接近小鼠正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況,與免疫熒光結(jié)果一致,EPS細(xì)胞在小鼠胚胎內(nèi)三胚層均有嵌合,揭示了干細(xì)胞在異種嵌合中的潛在應(yīng)用前景。
孫洪政[10]（2019）在《MAT2A/MAT2B在小鼠卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育中的功能研究》文中提出哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育受眾多信號(hào)通路以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。卵母細(xì)胞的成熟需要經(jīng)過(guò)兩次減數(shù)分裂過(guò)程,在減數(shù)分裂過(guò)程中,MAPK信號(hào)通路參與了調(diào)控紡錘體的組裝和染色體的正常排列。受精后的胚胎即進(jìn)入著床前發(fā)育階段,該階段包括兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程,一個(gè)是合子基因組激活,該過(guò)程是由母源調(diào)控向胚胎調(diào)控轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵時(shí)期。早期胚胎發(fā)育的另一個(gè)重要過(guò)程是桑椹胚-囊胚轉(zhuǎn)換,該過(guò)程會(huì)出現(xiàn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及滋養(yǎng)層的分化。轉(zhuǎn)錄因子以及表觀修飾因子在這兩個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵調(diào)控因子在卵母細(xì)胞成熟或早期胚胎發(fā)育中所發(fā)揮的作用是揭示發(fā)育過(guò)程復(fù)雜性和系統(tǒng)性的基礎(chǔ)。甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶II（MATII）是哺乳動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行甲硫氨酸代謝的關(guān)鍵復(fù)合物,它是由催化亞基α以及調(diào)控亞基β組成。其中,α亞基是由MAT2A基因編碼而成;β亞基是由MAT2B基因編碼而成。該復(fù)合物通過(guò)催化甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）進(jìn)而與機(jī)體轉(zhuǎn)甲基代謝通路緊密相關(guān),同時(shí)SAM也是生物體內(nèi)甲基基團(tuán)的最主要來(lái)源。MAT2A和MAT2B蛋白廣泛分布于生物體的多種細(xì)胞類型中,參與了體內(nèi)眾多DNA與組蛋白甲基化修飾。本研究通過(guò)篩選及功能分析,對(duì)MAT2A及MAT2B基因在小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式進(jìn)行研究,并且對(duì)MAT2B基因在小鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的功能進(jìn)行了研究,同時(shí)對(duì)MAT2A基因在小鼠早期胚胎發(fā)育中的功能以及與組蛋白甲基化修飾的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了相關(guān)研究,研究結(jié)果如下:（1）通過(guò)定量及免疫熒光染色實(shí)驗(yàn),確定了MAT2A和MAT2B基因在小鼠卵母細(xì)胞及著床前胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示MAT2B基因在卵母細(xì)胞GV期及MII期顯著高表達(dá),并且MAT2B蛋白在GV期呈現(xiàn)明顯的核定位。MAT2A基因在MII期、1-細(xì)胞期至桑椹胚階段均呈現(xiàn)高表達(dá)模式,在囊胚期其mRNA水平開始降低,免疫熒光染色分析MAT2A蛋白從2-細(xì)胞期呈現(xiàn)明顯的核定位,這與其參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相一致。（2）通過(guò)干擾片段顯微注射實(shí)驗(yàn),研究沉默MAT2B基因?qū)π∈舐涯讣?xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾MAT2B基因后小鼠卵母細(xì)胞的成熟率顯著降低,MI期阻滯率顯著升高。沉默MAT2B會(huì)顯著抑制ERK1/2的磷酸化,影響MAPK通路的正常功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),MAT2B蛋白通過(guò)與GIT1相互作用促進(jìn)ERK1/2的磷酸化,進(jìn)而調(diào)控下游蛋白發(fā)揮功能。同時(shí),MAT2B基因的敲降會(huì)影響紡錘體的正常組裝以及染色體的正常排列,同時(shí)敲降MAT2B后會(huì)影響Fgf8,Cdc2和Gdf9等母源mRNA的正常降解,導(dǎo)致這些母源mRNA異常高表達(dá)。（3）通過(guò)干擾片段顯微注射實(shí)驗(yàn),研究沉默MAT2A基因?qū)π∈蠛献踊蚪M激活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾MAT2A基因后小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯在2-細(xì)胞期,即合子基因組激活期。并且沉默MAT2A基因后會(huì)導(dǎo)致2-細(xì)胞胚胎整體轉(zhuǎn)錄水平降低、DNA損傷以及合子基因的表達(dá)異常。MAT2A基因沉默導(dǎo)致的2-細(xì)胞期阻滯可以通過(guò)顯微注射MAT2A mRNA進(jìn)行部分挽救并可發(fā)育至囊胚期。（4）通過(guò)添加MAT2A蛋白催化功能抑制劑以及甲硫氨酸饑餓培養(yǎng),研究MAT2A蛋白的催化功能在小鼠桑椹胚向囊胚轉(zhuǎn)換過(guò)程中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加抑制劑或者甲硫氨酸饑餓培養(yǎng)均會(huì)顯著降低囊胚率,使小鼠早期胚胎發(fā)育阻滯于桑椹胚期。通過(guò)沉默MAT2A基因并同時(shí)注射催化位點(diǎn)突變型MAT2A mRNA可以得到與以上相似的結(jié)果。說(shuō)明MAT2A蛋白的催化功能對(duì)于桑椹胚-囊胚轉(zhuǎn)換過(guò)程至關(guān)重要。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),添加抑制劑培養(yǎng)或者甲硫氨酸饑餓培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎桑椹胚期的H3K4me3水平降低,說(shuō)明MAT2A蛋白催化甲硫氨酸形成SAM的過(guò)程對(duì)于小鼠桑椹胚期正常表觀基因組的建立以及向囊胚期的發(fā)育至關(guān)重要。綜上所述,本論文研究了甲硫氨酸代謝關(guān)鍵復(fù)合物MATII的亞基β和α,其編碼基因MAT2B和MAT2A分別在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育中的功能。證明了MAT2B通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路影響小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟,干擾MAT2B基因會(huì)導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞異常阻滯于MI/AI期;另一方面研究了MAT2A對(duì)于小鼠合子基因組激活的影響以及MAT2A催化功能對(duì)于桑椹胚-囊胚轉(zhuǎn)換過(guò)程的影響,驗(yàn)證了MAT2A作為轉(zhuǎn)錄因子參與合子基因組激活的調(diào)控,同時(shí)MAT2A作為一種酶參與調(diào)控甲硫氨酸代謝過(guò)程并影響桑椹胚期表觀基因組建立及向囊胚期的發(fā)育。
二、應(yīng)用序列培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)鼠囊胚的效果觀察（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問(wèn)題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問(wèn)題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過(guò)程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁(yè)面大小,采用多級(jí)分層頁(yè)表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁(yè)表轉(zhuǎn)換過(guò)程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過(guò)主支變革、控制研究對(duì)象來(lái)發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過(guò)調(diào)查文獻(xiàn)來(lái)獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過(guò)具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來(lái)分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過(guò)創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來(lái)間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、應(yīng)用序列培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)鼠囊胚的效果觀察（論文提綱范文）
（1）甘草素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎氧化損傷影響的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 甘草素概述 |
| 1.2 活性氧對(duì)動(dòng)物生殖細(xì)胞的影響 |
| 1.3 早期胚胎體外培養(yǎng)及發(fā)育 |
| 1.4 胚胎抗氧化酶基因 |
| 1.5 胚胎凋亡基因 |
| 1.6 胚胎全能性基因 |
| 1.7 研究的目的與意義 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.2 試驗(yàn)試劑與儀器 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) |
| 2.5 試驗(yàn)方法 |
| 2.6 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 第三章 結(jié)果與分析 |
| 3.1 不同濃度甘草素對(duì)體外培養(yǎng)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響 |
| 3.2 甘草素對(duì)氧化損傷小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響 |
| 3.3 甘草素對(duì)氧化損傷小鼠囊胚內(nèi)ROS水平的影響 |
| 3.4 甘草素對(duì)氧化損傷小鼠囊胚內(nèi)GSH水平的影響 |
| 3.5 甘草素對(duì)氧化損傷小鼠囊胚內(nèi)線粒體膜電位的影響 |
| 3.6 甘草素對(duì)氧化損傷小鼠囊胚中抗氧化基因表達(dá)的影響 |
| 3.7 甘草素對(duì)氧化損傷小鼠囊胚中凋亡基因表達(dá)的影響 |
| 3.8 甘草素對(duì)氧化損傷小鼠囊胚中全能性基因表達(dá)的影響 |
| 第四章 討論 |
| 4.1 甘草素提高氧化損傷小鼠早期胚胎發(fā)育率 |
| 4.2 甘草素降低氧化損傷小鼠囊胚內(nèi)ROS水平 |
| 4.3 甘草素提高氧化損傷小鼠囊胚內(nèi)GSH水平 |
| 4.4 甘草素增強(qiáng)氧化損傷小鼠囊胚內(nèi)線粒體膜電位水平 |
| 4.5 甘草素提高氧化損傷小鼠囊胚抗氧化酶基因的表達(dá) |
| 4.6 甘草素降低氧化損傷小鼠囊胚凋亡基因的表達(dá) |
| 4.7 甘草素提高氧化損傷小鼠囊胚全能性基因的表達(dá) |
| 第五章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 附錄A (作者簡(jiǎn)介) |
| 附錄B (在研期間發(fā)表的論文) |
（2）烏骨綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 縮略語(yǔ)表 |
| 1 引言 |
| 1.1 烏骨羊 |
| 1.2 多能干細(xì)胞的概述 |
| 1.2.1 多能干細(xì)胞的起源 |
| 1.2.2 在體外獲取不同多能狀態(tài)的干細(xì)胞 |
| 1.3 家畜胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 牛、豬、綿羊胚胎干細(xì)胞的研究進(jìn)展 |
| 1.3.2 Wnt信號(hào)通路是維持家畜多能干細(xì)胞的關(guān)鍵信號(hào) |
| 1.4 家畜誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展 |
| 1.4.1 家畜PSCs重編程的方法 |
| 1.4.2 牛誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展 |
| 1.4.3 山羊及綿羊誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展 |
| 1.5 多能干細(xì)胞在家畜物種中的應(yīng)用 |
| 1.6 研究目的及意義 |
| 2 烏骨綿羊成纖維細(xì)胞的分離及飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)液的配制 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 烏骨綿羊成纖維細(xì)胞系的建立 |
| 2.2.2 STO feeder的制備 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.1 烏骨綿羊耳成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng) |
| 2.3.2 烏骨綿羊耳成纖維細(xì)胞的傳代 |
| 2.3.3 烏骨綿羊耳成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 |
| 2.3.4 烏骨綿羊成纖維細(xì)胞支原體檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.3.5 烏骨綿羊成纖維細(xì)胞染色體分析結(jié)果 |
| 2.3.6 烏骨綿羊耳成纖維細(xì)胞的復(fù)蘇效果 |
| 2.3.7 STO細(xì)胞解凍后的狀態(tài) |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 3 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材 |
| 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 3.1.3 主要試劑的配制 |
| 3.1.4 質(zhì)粒 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 質(zhì)粒PB-TRE-hRL、pBABE-hygro-hTERT、pSG5 LargeT simian virus的轉(zhuǎn)化與提取 |
| 3.2.2 線性載體的制備 |
| 3.2.3 目的基因的獲得 |
| 3.2.4 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.1 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表達(dá)載體質(zhì)粒圖譜 |
| 3.3.2 質(zhì)粒PB-TRE-hRL酶切結(jié)果 |
| 3.3.3 sLargeT和 hTERT基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 |
| 3.3.4 PB-TRE-sLhT載體構(gòu)建中間基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 |
| 3.3.5 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT測(cè)序結(jié)果 |
| 3.3.6 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT電轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 4 烏骨綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立 |
| 4.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材 |
| 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 4.1.3 主要試劑的配制 |
| 4.1.4 質(zhì)粒 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.2.1 電轉(zhuǎn)染 |
| 4.2.2 烏骨綿羊iPSCs的傳代及凍存 |
| 4.2.3 烏骨綿羊iPSCs內(nèi)源基因表達(dá)情況的檢測(cè) |
| 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.3.1 不同誘導(dǎo)體系的iPSCs細(xì)胞系建系率 |
| 4.3.2 不同誘導(dǎo)體系獲得的iPSCs克隆形態(tài)的比較 |
| 4.3.3 不同誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)初期iPSCs細(xì)胞克隆的形態(tài)變化 |
| 4.3.4 不同誘導(dǎo)體系獲得的iPSCs細(xì)胞系內(nèi)源基因激活情況 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 小結(jié) |
| 5 烏骨綿羊iPSCs發(fā)育潛能的研究 |
| 5.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 5.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材 |
| 5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 5.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 5.1.4 主要試劑的配制 |
| 5.1.5 質(zhì)粒 |
| 5.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 5.2.1 siPSC-4和siPSC-6 外源轉(zhuǎn)基因檢測(cè) |
| 5.2.2 堿性磷酸酶染色 |
| 5.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) |
| 5.2.4 擬胚體體外分化 |
| 5.2.5 畸胎瘤體內(nèi)分化 |
| 5.2.6 siPSC-4減DOX培養(yǎng)測(cè)試 |
| 5.2.7 siPSC-4 異種嵌合能力檢測(cè) |
| 5.2.8 siPSC-4 同種嵌合能力檢測(cè) |
| 5.2.9 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及分析 |
| 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 5.3.1 siPSC-4和siPSC-6 細(xì)胞干細(xì)胞特性分析 |
| 5.3.2 經(jīng)典培養(yǎng)液中siPSC-4 細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)源基因的表達(dá) |
| 5.3.3 無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞條件下培養(yǎng)siPSC-4 內(nèi)源基因表達(dá)檢測(cè) |
| 5.3.4 siPSC-4 細(xì)胞嵌合體發(fā)育潛能分析 |
| 5.3.5 RNA測(cè)序結(jié)果分析 |
| 5.4 討論 |
| 5.5 小結(jié) |
| 6 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡(jiǎn)介 |
（3）小鼠囊胚微囊泡誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮寫一覽表 |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 細(xì)胞外微囊泡(MV)對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控作用的研究進(jìn)展 |
| 1.1 微囊泡(MV) |
| 1.2 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) |
| 1.3 微囊泡在病理過(guò)程EMT中的作用 |
| 1.3.1 MV與腫瘤中EMT的關(guān)系 |
| 1.3.2 MV與腎病中EMT的關(guān)系 |
| 1.3.3 MV與肝病中EMT的關(guān)系 |
| 1.4 微囊泡在EMT中的作用機(jī)制 |
| 1.4.1 MV誘導(dǎo)EMT的發(fā)生 |
| 1.4.2 MV抑制EMT的發(fā)生 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第二章 引言 |
| 第三章 小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分離、純化方法優(yōu)化及鑒定 |
| 3.1 材料、試劑和儀器 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 mEE細(xì)胞原代培養(yǎng)及純化 |
| 3.2.2 細(xì)胞免疫熒光法 |
| 3.2.3 流式細(xì)胞術(shù)法 |
| 3.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.1 小鼠子宮大體圖 |
| 3.3.2 Dispase II與胰酶消化后差速貼壁純化的細(xì)胞 |
| 3.3.3 膠原酶I與 DNase消化后過(guò)細(xì)胞篩純化的細(xì)胞 |
| 3.3.4 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Cytokeratin-8 表達(dá) |
| 3.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cytokeratin-8 表達(dá) |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第四章 小鼠囊胚微囊泡誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的侵襲性 |
| 4.1 材料、試劑及儀器 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.2.1 超排卵與提取囊胚 |
| 4.2.2 囊胚M(jìn)V制備 |
| 4.2.3 囊胚M(jìn)V鑒定 |
| 4.2.4 mEE細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 4.2.5 小鼠囊胚M(jìn)V與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(mEEC)的共培養(yǎng) |
| 4.2.6 細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀分析mEE侵襲力的變化 |
| 4.2.7 qPCR法分析囊胚M(jìn)V促進(jìn)侵襲性的miRNA |
| 4.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.3.1 植入前囊胚形態(tài) |
| 4.3.2 鑒定植入前囊胚M(jìn)V的形態(tài)、大小及其特征蛋白 |
| 4.3.3 細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)mEE侵襲力的變化 |
| 4.3.4 植入前囊胚微囊泡中miRNAs情況 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 小結(jié) |
| 第五章 小鼠囊胚微囊泡對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞E-cadherin、Vimentin表達(dá)的影響 |
| 5.1 材料、試劑和儀器 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 5.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 5.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 5.2.1 超排卵與提取囊胚 |
| 5.2.1.1 BABL/C小鼠超數(shù)排卵、合籠、檢栓 |
| 5.2.1.2 提取囊胚 |
| 5.2.2 囊胚的MV制備 |
| 5.2.3 小鼠囊胚M(jìn)V與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(mEEC)的共培養(yǎng) |
| 5.2.4 mEE細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 5.2.5 激光共聚焦觀察囊胚M(jìn)V進(jìn)入mEE細(xì)胞的過(guò)程 |
| 5.2.6 Western-blot分析mEE細(xì)胞表達(dá)E-caderhin 蛋白、Vimentin 蛋白水平 |
| 5.2.7 ICC法分析mEE細(xì)胞表達(dá)E-caderhin 蛋白、Vimentin 蛋白水平 |
| 5.2.8 Image J分析免疫組化光密度值 |
| 5.2.9 Image J分析westen-blot條帶灰度值 |
| 5.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 5.3.1 植入前囊胚M(jìn)V進(jìn)入mEE細(xì)胞過(guò)程 |
| 5.3.2 植入前囊胚M(jìn)V下調(diào)mEE細(xì)胞表達(dá)E-caderhin蛋白水平 |
| 5.3.3 植入前囊胚M(jìn)V上調(diào)mEE細(xì)胞表達(dá)Vimentin蛋白水平 |
| 5.4 討論 |
| 5.5 小結(jié) |
| 第六章 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 碩士期間發(fā)表的論文 |
（4）小分子化合物組合重編程小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為胚外內(nèi)胚層樣細(xì)胞（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文縮略詞表 |
| 第1篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 胚外內(nèi)胚層細(xì)胞研究概況 |
| 2.1 ELSCs的定義及種類 |
| 2.2 XEN細(xì)胞的生物學(xué)特性 |
| 2.3 XEN細(xì)胞的培養(yǎng)條件 |
| 2.4 XEN細(xì)胞的來(lái)源 |
| 2.5 XEN細(xì)胞與CR間的聯(lián)系 |
| 2.6 XEN細(xì)胞的應(yīng)用 |
| 第3章 XEN樣細(xì)胞在CR中的研究進(jìn)展 |
| 3.1 體細(xì)胞重編程的研究概況 |
| 3.2 CR過(guò)程中的XEN樣細(xì)胞 |
| 3.3 CR過(guò)程中MET的作用 |
| 3.4 化學(xué)重編程產(chǎn)生ciXEN細(xì)胞時(shí)小分子化合物的選擇 |
| 3.5 ciXEN細(xì)胞研究存在的問(wèn)題 |
| 第4章 CR過(guò)程中代謝重塑的研究現(xiàn)狀 |
| 4.1 代謝的定義、分類及意義 |
| 4.2 CR過(guò)程中的代謝變化 |
| 4.3 XEN細(xì)胞的代謝特點(diǎn) |
| 第4章 問(wèn)題與展望 |
| 第2篇 實(shí)驗(yàn)研究 |
| 第1章 利用小分子化合物組合重編程產(chǎn)生ciXEN細(xì)胞 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.3 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1.5 討論 |
| 1.6 小結(jié) |
| 第2章 ciXEN細(xì)胞生物學(xué)特性研究 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第3章 去除小分子化合物后iXEN細(xì)胞生物學(xué)特性研究 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.5 討論 |
| 3.6 小結(jié) |
| 第4章 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果 |
| 致謝 |
（5）基于“嫉妒不孕”理論探討心理應(yīng)激對(duì)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及早期胚胎發(fā)育的影響（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文縮略詞表 |
| 前言 |
| 技術(shù)路線圖(一) |
| 技術(shù)路線圖(二) |
| 實(shí)驗(yàn)一 心理應(yīng)激對(duì)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的研究 |
| 1 材料與方法 |
| 2 實(shí)驗(yàn)操作 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4 小結(jié) |
| 實(shí)驗(yàn)二 心理應(yīng)激對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的研究 |
| 1 材料與方法 |
| 2 實(shí)驗(yàn)操作 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4 小結(jié) |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 綜述 心理應(yīng)激與女性自然生育力及輔助生殖技術(shù)結(jié)局的研究進(jìn)展 |
| 1 心理應(yīng)激與女性自然生育力的相關(guān)性 |
| 2 心理應(yīng)激與輔助生殖技術(shù)的相關(guān)性 |
| 3 心理應(yīng)激對(duì)女性生殖內(nèi)分泌的影響機(jī)制 |
| 4 結(jié)語(yǔ) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
（6）納米金非侵入性介導(dǎo)外源基因進(jìn)入小鼠早期胚胎細(xì)胞的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 綜述 |
| 1.1 基因?qū)氲母拍?/td> |
| 1.2 基因?qū)氲募夹g(shù)方法 |
| 1.2.1 物理方法 |
| 1.2.2 生物學(xué)方法 |
| 1.2.3 化學(xué)方法 |
| 1.3 基因載體 |
| 1.3.1 有機(jī)納米粒子載體 |
| 1.3.2 無(wú)機(jī)納米粒子載體 |
| 1.4 基因載體導(dǎo)入的路徑 |
| 1.4.1 載體與DNA復(fù)合 |
| 1.4.2 載體穿過(guò)細(xì)胞膜 |
| 1.4.3 載體逃離內(nèi)涵體 |
| 1.4.4 載體入核 |
| 1.5 本研究的選題思路及研究意義 |
| 第2章 納米金基因載體的構(gòu)建及性能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2.2 AuNPs-PEI的制備 |
| 2.2.3 AuNPs-PEI的表征 |
| 2.2.4 APD的制備 |
| 2.2.5 AuNPs-PEI負(fù)載性能的分析 |
| 2.2.6 AuNPs-PEI的細(xì)胞毒性 |
| 2.3 結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 AuNPs-PEI的表征 |
| 2.3.2 AuNPs-PEI的負(fù)載能力及穩(wěn)定性分析 |
| 2.3.3 AuNPs-PEI的細(xì)胞毒性 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第3章 基因載體介導(dǎo)外源基因?qū)胄∈笤缙谂咛ゼ?xì)胞 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2.2 以APD介導(dǎo)GFP質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.3 以兩種分子量PEI構(gòu)建的APD進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.4 以免疫熒光檢測(cè)鑒定GFP的表達(dá) |
| 3.3 結(jié)果與分析 |
| 3.3.1 體外轉(zhuǎn)染后GFP的表達(dá)情況 |
| 3.3.2 兩種分子量PEI構(gòu)建的APD載體效果分析 |
| 3.3.3 GFP免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第4章 納米金基因載體對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育和后代生長(zhǎng)的影響 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)部分 |
| 4.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.2.2 TUNEL染色法檢測(cè)小鼠胚胎細(xì)胞的凋亡 |
| 4.2.3 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)小鼠胚胎細(xì)胞中Oct4和Cdx2 的表達(dá) |
| 4.2.4 小鼠胚胎移植 |
| 4.3 結(jié)果與分析 |
| 4.3.1 TUNEL檢測(cè)結(jié)果 |
| 4.3.2 Oct4和Cdx2 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 |
| 4.3.3 胚胎移植獲得子代小鼠 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 小結(jié) |
| 第5章 鑒定胚胎移植子代小鼠染色體中的GFP |
| 5.1 前言 |
| 5.2 實(shí)驗(yàn)部分 |
| 5.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 5.2.2 基因分型驗(yàn)證子代小鼠染色體中的GFP |
| 5.2.3 質(zhì)粒DNA的測(cè)序 |
| 5.2.4 以免疫熒光檢測(cè)子代小鼠脾臟中的GFP表達(dá) |
| 5.2.5 使用γH2AX抗體檢測(cè)小鼠胚胎細(xì)胞中的DNA雙鏈斷裂 |
| 5.3 結(jié)果與分析 |
| 5.3.1 基因分型的結(jié)果 |
| 5.3.2 基因測(cè)序結(jié)果 |
| 5.3.3 脾臟的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 |
| 5.3.4 γH2AX抗體檢測(cè)胚胎細(xì)胞DNA雙鏈斷裂情況 |
| 5.4 討論 |
| 5.5 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
| 在校期間公開發(fā)表論文及著作情況 |
（7）TP、ALC和NAC組合處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎氧化損傷的保護(hù)作用（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 茶多酚(Tea Polyphenols)概述 |
| 1.2 乙酰左旋肉堿概述 |
| 1.3 N-乙酰半胱氨酸(NAC)概述 |
| 1.4 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路 |
| 1.5 抗氧化反應(yīng)的氧化還原信號(hào)模型 |
| 1.6 凋亡通路及研究進(jìn)展 |
| 1.7 本研究的目的與意義 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) |
| 2.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要藥品 |
| 2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑的配置 |
| 2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要儀器 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 小鼠的超數(shù)排卵 |
| 2.2.2 胚胎的收集 |
| 2.2.3 胚胎的培養(yǎng) |
| 2.2.4 ROS水平的測(cè)定 |
| 2.2.5 GSH水平的測(cè)定 |
| 2.2.6 JC-1水平測(cè)定 |
| 2.2.7 TUNEL檢測(cè) |
| 2.2.8 RT-qPCR反應(yīng) |
| 2.2.9 Western-blot檢測(cè) |
| 第三章 結(jié)果 |
| 3.1 TP、ALC和NAC組合處理對(duì)氧化損傷小鼠胚胎早期發(fā)育的影響 |
| 3.2 TP、ALC和NAC組合處理對(duì)氧化損傷小鼠胚胎內(nèi)ROS水平及GSH水平的影響 |
| 3.3 TP、ALC和NAC組合處理對(duì)氧化損傷小鼠胚胎Keap1-Nrf2通路的檢測(cè) |
| 3.4 TP、ALC和NAC組合處理對(duì)氧化損傷小鼠胚胎Keap1-Nrf2通路下游抗氧化酶基因mRNA表達(dá)的測(cè)定 |
| 3.5 TP、ALC和NAC組合處理對(duì)氧化損傷小鼠胚胎內(nèi)JC-1水平的影響 |
| 3.6 TP、ALC和NAC組合處理對(duì)氧化損傷小鼠胚胎凋亡指數(shù)的影響 |
| 3.7 TP、ALC和NAC組合處理對(duì)氧化損傷小鼠胚胎凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的測(cè)定 |
| 3.8 TP、ALC和NAC組合處理對(duì)氧化損傷小鼠胚胎全能性相關(guān)基因mRNA表達(dá)的測(cè)定 |
| 第四章 討論 |
| 4.1 TP、ALC和NAC組合處理提高早期胚胎發(fā)育率 |
| 4.2 TP、ALC和NAC組合處理減少胚胎內(nèi)氧化應(yīng)激水平 |
| 4.3 TP、ALC和NAC組合處理調(diào)節(jié)Keap1-NRF2-ARE信號(hào)通路 |
| 4.4 TP、ALC和NAC組合處理提高胚胎內(nèi)線粒體膜電位水平 |
| 4.5 TP、ALC和NAC組合處理影響細(xì)胞內(nèi)凋亡水平 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
（8）黃芪總黃酮對(duì)氧化損傷小鼠胚胎凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 黃芪總黃酮 |
| 1.2 早期胚胎體外培養(yǎng) |
| 1.3 細(xì)胞凋亡 |
| 1.4 細(xì)胞凋亡基因 |
| 1.4.1 半胱天冬酶 |
| 1.4.2 B淋巴細(xì)胞瘤-2基因 |
| 1.4.3. 細(xì)胞色素c |
| 1.4.4 Fas/FasL |
| 1.5 ROS |
| 1.6 谷胱甘肽 |
| 1.7 JC-1 |
| 1.8 研究的目的及意義 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器、藥品 |
| 2.3.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器 |
| 2.3.2 實(shí)驗(yàn)主要藥品 |
| 2.4 實(shí)驗(yàn)試劑的配置 |
| 2.4.1 孕馬血清促性腺激素(PMSG)的配置 |
| 2.4.2 人絨毛膜促性腺激素(hCG)的配置 |
| 2.4.3 0.1%透明質(zhì)酸酶的配置 |
| 2.4.4 25 μmol/L過(guò)氧化氫(H_2O_2)溶液的配置 |
| 2.4.5 75mg/LTFA黃芪總黃酮(TFA)工作液的配置 |
| 2.4.6 M2緩沖液的配置 |
| 2.4.7 2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)的配置 |
| 2.4.8 4-氯甲基-6,8-二氟-7-羥基香豆素(CMF2HC)的配制 |
| 2.4.9 JC-1工作液的配制 |
| 2.4.10 固相RNase清除劑工作液的配置 |
| 2.4.11 70%乙醇的配置 |
| 2.4.12 Buffer RPE工作液的配置 |
| 2.4.13 引物稀釋 |
| 2.5 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.5.1 小鼠超數(shù)排卵處理 |
| 2.5.2 小鼠胚胎的收集和培養(yǎng) |
| 2.5.3 小鼠胚胎氧化損傷模型的建立 |
| 2.5.4 實(shí)驗(yàn)分組 |
| 2.5.5 ROS水平的檢測(cè) |
| 2.5.6 GSH水平的檢測(cè) |
| 2.5.7 JC-1水平的檢測(cè) |
| 2.5.8 總RNA提取 |
| 2.5.9 反轉(zhuǎn)錄 |
| 2.5.10 RTq-PCR |
| 2.6 統(tǒng)計(jì)方法 |
| 第三章 結(jié)果與分析 |
| 3.1 TFA對(duì)小鼠胚胎體外發(fā)育的影響 |
| 3.1.1 囊胚形態(tài)的比較 |
| 3.1.2 早期胚胎發(fā)育率的比較 |
| 3.2 TFA對(duì)氧化損傷小鼠囊胚ROS水平的影響 |
| 3.3 TFA對(duì)氧化損傷小鼠囊胚GSH水平的影響 |
| 3.4 TFA對(duì)氧化損傷小鼠囊胚線粒體膜電位的影響 |
| 3.5 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Caspase基因表達(dá)的影響 |
| 3.5.1 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Caspase-3基因表達(dá)的影響 |
| 3.5.2 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Caspase-8基因表達(dá)的影響 |
| 3.5.3 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Caspase-9基因表達(dá)的影響 |
| 3.6 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Cyt-c基因表達(dá)的影響 |
| 3.7 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Fas/FasL基因表達(dá)的影響 |
| 3.7.1 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Fas基因表達(dá)的影響 |
| 3.7.2 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚FasL基因表達(dá)的影響 |
| 3.7.3 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Fas/FasL基因表達(dá)的影響 |
| 3.8 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Bcl-2/Bax基因表達(dá)的影響 |
| 3.8.1 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Bcl-2基因表達(dá)的影響 |
| 3.8.2 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Bax基因表達(dá)的影響 |
| 3.8.3 TFA對(duì)氧損傷小鼠囊胚Bcl-2/Bax基因表達(dá)的影響 |
| 第四章 討論 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
（9）小鼠植入后胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系的建立以及應(yīng)用（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 第一章 小鼠植入后胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)的建立與優(yōu)化 |
| 1.1 緒論 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2.1 實(shí)驗(yàn)所用的設(shè)備和耗材 |
| 1.2.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑 |
| 1.2.3 實(shí)驗(yàn)用到的溶液及培養(yǎng)基的配制 |
| 1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.3 小鼠胚胎的獲取以及培養(yǎng)方法 |
| 1.3.1 超數(shù)排卵 |
| 1.3.2 ICR小鼠胚胎的獲取(取2細(xì)胞) |
| 1.3.3 去除囊胚透明帶 |
| 1.3.4 植入后胚胎的體外延時(shí)培養(yǎng) |
| 1.3.4.1 2D體外延時(shí)培養(yǎng) |
| 1.3.4.2 3D體外延時(shí)培養(yǎng)(Ibi Treat-μ-slide-8-well腔室載玻片) |
| 1.3.5 胚胎的回收以及免疫熒光染色鑒定 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1.4.1 小鼠植入后胚胎2D培養(yǎng)體系 |
| 1.4.2 小鼠植入后胚胎3D培養(yǎng)體系的建立 |
| 1.4.3 小鼠植入后胚胎3D培養(yǎng)體系的優(yōu)化 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第二章 胚胎干細(xì)胞的背景簡(jiǎn)介與EPS的培養(yǎng) |
| 2.1 緒論 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2.1 實(shí)驗(yàn)所用的設(shè)備和耗材 |
| 2.2.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑和藥品 |
| 2.2.3 實(shí)驗(yàn)用到的溶液及培養(yǎng)基的配制 |
| 2.3 EPS的培養(yǎng)方法及干性檢測(cè) |
| 2.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) |
| 2.3.2 小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)(MEF) |
| 2.3.2.1 復(fù)蘇 |
| 2.3.2.2 傳代 |
| 2.3.2.3 細(xì)胞污染的判斷 |
| 2.3.2.4 MEF污染的檢測(cè)方法 |
| 2.3.2.5 凍存 |
| 2.3.3 利用小鼠成纖維細(xì)胞制作飼養(yǎng)層細(xì)胞 |
| 2.3.4 EPS的復(fù)蘇 |
| 2.3.5 EPS的傳代 |
| 2.3.6 EPS細(xì)胞支原體檢測(cè) |
| 2.3.7 EPS細(xì)胞的凍存 |
| 2.3.8 EPS干性的免疫熒光檢測(cè) |
| 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.4.1 小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)的培養(yǎng)結(jié)果 |
| 2.4.2 EPS的培養(yǎng)回收細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)圖 |
| 2.4.3 支原體檢測(cè)結(jié)果 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第三章 小鼠胚胎和EPS嵌合體的制備 |
| 3.1 緒論 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2.1 實(shí)驗(yàn)所用的設(shè)備和耗材 |
| 3.2.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑 |
| 3.2.3 操作液的制備 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3.1 小鼠胚胎的準(zhǔn)備(早期桑葚胚,early morula) |
| 3.3.2 EPS消化成單細(xì)胞的制備 |
| 3.3.3 Mouse-EPS嵌合體的制備 |
| 3.3.3.1 注射針和持卵針的制備 |
| 3.3.3.2 顯微操作儀以及相關(guān)儀器的開啟 |
| 3.3.3.3 注射針和持卵針的安裝 |
| 3.3.3.4 嵌合體的注射 |
| 3.3.4 囊胚和E6.5胚胎的回收以及免疫熒光檢測(cè)方法 |
| 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.4.1 Mouse-EPS注射前嵌合時(shí)期以及注射細(xì)胞數(shù)的探討 |
| 3.4.1.1 Mouse-H9-EPS注射前嵌合時(shí)期以及注射細(xì)胞數(shù)的探討 |
| 3.4.1.2 Mouse-JB-EPS注射前嵌合時(shí)期以及注射細(xì)胞數(shù)的探討 |
| 3.4.2 Mouse-EPS嵌合體植入后體外延時(shí)培養(yǎng)至E6.5 的免疫熒光檢測(cè)EPS細(xì)胞在體內(nèi)的嵌合情況分析 |
| 3.4.2.1 Mouse-H9-EPS在小鼠胚胎體內(nèi)的嵌合情況分析 |
| 3.4.2.2 Mouse-JB-EPS在小鼠胚胎體內(nèi)的嵌合情況分析 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第四章 單細(xì)胞的獲得和樣品處理 |
| 4.1 緒論 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.2.1 實(shí)驗(yàn)所用的設(shè)備和耗材 |
| 4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品 |
| 4.2.3 實(shí)驗(yàn)用到溶液的配制 |
| 4.3 單細(xì)胞的獲取及處理方法 |
| 4.3.1 單細(xì)胞的收取 |
| 4.3.2 單細(xì)胞的處理 |
| 4.3.3 cDNA純化 |
| 4.3.4 單細(xì)胞的建庫(kù) |
| 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.4.1 單細(xì)胞的收取情況 |
| 4.4.2 單細(xì)胞數(shù)據(jù)處理結(jié)果 |
| 4.5 小結(jié) |
| 第五章 生物信息分析 |
| 5.1 緒論 |
| 5.2 分析方法 |
| 5.2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)處理 |
| 5.2.2 數(shù)據(jù)過(guò)濾 |
| 5.2.3 降維及Marker基因篩選 |
| 5.3 分析結(jié)果 |
| 5.4 小結(jié) |
| 第六章 討論與總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
（10）MAT2A/MAT2B在小鼠卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育中的功能研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略詞 |
| 綜述部分 |
| 第一章 卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育 |
| 1.1 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程及調(diào)控機(jī)制 |
| 1.1.1 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程 |
| 1.1.2 卵母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控 |
| 1.2 早期胚胎發(fā)育的合子基因組激活 |
| 1.2.1 合子基因組激活的時(shí)間 |
| 1.2.2 合子基因組激活的機(jī)制 |
| 1.2.3 母源mRNA的翻譯 |
| 1.2.4 母源mRNA的清除 |
| 1.2.5 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 |
| 1.2.6 染色質(zhì)重塑 |
| 1.3 囊胚的形成和發(fā)育 |
| 1.3.1 致密化和極化的發(fā)生 |
| 1.3.2 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層的形成 |
| 1.3.3 囊胚期組蛋白修飾 |
| 第二章 MAT2A及 MAT2B的研究進(jìn)展 |
| 2.1 MAT2A研究進(jìn)展 |
| 2.2 MAT2B研究進(jìn)展 |
| 2.3 甲硫氨酸代謝調(diào)控 |
| 2.4 甲硫氨酸代謝與DNA甲基化 |
| 2.5 早期胚胎發(fā)育的甲硫氨酸供給 |
| 2.6 研究目的和意義 |
| 試驗(yàn)部分 |
| 第三章 MAT2A和MAT2B在HEPG2及LO2細(xì)胞中的表達(dá)和定位 |
| 3.1 材料和試劑 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要試劑 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 3.2.2 RNA提取 |
| 3.2.3 反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
| 3.2.4 基因擴(kuò)增與載體構(gòu)建 |
| 3.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 |
| 3.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色 |
| 3.2.7 蛋白免疫印跡檢測(cè) |
| 3.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2細(xì)胞系中的表達(dá) |
| 3.3.2 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2細(xì)胞系中的定位 |
| 3.3.3 MAT2A和MAT2B過(guò)表達(dá)影響其亞細(xì)胞分布 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第四章 MAT2B調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟 |
| 4.1 材料和試劑 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要試劑 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 卵母細(xì)胞及受精卵的采集和培養(yǎng) |
| 4.2.2 卵母細(xì)胞顯微注射 |
| 4.2.3 胚胎實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
| 4.2.4 胚胎免疫熒光染色 |
| 4.2.5 MAT2B及 GIT1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 4.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 4.2.7 蛋白質(zhì)免疫共沉淀 |
| 4.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 4.3 結(jié)果 |
| 4.3.1 MAT2B在卵母細(xì)胞期高表達(dá) |
| 4.3.2 敲降MAT2B對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響 |
| 4.3.3 MAT2B與 GIT1 互作并激活MAPK通路 |
| 4.3.4 U0126 處理對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響 |
| 4.3.5 敲降MAT2B影響紡錘體排列和母源mRNA降解 |
| 4.4 討論 |
| 4.5 小結(jié) |
| 第五章 MAT2A在小鼠合子基因組激活中的功能研究 |
| 5.1 材料和試劑 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要試劑 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 5.2.2 組織RNA提取 |
| 5.2.3 小鼠卵母細(xì)胞及胚胎的采集與培養(yǎng) |
| 5.2.4 mRNA反轉(zhuǎn)錄 |
| 5.2.5 蛋白免疫印跡檢測(cè) |
| 5.2.6 胚胎顯微注射 |
| 5.2.7 胚胎免疫熒光染色 |
| 5.2.8 胚胎實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
| 5.2.9 體外轉(zhuǎn)錄 |
| 5.2.10 胚胎轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè) |
| 5.3 結(jié)果 |
| 5.3.1 MAT2A及 MAT2B在小鼠多組織中的表達(dá)模式 |
| 5.3.2 MAT2A及 MAT2B在小鼠卵母細(xì)胞及早期胚胎中的表達(dá)模式 |
| 5.3.3 免疫熒光檢測(cè)MAT2A在小鼠早期胚胎中的分布模式 |
| 5.3.4 MAT2A干擾RNA的驗(yàn)證 |
| 5.3.5 敲降MAT2A導(dǎo)致小鼠2-細(xì)胞胚胎阻滯 |
| 5.3.6 敲降MAT2A對(duì)2-細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的影響 |
| 5.3.7 胚胎發(fā)育挽救實(shí)驗(yàn) |
| 5.3.8 細(xì)胞水平敲降MAT2A后影響組蛋白甲基化修飾 |
| 5.3.9 敲降MAT2A后對(duì)2細(xì)胞胚胎組蛋白甲基化的影響 |
| 5.3.10 敲降MAT2A后導(dǎo)致2細(xì)胞胚胎DNA損傷 |
| 5.4 討論 |
| 5.5 小結(jié) |
| 第六章 MAT2A在小鼠囊胚發(fā)育中的功能研究 |
| 6.1 材料和試劑 |
| 6.1.1 主要材料 |
| 6.1.2 主要試劑 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 小鼠胚胎獲取 |
| 6.2.2 小鼠胚胎培養(yǎng) |
| 6.2.3 胚胎免疫熒光染色 |
| 6.2.4 胚胎實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
| 6.2.5 MAT2A催化位點(diǎn)突變載體構(gòu)建 |
| 6.2.6 體外轉(zhuǎn)錄 |
| 6.2.7 胚胎顯微注射 |
| 6.2.8 胚胎凋亡染色 |
| 6.3 結(jié)果 |
| 6.3.1 環(huán)亮氨酸處理對(duì)胚胎發(fā)育的影響 |
| 6.3.2 環(huán)亮氨酸處理對(duì)組蛋白甲基化修飾的影響 |
| 6.3.3 甲硫氨酸饑餓培養(yǎng)對(duì)胚胎發(fā)育的影響 |
| 6.3.4 甲硫氨酸饑餓培養(yǎng)對(duì)組蛋白甲基化修飾的影響 |
| 6.3.5 MAT2A催化突變體對(duì)胚胎發(fā)育的影響 |
| 6.3.6 抑制MAT2A催化活性對(duì)胚胎凋亡的影響 |
| 6.3.7 抑制MAT2A催化活性對(duì)囊胚細(xì)胞數(shù)的影響 |
| 6.3.8 抑制MAT2A催化活性對(duì)囊胚基因表達(dá)的影響 |
| 6.4 討論 |
| 6.5 小結(jié) |
| 全文結(jié)論 |
| 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 不足之處和進(jìn)一步研究計(jì)劃 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
四、應(yīng)用序列培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)鼠囊胚的效果觀察（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]甘草素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎氧化損傷影響的研究[D]. 朱純宇. 延邊大學(xué), 2021
- [2]烏骨綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立[D]. 劉默凝. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2021
- [3]小鼠囊胚微囊泡誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究[D]. 段乳俠. 西南大學(xué), 2021(01)
- [4]小分子化合物組合重編程小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為胚外內(nèi)胚層樣細(xì)胞[D]. 賀霞. 吉林大學(xué), 2020(01)
- [5]基于“嫉妒不孕”理論探討心理應(yīng)激對(duì)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及早期胚胎發(fā)育的影響[D]. 程蕊. 天津中醫(yī)藥大學(xué), 2020(04)
- [6]納米金非侵入性介導(dǎo)外源基因進(jìn)入小鼠早期胚胎細(xì)胞的研究[D]. 王旗. 阜陽(yáng)師范大學(xué), 2020(12)
- [7]TP、ALC和NAC組合處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠胚胎氧化損傷的保護(hù)作用[D]. 楊碩. 延邊大學(xué), 2020(05)
- [8]黃芪總黃酮對(duì)氧化損傷小鼠胚胎凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響[D]. 賀一博. 延邊大學(xué), 2020(05)
- [9]小鼠植入后胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系的建立以及應(yīng)用[D]. 邵紅蓮. 昆明理工大學(xué), 2020(05)
- [10]MAT2A/MAT2B在小鼠卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育中的功能研究[D]. 孫洪政. 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2019
標(biāo)簽：卵母細(xì)胞論文; 囊胚論文; 胚胎發(fā)育論文; 上皮細(xì)胞論文; 子宮內(nèi)膜論文;