一、綿羊腐敗梭菌與魏氏梭菌混合感染的診斷報(bào)告（論文文獻(xiàn)綜述）
李一鳴[1]（2021）在《奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及污染牛奶的風(fēng)險(xiǎn)因素分析》文中研究表明產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）作為一種重要的人獸共患病病原,不僅能引起動(dòng)物的多種疾病和造成家畜的大量死亡,而且也直接危害著人類的健康。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的風(fēng)險(xiǎn)因素分析的研究很少。本研究首先建立產(chǎn)氣莢膜梭菌多重?zé)晒舛縋CR方法,然后對(duì)奶牛養(yǎng)殖和擠奶各環(huán)節(jié)樣品進(jìn)行快速檢測(cè)分型,明確奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中各環(huán)節(jié)產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染狀況并了解其傳播規(guī)律;同時(shí),對(duì)各環(huán)節(jié)樣品進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌污染菌量的檢測(cè),并構(gòu)建該菌在牛奶中的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型,利用@Risk和Excel軟件,確定關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素控制點(diǎn)。獲得以下結(jié)果:1.建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌多重?zé)晒舛縋CR方法對(duì)cpa-PMD18-T、cpb-p GEM-T、etx-p GEM-T和ia-p GEM-T質(zhì)粒拷貝數(shù)檢測(cè)限均可達(dá)1×102拷貝/μL,菌液和DNA的檢測(cè)限分別為102 CFU/m L和100 fg/μL,具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性。2.應(yīng)用建立的多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法,對(duì)從陜西省的2個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)采集奶牛養(yǎng)殖和擠奶環(huán)節(jié)的樣品244份進(jìn)行快速檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行分離純化,共分離鑒定91株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌,二者的結(jié)果相符,表明A型菌為奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中的流行血清型。3.構(gòu)建產(chǎn)氣莢膜梭菌在牛奶中的Logistic生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型,并對(duì)奶牛養(yǎng)殖和擠奶各環(huán)節(jié)樣品的污染量進(jìn)行檢測(cè),利用@Risk和Excel軟件,確立初始奶帶菌量和工人手及糞便為生鮮奶的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素控制點(diǎn),空氣、乳頭和擠奶杯的污染也不可忽視。綜上所述,本研究弄清楚了奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中產(chǎn)氣莢膜梭菌的污染狀況,確定了初始奶帶菌量、工人手及糞便為生鮮牛奶產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素控制點(diǎn),可為奶牛養(yǎng)殖企業(yè)有效防控牛奶產(chǎn)氣莢膜梭菌污染提供科學(xué)依據(jù)。
張秀坤[2]（2020）在《腐敗梭菌α毒素阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的建立》文中研究表明腐敗梭菌（Clostridium septium）是人的氣性壞疽以及豬、馬、牛、羊、雞、鹿等多種動(dòng)物的惡性水腫病的主要病原,產(chǎn)生的α毒素（Clostridium septicum alpha toxin,CSA）是其分泌的幾種外毒素中最主要致死性毒力因子和免疫原,具有溶血活性,能夠?qū)е聶C(jī)體細(xì)胞壞死。腐敗梭菌感染羊引起羊快疫,發(fā)病羊病程多呈急性經(jīng)過,發(fā)病后迅速死亡,病死率高,給我國(guó)畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是防治羊快疫的主要手段,由于缺乏體外抗體檢測(cè)方法。該類疫苗免疫后效果評(píng)價(jià)多采用血清-毒素中和后經(jīng)尾靜脈注射小鼠,根據(jù)小鼠死亡情況判定血清中和抗體效價(jià)的方法,該方法操作繁瑣,難以用于臨床大量樣本的免疫效果評(píng)價(jià)。為此,本研究擬通過制備腐敗梭菌α毒素單克隆抗體,建立腐敗梭菌α毒素阻斷ELISA檢測(cè)方法,以期用快速、簡(jiǎn)便、高通量的體外檢測(cè)方法替代動(dòng)物檢驗(yàn)法,用于疫苗的效力檢驗(yàn)及疫苗免疫后效果評(píng)價(jià)。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng),通過缺失腐敗梭菌α毒素的第212222位共11個(gè)氨基酸序列,使其喪失毒力,對(duì)腐敗梭菌重組α毒素?zé)o毒突變體進(jìn)行體外表達(dá),目的蛋白主要以可溶性形式表達(dá)。將表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,獲得濃度為0.76mg/mL的目的蛋白,經(jīng)Western blot鑒定該重組α毒素蛋白具有良好的反應(yīng)原性。提取腐敗梭菌天然α毒素,制備類毒素后以30 MLD/只小鼠的劑量免疫BALB/c小鼠,經(jīng)三次基礎(chǔ)免疫后測(cè)定血清效價(jià),選取效價(jià)較高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫并融合,使用體外表達(dá)的重組α毒素蛋白以間接ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選并對(duì)陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆,最終獲得七株強(qiáng)陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞株,其中374、333、932、443和447五株雜交瘤細(xì)胞對(duì)腐敗梭菌天然α毒素識(shí)別能力較強(qiáng)。經(jīng)亞型鑒定,374、333和932三株為IgG,其余為IgM或IgA,中和試驗(yàn)結(jié)果表明僅932株具有中和活性。因此對(duì)932株單抗進(jìn)行腹水制備及辛酸硫酸銨沉淀法純化,純化后濃度為3.02mg/mL;經(jīng)間接ELISA檢測(cè),效價(jià)可達(dá)1:256000。利用獲得的單克隆抗體初步建立阻斷ELISA檢測(cè)方法,通過方陣滴定實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳抗原包被條件、最佳封閉方式、最佳抗體作用條件、酶標(biāo)二抗作用時(shí)間、顯色液作用時(shí)間等分別進(jìn)行了篩選和優(yōu)化,確定最佳抗原包被條件為以4μg/mL的濃度在4℃條件下包被12h,最佳封閉方式為5%脫脂乳37℃條件下封閉2h,最佳抗體作用條件為將單抗進(jìn)行1:512000稀釋后37℃孵育45min,酶標(biāo)二抗作用條件為1:15000倍稀釋后37℃孵育45min,顯色液作用條件為室溫避光顯色15min。在確定最佳反應(yīng)條件后,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保存的90份經(jīng)小鼠中和試驗(yàn)驗(yàn)證的陰性羊血清樣品,確定該阻斷ELISA方法的陰、陽性臨界值。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明,該方法具有良好的批內(nèi)和批間重復(fù)性。阻斷ELISA試驗(yàn)與小鼠中和試驗(yàn)和細(xì)胞中和試驗(yàn)的相關(guān)性測(cè)定結(jié)果表明,阻斷ELISA檢測(cè)結(jié)果與兩種中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān),且阻斷ELISA檢測(cè)方法的敏感性高于中和試驗(yàn)。本研究以腐敗梭菌天然α毒素為免疫原,重組表達(dá)的α毒素?zé)o毒突變體蛋白為篩選抗原,成功制備出1株特異性高、反應(yīng)性強(qiáng)且具有中和活性的單克隆抗體,在此基礎(chǔ)上建立了腐敗梭菌α毒素阻斷ELISA檢測(cè)方法,并對(duì)其特異性及敏感性進(jìn)行了驗(yàn)證,有望用于羊快疫滅活疫苗的效力檢驗(yàn)及疫苗免疫后效果評(píng)價(jià)。
雷有菊,王文勇,張學(xué)勇[3]（2019）在《互助藏羊梭菌病病原體的分離鑒定與分析》文中提出青海省互助縣某羊場(chǎng)藏系綿羊患病死亡,伴有腹瀉、神經(jīng)癥狀,為快速確診發(fā)病原因,及時(shí)防控和治療,采集病羊樣品5份,通過鏡檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)試驗(yàn)及致病性試驗(yàn)進(jìn)行病原鑒定分析。結(jié)果證明此次病原菌為羊致病性D型魏氏梭菌,毒素基因分析顯示該菌同時(shí)含有α和ε兩種毒素基因,動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明該菌對(duì)昆明系小鼠具有較強(qiáng)的致病性,并從試驗(yàn)致死的小鼠中分離到與藏羊病原相一致的細(xì)菌。三種基因的遺傳進(jìn)化樹顯示,該菌具有較強(qiáng)的多樣性。研究確定了本次藏羊致死的主要病原為D型魏氏梭菌,結(jié)果可為該羊場(chǎng)梭菌病的治療和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。
朱凱宗[4]（2019）在《山東地區(qū)鹿腸毒血癥的綜合診斷及致病性研究》文中研究指明魏氏梭菌,又稱產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌,屬于芽孢桿菌科,梭狀芽孢桿菌屬,魏氏梭菌種,屬溫和厭氧菌,革蘭陽性、兩端鈍圓的大桿菌,屬于典型的條件致病菌。該菌能產(chǎn)生多種外毒素或酶類,目前發(fā)現(xiàn)的外毒素多達(dá)12種（α、γ、ε、θ、κ、μ和ν）,四種毒素（α、β、ε和ι）起主要致病作用,根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)生的毒素不同,可將此菌分為A–E五個(gè)血清型。該菌會(huì)引起豬、牛、雞壞死性腸炎或是腸毒血癥等。本文對(duì)鹿腸毒血癥病例進(jìn)行綜合診斷,并對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn)。山東某地區(qū)發(fā)生了鹿的突然死亡,發(fā)病鹿群具有典型的鹿腸毒血癥臨床癥狀,鹿群發(fā)病急,死亡率高達(dá)50%以上,患者均為營(yíng)養(yǎng)較好的青壯年鹿,死亡鹿均表現(xiàn)為腹部膨氣。病理剖檢,尸僵完全,黏膜發(fā)紺;各臟器出現(xiàn)出血斑或彌漫性出血。病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞多發(fā)生壞死,腸道以彌漫性出血為主。鏡檢腸內(nèi)容物的涂片,可見到一種革蘭氏陽性、有莢膜的粗大桿菌。厭氧環(huán)境下培養(yǎng)后在TSC瓊脂平板上,形態(tài)為圓形、突起、表面光滑,菌落中央呈黑色。卵黃瓊脂平板上生長(zhǎng)呈灰色至灰黃色、表面光滑半透明的圓形菌落,菌落周圍及底部形成乳白色的混濁帶。細(xì)菌生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)氣莢膜梭菌結(jié)果一致。經(jīng)過多重PCR鑒定,產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只在324bp處出現(xiàn)一條亮帶。與NCBI的參考株序列進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)12個(gè)分離株的序列與其它已發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌序列同源性在97%以上,說明分離株為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。試驗(yàn)中我們將腸毒素和分離得到的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行了致病性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)小鼠和雛雞同樣具有很強(qiáng)的致病性。通過對(duì)流行鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌的分型,發(fā)現(xiàn)目前流行較多的依然是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。
董令贏[5]（2019）在《重組腐敗梭菌α毒素突變體的生物學(xué)特性及免疫原性研究》文中研究指明腐敗梭菌（Clostridium septicum）是人氣性壞疽和動(dòng)物惡性水腫的主要病原,也是羊快疫的病原,其產(chǎn)生的α毒素（Clostridium septicum alpha toxin,CSA）是其主要的致病因子和免疫原。由該菌引起的羊快疫發(fā)病急,往往來不及治療發(fā)病動(dòng)物即行死亡,因此疫苗免疫是預(yù)防該病的唯一有效措施。預(yù)防該病的疫苗均由腐敗梭菌強(qiáng)毒培養(yǎng)物經(jīng)甲醛滅活脫毒制成菌體-類毒素疫苗,由于生產(chǎn)過程中需要培養(yǎng)大量的強(qiáng)毒菌液,存在著一定生物安全隱患。因而,無毒重組腐敗梭菌α毒素疫苗已成為新型疫苗的研制熱點(diǎn)。本研究依據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子,優(yōu)化合成包含信號(hào)肽的腐敗梭菌α毒素全基因并連接至pEZ-clone質(zhì)粒,以該質(zhì)粒為模板采用OEPR（Overlap Extension PCR and Recombination）法構(gòu)建了表達(dá)CSA的重組質(zhì)粒pET28a-csa,以pET28a-csa為模板,利用點(diǎn)突變技術(shù),成功構(gòu)建7個(gè)不同腐敗梭菌α毒素突變體的表達(dá)載體(pET28a-csaC86L、pET28a-csaY118T、pET28a-csaTMD△212-222、pET28a-csaC86L/TMD△212-222、pET28a-csaY118T/TMD△212-222、pET28a-csaC86L/Y118T和pET28a-csaC86L/Y118T/TMD△212-222)并將其分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21,得到表達(dá)CSA和7個(gè)不同CSA突變體的重組菌。誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析結(jié)果表明,8個(gè)重組蛋白的分子量與預(yù)期大小一致,均以包涵體和可溶性兩種形式獲得表達(dá)。8個(gè)重組蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為rCSAC86L86L 5.86%、rCSAY118T118T 6.56%、rCSATMD△212-22212-222 15.4%、rCSAC86L/TMD△212-22212-222 12.7%、rCSAY118T/TMD△212-22212-222 12.9%、rCSAC86L/Y118T4.26%、rCSAC86L/Y118T/TMD△212-22212-222 11.9%、rCSA 7.11%,結(jié)果表明跨膜區(qū)的缺失可增加蛋白表達(dá)量。Western-blotting結(jié)果表明,所有的重組蛋白均可被腐敗梭菌α毒素高免血清識(shí)別,具有良好的反應(yīng)原性。小鼠毒性試驗(yàn)表明,rCSA對(duì)小鼠的致死量為0.1μg/只,rCSAY118T為1μg/只,兩者相比rCSAY118T對(duì)小鼠致死性下降10倍,表明CSA的Y118T突變,雖然降低了對(duì)小鼠的致死性,但并未完全消除其毒性,而rCSAC86L和rCSAC86L/Y118T 18μg/只、rCSAY118T/TMD△212-222 80μg/只、rCSATMD△212-222、rCSAC86L/TMD△212-222、rCSAC86L/Y118T/TMD△212-222 120μg/只均未致死小鼠,與rCSA相比,對(duì)小鼠的致死性分別至少下降了180、800和1200倍,表明這6個(gè)CSA突變體均已喪失了對(duì)小鼠的致死性。細(xì)胞試驗(yàn)表明,以rCSA 0.001μg/mL、rCSAY118T 0.5μg/mL的濃度接種Vero細(xì)胞即可引起細(xì)胞病變,而rCSAC86L/Y118T86L/Y118T 1μg/mL、rCSAC86L和rCSAY118T/TMD△212-22212-222 10μg/mL、rCSAC86L/TMD△212-22212-222 30μg/mL、rCSATMD△212-222和rCSAC86L/Y118T/TMD△212-22212-222 50μg/mL的濃度接種Vero細(xì)胞,均不引起細(xì)胞病變,與rCSA相比,rCSA突變體對(duì)細(xì)胞的毒性至少分別下降了500、1000、10000、30000和50000倍,結(jié)果表明除rCSAY118T仍具有一定細(xì)胞毒性外,其余rCSA突變體均已喪失了細(xì)胞毒性,且細(xì)胞毒性試驗(yàn)與小鼠毒性試驗(yàn)結(jié)果一致。溶血試驗(yàn)表明,rCSA具有溶血活性,而7個(gè)rCSA突變體均喪失了溶血活性。將rCSA及7個(gè)不同的rCSA突變體可溶性表達(dá)產(chǎn)物制備成氫氧化鋁膠疫苗,以200μg/只的劑量皮下注射家兔,間隔21天進(jìn)行二免,在免疫前（D0）、一免后21天（D21）、一免后35天（D35）分別進(jìn)行采血,并于D35以1MLD的腐敗梭菌毒素進(jìn)行攻毒。攻毒結(jié)果表明,除rCSAC86L/TMD△212-222免疫組（4/5）和rCSAY118T/TMD△212-222免疫組（2/4）外,其余各組均5/5保護(hù)。血清中和效價(jià)測(cè)定結(jié)果表明,一免后,rCSAC86L、rCSAY118T、rCSATMD△212-222、rCSAC86L/TMD△212-222、rCSAY118T/TMD△212-222、rCSAC86L/Y118T、rCSAC86L/Y118T/TMD△212-222、rCSA免疫組的血清中和效價(jià)（每0.1 mL的混合免疫血清可中和的腐敗梭菌毒素小鼠MLD數(shù)）分別為3、7、2、2、1、2、4、10;二免血清的中和效價(jià)分別為20、36、34、20、2、60、24、60。該結(jié)果也表明CSA的第118位的Y及跨膜區(qū)不僅與毒素的毒力相關(guān),也與毒素的免疫原性相關(guān)。綜合7個(gè)rCSA突變體蛋白的表達(dá)量、對(duì)小鼠的毒性、細(xì)胞毒性、血清中和效價(jià)及免疫攻毒保護(hù)結(jié)果,選取重組菌E.coli BL21(pET28a-csaTMD△212-222)進(jìn)行了rCSATMD△212-222表達(dá)條件的優(yōu)化以提高其可溶性蛋白的表達(dá)量,并對(duì)純化的rCSATMD△212-222的免疫原性進(jìn)行了進(jìn)一步的試驗(yàn)。結(jié)果表明,rCSATMD△212-222的最佳表達(dá)條件為在菌液OD600為0.8時(shí),加入0.5 mM的IPTG,于15℃誘導(dǎo)16 h,可使可溶部分表達(dá)量最大,蛋白表達(dá)量可達(dá)24.7%。純化的rCSATMD△212-222純度可達(dá)85%,以140μg/只的劑量靜脈注射,小鼠仍健活,以80μg/mL接種Vero細(xì)胞不引起細(xì)胞病變,表明rCSATMD△212-222已經(jīng)喪失了小鼠致死毒性和細(xì)胞毒性。將純化后的表達(dá)產(chǎn)物制備成氫氧化鋁膠疫苗,按25μg/只、50μg/只和100μg/只的劑量皮下免疫家兔,間隔21天二免,在免疫前（D0）、一免后21天（D21）、一免后35天（D35）分別進(jìn)行采血,并于D35以1 MLD的腐敗梭菌毒素進(jìn)行攻毒。一免后,25μg、50μg、100μg免疫組的血清中和效價(jià)為1、4和6;二免血清中和效價(jià)分別為68、72和58,二免后攻毒各組均5/5保護(hù)。綜上所述,本研究構(gòu)建的E.coli BL21(pET28a-csaTMD△212-222)菌株具有目的蛋白表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物無毒性、免疫原性好等特點(diǎn),可作為重組腐敗梭菌疫苗研制的候選菌株。
孟德志[6]（2019）在《諾維氏梭菌的培養(yǎng)、鑒定方法的建立及其α毒素單克隆抗體和多克隆抗體的制備》文中研究說明諾維氏梭菌（Clostridium novyi）曾被稱為水腫梭菌（Clostridium oedematiens）、水腫桿菌、第二型惡性水腫桿菌、巨大桿菌和水牛梭菌等,它是羊黑疫的致病菌。諾維氏梭菌廣泛存在于自然界特別是土壤之中,飼草被芽胞體污染后,經(jīng)羊采食,芽胞從胃腸壁經(jīng)目前尚未闡明的途徑到達(dá)肝臟引起發(fā)病。羊、牛均可感染。該菌可以使1歲以上的綿羊發(fā)病,山羊也可以患此病,牛僅偶發(fā)感染。由諾維氏梭菌引起的羊黑疫發(fā)病急,死亡快,家畜往往還沒有表現(xiàn)出明顯癥狀就死亡,部分病例可拖延12 d,但沒有超過3 d的,給畜牧業(yè)帶來了巨大損失。因此,亟需建立在羊群快速鑒定諾維氏梭菌的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù),如ELISA診斷方法等。諾維氏梭菌屬嚴(yán)格厭氧菌,其生長(zhǎng)繁殖對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求和環(huán)境要求高,常見的培養(yǎng)基不能滿足其需要。為了獲得高密度的細(xì)菌培養(yǎng)物,滿足實(shí)驗(yàn)室或疫苗生產(chǎn)的需要,須合成新的培養(yǎng)基;為了制備新的診斷試劑盒如ELISA試劑盒等,須制備天然毒素、單克隆抗體、多克隆抗體;為了獲得單克隆抗體和多克隆抗體,在天然毒素獲得困難的情況下,須用重組蛋白代替天然毒素。該病死亡快,為了實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)在羊群快速診斷,制備了諾維氏梭菌重組蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體,為構(gòu)建ELISA診斷方法等快速檢測(cè)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。本研究的主要目標(biāo)包括以下四個(gè)方面:探索諾維氏梭菌新型增菌培養(yǎng)基;設(shè)計(jì)合適引物對(duì)諾維氏梭菌進(jìn)行PCR鑒定;諾維氏梭菌天然毒素的SDS-PAGE鑒定;利用重組諾維氏梭菌ɑ毒素制備單克隆抗體和多克隆抗體。α毒素為A、B型諾維氏梭菌產(chǎn)生的主要致死性毒素,本研究首先選取合適的目的片段,對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化后生物合成目的片段,通過原核表達(dá),鎳柱純化后,得到了相對(duì)較純的重組諾維氏梭菌α毒素,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)所獲得的重組蛋白進(jìn)行蛋白純度檢測(cè)。使用鎳柱純化的方法純化重組蛋白對(duì)單克隆抗體的制備和多克隆抗體的制備起了至關(guān)重要的作用。本研究使用純化的重組α毒素蛋白對(duì)6-8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫,于加強(qiáng)免疫3 d后取免疫小鼠脾臟細(xì)胞,將其與骨髓瘤細(xì)胞F0進(jìn)行細(xì)胞融合。使用間接ELISA的方法來篩選,使用有限稀釋亞克隆的方法成功獲得了2株能夠穩(wěn)定分泌針對(duì)諾維氏梭菌α毒素重組蛋白的陽性雜交瘤細(xì)胞株。本研究選取生長(zhǎng)狀態(tài)好的陽性雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi),待小鼠腹部自然膨大后收集腹水。所收集的腹水使用正辛酸-硫酸銨純化方法進(jìn)行純化,從而獲得針對(duì)諾維氏梭菌α毒素重組蛋白的單克隆抗體。本研究成功制備了2株針對(duì)諾維氏梭菌α毒素重組蛋白的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為1978CT716.15.65、1978CT142.38.7。對(duì)所得2株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體進(jìn)行間接ELISA測(cè)抗體效價(jià),純化后的腹水抗體效價(jià),最高可達(dá)到1:512000。對(duì)所獲得的兩株雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行Western Blot分析可知,兩種單克隆抗體均能與重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。鑒于單克隆抗體具有生物活性單一、純度相對(duì)比較高且與抗原結(jié)合特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),我們可以利用單克隆抗體達(dá)到快速檢測(cè)疾病及治療疾病的目的。本研究將制備的針對(duì)諾維氏梭菌α毒素重組蛋白單克隆抗體進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分析和免疫印跡（Western-blot）分析,進(jìn)一步驗(yàn)證了該單克隆抗體的純度和反應(yīng)原性。本研究為構(gòu)建快速檢測(cè)諾維氏梭菌的檢測(cè)技術(shù)和檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。
李靜[7]（2015）在《我國(guó)三省部分地區(qū)羊四種病原感染情況調(diào)查》文中提出羊腹瀉是由多種原因引起羊的以拉稀為主要癥狀的一類疾病的總稱。近些年來一直困擾著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展,已經(jīng)成為羊養(yǎng)殖中影響羊的種群繁育速度和經(jīng)濟(jì)效益的主要疾病之一,應(yīng)引起高度重視。引起羊腹瀉的因素多而復(fù)雜,但以寄生蟲性病原和細(xì)菌性病原為主導(dǎo)因素。隱孢子蟲、賈第蟲和球蟲是引起羊腹瀉較為常見的寄生蟲性病原,這三種病原在世界范圍內(nèi)均有分布,羊均易感染。羊細(xì)菌性腹瀉病是一種以腹瀉為特征性癥狀的羊消化道疾病,嚴(yán)重影響羊早期的生長(zhǎng)發(fā)育,然而引起羊腹瀉的細(xì)菌性病原主要以羊魏氏梭菌和沙門氏菌為主,這二種細(xì)菌性病原危害最為嚴(yán)重。為了解致羊腹瀉的三種病原的流行情況,為羊腹瀉病的防治提供科學(xué)的參考和依據(jù)。根據(jù)不同地區(qū)和飼養(yǎng)方式,選取河南省的鄭州市、登封市、中牟縣、開封市、新鄉(xiāng)市、新密市、長(zhǎng)葛市、安陽市、南陽市、平頂山市以及安徽省合肥市、陜西省等地12個(gè)縣市的13個(gè)羊場(chǎng),共采集羊糞便樣品553份。經(jīng)顯微鏡檢查后發(fā)現(xiàn),球蟲感染率為88.61%,其中感染率最高為100%,最低為67.31%,感染強(qiáng)度最大為4200000（OPG）,隱孢子蟲感染率為1.27%,賈第蟲感染率為3.25%。對(duì)收集的糞便DNA樣品同時(shí)采用PCR法對(duì)隱孢子蟲、賈第蟲、魏氏梭菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果,基于SSUrRNA的nested-PCR共檢出50份隱孢子蟲陽性樣品,基于16SrRNA的nested-PCR共檢出39份賈第蟲陽性樣品,隱孢子蟲和賈第蟲感染率分別為9.04%（50/553）、7.05%（39/553）;基于ɑ毒素基因的常規(guī)PCR共檢出13份魏氏梭菌陽性樣品,感染率為2.35%（13/553）。幼齡羊的隱孢子蟲、賈第蟲和魏氏梭菌感染率明顯高于成年羊,其中幼齡羊的感染率分別為13.02%（41/315）、8.25%（26/315）、2.86%（9/315）,成年羊的感染率分別為4.04%（8/198）、6.57%（13/198）、2.02%（4/198）;放牧羊的隱孢子蟲、賈第蟲和魏氏梭菌的感染率分別為31.34%（21/67）、7.46%（5/67）、5.97%（4/67）,舍飼羊的感染率分別為5.97%（29/486）、7.00%（34/486）、1.85%（9/486）;綿羊隱孢子蟲、賈第蟲、魏氏梭菌的感染率分別為9.28%（31/334）、8.08%（27/334）、3.59%（12/334）,山羊的感染率分別為8.68%（19/219）、5.48%（12/219）、0.46%（1/219）,綿羊感染率均高于山羊。為了確定引起羊腹瀉的各個(gè)病原的種類,將擴(kuò)增出的陽性樣品序列擴(kuò)增后分別在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì),下載相關(guān)參考序列,應(yīng)用Clustalⅹ2.11軟件分別進(jìn)行序列比對(duì),鑒定出致病種。在本次調(diào)查的羊糞便樣品中共鑒出3個(gè)隱孢子蟲蟲種,分別是C.ubiquitum（N=27）、C.xiaoi（N=19）、C.parvum（N=4）;賈第蟲經(jīng)鑒定分別為集聚體A（N=1）和集聚體E（N=38）;魏氏梭菌經(jīng)鑒定分屬于A型（N=9）、C型（N=2）和D型（N=2）。其中C.parvum、C.ubiquitum、賈第蟲集聚體A和魏氏梭菌A、C型均屬人畜共患的病原種類,應(yīng)引起高度重視。本研究表明羊腹瀉病原在各種年齡和飼養(yǎng)方式中普遍存在,實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)該病已經(jīng)嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和健康發(fā)展,其中的人畜共患性寄生蟲和細(xì)菌性病原是人類健康的潛在威脅。所以,對(duì)引起羊腹瀉的重要病原應(yīng)盡早做出準(zhǔn)確診斷,采取有效的綜合預(yù)防措施。本研究為羊腹瀉的診斷和防控提供技術(shù)手段和參考依據(jù)。
郎利敏,王克領(lǐng),游一,張立憲,張清嫻[8]（2008）在《家兔魏氏梭菌病的診治》文中研究說明
李云霄[9]（2008）在《Dot-ELISA檢測(cè)牛D型產(chǎn)氣莢膜梭菌病抗體的研究》文中指出產(chǎn)氣莢膜梭菌（Cl.perfringens）是一種梭狀芽孢屬條件性致病菌,該病廣泛分布于自然界,在一定條件下,可引起嚴(yán)重的犢牛腸毒血癥,甚至死亡。而針對(duì)該病菌體蛋白產(chǎn)生的特異抗體尚無一套完整的血清學(xué)檢測(cè)方法。因此,本研究目的是以純化的菌體蛋白建立一種快速、準(zhǔn)確、敏感的血清學(xué)診斷方法。本試驗(yàn)成功地以Cl.perfringens D型標(biāo)準(zhǔn)株C60的菌體經(jīng)過超聲波裂解后,進(jìn)行了SephadexG-200凝膠柱純化、SDS-PAGE和Western blot分析,提純的140KD大小的Cl.perfringens菌體蛋白與牛血清中D型Cl.perfringens抗體具有良好的特異性反應(yīng)。因此,純化后的Cl.perfringens140KD菌體蛋白可以用于建立牛D型Cl.perfringens病間接Dot-ELISA的診斷抗原。本試驗(yàn)對(duì)間接Dot-ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了最適工作條件。結(jié)果表明,試驗(yàn)流程中最適抗原包被濃度1.95μg/mL、最適血清稀釋度1∶320及最適酶標(biāo)兔抗牛IgG的工作濃度1∶2 000;采用Dot-ELISA檢測(cè)同一份1∶320倍稀釋的陽性血清抗體時(shí)粗提抗原的濃度為40.6μg/mL時(shí),而提純抗原的濃度僅為1.9μg/mL;應(yīng)用提純抗原的Dot-ELISA對(duì)100份牛血清進(jìn)行檢測(cè),敦化地區(qū)陽性率最高;用二抗體間接Dot-ELISA和AGID同時(shí)檢測(cè)30份陽性血清的抗體滴度,結(jié)果二法所測(cè)抗體平均滴度分布為1∶736和1∶17,間接Dot-ELISA的相對(duì)靈敏度為AGID的43倍;而且所建立的二抗體間接Dot-ELISA不與牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病A、B、C、E型陽性血清反應(yīng),表明該法具有較高的特異性。本試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用純化的D型Cl.perfringens菌體蛋白為抗原,成功建立了檢測(cè)牛血清中D型Cl.perfringens抗體的間接Dot-ELISA診斷方法,所建立的Dot-ELISA法除了具有ELISA的高度特異性和敏感性之外,還具有抗原用量少,快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),為牛產(chǎn)氣莢膜梭菌病診斷和預(yù)防提供了一種可靠的試驗(yàn)手段。
張營(yíng)[10]（2007）在《延邊黃牛D型魏氏梭菌病間接ELISA診斷方法的建立》文中研究說明魏氏梭菌是一種梭狀芽孢屬條件性致病菌，該病廣泛分布于自然界，是腸道中的常在菌群之一。在一定條件下，可引起機(jī)體嚴(yán)重的疾病。延邊地區(qū)是魏氏梭菌病的高發(fā)區(qū)，尤其對(duì)延邊黃牛的危害極為嚴(yán)重。而針對(duì)該病的檢測(cè)尚無一套完整的血清學(xué)技術(shù)，因此，本研究將提取的D型魏氏梭菌制成菌體抗原，并建立了檢測(cè)該病的間接ELISA方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)間接ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索，確定了最適工作條件。結(jié)果表明，美國(guó)Costar公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板的變異系數(shù)為4.5％，達(dá)到間接ELISA的要求；D型魏氏梭菌菌體裂解抗原最適包被濃度為50μg／ml，最適包被條件為37℃1h；被檢血清的最適稀釋度為1：100，酶標(biāo)二抗的最適工作濃度為1：1000，血清與酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間均為37℃1h；最適封閉時(shí)間為37℃1h；PBST稀釋液中脫脂乳的濃度為3％；底物最適反應(yīng)條件為室溫25min；陰陽性臨界值為0.032。經(jīng)特異性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)，表明建立的間接ELISA方法是特異的，且重復(fù)性好；對(duì)采集于延邊地區(qū)的100份牛血清樣品進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果陽性率為11％。本試驗(yàn)應(yīng)用D型魏氏梭菌菌體裂解抗原為抗原，成功建立了一種檢測(cè)延邊黃牛血清中D型魏氏梭菌抗體的間接ELISA診斷方法，為延邊黃牛D型魏氏梭菌疾病免疫監(jiān)測(cè)和血清學(xué)調(diào)查提供了一種快捷、敏感、特異的血清學(xué)診斷方法。
二、綿羊腐敗梭菌與魏氏梭菌混合感染的診斷報(bào)告（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、綿羊腐敗梭菌與魏氏梭菌混合感染的診斷報(bào)告（論文提綱范文）
（1）奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及污染牛奶的風(fēng)險(xiǎn)因素分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一章 奶牛場(chǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌污染檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究進(jìn)展 |
| 1.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學(xué)特性 |
| 1.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行與危害 |
| 1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)方法 |
| 1.3.1 Taq Man探針熒光定量PCR方法 |
| 1.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) |
| 1.4 動(dòng)物性食品微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 |
| 1.4.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 |
| 1.4.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在牛奶生產(chǎn)過程中的應(yīng)用 |
| 1.5 本研究的目的與意義 |
| 試驗(yàn)研究 |
| 第二章 奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要試劑 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 樣品采集 |
| 2.2.2 多重?zé)晒舛縋CR方法的建立 |
| 2.2.3 敏感性檢測(cè) |
| 2.2.4 樣品檢測(cè) |
| 2.2.5 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離純化 |
| 2.3 結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 多重?zé)晒舛縋CR方法的建立 |
| 2.3.2 敏感性檢測(cè) |
| 2.3.3 樣品檢測(cè)及細(xì)菌分離純化 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第三章 奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的風(fēng)險(xiǎn)因素分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株與主要試劑 |
| 3.1.2 主要儀器設(shè)備 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 樣品采集 |
| 3.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌污染量檢測(cè) |
| 3.2.3 牛奶中產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立 |
| 3.2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌污染牛奶的風(fēng)險(xiǎn)因素分析 |
| 3.2.5 敏感性分析 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌污染量檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.2 牛奶中產(chǎn)氣莢膜梭菌預(yù)測(cè)模型的建立 |
| 3.3.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌污染牛奶的風(fēng)險(xiǎn)因素分析 |
| 3.3.4 敏感性分析 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 附錄 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
（2）腐敗梭菌α毒素阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的建立（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略詞表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 梭菌屬概述 |
| 1.1.1 梭菌屬生物特性 |
| 1.1.2 主要致病性梭菌概述 |
| 1.2 腐敗梭菌研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 病原學(xué) |
| 1.2.2 流行病學(xué) |
| 1.2.3 臨床癥狀 |
| 1.2.4 病理變化 |
| 1.2.5 致病機(jī)理 |
| 1.2.6 診斷 |
| 1.2.7 防治 |
| 1.3 腐敗梭菌α毒素 |
| 1.3.1 α毒素的理化特性及生物學(xué)特性 |
| 1.3.2 α毒素的結(jié)構(gòu)與功能 |
| 1.3.3 α毒素的免疫原性 |
| 1.4 本研究的目的與意義 |
| 第二章 腐敗梭菌α毒素制備 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 主要試劑與耗材 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 腐敗梭菌天然α毒素制備 |
| 2.3.2 重組腐敗梭菌α毒素?zé)o毒突變體制備 |
| 2.4 結(jié)果 |
| 2.4.1 腐敗梭菌天然α毒素制備 |
| 2.4.2 重組腐敗梭菌α毒素?zé)o毒突變體制備 |
| 2.5 討論 |
| 2.6 小結(jié) |
| 第三章 單克隆抗體的制備與鑒定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 主要試劑與耗材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 小鼠免疫 |
| 3.3.2 細(xì)胞融合 |
| 3.3.3 單克隆抗體篩選 |
| 3.3.4 單克隆抗體亞型鑒定 |
| 3.3.5 單克隆抗體針對(duì)抗原表位鑒定 |
| 3.3.6 細(xì)胞中和試驗(yàn) |
| 3.3.7 單克隆抗體的大量制備 |
| 3.3.8 單克隆抗體的純化及效價(jià)測(cè)定 |
| 3.3.9 單克隆抗體特異性鑒定 |
| 3.3.10 單克隆抗體親和常數(shù)測(cè)定 |
| 3.4 結(jié)果與分析 |
| 3.4.1 小鼠免疫 |
| 3.4.2 細(xì)胞融合 |
| 3.4.3 陽性雜交瘤孔的克隆 |
| 3.4.4 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 |
| 3.4.5 單克隆抗體亞型鑒定 |
| 3.4.6 單克隆抗體針對(duì)抗原表位鑒定 |
| 3.4.7 中和試驗(yàn) |
| 3.4.8 腹水制備 |
| 3.4.9 單克隆抗體純化效果鑒定 |
| 3.4.10 單克隆抗體特異性鑒定 |
| 3.4.11 單克隆抗體親和常數(shù)測(cè)定結(jié)果 |
| 3.5 討論 |
| 3.6 小結(jié) |
| 第四章 阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 主要試劑與耗材 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 制備包被抗原 |
| 4.3.2 阻斷ELISA基本操作步驟 |
| 4.3.3 最佳抗原包被濃度以及陰、陽性血清工作濃度的確定 |
| 4.3.4 單抗以及酶標(biāo)抗體工作濃度的確定 |
| 4.3.5 包被液以及包被條件的確定 |
| 4.3.6 封閉液以及封閉條件的確定 |
| 4.3.7 單克隆抗體作用條件的確定 |
| 4.3.8 底物顯色液作用條件的確定 |
| 4.3.9 陰陽性臨界值的確定 |
| 4.3.10 特異性試驗(yàn) |
| 4.3.11 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 4.3.12 阻斷ELISA與細(xì)胞中和試驗(yàn)相關(guān)性測(cè)定 |
| 4.3.13 阻斷ELISA與小鼠中和試驗(yàn)相關(guān)性測(cè)定 |
| 4.4 結(jié)果 |
| 4.4.1 最佳抗原包被濃度以及陰、陽性血清工作濃度的確定 |
| 4.4.2 單抗及酶標(biāo)抗體工作條件的確定 |
| 4.4.3 包被液以及包被條件的確定 |
| 4.4.4 封閉液以及封閉條件的確定 |
| 4.4.5 單抗作用條件的確定 |
| 4.4.6 底物顯色液作用條件的確定 |
| 4.4.7 陰、陽性臨界值的確定 |
| 4.4.8 特異性試驗(yàn) |
| 4.4.9 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 4.4.10 阻斷ELISA與細(xì)胞中和試驗(yàn)相關(guān)性 |
| 4.4.11 阻斷ELISA與小鼠中和試驗(yàn)相關(guān)性 |
| 4.5 討論 |
| 4.6 小結(jié) |
| 第五章 結(jié)論 |
| 第六章 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
（3）互助藏羊梭菌病病原體的分離鑒定與分析（論文提綱范文）
| 1 材料與方法 |
| 1.1 流行病學(xué)資料與樣品采集 |
| 1.2 主要試劑儀器 |
| 1.3 細(xì)菌學(xué)檢測(cè) |
| 1.4 分子鑒定 |
| 1.5 基因序列比較與進(jìn)化分析 |
| 1.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn) |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 鏡檢結(jié)果 |
| 2.2 分子鑒定結(jié)果 |
| 2.3 基因同源性分析 |
| 2.4 基因進(jìn)化分析 |
| 2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn) |
| 3 討論 |
（4）山東地區(qū)鹿腸毒血癥的綜合診斷及致病性研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文縮略詞表 |
| 前言 |
| 1.1 國(guó)內(nèi)流行狀況及危害 |
| 1.2 病原形態(tài)及生化特征 |
| 1.3 細(xì)菌的類型及毒素的生物學(xué)研究 |
| 1.4 致病機(jī)制 |
| 1.5 病理學(xué)變化 |
| 1.6 診斷方法 |
| 1.7 本試驗(yàn)的研究目的和意義 |
| 試驗(yàn)一 鹿腸毒血癥的綜合診斷 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 樣品采集 |
| 1.2 儀器設(shè)備 |
| 1.3 試劑配制 |
| 1.4 方法與步驟 |
| 1.4.1 臨床診斷 |
| 1.4.2 病理組織學(xué)診斷 |
| 1.4.3 顯微鏡檢查 |
| 1.4.4 生化鑒定檢測(cè) |
| 1.4.5 應(yīng)用多重PCR進(jìn)行鑒定和分型 |
| 1.4.6 PCR產(chǎn)物膠回收及鑒定 |
| 1.4.7 連接 |
| 1.4.8 DH5α的制備 |
| 1.4.9 轉(zhuǎn)化 |
| 1.4.10 重組質(zhì)粒鑒定 |
| 1.4.11 測(cè)序分析 |
| 1.4.12 藥敏試驗(yàn) |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 流行病學(xué)分析 |
| 2.2 臨床癥狀 |
| 2.3 剖檢病變 |
| 2.4 病理組織學(xué)檢測(cè) |
| 2.5 病料涂片鏡檢結(jié)果 |
| 2.6 細(xì)菌的分離培養(yǎng) |
| 2.7 細(xì)菌生化鑒定的結(jié)果 |
| 2.8 多重PCR鑒定結(jié)果 |
| 2.9 同源性及進(jìn)化分析 |
| 2.10 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.11 干預(yù)治療 |
| 3 討論 |
| 試驗(yàn)二 鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性試驗(yàn) |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2 試驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 腸內(nèi)容物毒素測(cè)定結(jié)果 |
| 2.2 分離菌毒力測(cè)定結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
（5）重組腐敗梭菌α毒素突變體的生物學(xué)特性及免疫原性研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略詞表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 腐敗梭菌概述 |
| 1.1.1 病原學(xué) |
| 1.1.2 致病性 |
| 1.1.3 臨床癥狀和病理變化 |
| 1.1.4 診斷 |
| 1.1.5 免疫與防控 |
| 1.2 腐敗梭菌α毒素的研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 α 毒素的一般特性 |
| 1.2.2 α 毒素的結(jié)構(gòu)與功能 |
| 1.2.3 α 毒素的致病機(jī)理 |
| 1.2.4 α 毒素的免疫原性 |
| 1.3 本研究的目的與意義 |
| 第二章 重組腐敗梭菌α毒素突變表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株、載體和細(xì)胞 |
| 2.2.2 主要試劑 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 腐敗梭菌α毒素基因的擴(kuò)增 |
| 2.3.2 重組表達(dá)載體pET28a-csa的構(gòu)建 |
| 2.3.3 不同重組腐敗梭菌α毒素突變表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.4 結(jié)果 |
| 2.4.1 腐敗梭菌α毒素密碼子的優(yōu)化 |
| 2.4.2 腐敗梭菌α毒素基因的擴(kuò)增 |
| 2.4.3 重組表達(dá)載體pET28a-csa的構(gòu)建 |
| 2.4.4 重組表達(dá)載體pET28a-csa的序列測(cè)定 |
| 2.4.5 不同重組腐敗梭菌α毒素突變表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.4.6 不同重組腐敗梭菌α毒素突變表達(dá)載體的序列測(cè)定 |
| 2.5 討論 |
| 2.6 小結(jié) |
| 第三章 不同rCSA突變體的表達(dá)與生物活性鑒定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 |
| 3.2.2 毒素、抗體與血清 |
| 3.2.3 主要試劑 |
| 3.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 重組α毒素及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 3.3.2 重組α毒素及其突變體的生物特性研究 |
| 3.4 結(jié)果 |
| 3.4.1 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 3.4.2 重組α毒素及其突變體的生物特性研究 |
| 3.5 討論 |
| 3.6 小結(jié) |
| 第四章 不同重組腐敗梭菌α毒素突變體的免疫原性比較 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株、毒素與抗體 |
| 4.2.2 主要試劑 |
| 4.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 不同重組α毒素突變體的制備 |
| 4.3.2 不同重組α毒素突變體的濃度測(cè)定 |
| 4.3.3 不同重組α毒素突變體疫苗的制備 |
| 4.3.4 不同重組α毒素突變體的免疫原性比較 |
| 4.4 結(jié)果 |
| 4.4.1 不同重組α毒素突變體的濃度測(cè)定 |
| 4.4.2 疫苗的檢驗(yàn) |
| 4.4.3 不同重組α毒素突變體的免疫原性比較 |
| 4.5 討論 |
| 4.6 小結(jié) |
| 第五章 rCSA_(TMD△212-222)表達(dá)條件優(yōu)化、表達(dá)產(chǎn)物的生物活性及免疫原性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 菌株、毒素與抗體 |
| 5.2.2 主要試劑 |
| 5.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 重組菌表達(dá)條件的優(yōu)化 |
| 5.3.2 重組蛋白rCSA_(TMD△212-222)的純化 |
| 5.3.3 重組蛋白rCSA_(TMD△212-222)的生物活性鑒定 |
| 5.3.4 重組α毒素突變體rCSA_(TMD△212-222)疫苗的制備 |
| 5.3.5 不同免疫劑量rCSA_(TMD△212-222)疫苗免疫效果的比較 |
| 5.4 結(jié)果 |
| 5.4.1 重組菌表達(dá)條件的優(yōu)化 |
| 5.4.2 重組蛋白rCSA_(TMD△212-222)的純化 |
| 5.4.3 重組蛋白rCSA_(TMD△212-222)的生物活性鑒定 |
| 5.4.4 重組α毒素突變體rCSA_(TMD△212-222)疫苗的制備 |
| 5.4.5 不同免疫劑量rCSA_(TMD△212-222)疫苗的免疫效果比較 |
| 5.5 討論 |
| 5.6 小結(jié) |
| 第六章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄1 pET-28a-c(+)載體 |
| 附錄2 OEPR法構(gòu)建重組質(zhì)粒示意圖 |
| 附錄3 試驗(yàn)用主要溶液和培養(yǎng)基的配制 |
| 附錄4 試驗(yàn)用主要儀器和設(shè)備 |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)歷 |
（6）諾維氏梭菌的培養(yǎng)、鑒定方法的建立及其α毒素單克隆抗體和多克隆抗體的制備（論文提綱范文）
| 項(xiàng)目資助 |
| 符號(hào)說明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 諾維氏梭菌介紹 |
| 1.2 相關(guān)菌介紹 |
| 1.2.1 腐敗梭菌 |
| 1.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌 |
| 1.3 諾維氏梭菌培養(yǎng)現(xiàn)狀 |
| 1.4 PCR技術(shù) |
| 1.5 本課題的研究目的及意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株及細(xì)胞 |
| 2.1.2 主要的試劑及溶液的配制 |
| 2.1.3 主要試驗(yàn)儀器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌種復(fù)蘇 |
| 2.2.2 菌種保存 |
| 2.2.3 諾維氏梭菌增菌培養(yǎng)基探索 |
| 2.2.4 諾維梭菌、腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR檢測(cè) |
| 2.2.5 天然毒素的制備 |
| 2.2.6 諾維氏梭菌α天然毒素蛋白鑒定的SDS-PAGE檢測(cè)技術(shù) |
| 2.2.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染 |
| 2.2.8 諾維氏梭菌重組蛋白的原核表達(dá) |
| 2.2.9 單克隆抗體的制備 |
| 2.2.10 BALB/c小鼠單克隆抗體腹水的制備 |
| 2.2.11 BALB/c小鼠單克隆抗體腹水的純化 |
| 2.2.12 單克隆抗體的效價(jià)檢測(cè) |
| 2.2.13 單克隆抗體特異性的鑒定 |
| 2.2.14 陽性雜交瘤細(xì)胞株分泌單克隆抗體穩(wěn)定性的測(cè)定 |
| 2.2.15 小鼠單克隆抗體Ig亞類的鑒定 |
| 2.2.16 多克隆抗體的制備 |
| 3 結(jié)果和分析 |
| 3.1 菌株培養(yǎng)及其特性分析結(jié)果 |
| 3.2 諾維氏梭菌增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)效果 |
| 3.3 諾維梭菌的PCR檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 |
| 3.3.2 PCR檢測(cè)的特異性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.3 PCR檢測(cè)的臨床應(yīng)用效果 |
| 3.4 諾維氏梭菌天然毒素的純化結(jié)果 |
| 3.5 諾維氏梭菌動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn) |
| 3.6 諾維氏梭菌α毒素重組蛋白的原核表達(dá) |
| 3.6.1 基因合成和構(gòu)建結(jié)果 |
| 3.6.2 質(zhì)粒構(gòu)建酶切結(jié)果 |
| 3.6.3 諾維氏梭菌重組蛋白表達(dá)結(jié)果 |
| 3.6.4 諾維氏梭菌重組蛋白Western Blot驗(yàn)證結(jié)果 |
| 3.7 諾維氏梭菌單克隆抗體的制備結(jié)果 |
| 3.7.1 免疫BALB/c小鼠抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.7.2 陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立結(jié)果 |
| 3.7.3 雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況 |
| 3.8 陽性雜交瘤細(xì)胞株分泌單克隆抗體穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 |
| 3.9 單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果 |
| 3.10 腹水的純化及濃度測(cè)定結(jié)果 |
| 3.11 單克隆抗體的特性鑒定 |
| 3.11.1 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.11.2 單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果 |
| 3.11.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.12 諾維氏梭菌多克隆抗體的制備結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 4.1 選取重組蛋白的原因 |
| 4.2 天然α毒素的制備及純化 |
| 4.3 雜交瘤細(xì)胞的融合和篩選 |
| 4.4 陽性雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng) |
| 4.5 單克隆抗體的純化 |
| 4.6 單克隆抗體特異性的鑒定 |
| 4.7 多克隆抗體的制備 |
| 4.8 單克隆抗體和多克隆抗體制備出來的意義 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
| 發(fā)表論文情況 |
（7）我國(guó)三省部分地區(qū)羊四種病原感染情況調(diào)查（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 摘要 |
| 第一部分 文獻(xiàn)綜述 |
| 引言 |
| 1 隱孢子蟲研究及流行概況 |
| 2.羊賈第蟲研究及流行概況 |
| 3 魏氏梭菌概況 |
| 第二部分 研究?jī)?nèi)容 |
| 第一章 三種致羊腹瀉腸道寄生蟲的感染情況調(diào)查 |
| 引言 |
| 1.材料與方法 |
| 2.結(jié)果與分析 |
| 3.結(jié)論與討論 |
| 第二章 致羊腹瀉的三種病原的分子鑒定 |
| 引言 |
| 1.材料與方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 3 結(jié)論與討論 |
| 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 英文摘要 |
（8）家兔魏氏梭菌病的診治（論文提綱范文）
| 1 臨床癥狀 |
| 2 病理變化 |
| 3實(shí)驗(yàn)室診斷 |
| 3.1鏡檢 |
| 3.2細(xì)菌培養(yǎng) |
| 3.3細(xì)菌生化反應(yīng) |
| 4防治措施 |
| 4.1消毒與隔離 |
| 4.2西藥治療 |
| 4.3中藥治療 |
| 5小結(jié) |
（9）Dot-ELISA檢測(cè)牛D型產(chǎn)氣莢膜梭菌病抗體的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 病原體簡(jiǎn)介 |
| 2 毒素 |
| 3 流行病學(xué)及其臨床特征 |
| 4 產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)人類的危害 |
| 5 產(chǎn)氣莢膜梭菌診斷方法研究進(jìn)展 |
| 6 防治措施 |
| 7 本課題研究的目的和意義 |
| 材料與方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)所用材料 |
| 1.2 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗原分離所用材料 |
| 1.3 SDS-PAGE和Western blotting所用材料 |
| 1.4 Dot-ELISA所用材料 |
| 1.5 抗原及血清樣本 |
| 1.6 試驗(yàn)儀器 |
| 2 方法 |
| 2.1 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng) |
| 2.2 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 |
| 2.3 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌純化抗原制備研究 |
| 2.4 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌純化菌體蛋白反應(yīng)原性分析 |
| 2.5 Dot-ELISA操作程序 |
| 2.6 Dot-ELISA最適工作條件選擇 |
| 2.7 不同載體膜的選擇 |
| 2.8 特異性試驗(yàn) |
| 2.9 敏感性試驗(yàn) |
| 2.10 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 2.11 比較試驗(yàn) |
| 2.12 對(duì)樣本血清的檢測(cè) |
| 2.13 保存期試驗(yàn) |
| 結(jié)果 |
| 1 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng) |
| 2 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 |
| 3 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗原分析 |
| 4 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌純化菌體抗原SDS-PAGE分析 |
| 5 純化菌體抗原Western blot分析 |
| 6 Dot-ELISA反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn) |
| 7 Dot-ELISA程序的標(biāo)準(zhǔn)化 |
| 8 不同載體的比較 |
| 9 特異性試驗(yàn) |
| 10 敏感性試驗(yàn) |
| 11 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 12 比較試驗(yàn) |
| 13 間接Dot-ELISA對(duì)血清樣本檢測(cè) |
| 14 膜片保存期試驗(yàn) |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
| 附錄(攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文目錄) |
（10）延邊黃牛D型魏氏梭菌病間接ELISA診斷方法的建立（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 病原體 |
| 2 毒素 |
| 3 流行病學(xué) |
| 4 臨床癥狀 |
| 5 病理變化 |
| 6 魏氏梭菌對(duì)人的危害 |
| 7 診斷方法 |
| 8 防治措施 |
| 9 本課題研究的目的和意義 |
| 1 材料 |
| 1.1 制備抗原所用試劑 |
| 1.2 間接ELISA所用試劑 |
| 1.3 主要儀器 |
| 1.4 試驗(yàn)用抗原及血清 |
| 2 方法 |
| 2.1 D型魏氏梭菌菌體裂解抗原制備 |
| 2.2 間接ELISA方法的建立 |
| 2.3 間接ELISA方法特異性和重復(fù)性試驗(yàn) |
| 2.4 間接ELISA方法與瓊脂擴(kuò)散方法的比較試驗(yàn) |
| 2.5 現(xiàn)地血清樣品的檢測(cè) |
| 結(jié)果 |
| 1 D型魏氏梭菌菌體裂解抗原的制備 |
| 2 間接ELISA方法的建立 |
| 2.1 反應(yīng)板均一性的測(cè)定 |
| 2.2 抗原最適包被濃度及陰陽性血清最適稀釋度的確定 |
| 2.3 抗原的最適包被溫度及最適包被時(shí)間的確定 |
| 2.4 血清最適作用時(shí)間的確定 |
| 2.5 酶標(biāo)二抗最適工作濃度及最適作用時(shí)間的確定 |
| 2.6 PBST稀釋液中封閉液濃度的確定 |
| 2.7 底物最適顯色時(shí)間的確定 |
| 2.8 間接ELISA方法陰陽性臨界值的確定 |
| 3 間接ELISA方法的特異性和重復(fù)性試驗(yàn) |
| 3.1 特異性試驗(yàn) |
| 3.2 板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) |
| 3.3 板間重復(fù)性試驗(yàn) |
| 4 間接ELISA方法與瓊脂擴(kuò)散方法的比較試驗(yàn) |
| 5 現(xiàn)地血清樣品的檢測(cè) |
| 討論 |
| 1 各種條件對(duì)間接LEISA的影響 |
| 2 間接LEISA實(shí)驗(yàn)的特異性 |
| 3 間接LEISA實(shí)驗(yàn)的敏感性 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)介 |
四、綿羊腐敗梭菌與魏氏梭菌混合感染的診斷報(bào)告（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]奶牛養(yǎng)殖和擠奶過程中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及污染牛奶的風(fēng)險(xiǎn)因素分析[D]. 李一鳴. 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2021(01)
- [2]腐敗梭菌α毒素阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[D]. 張秀坤. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 2020(09)
- [3]互助藏羊梭菌病病原體的分離鑒定與分析[J]. 雷有菊,王文勇,張學(xué)勇. 青海畜牧獸醫(yī)雜志, 2019(04)
- [4]山東地區(qū)鹿腸毒血癥的綜合診斷及致病性研究[D]. 朱凱宗. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019(03)
- [5]重組腐敗梭菌α毒素突變體的生物學(xué)特性及免疫原性研究[D]. 董令贏. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 2019(08)
- [6]諾維氏梭菌的培養(yǎng)、鑒定方法的建立及其α毒素單克隆抗體和多克隆抗體的制備[D]. 孟德志. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019(01)
- [7]我國(guó)三省部分地區(qū)羊四種病原感染情況調(diào)查[D]. 李靜. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015(08)
- [8]家兔魏氏梭菌病的診治[J]. 郎利敏,王克領(lǐng),游一,張立憲,張清嫻. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(11)
- [9]Dot-ELISA檢測(cè)牛D型產(chǎn)氣莢膜梭菌病抗體的研究[D]. 李云霄. 延邊大學(xué), 2008(03)
- [10]延邊黃牛D型魏氏梭菌病間接ELISA診斷方法的建立[D]. 張營(yíng). 延邊大學(xué), 2007(06)
標(biāo)簽：產(chǎn)氣莢膜梭菌論文; 單克隆抗體技術(shù)論文; 畜牧業(yè)論文;