一、超嗜熱菌中逆促旋酶的研究進(jìn)展（論文文獻(xiàn)綜述）
莊瀅潭,劉芮存,陳雨露,楊岑玥,余巖,王濤,王友亮,宋亞軍,滕越[1]（2022）在《極端微生物及其應(yīng)用研究進(jìn)展》文中提出極端微生物是指在高/低溫、高/低p H、高鹽、高壓等極端環(huán)境條件下生存的微生物.特殊的生存條件導(dǎo)致其具有特殊的遺傳背景和代謝途徑,并可產(chǎn)生功能特殊的酶類和活性物質(zhì).隨著系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,極端微生物作為一類特殊的微生物群體,在生物醫(yī)療、生物能源和生物材料等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力.極端微生物相關(guān)研究也對生命起源與演化、生物工程技術(shù)等領(lǐng)域的發(fā)展具有重大意義.本文對極端環(huán)境及極端微生物的概念和分類進(jìn)行了回顧,綜述了極端微生物在不同環(huán)境條件下的適應(yīng)機(jī)制及其酶的應(yīng)用,并介紹了合成生物學(xué)在極端微生物研究中的應(yīng)用情況.此外,由于極端微生物和極端酶的特殊性和高效性,本文還探討了極端微生物開發(fā)過程中的挑戰(zhàn),以及其在航空航天與國防安全領(lǐng)域的綜合應(yīng)用潛力,并指出了相關(guān)研究的必要性.
代瑞陽[2]（2017）在《新型GyrB/ParE抑制劑和LpxC抑制劑的設(shè)計(jì)合成與生物活性評(píng)價(jià)》文中指出由細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染已經(jīng)成為人類健康和生命的重大威脅。其中多藥耐藥的革蘭陰性菌最難以防治,然而相應(yīng)的抗菌藥物卻十分稀缺。因此,臨床上迫切需要安全、有效的抗革蘭陰性菌藥物。細(xì)菌II型拓?fù)洚悩?gòu)酶,即細(xì)菌DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV是細(xì)菌DNA復(fù)制和細(xì)胞存活所必需的關(guān)鍵酶,是所有細(xì)菌共有的組成成分,也是重要的抗菌藥靶點(diǎn)。兩種酶均是由兩類亞基所組成的四聚體（[（GyrA）2（GyrB）2]和[（ParC）2（ParE）2]）。近年來發(fā)現(xiàn)的Gyr B/ParE雙靶點(diǎn)抑制劑,作用于GyrB亞基和ParE亞基的ATP水解酶區(qū)域,通過競爭性抑制ATP水解,阻斷酶催化反應(yīng)的能量供應(yīng),進(jìn)而抑制細(xì)菌DNA復(fù)制,導(dǎo)致細(xì)菌死亡,是區(qū)別于喹諾酮類藥物的一類具有全新作用機(jī)制的抑制劑。一些化合物如Vertex公司的苯并咪唑脲系列和Tirus公司的三環(huán)系列還具有不錯(cuò)的抗革蘭陰性菌活性,因而具有非常好的研究前景。脂多糖（LPS）層是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外層所特有的結(jié)構(gòu),而其組分之一的類脂A（Lipid A）負(fù)責(zé)將LPS錨定在細(xì)胞外膜上,進(jìn)而防止外來物質(zhì)的侵入。研究表明類脂A對革蘭陰性菌的生長至關(guān)重要,抑制其合成能導(dǎo)致細(xì)菌死亡。而LpxC是類脂A生物合成中所必需的一個(gè)金屬蛋白酶,且在革蘭陰性菌中廣泛存在。該酶能被小分子金屬蛋白酶抑制劑所抑制,是很有吸引力的抗菌藥物靶點(diǎn)。我們根據(jù)DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV中ATP水解酶與小分子抑制劑的結(jié)合模式,利用藥效團(tuán)拼接、生物電子等排、基團(tuán)替換等方法將具有抗革蘭陰性菌活性的苯并咪唑系列的母核與Tirus公司三環(huán)系列中對發(fā)揮抗革蘭陰性菌活性起重要作用的氨基片段相結(jié)合,設(shè)計(jì)合成了9個(gè)全新結(jié)構(gòu)的GyrB/ParE抑制劑。另一方面,我們從另一類金屬酶抑制劑——肽脫甲?；福≒DF）抑制劑結(jié)構(gòu)中受到啟發(fā),將N-甲酰羥胺片段引入到現(xiàn)有的LpxC抑制劑中,設(shè)計(jì)合成了4個(gè)新結(jié)構(gòu)的化合物,期望得到活性保持,代謝更穩(wěn)定,毒性更小的Lpx C抑制劑。但遺憾的是,我們所設(shè)計(jì)的化合物在體外抗菌活性測試中,對所試菌株并沒有表現(xiàn)出明顯的抗菌活性,證明了我們這一系列的改造失敗了。雖然結(jié)構(gòu)改造沒有取得成功,但也為這兩類抑制劑的后續(xù)設(shè)計(jì)開發(fā)進(jìn)一步提供了構(gòu)效關(guān)系理論基礎(chǔ)。
馮曉遠(yuǎn)[3]（2017）在《基于宏基因組學(xué)的深古菌進(jìn)化和代謝潛能研究》文中指出海洋沉積物中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源,其細(xì)胞計(jì)數(shù)總量達(dá)到2.9×1029,這個(gè)數(shù)目與估算得到的海洋微生物總量相當(dāng)。但是由于此類微生物缺少實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)菌株,其代謝方式和生態(tài)功能都有待深入研究。深古菌（Bathyarchaeota）在海洋沉積物中廣泛分布,且具有很高的豐度。目前的系統(tǒng)發(fā)育研究將深古菌定義為一個(gè)獨(dú)立的古菌門（Phylum）分類單元,其分為至少19個(gè)亞群;然而,目前只有七篇深古菌相關(guān)的基因組報(bào)道,其不同亞群所具有的代謝特征和生理特點(diǎn)也所知甚少。本課題中主要使用宏基因組技術(shù)手段,直接對瓜伊馬斯盆地深海熱液沉積物中的環(huán)境DNA進(jìn)行測序和分析,以研究這一環(huán)境中深古菌的生理特征及生態(tài)功能,及其可能存在的特殊的環(huán)境適應(yīng)性。本課題中,我們首先對深古菌16S r RNA基因序列分類系統(tǒng)進(jìn)行了更加精細(xì)的劃分,在原有的亞群分類基礎(chǔ)上,新確定了四個(gè)新的深古菌亞群,即Bathy-3bc/20/21/22,這四個(gè)亞群在之前的分類系統(tǒng)中處于未確定的狀態(tài)。此外,我們還利用宏基因組技術(shù)手段,從瓜伊馬斯盆地的兩個(gè)深海熱液沉積物中測序和分裝得到16個(gè)深古菌基因組,并將其與通過文獻(xiàn)調(diào)研收集到的26個(gè)已公開發(fā)表基因組進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和比較基因組分析。通過系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,我們將其中38個(gè)基因組定位到11個(gè)不同的深古菌亞群,4個(gè)基因組由于缺少相關(guān)的標(biāo)記基因,暫時(shí)不能確定其亞群分類。通過比較基因組分析,我們發(fā)現(xiàn)并確定了目前已知的深古菌亞群的核心代謝途徑,這些途徑包括蛋白質(zhì)降解途徑、糖酵解途徑、檸檬酸循環(huán)、還原型乙酰輔酶A途徑和產(chǎn)乙酸途徑。其中,亞群Bathy-15編碼古菌類型和細(xì)菌類型兩種還原型乙酰輔酶A途徑,而其他亞群則僅包含其中的古菌類型;亞群Bathy-20/21通過編碼磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-乙酸激酶（pta-ack）基因完成產(chǎn)乙酸的代謝途徑,而其他亞群則通過編碼乙酰輔酶A連接酶（acd）基因來實(shí)現(xiàn)相同的代謝功能。此外,不同的深古菌亞群還顯示出多樣的異養(yǎng)代謝有機(jī)化合物的底物降解潛能,尤其是亞群Bathy-20,和其他亞群相比具有更加豐富的碳水化合物降解途徑和獨(dú)有的有機(jī)硫化物降解途徑。除了代謝特征的差異,亞群Bathy-1/20/21/22等分裝自瓜伊馬斯盆地深海熱液沉積物樣本的深古菌亞群還具有嗜熱性的生存策略?？傊?深古菌的核心代謝途徑為兼性厭氧的蛋白質(zhì)和其他有機(jī)化合物發(fā)酵作用、還原型乙酰輔酶A途徑和產(chǎn)乙酸自養(yǎng)途徑。本課題揭示了深古菌復(fù)雜的內(nèi)部亞群分類多樣性和多樣的代謝潛能,同時(shí)也說明在不同環(huán)境下生存的不同深古菌亞群可能具有不同的生態(tài)作用。
張瑤心[4]（2014）在《嗜鹽蛋白酶SptC的成熟機(jī)制及其幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能的研究》文中指出幾丁質(zhì)是是蝦蟹等甲殼動(dòng)物的外殼、昆蟲的外骨骼和許多真菌細(xì)胞壁的重要組成成分。許多微生物分泌各種酶來降解含幾丁質(zhì)生物質(zhì),為自身的代謝提供物質(zhì)與能量,這些酶包括幾丁質(zhì)酶、乙酰葡萄糖胺糖苷酶、蛋白酶等,它們通過協(xié)同作用完成對幾丁質(zhì)的降解。人們已經(jīng)詳細(xì)研究了細(xì)菌和真核生物分泌的幾丁質(zhì)降解代謝途徑,但到目前為止,已報(bào)道的具有幾丁質(zhì)降解能力的嗜鹽古生菌僅有Haloferax mediterranei。極端嗜鹽古生菌Natrinema sp. J7-2由本實(shí)驗(yàn)室從湖北應(yīng)城鹽礦分離得到,該菌株的基因組編碼一個(gè)幾丁質(zhì)降解代謝相關(guān)的基因簇,其中包含一個(gè)蛋白酶基因sptC。與其他嗜鹽胞外蛋白酶的C端延伸區(qū)所不同的是,SptC的C端延伸區(qū)由PkdD和ChBD這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。在本研究中,我們重點(diǎn)探討了該酶自加工成熟機(jī)制及其在Natrinema sp. J7-2的幾丁質(zhì)分解代謝系統(tǒng)可能發(fā)揮的作用。首先,我們對Natrinema sp. J7-2基因組中幾丁質(zhì)分解代謝相關(guān)的基因簇及其編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。該幾丁質(zhì)分解代謝相關(guān)的基因簇在Natrinema屬的成員中高度保守,它不僅編碼幾丁質(zhì)酶（Chi1, Chi2and Chi3）、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（Cbp）、糖類物質(zhì)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、胞內(nèi)糖苷酶,還編碼一個(gè)胞外蛋白酶SptC。Chi1、Chi2、Chi3、Cbp和SptC這五個(gè)蛋白前體均含有PkdD和ChBD這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在氨基酸序列上呈現(xiàn)出相似性,表明這幾個(gè)蛋白質(zhì)在進(jìn)化和功能方面具有相關(guān)性。同時(shí),我們通過實(shí)驗(yàn)證明菌株J7-2具備降解幾丁質(zhì)的能力并能利用其降解產(chǎn)物作為唯一碳源進(jìn)行生長。其次,我們對重組SptC體外活化過程進(jìn)行了研究,并通過構(gòu)建一系列缺失突變體,探討N端前肽、PkdD和ChBD在蛋白酶活化、活性和穩(wěn)定性方面的功能。重組SptC （SptC*）在高鹽條件下的活化過程經(jīng)歷兩步加工：首先SptC通過順式加工對N端前肽核心區(qū)域（N*）進(jìn)行切割,形成自加工復(fù)合物N*-IwT；隨后,自加工復(fù)合物中的N*和連接肽通過反式加工被降解,并伴隨著ChBD的切除,N*-IWT轉(zhuǎn)變?yōu)橛纱呋δ苡蚝蚉kdD組成的成熟酶。在SptC自加工成熟過程中,N端前肽作為分子內(nèi)伴侶幫助前體正確折疊,N端前肽缺失突變體SptCAN無法正確折疊。C端延伸區(qū)對于SptC的折疊和自加工并不是必需的,但是缺失C端延伸區(qū)會(huì)導(dǎo)致SptC成熟速度減慢。SptC及各突變體成熟酶的最適鹽濃度為3-3.5M NaCl,它們需要高鹽條件以維持自身穩(wěn)定性。PkdD的存在提高了SptC成熟酶的活性但對穩(wěn)定性沒有影響。然后,我們對SptC與幾丁質(zhì)相關(guān)功能進(jìn)行研究。ChBD介導(dǎo)SptC與幾丁質(zhì)結(jié)合,而且ChBD對幾丁質(zhì)的結(jié)合能力隨著鹽濃度的上升而增強(qiáng)。SptC無法與纖維素或殼聚糖結(jié)合。同時(shí),幾丁質(zhì)和纖維素可以加快SptC及各C端缺失突變體的成熟速度,而含有ChBD的自加工復(fù)合物（N*-I1WT和N*-IΔPkdD）可以通過ChBD與幾丁質(zhì)結(jié)合,增加與幾丁質(zhì)相互作用的機(jī)會(huì)并提高幾丁質(zhì)周圍自加工復(fù)合物的局部濃度,從而使幾丁質(zhì)對SptC*和SptCAPkdD的成熟促進(jìn)效果更為顯著。此外,我們選取了與SptC同源但不含ChBD的SptA、pyrolysin、S41、sphericase和WF146蛋白酶,對多糖促進(jìn)蛋白酶成熟的作用進(jìn)行了進(jìn)一步探討。結(jié)果顯示,多糖雖然均無法與這五種蛋白酶結(jié)合,但幾丁質(zhì)和纖維素能在一定程度上加快WF146蛋白酶的成熟速度,并且與它們對SptCΔCTE和SptCΔChBD的成熟促進(jìn)效果相似。這些結(jié)果表明,這些多糖對蛋白酶成熟的促進(jìn)作用并不完全依賴于ChBD的存在,而可能與蛋白酶的氨基酸序列特異性有關(guān)。最后,我們發(fā)現(xiàn)SptC可以在高鹽濃度下降解蝦殼粉中的蛋白質(zhì)組分。蝦殼粉被自加工復(fù)合物N*-IWT處理后可溶肽段的釋放的速度比被成熟酶MWT處理過的樣品要快。究其原因,可能是N*-IWT通過ChBD與蝦殼粉中幾丁質(zhì)結(jié)合不僅加快N*-IWT的活化,還增加了蝦殼粉周圍的成熟酶濃度,從而加快了蛋白酶對蝦殼蛋白質(zhì)的降解。這些結(jié)果表明,蛋白酶SptC可能參與嗜鹽古生菌Natrinema sp. J7-2對含幾丁質(zhì)生物質(zhì)的降解。
馮守帥[5]（2014）在《極端嗜酸氧化硫硫桿菌篩選及貧黃銅礦生物浸出研究》文中研究表明伴隨全球高品位原礦儲(chǔ)量減少及金屬需求量日益增加，如何有效提煉低品位的貧尾礦已成為世界性難題。生物浸出工藝具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且可有效提煉貧尾礦等優(yōu)點(diǎn)，是解決以上問題的新型綠色冶煉技術(shù)。然而由于極低品位和復(fù)雜構(gòu)成，黃銅礦的生物浸出機(jī)理尚未完善，工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)展也并不理想。本文從極端嗜酸Acidithiobacillusthiooxidans（A. thiooxidans）的篩選及其極端耐酸機(jī)理研究開始，提出強(qiáng)化生物浸出的復(fù)合體系和組合工藝，建立了定性定量分子探針檢測方法，揭示了浸出過程不同集落態(tài)的群落演變規(guī)律，并初步構(gòu)建貧黃銅礦生物浸出機(jī)理模型。主要研究如下：（1）極端嗜酸氧化硫硫桿菌篩選及耐酸機(jī)理研究。采用以異養(yǎng)微生物-Rhodotorulasp.作為底層培養(yǎng)物的雙層平板法，將篩選化能自養(yǎng)型浸礦微生物的篩選周期縮減1/3，檢出率提高3.1倍。從福建紫金礦業(yè)的工業(yè)化生物堆浸的浸出液篩得1株極端嗜酸硫氧化菌種，對無機(jī)強(qiáng)酸耐受能力可達(dá)pH0.2。經(jīng)生理特性及雙重分子特征基因鑒定為A.thioodidans ZJJN-3，保藏于中國典型微生物保藏中心-CCTCC M2012104。進(jìn)而從胞內(nèi)pH、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞多糖、細(xì)胞膜脂肪酸成分、ATPase活性及耐酸相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄水平等對其極端耐酸機(jī)理進(jìn)行研究。伴隨酸脅迫的增強(qiáng)，細(xì)胞莢膜層先明顯增厚后逐漸褪去。細(xì)胞多糖含量也呈先上升后下降趨勢。細(xì)胞膜不飽和脂肪酸比例從37.85%顯著提升至49.06%，而且環(huán)丙烷脂肪酸比例維持在12.56%-18.59%。ATPase活性明顯增強(qiáng)，相關(guān)耐酸蛋白抗逆體系GrpE/DnaK/DnaJ的基因相對轉(zhuǎn)錄水平提升至原有水平的2.23-3.50倍?；谝陨辖Y(jié)果初步構(gòu)建A. thioodidans ZJJN-3的耐酸協(xié)同機(jī)制模型。（2）雙菌協(xié)同浸出貧黃銅礦技術(shù)研究。基于Starkey-硫化礦培養(yǎng)基的重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)模式，將A. thioodidans ZJJN-3的硫轉(zhuǎn)化率和生物量生產(chǎn)強(qiáng)度提高31.1%和187.9%。關(guān)鍵生化參數(shù)、掃描電鏡（SEM）及X射線衍射（XRD）結(jié)果均表明在雙菌協(xié)同效應(yīng)下，增強(qiáng)了浸出體系中生化活躍度并減弱鈍化作用。最終浸出效率為Acidithiobacillusferrooxidans CUMT-1（A. ferrooxidans CUMT-1）純菌體系的1.81倍。分別采用恒pH、Ag+和Cl-體系抑制鈍化效應(yīng)和加速生化反應(yīng)速率。確定最佳復(fù)合浸出體系為恒pH1.3-2.0mg·L-1Ag+-2.5g·L-1Cl-。在更高的生物量和化學(xué)反應(yīng)速率基礎(chǔ)上，有效減弱了黃鉀鐵礬沉淀和S0膜的鈍化作用。最終Cu2+濃度和浸出率分別達(dá)55.5mg·L-1和55.0%，約為對照體系的兩倍。外源能源底物、分階段恒pH調(diào)控和補(bǔ)料發(fā)酵策略分別被用于縮減貧黃銅礦分批浸出過程菌礦適應(yīng)期、減弱中后期黃鉀鐵礬鈍化及降低礦物底物抑制作用。確定最優(yōu)組合工藝為2g·L-1Fe2++2g·L-1S0、三階段恒pH調(diào)控（pH1.3-1.0-0.7）和補(bǔ)料-分批策略（0.5+0.125×4）。在7L攪拌式發(fā)酵罐驗(yàn)證結(jié)果表明，組合工藝更好的平衡了各浸出階段中生物和化學(xué)效應(yīng)。最終Cu2+濃度、浸出率和平均浸出速率分別達(dá)到89.1mg·L-1、44.1%和2.23mg·L-1·d-1，比原始水平提高約53%。（3）定量檢測浸礦微生物的分子探針技術(shù)構(gòu)建。結(jié)合分子探針、核酸S1酶消解功能及熒光標(biāo)記等手段，建立了一種浸礦微生物專用定性定量檢測方法。基于目標(biāo)菌種16SrRNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性分子探針。比對結(jié)果表明分子探針與近緣菌種有2個(gè)或更多的堿基差異。進(jìn)而優(yōu)選了分子探針檢測關(guān)鍵步驟的操作條件。如低非特異性吸附的封閉和洗脫條件（250μL0.1%BSA，30min，以0.5%PBST洗脫為輔助）、細(xì)胞破碎方式（300W，50%空白比，超聲破碎4min，以細(xì)胞裂解液為輔助）、探針工作濃度（主探針100nM，捕獲探針10nM，信號(hào)探針10nM）、雜交時(shí)間（1h，0.5h，0.5h）、雜交溫度（30℃，45℃，45℃）、核酸S1酶酶切時(shí)間（20min）及熒光素抗體工作濃度（1:5000稀釋比例）。最終建立分子探針檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性系數(shù)達(dá)98.64%，細(xì)胞量的檢測低限為103cells·mL-1左右。純菌、混菌及浸出體系驗(yàn)證結(jié)果表明該檢測方法特異性和準(zhǔn)確性良好，可有效應(yīng)用于后續(xù)浸出過程中群落結(jié)構(gòu)演變分析。（4）雙菌集落演化規(guī)律對貧黃銅礦浸出的影響。結(jié)合分子探針檢測技術(shù)，對浸出過程雙菌不同集落態(tài)的演變規(guī)律及其影響進(jìn)行了翔實(shí)的研究。附著細(xì)胞對浸出體系中自由細(xì)胞群落的影響顯著。僅占總生物量比例3.8%-11.6%的附著細(xì)胞缺失卻可導(dǎo)致19.1%-31.2%自由細(xì)胞損失，尤其以A. thiooxidans ZJJN-3純菌體系最為明顯。雙菌體系中附著細(xì)胞的缺失使得A. thiooxidans ZJJN-3在與A. ferrooxidans CUMT-1的群落競爭力明顯下降，表明A. thiooxidans ZJJN-3對附著細(xì)胞有更強(qiáng)的依賴性。與此同時(shí)，關(guān)鍵化學(xué)參數(shù)的變化也證實(shí)了附著細(xì)胞的重要性。脫附著體系中Fe2+和SO24-濃度的最大減少量均高達(dá)40%左右。XRD及傅里葉紅外變換光譜技術(shù)（FTIR）對礦渣分析均表明附著細(xì)胞與硫代謝緊密相關(guān)。約37.5%-50.5%甚至更高的浸出效率與吸附作用有直接關(guān)聯(lián)。在生物和化學(xué)效應(yīng)平衡的基礎(chǔ)上，歸納總結(jié)了強(qiáng)化貧黃銅礦生物浸出的工藝和策略，并初步構(gòu)建貧黃銅礦生物浸出機(jī)理模型。
呂杰[6]（2013）在《極端嗜鹽古生菌Natrinema屬遺傳操作系統(tǒng)的初步構(gòu)建及其啟動(dòng)子跨域啟動(dòng)活性的普遍性分析》文中認(rèn)為1998年Terry J. McGenity根據(jù)16SrRNA序列以及其他的一些分類特征提出Natrinema屬,目前在該屬中還沒有遺傳操作系統(tǒng)相關(guān)的研究報(bào)道。Natrinema sp. J7-1及J7-2是本實(shí)驗(yàn)室保存的極端嗜鹽古生菌Natrinema屬的兩個(gè)菌株,基因測序結(jié)果證實(shí),二株菌的染色體序列幾乎一模一樣,唯一的差別在于攜帶的質(zhì)粒,J7-1含有pHH205,而J7-2中的質(zhì)粒為pJ7-I。本論文以極端嗜鹽古生菌Natrinema sp. J7系列菌株為研究對象,對其相關(guān)遺傳學(xué)元件進(jìn)行研究。以J7-2及CJ7（不含質(zhì)粒）菌株作為Natrinema屬的代表,進(jìn)行了該屬中的遺傳操作系統(tǒng)的初步研究構(gòu)建工作：以J7-2菌株作為古生菌的代表,對其具有跨域啟動(dòng)活性的啟動(dòng)子的普遍性進(jìn)行了初步的研究。Natrinema屬中沒有遺傳操作系統(tǒng)的報(bào)道,而本實(shí)驗(yàn)室對該屬中的J7-1和J7-2菌株已有廣泛的研究,部分研究對于構(gòu)建Natrinema屬J7-2及CJ7菌株的遺傳操作系統(tǒng)提供了有用的信息。營養(yǎng)缺陷型常作為篩選標(biāo)記廣泛應(yīng)用于菌株的遺傳操作系統(tǒng)的研究。通過NTG以及紫外誘變的方式,對J7-2菌株進(jìn)行誘變處理,分離篩選營養(yǎng)缺陷型菌株,分別為J7-2-1,J7-2-22,J7-2-26和J7-2-52。通過實(shí)驗(yàn)確定其缺陷類型分別為：J7-2-1為亮氨酸營養(yǎng)缺陷型,J7-2-26為賴氨酸營養(yǎng)缺陷型,J7-2-22與J7-2-52為精氨酸營養(yǎng)缺陷型。再根據(jù)全基因組信息結(jié)合PCR擴(kuò)增片段驗(yàn)證,進(jìn)一步確定其突變基因及突變類型,分別為J7-2-1中突變基因?yàn)閘euB基因（1752）,編碼3-異丙基蘋果酸脫氫酶,突變?yōu)閺?90bp到701bp的長12bp的缺失突變；在J7-2-26中,突變基因?yàn)閐apD （4049）,編碼2,3,4,5-四氫吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶,突變?yōu)閺?83bp到600bp的長18bp的缺失突變；J7-2-52的argC基因（262）,編碼N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脫氫酶,1051bp處發(fā)生點(diǎn)突變,由G突變?yōu)锳,此突變使得密碼子GGG突變?yōu)镚AG。野生型J7-2基因組能夠轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株J7-2-1及J7-2-26,并使菌株恢復(fù)原養(yǎng)型。leuB或者dapD基因擴(kuò)增產(chǎn)物、含有l(wèi)euB或者dapD基因的整合質(zhì)粒也同樣可以轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株J7-2-1及J7-2-26,并使菌株恢復(fù)原養(yǎng)型。說明線性片段及環(huán)狀質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化Natrinema屬的菌株,同樣說明在該屬中PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法的可行性。外源α-淀粉酶基因可以通過整合質(zhì)粒中篩選標(biāo)記基因同源重組的方式一起整合到營養(yǎng)缺陷型菌株基因組上,并能表達(dá)有淀粉酶活性的蛋白,說明外源的DNA通過整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,可以表達(dá)于Natrinema sp. J7-2的營養(yǎng)缺陷型菌株中。這些結(jié)果均證明該屬是可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和遺傳操作的。與此同時(shí),我們嘗試構(gòu)建宿主／穿梭載體的遺傳操作體系。pHH205是菌株J7-1的內(nèi)源性質(zhì)粒,由于沒有篩選標(biāo)記,先將其轉(zhuǎn)化不含此質(zhì)粒的J7-2菌株及CJ7菌株,并通過絲裂霉素C誘導(dǎo)恢復(fù)過夜的轉(zhuǎn)化體系,通過檢測噬菌斑的方法,發(fā)現(xiàn)其上清可以感染敏感菌株J7-2并形成噬菌斑。這再次證實(shí)了Natrinema屬中遺傳轉(zhuǎn)化的可行性,同時(shí)該結(jié)果是第一次用實(shí)驗(yàn)的方式證實(shí)了質(zhì)粒pHH205即為噬菌體SNJ1的原噬菌體。以Mev為選擇標(biāo)記、以pHH205全長,構(gòu)建攜帶Mev選擇標(biāo)記的穿梭質(zhì)粒pUC19-Mev-pHH205i8。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化J7-2及CJ7后能得到具有Mev抗性的轉(zhuǎn)化子,且能夠提到相應(yīng)的質(zhì)粒,說明該穿梭質(zhì)粒在J7系列菌株中確實(shí)有復(fù)制功能。在尋找pHH205上的最小復(fù)制區(qū)時(shí)發(fā)現(xiàn),含有8.715Kb的4號(hào)片段的穿梭載體可以有復(fù)制功能,但是轉(zhuǎn)化效率不高。含有7.047Kb的8號(hào)片段以及含有2.706Kb的16號(hào)片段的穿梭載體轉(zhuǎn)化后也曾篩到轉(zhuǎn)化子,但轉(zhuǎn)化效率非常低,甚至只得到一個(gè)轉(zhuǎn)化子。從這些轉(zhuǎn)化子中未能提到可見的質(zhì)粒DNA,說明拷貝數(shù)可能較低。但將質(zhì)粒DNA提取物重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌卻能重新得到轉(zhuǎn)化子并檢測到目標(biāo)質(zhì)粒。說明8號(hào)片段和16號(hào)片段上含有能在Natrinema屬極端嗜鹽古菌中進(jìn)行自主復(fù)制的區(qū)域。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們還發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CJ7的效率要高于J7-2,其原因可能是J7-2中含有一個(gè)大小約為95Kb的pJ7-I大質(zhì)粒,該質(zhì)粒有可能會(huì)影響外源DNA轉(zhuǎn)化J7-2菌株的效率。質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在無抗連續(xù)培養(yǎng)十天的情況下,pUC19-Mev-pHH205i8質(zhì)粒的穩(wěn)定性高于pUC19-Mev-pHH2054質(zhì)粒,幾乎沒有質(zhì)粒丟失,而pUC19-Mev-pHH2054質(zhì)粒存在不同程度丟失的情況,推測其原因可能是4號(hào)片段中缺少了能夠穩(wěn)定質(zhì)粒的元件,因而菌株在無抗培養(yǎng)情況下,質(zhì)粒沒有相應(yīng)的篩選壓力會(huì)有不同程度的丟失。產(chǎn)噬菌斑能力及SNJ1侵染實(shí)驗(yàn)的工作也同時(shí)進(jìn)行。其結(jié)果為轉(zhuǎn)化pUC19-Mev-pHH205i8質(zhì)粒的菌株經(jīng)MMC誘導(dǎo)后期上清可侵染敏感菌J7-2并有噬菌斑的產(chǎn)生,而轉(zhuǎn)化pUC19-Mev-pHH2054質(zhì)粒的菌株誘導(dǎo)后的上清中則沒有噬菌斑的產(chǎn)生。另一方面,SNJ1不能侵染含有pUC19-Mev-pHH205i8質(zhì)粒的菌株,但是卻能侵染含有pUC19-Mev-pHH2054質(zhì)粒的菌株,這說明,與全長的i8片段相比,4號(hào)片段中可能缺少了使宿主菌對外源病毒顆粒產(chǎn)生免疫的元件。上述結(jié)果為后續(xù)研究噬菌體遺傳學(xué)特征及噬菌體侵染裂解機(jī)制等工作奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室前期曾發(fā)現(xiàn)Haloarcular hispanicaα-淀粉酶基因啟動(dòng)子在大腸桿菌和極端嗜鹽古生菌中都具有啟動(dòng)活性,分析其啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)有類似于大腸桿菌啟動(dòng)子保守元件“-10B0x”,推測這可能是其有兩域啟動(dòng)活性的原因。為了探究古生菌啟動(dòng)子具有跨域啟動(dòng)活性現(xiàn)象是否具有一定的普遍性,我們以Natrinema sp.J7-2基因組為代表對該問題進(jìn)行進(jìn)一步的研究。為此需要構(gòu)建兩個(gè)載體,分別用于檢測啟動(dòng)子在細(xì)菌和古生菌兩域中的啟動(dòng)活性。對大腸桿菌-沃氏富鹽菌穿梭載體pSY1進(jìn)行改進(jìn),構(gòu)建了大腸桿菌-沃氏富鹽菌的穿梭表達(dá)載體pAJ,并通過在兩域中分別表達(dá)兩種不同的蛋白對其穿梭表達(dá)及多克隆位點(diǎn)的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。在細(xì)菌中,對啟動(dòng)子探針載體pKK232-8進(jìn)行改進(jìn),構(gòu)建了啟動(dòng)子探針載體pUKM,對其多克隆位點(diǎn)的功能以及啟動(dòng)子探針載體的功能也做了相應(yīng)的驗(yàn)證工作。分別通過pUKM載體和pAJ載體分析并檢測了來自于Natrinema sp.J7-2基因組上的定向以及隨機(jī)選取的預(yù)測啟動(dòng)子片段在細(xì)菌和古生菌兩域中的啟動(dòng)活性,發(fā)現(xiàn)以‘’-10Box"為基礎(chǔ)的定向選取的17個(gè)預(yù)測的啟動(dòng)子中有16個(gè)在細(xì)菌中有相應(yīng)的啟動(dòng)活性,而隨機(jī)選取中的34個(gè)預(yù)測啟動(dòng)子則大部分是在細(xì)菌中沒有啟動(dòng)活性,只有6個(gè)有啟動(dòng)活性,而且它們的啟動(dòng)活性要低于定向挑取的預(yù)測啟動(dòng)子。分析隨機(jī)選取的有活性的預(yù)測啟動(dòng)子片段后,發(fā)現(xiàn)它們中有一個(gè)也有類似于定向選取的預(yù)測啟動(dòng)子中的‘’-10Box"元件的存在,其他啟動(dòng)子中也有預(yù)測的元件,推測隨機(jī)挑取的預(yù)測啟動(dòng)子啟動(dòng)活性低于定向挑取預(yù)測啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性的原因是缺少類似‘’-10Box’’元件的存在。這與大多數(shù)的古生菌的啟動(dòng)子的保守元件（BRE元件,TATA box以及轉(zhuǎn)錄起始區(qū)）并不相同。根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們推測在古生菌中存在一定數(shù)量的具有跨域啟動(dòng)活性的啟動(dòng)子,而且其與細(xì)菌及真核生物中的啟動(dòng)子存在著某種程度的進(jìn)化關(guān)系。
胡詠梅[7]（2012）在《硫磺礦硫化葉菌Sso0660和Sso0661基因的表達(dá)與功能研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理硫化葉菌是古菌遺傳學(xué)、生理和生化研究的模式生物。在硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobu）solfataricusP2菌株的基因組中,推測至少有37個(gè)基因編碼假定的蛋白酶、蛋白酶亞基或肽酶。然而迄今為止,僅有6個(gè)蛋白酶或肽酶（包括Sso2045、Sso2154和CPSso等）得以被鑒定和進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析,其余的假定蛋白酶都沒有被解析。例如,Sso0660和Sso0661在S.solfataricus P2基因組的數(shù)據(jù)庫中被預(yù)測編碼鋅依賴的蛋白酶,因?yàn)榕c細(xì)菌中的TldD和TldE（PmbA）序列相似而被分別注解為TldD和TldE同源類似物。雖然體內(nèi)的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持Escherichia coli的TldD和TldE具有蛋白酶活性的假說,并預(yù)測這兩個(gè)蛋白可能形成蛋白酶復(fù)合物行使功能,但缺乏明確的生物化學(xué)證據(jù);而對Thermotoga maritima中TldE（PmbA）的晶體結(jié)構(gòu)分析后,并沒有在其中發(fā)現(xiàn)金屬的結(jié)合位點(diǎn)或任何水解酶結(jié)構(gòu)域,TldE是否具有蛋白酶活性由此產(chǎn)生爭議。在目前的文獻(xiàn)中還沒有TldD和TldE生化性質(zhì)的相關(guān)報(bào)道,TldD和TldE具有怎樣的生理功能還不明確。為此,本文圍繞S.solfataricus P2中的Sso0660和Sso0661基因的表達(dá)和功能進(jìn)行了研究,獲得了以下幾個(gè)方面的結(jié)果:1.通過構(gòu)建 pSeSD-0660、pSeSD-0661、pET30a-0660 和 pET30a-0661 等表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了Ss 0o60和Sso0661基因的同源與異源表達(dá)。同源表達(dá)的Sso0660和Sso0661產(chǎn)物可溶,而異源表達(dá)的Sso0660和Sso0661大多以包涵體的形式存在。通過凝膠過濾、質(zhì)譜分析結(jié)合點(diǎn)突變,確定了 Sso0660單體的分子量為49851 Da,兩個(gè)單體首先通過C416處的分子鏈間二硫鍵形成二聚體,在此基礎(chǔ)上再形成36聚體;同源超表達(dá)的重組Sso0661為單體,分子量為47346 Da。2.從生化角度證實(shí)了 Sso0660和Sso0661具有蛋白酶活性。包涵體經(jīng)過變性、復(fù)性可獲得有活性的重組Sso0660和Sso0661蛋白酶,與可溶性的重組酶一樣,可分解蛋白酶的通用底物FTC-BSA、azocasein和gelatin,最適作用pH是7。同源和異源超表達(dá)的重組Sso0660最適的作用溫度分別為75℃和55℃,重組Sso0661最適的作用溫度是65℃。Sso0660和Sso0661對金屬蛋白酶的抑制劑EDTA和o-phenanthroline最為敏感,說明均為金屬蛋白酶?；鹧娣ㄔ游战Y(jié)果表明,每摩爾Sso0660分子含有1摩爾鋅,而Sso0661并不含鋅。多序列比對結(jié)果顯示TldD和TldE擁有共同保守的"DDEG"模序,TldD則獨(dú)有"HExxxH"模序以及位于C端的半胱氨酸殘基。點(diǎn)突變結(jié)果表明,"HExxxH"和"DDEG"模序與Sso0660的鋅結(jié)合有關(guān),D278E改變切割位點(diǎn),可能為活性性中心。3.揭示了古菌Sso0660同源超表達(dá)與硫化葉菌程序性死亡（PCD）之間可能存在的相關(guān)性。因?yàn)镾so0660超表達(dá)后,細(xì)胞出現(xiàn)基因組DNA降解、胞內(nèi)caspase-like活性增高、細(xì)胞不易被培養(yǎng)和生長嚴(yán)重滯后現(xiàn)象,顯示出古菌TldD超家族成員調(diào)控古菌程序性死亡（PCD）的重要性。Sso0660蛋白對caspase的通用抑制劑Z-VAD-fmk敏感,能與抗人caspase-8的抗體雜交,并展現(xiàn)caspase-8-like的活性,說明Sso0660具有caspase8-like的免疫活性和生理活性,為古菌中的死亡蛋白酶,在古菌PCD中行使重要功能。這是首次在古菌域中鑒定具有caspase-like活性的蛋白的報(bào)道。4.構(gòu)建了 pSeSD-0660/0661的共表達(dá)載體,采用共純化和免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)Sso0660和Sso0661形成了復(fù)合體。進(jìn)一步推測TldD與TldE在體內(nèi)可能存在相互制約的關(guān)系,但具體作用機(jī)制尚待深入的研究。
岳怡涵[8]（2012）在《OsDCL3b基因沉默對稻穗生長發(fā)育的影響》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理Dicer是一種高度保守的核糖核酸酶,在植物中稱為Dicer-like （DCL）蛋白。Dicer/DCL的直接生物學(xué)功能主要是加工生成各種具有調(diào)控功能的小分子RNA,這些調(diào)控小RNA進(jìn)一步影響其他相關(guān)蛋白基因的時(shí)空表達(dá),進(jìn)而影響生物個(gè)體的生長發(fā)育、抗病蟲害能力和逆境適應(yīng)能力等。因而,研究Dicer/DCL蛋白基因的功能對揭示真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理具有十分重要的意義。本研究基于RNA干擾技術(shù),對水稻OsDCL3b進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因沉默分析,獲得了影響稻穗生長發(fā)育的T2代轉(zhuǎn)基因陽性純合植株,發(fā)現(xiàn)OsDCL3b基因主要影響21nt和24nt大小的小RNA的生物合成,為深入研究OsDCL3b基因調(diào)控稻穗生長發(fā)育的遺傳途徑奠定了基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：1、基于改造了的RNAi-Ubi質(zhì)粒pYL,成功構(gòu)建了OsDCL3b的轉(zhuǎn)基因沉默載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻中花11,獲得了轉(zhuǎn)基因T2代陽性純合株系。2、熒光定量PCR比較分析發(fā)現(xiàn),OsDCL3b基因在其中2個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因純合株系DCL4-6和DCL6-1幼穗中的表達(dá)量分別比其在野生型中花11幼穗中的表達(dá)量減少了約30%和70%；大田種植成熟期表型分析結(jié)果表明,這2個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因純合株系植株的結(jié)實(shí)率分別只有40.0%和37.7%,而野生型中花11的結(jié)實(shí)率高達(dá)91.7%,同時(shí)這2個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因純合株系植株的每穗枝梗數(shù)和總粒數(shù)變少,穗長變短；表明OsDCL3b基因與稻穗的生長發(fā)育密切相關(guān)。3、對DCL6-1和對照中花11幼穗中大小為21～36nt的小RNA進(jìn)行測序比較分析發(fā)現(xiàn),OsDCL3b基因主要影響21nt和24nt大小的小RNA的生物合成；這些小RNA在水稻第2號(hào)染色體上分布最多,分別占總數(shù)的32.9%（DCL6-1）和24.3%（對照中花11）,在水稻其他染色體上的分布量均未到總數(shù)的10.0%。
張麗梅,賀紀(jì)正[9]（2012）在《一個(gè)新的古菌類群——奇古菌門（Thaumarchaeota）》文中認(rèn)為基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,古菌域（Archaea）被分為兩個(gè)主要類群:廣古菌門（Euryarchaeota）和泉古菌門（Crenarchaeota）。近20年來,微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用顯示,在中溫環(huán)境中廣泛存在著大量的未培養(yǎng)古菌,而且它們可能在自然界重要元素（N、C）的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。最初,這些未培養(yǎng)古菌因在16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育上與泉古菌關(guān)系較密切而被稱作中溫泉古菌（non-thermophilic Crenarchaeota）。而近年來,對更多新發(fā)現(xiàn)的中溫古菌核糖體RNA基因序列和其它分子標(biāo)記物進(jìn)行的分析均不支持中溫泉古菌由嗜熱泉古菌進(jìn)化而來的假設(shè),而揭示其可能代表古菌域中一個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)發(fā)育分支?；蚪M學(xué)、生理生態(tài)特征等分析也顯示中溫泉古菌與泉古菌具有明顯不同的特征。因而專家建議將這些古菌（中溫泉古菌）劃分為一個(gè)新的門,成為古菌域的第三個(gè)主要類群—Thaumarchaeota（意譯為奇古菌門）。這一新古菌門提出后得到其他研究證據(jù)的支持和認(rèn)可。本文對目前已知的奇古菌門的分類地位演化、基因組學(xué)、多樣性和生理代謝特征等作一簡要綜述。
王維[10]（2010）在《嗜熱微生物熱穩(wěn)定與熱適應(yīng)機(jī)制的研究》文中指出地球上的生命具有強(qiáng)大的適應(yīng)能力。大部分生物的生存溫度范圍在20℃～50℃,還有很多生物可以在50℃以上的高溫或者20℃以下的低溫環(huán)境中生長。生長溫度在+46℃以上的被稱為嗜熱微生物。嗜熱微生物的熱適應(yīng)機(jī)制一直都是人們非常關(guān)注的問題。得益于微生物基因組序列數(shù)據(jù)的積累以及生物信息學(xué)的發(fā)展,我們可以從基因組和蛋白質(zhì)組的角度來探討嗜熱微生物的熱穩(wěn)定和熱適應(yīng)機(jī)制。前人對于微生物嗜熱機(jī)制的研究多局限于對某一種蛋白家族的序列或結(jié)構(gòu)的分析。但是到目前為止,已經(jīng)積累了大量的微生物基因組序列信息。因此,我們決定從微生物全基因組和全蛋白質(zhì)組的角度,來綜合地分析蛋白質(zhì)和氨基酸對嗜熱微生物熱穩(wěn)定和熱適應(yīng)的影響,以及嗜熱微生物蛋白功能的演化。本論文首先選取了526個(gè)細(xì)菌的全蛋白質(zhì)組序列,利用雙向比對的方法找出全部的同源蛋白,從蛋白的序列組成方面入手分析熱穩(wěn)定和熱適應(yīng)的機(jī)理。結(jié)果表明嗜熱微生物在蛋白質(zhì)的氨基酸組成上存在偏好性。通過對蛋白的功能和COG分析發(fā)現(xiàn),嗜熱微生物中特有的一些蛋白質(zhì),更多地參與細(xì)胞生物信息的存儲(chǔ)與處理過程。最后還對這些蛋白的結(jié)構(gòu)做了分析。此外,本論文還研究了氨基酸的穩(wěn)定性在嗜熱微生物熱穩(wěn)定和熱適應(yīng)方面的貢獻(xiàn)。通過考察297個(gè)原核微生物基因組中氨基酸含量與最適生長溫度（OGT）之間的相關(guān)性來衡量氨基酸穩(wěn)定性在生物熱適應(yīng)中所起到的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)除了DNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性對熱適應(yīng)的作用之外,氨基酸的穩(wěn)定性也是嗜熱微生物熱適應(yīng)的決定因素之一。這些發(fā)現(xiàn)不僅為前人提出的假設(shè)提供了進(jìn)一步的證據(jù)支持,而且也表明了氨基酸的穩(wěn)定性對嗜熱菌中氨基酸殘基的選擇有重要影響。通過考察Top-90中同源蛋白的氨基酸含量,進(jìn)一步說明氨基酸的穩(wěn)定性對蛋白質(zhì)的殘基組成有貢獻(xiàn)。
二、超嗜熱菌中逆促旋酶的研究進(jìn)展（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、超嗜熱菌中逆促旋酶的研究進(jìn)展（論文提綱范文）
（1）極端微生物及其應(yīng)用研究進(jìn)展（論文提綱范文）
| 1 嗜熱微生物 |
| 1.1 嗜熱微生物的定義及分布 |
| 1.2 嗜熱微生物的適應(yīng)機(jī)制 |
| 1.3 酶及其應(yīng)用 |
| 2 嗜冷微生物和耐冷微生物 |
| 2.1 嗜冷微生物的定義及分布 |
| 2.2 嗜冷微生物的適應(yīng)機(jī)制 |
| 2.3 酶及其應(yīng)用 |
| 3 嗜鹽微生物 |
| 3.1 嗜鹽微生物的定義及分布 |
| 3.2 嗜鹽微生物的適應(yīng)機(jī)制 |
| 4 嗜堿微生物 |
| 4.1 嗜堿微生物的定義及分布 |
| 4.2 嗜堿微生物的適應(yīng)機(jī)制 |
| 4.3 酶及其應(yīng)用 |
| 5 嗜酸微生物 |
| 5.1 嗜酸微生物的定義及分布 |
| 5.2 嗜酸微生物的適應(yīng)機(jī)制 |
| 5.3 酶及其應(yīng)用 |
| 6 極端微生物在下一代工業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用 |
| 7 結(jié)論與展望 |
（2）新型GyrB/ParE抑制劑和LpxC抑制劑的設(shè)計(jì)合成與生物活性評(píng)價(jià)（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 緒論 |
| 1.1 抗菌藥物的研發(fā)現(xiàn)狀 |
| 1.2 細(xì)菌耐藥性 |
| 1.3 GyrB/ParE抑制劑概述 |
| 1.3.1 細(xì)菌Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶 |
| 1.3.2 GyrB/ParE抑制劑研發(fā)歷程 |
| 1.3.3 GyrB/ParE抑制劑構(gòu)效關(guān)系 |
| 1.3.4 小結(jié) |
| 1.4 LpxC抑制劑類抗菌藥物概述 |
| 1.4.1 革蘭陰性菌的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) |
| 1.4.2 類脂A的生物合成途徑 |
| 1.4.3 LpxC的生理學(xué)特性 |
| 1.4.4 LpxC的催化機(jī)理 |
| 1.4.5 LpxC抑制劑的研發(fā)歷程 |
| 1.4.6 LpxC抑制劑的構(gòu)效關(guān)系 |
| 1.4.7 小結(jié) |
| 1.5 論文的研究目的及意義 |
| 第2章 GyrB/ParE抑制劑和LpxC抑制劑的設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.1 GyrB/ParE抑制劑的設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.1.1 化合物設(shè)設(shè)計(jì) |
| 2.1.2 化合物的合成 |
| 2.2 GyrB/ParE抑制劑體外抗菌活性測試與結(jié)果分析 |
| 2.3 LpxC抑制劑的設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.3.1 化合物設(shè)計(jì) |
| 2.3.2 化合物的合成 |
| 2.4 LpxC抑制劑體外抗菌活性測試與結(jié)果分析 |
| 第3章 實(shí)驗(yàn)部分 |
| 3.1 化學(xué)實(shí)驗(yàn)部分 |
| 3.2 生物活性測試部分 |
| 3.2.1 GyrB/ParE抑制劑抗菌活性測試實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.2 LpxC抑制劑抗菌活性測試實(shí)驗(yàn) |
| 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 攻讀碩士期間發(fā)表的論文 |
（3）基于宏基因組學(xué)的深古菌進(jìn)化和代謝潛能研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 古菌概述 |
| 1.2 海洋環(huán)境微生物研究進(jìn)展簡介 |
| 1.3 宏基因組測序 |
| 1.3.1 測序平臺(tái)介紹 |
| 1.3.2 宏基因組測序 |
| 1.4 深古菌概述 |
| 1.4.1 深古菌的命名與分布 |
| 1.4.2 深古菌的亞群分類 |
| 1.4.3 影響深古菌亞群分布特點(diǎn)的環(huán)境因子 |
| 1.4.4 基因組信息揭示的深古菌生理功能 |
| 1.5 本課題的研究目的、思路以及意義 |
| 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 |
| 2.1 樣本信息 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法 |
| 2.2.1 瓊脂糖凝膠方法進(jìn)行DNA提取 |
| 2.2.2 宏基因組庫構(gòu)建和測序 |
| 2.3 生物信息學(xué)分析 |
| 2.3.1 測序數(shù)據(jù)組裝和基因組分裝 |
| 2.3.2 基于16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 |
| 2.3.3 功能基因的預(yù)測和注釋 |
| 2.3.4 針對物種進(jìn)化地位的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 |
| 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論 |
| 3.1 基因組組裝和分裝信息 |
| 3.2 深古菌亞群分類 |
| 3.2.1 基于16SrRNA基因序列的亞群分類 |
| 3.2.2 基于保守核糖體蛋白序列的進(jìn)化地位確認(rèn) |
| 3.3 深古菌代謝途徑分析 |
| 3.3.1 核心代謝途徑分析 |
| 3.3.2 有機(jī)化合物底物降解潛能 |
| 3.3.3 其他代謝途徑分析 |
| 3.3.4 環(huán)境適應(yīng)性分析 |
| 第四章 總結(jié)和展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表或錄用的論文 |
（4）嗜鹽蛋白酶SptC的成熟機(jī)制及其幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能的研究（論文提綱范文）
| 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn) |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略語表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 極端環(huán)境微生物 |
| 1.2 嗜鹽微生物(halophiles) |
| 1.3 枯草桿菌蛋白酶類蛋白酶(Subtilase) |
| 1.4 蛋白酶的加工成熟 |
| 1.5 蛋白酶的C端延伸區(qū)(C-terminal extension,CTE) |
| 1.6 多糖 |
| 1.7 幾丁質(zhì)的生物降解 |
| 1.8 嗜鹽蛋白的異源表達(dá) |
| 1.9 本研究的目的和意義 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 第三章 蛋白酶SptC及相關(guān)蛋白的生物信息學(xué)分析 |
| 3.1 菌株J7-2中的幾丁質(zhì)分解代謝相關(guān)基因簇 |
| 3.2 蛋白酶SptC及相關(guān)蛋白的序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測 |
| 3.3 菌株J7-2的降解幾丁質(zhì)能力的檢測 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 本章小結(jié) |
| 第四章 SptC的自加工成熟及其成熟酶性質(zhì) |
| 4.1 重組SptC(SptC~*)的表達(dá)、純化與活化 |
| 4.2 SptC~*的變性、復(fù)性及成熟 |
| 4.3 SptC~*的自加工成熟過程的解析 |
| 4.4 N端前肽及CTE在SptC~*折疊及成熟過程中的作用 |
| 4.5 成熟酶的活性及穩(wěn)定性 |
| 4.6 討論 |
| 4.7 本章小結(jié) |
| 第五章 SptC與幾丁質(zhì)的相互作用及ChBD的功能 |
| 5.1 SptC與幾丁質(zhì)的結(jié)合 |
| 5.2 SptC與其他多糖的結(jié)合 |
| 5.3 幾丁質(zhì)及其他多糖對SptC成熟的影響 |
| 5.4 多糖對其他蛋白酶的促進(jìn)作用 |
| 5.5 多糖對不同蛋白酶成熟的促進(jìn)作用的比較 |
| 5.6 SptC對蝦殼中蛋白質(zhì)的降解作用 |
| 5.7 討論 |
| 5.8 本章小結(jié) |
| 全文總結(jié)及研究展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 在讀期間發(fā)表的論文 |
| 致謝 |
（5）極端嗜酸氧化硫硫桿菌篩選及貧黃銅礦生物浸出研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目錄 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 生物浸出概述 |
| 1.2 貧黃銅礦生物浸出研究 |
| 1.2.1 貧黃銅礦生物浸出意義 |
| 1.2.2 生物浸出機(jī)制演變過程 |
| 1.3 浸礦微生物研究現(xiàn)狀 |
| 1.3.1 浸礦微生物 |
| 1.3.2 浸礦微生物耐酸機(jī)理 |
| 1.4 貧黃銅礦浸出工藝及強(qiáng)化策略 |
| 1.4.1 浸出工藝 |
| 1.4.2 生物浸出強(qiáng)化策略 |
| 1.5 浸出過程群落結(jié)構(gòu)研究趨勢 |
| 1.5.1 浸礦微生物檢測技術(shù) |
| 1.5.2 浸出過程群落結(jié)構(gòu)演變規(guī)律 |
| 1.6 立體依據(jù)和研究內(nèi)容 |
| 1.6.1 立題依據(jù)和研究意義 |
| 1.6.2 本論文主要研究內(nèi)容 |
| 第二章 極端嗜酸氧化硫硫桿菌篩選及耐酸機(jī)理研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 菌種樣本 |
| 2.2.3 培養(yǎng)基 |
| 2.2.4 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 |
| 2.2.5 雙層平板篩選極端嗜酸氧化硫硫桿菌 |
| 2.2.6 極端 A. thiooxidans ZJJN-3 篩選與鑒定 |
| 2.2.7 熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.8 主要參數(shù)測定及分析方法 |
| 2.3 結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 建立快捷高效的浸礦微生物篩選方法 |
| 2.3.2 極端 A. thiooxidans ZJJN-3 分類鑒定 |
| 2.3.3 A. thiooxidans ZJJN-3 極端耐酸機(jī)理分析 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 雙菌協(xié)同浸出貧黃銅礦技術(shù)研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 |
| 3.2.2 A. thioodidans ZJJN-3 培養(yǎng)模式優(yōu)化實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.3 雙菌協(xié)同浸出實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.4 復(fù)合催化浸出體系實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.5 組合浸礦工藝實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.6 分析方法 |
| 3.3 結(jié)果與討論 |
| 3.3.1 A. thiooxidans ZJJN-3 培養(yǎng)模式優(yōu)選 |
| 3.3.2 雙菌協(xié)同浸出貧銅礦的生化參數(shù)分析 |
| 3.3.3 復(fù)合催化浸出體系的建立 |
| 3.3.4 組合浸出工藝強(qiáng)化貧黃銅礦浸出 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第四章 定量檢測浸礦微生物的分子探針技術(shù)構(gòu)建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 |
| 4.2.3 儀器與試劑 |
| 4.2.4 分子探針設(shè)計(jì)及總流程 |
| 4.2.5 分子探針檢測技術(shù)具體步驟 |
| 4.2.6 分子探針檢測技術(shù)的特異性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) |
| 4.3 結(jié)果與討論 |
| 4.3.1 分子探針檢測的原理和特異性分析 |
| 4.3.2 分子探針檢測技術(shù)關(guān)鍵操作條件優(yōu)選 |
| 4.3.3 分子探針檢測技術(shù)定性定量效果分析 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第五章 雙菌集落演化規(guī)律對貧黃銅礦浸出的影響 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料與方法 |
| 5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 |
| 5.2.2 浸出實(shí)驗(yàn) |
| 5.2.3 脫附著體系定義 |
| 5.2.4 總自由細(xì)胞和附著細(xì)胞菌體濃度測定 |
| 5.2.5 雙菌體系中菌體濃度測定 |
| 5.2.6 主要化學(xué)參數(shù)檢測方法 |
| 5.3 結(jié)果與討論 |
| 5.3.1 雙菌集落演化規(guī)律及對生物群落影響 |
| 5.3.2 附著細(xì)胞對關(guān)鍵化學(xué)參數(shù)影響 |
| 5.3.3 貧黃銅礦雙菌體系浸出機(jī)制模型的構(gòu)建 |
| 5.4 本章小結(jié) |
| 結(jié)論與展望 |
| 1 結(jié)論 |
| 2 展望 |
| 論文創(chuàng)新點(diǎn) |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄1：論文涉及的基因序列、檢測圖譜及縮略詞 |
| 附錄2：作者在攻讀博士學(xué)位期間主要科研成果 |
（6）極端嗜鹽古生菌Natrinema屬遺傳操作系統(tǒng)的初步構(gòu)建及其啟動(dòng)子跨域啟動(dòng)活性的普遍性分析（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 古生菌 |
| 1.1.1 古生菌名稱的由來 |
| 1.1.2 古生菌的分類 |
| 1.1.3 古生菌的形態(tài)和細(xì)胞學(xué)特征 |
| 1.1.4 古生菌的生態(tài)環(huán)境 |
| 1.1.5 古生菌的基本遺傳學(xué)特征 |
| 1.1.6 古生菌的啟動(dòng)子 |
| 1.2 嗜鹽古生菌 |
| 1.2.1 嗜鹽古生菌的概述 |
| 1.2.2 嗜鹽古生菌的基因組研究 |
| 1.2.3 嗜鹽古生菌中構(gòu)建的遺傳操作系統(tǒng) |
| 1.2.4 嗜鹽古生菌中的Natrinema屬的簡單介紹 |
| 1.3 古生菌噬菌體在古生菌遺傳操作系統(tǒng)中的應(yīng)用 |
| 1.4 本研究的背景、內(nèi)容和意義 |
| 2 Natrinema sp.J7-2遺傳操作系統(tǒng)的初步構(gòu)建 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 菌株和質(zhì)粒 |
| 2.1.2 試劑、溶液及儀器 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 常用的分子生物學(xué)方法 |
| 2.2.2 Natrinema sp.J7-2的誘變處理 |
| 2.2.3 Natrinema sp.J7-2營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選及驗(yàn)證 |
| 2.2.4 Natrinema sp.J7-2營養(yǎng)缺陷型菌株缺陷類型的鑒定 |
| 2.2.5 嗜鹽古生菌基因組DNA的提取 |
| 2.2.6 Natrinema sp.J7-2營養(yǎng)缺陷型菌株缺陷突變基因及突變位點(diǎn)的確定 |
| 2.2.7 菌株轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.8 轉(zhuǎn)化子的鑒定 |
| 2.2.9 Natrinema sp.J7-2營養(yǎng)缺陷型菌株轉(zhuǎn)化子中檢測α-淀粉酶基因 |
| 2.2.10 pHH205轉(zhuǎn)化Natrinema sp.J7-2及CJ7后的噬菌斑檢測 |
| 2.2.11 Natrinema sp.J7-2的抗性實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.12 穿梭載體的構(gòu)建流程 |
| 2.2.13 質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.14 噬菌體的相關(guān)實(shí)驗(yàn) |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 營養(yǎng)缺陷型菌株的誘變與篩選 |
| 2.3.2 以pHH205為基礎(chǔ)構(gòu)建的E.coli-Natrinema sp.J7-2穿梭載體 |
| 2.4 小結(jié)與討論 |
| 3 Natrinema sp.J7-2啟動(dòng)子跨域啟動(dòng)活性現(xiàn)象的普遍性分析 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.1 菌株和質(zhì)粒 |
| 3.1.2 試劑、溶液及儀器 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取 |
| 3.2.2 基因的擴(kuò)增 |
| 3.2.3 一步提質(zhì)粒 |
| 3.2.4 多克隆位點(diǎn)序列的構(gòu)建 |
| 3.2.5 限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)體系 |
| 3.2.6 瓊脂糖凝膠電泳 |
| 3.2.7 電泳DNA樣品的回收純化 |
| 3.2.8 末端補(bǔ)平 |
| 3.2.9 酶切載體后去磷酸化處理 |
| 3.2.10 DNA樣品純化 |
| 3.2.11 連接反應(yīng) |
| 3.2.12 大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.13 嗜鹽古生菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.14 轉(zhuǎn)化子鑒定 |
| 3.2.15 嗜鹽古生菌質(zhì)粒DNA的提取 |
| 3.2.16 嗜鹽古生菌基因組DNA的提取 |
| 3.2.17 氯霉素抗性實(shí)驗(yàn)及CAT ELISA測定 |
| 3.2.18 總蛋白的測定 |
| 3.2.19 WF146蛋白酶檢測 |
| 3.2.20 α-淀粉酶檢測及酶活測定 |
| 3.2.21 β-半乳糖苷酶檢測及酶活測定 |
| 3.2.22 Western blot |
| 3.2.23 RNA提取 |
| 3.2.24 5'-3'RACE |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.1 在古生菌中檢測啟動(dòng)子活性的載體 |
| 3.3.2 在細(xì)菌中檢測啟動(dòng)子活性的載體 |
| 3.3.3 有跨域啟動(dòng)活性的古生菌啟動(dòng)子 |
| 3.4 小結(jié)與討論 |
| 總結(jié) |
| 中外文參考文獻(xiàn) |
| 攻博期間取得的科研成果 |
| 致謝 |
（7）硫磺礦硫化葉菌Sso0660和Sso0661基因的表達(dá)與功能研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略語表 |
| 1 前言 |
| 1.1 古菌 |
| 1.2 硫化葉菌 |
| 1.2.1 硫化葉菌的發(fā)現(xiàn) |
| 1.2.2 硫化葉菌的基因組測序 |
| 1.2.3 硫化葉菌的遺傳操作體系 |
| 1.3 蛋白酶及其分類 |
| 1.4 啟動(dòng)和執(zhí)行細(xì)胞程序性死亡的蛋白酶 |
| 1.4.1 細(xì)胞程序性死亡 |
| 1.4.2 Caspases |
| 1.4.3 Caspase-like蛋白 |
| 1.4.4 古菌PCD及其相關(guān)基因 |
| 1.5 硫化葉菌蛋白酶研究進(jìn)展 |
| 1.5.1 硫化葉菌中的金屬蛋白酶 |
| 1.5.2 硫化葉菌中的半胱氨酸蛋白酶 |
| 1.5.3 硫化葉菌中的絲氨酸蛋白酶 |
| 1.5.4 硫化葉菌中的天冬氨酸蛋白酶 |
| 1.6 TLDD和TLDE蛋白研究進(jìn)展 |
| 1.7 研究的目的與意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 菌株和質(zhì)粒 |
| 2.2 培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件 |
| 2.2.1 LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基 |
| 2.2.2 硫化葉菌培養(yǎng)基 |
| 2.3 主要分子生物學(xué)或生化試劑 |
| 2.4 主要儀器設(shè)備 |
| 2.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.5.1 硫化葉菌總DNA的提取 |
| 2.5.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.5.3 PCR擴(kuò)增 |
| 2.5.4 T-A克隆 |
| 2.5.5 E. coli DH5α感受態(tài)的制備及酶連產(chǎn)物的化學(xué)轉(zhuǎn)化 |
| 2.5.6 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取 |
| 2.5.7 質(zhì)粒DNA的酶切與驗(yàn)證 |
| 2.5.8 表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.6 點(diǎn)突變 |
| 2.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 |
| 2.7.1 pET原核表達(dá)載體T7強(qiáng)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)原理 |
| 2.7.2 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.7.3 重組蛋白在硫化葉菌中的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.7.4 誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)物的預(yù)處理 |
| 2.7.5 用His-Gravitrap鎳柱親和層析純化帶His-tag的重組蛋白 |
| 2.7.6 透析 |
| 2.7.7 包涵體復(fù)性 |
| 2.7.8 凝膠過濾 |
| 2.8 SDS-PAGE分析與凝膠成像 |
| 2.8.1 分離膠的灌制 |
| 2.8.2 濃縮膠的灌制 |
| 2.8.3 樣品制備和上樣 |
| 2.8.4 電泳、考染、脫色 |
| 2.8.5 銀染、脫色 |
| 2.9 抗體制備 |
| 2.10 WESTERN BLOTTING |
| 2.10.1 Western blotting的原理 |
| 2.10.2 Western blotting的具體操作步驟 |
| 2.11 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) |
| 2.11.1 酶聯(lián)免疫吸附測定的原理 |
| 2.11.2 間接法ELISA的具體操作步驟 |
| 2.12 質(zhì)譜分析 |
| 2.13 BCA法測定蛋白濃度 |
| 2.14 重組蛋白酶的活力測定 |
| 2.14.1 以FITC-BSA為底物的蛋白酶酶活測定 |
| 2.14.2 以azocasein為底物的蛋白酶酶活測定 |
| 2.14.3 蛋白酶活力染色法 |
| 2.14.4 相對酶活的計(jì)算方法 |
| 2.14.5 溫度和pH值對酶活力的影響 |
| 2.14.6 金屬離子對蛋白酶酶活的影響 |
| 2.14.7 蛋白酶抑制劑對蛋白酶酶活的影響 |
| 2.14.8 caspase活性分析 |
| 2.15 鋅含量的測定 |
| 2.16 流式細(xì)胞分析和顯微照相 |
| 2.17 共表達(dá)/共純化分析蛋白復(fù)合物 |
| 2.17.1 共表達(dá)/共純化及其原理 |
| 2.17.2 共表達(dá)/共純化的具體操作步驟 |
| 2.18 免疫共沉淀分析蛋白質(zhì)之間的相互作用 |
| 2.18.1 免疫共沉淀及其原理 |
| 2.18.2 免疫共沉淀具體操作步驟 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 Sso0660和Sso0661蛋白的序列分析和功能預(yù)測 |
| 3.1.1 Sso0660和Sso0661蛋白同屬TldD超家族 |
| 3.1.2 預(yù)測Sso0660和Sso0661均為胞內(nèi)蛋白 |
| 3.1.3 古菌與細(xì)菌TldD和TldE蛋白的多序列比對 |
| 3.1.4 泉古菌中TldD蛋白的多序列比對 |
| 3.1.5 TldD蛋白與真核生物DPPⅢ的多序列比對 |
| 3.2 Sso0660和Sso0661相關(guān)超表達(dá)基因工程菌株的構(gòu)建 |
| 3.2.1 Sso0660和Sso0661基因的PCR擴(kuò)增 |
| 3.2.2 Sso0660同源與異源超表達(dá)菌株的構(gòu)建 |
| 3.2.3 Sso0661同源與異源超表達(dá)菌株的構(gòu)建 |
| 3.2.4 Sso0660各突變的同源與異源超表達(dá)菌株的構(gòu)建 |
| 3.2.5 Sso0660與Sso0661共表達(dá)同源超表達(dá)菌株的構(gòu)建 |
| 3.3 Sso660和Sso0661蛋白的超表達(dá)、性質(zhì)與功能分析 |
| 3.3.1 Sso0661異源超表達(dá)以包涵體為主 |
| 3.3.2 Sso0661同源超表達(dá)產(chǎn)物為可溶的單體形式 |
| 3.3.3 Sso0660的同源超表達(dá)與純化 |
| 3.3.4 Sso0660異源超表達(dá)以包涵體為主 |
| 3.3.5 鼠抗重組Sso0660和鼠抗重組Sso0661抗體的制備 |
| 3.3.6 異源超表達(dá)Sso0660蛋白酶的二聚體化與切割成熟 |
| 3.3.7 異源超表達(dá)重組Sso0660為36聚體 |
| 3.3.8 重組Sso0660為高溫中性蛋白酶 |
| 3.3.9 重組Sso0661蛋白展現(xiàn)微弱的蛋白水解活性 |
| 3.3.10 重組Sso0661蛋白酶不分解牛胰島素B鏈 |
| 3.3.11 重組Sso0661蛋白酶為高溫中性蛋白酶 |
| 3.3.12 重組Sso0660和Sso0661均展現(xiàn)金屬蛋白酶活性 |
| 3.3.13 Sso0660同源超表達(dá)菌株出現(xiàn)生長受阻的表型 |
| 3.3.14 Sso0660的切割成熟與硫化葉菌胞內(nèi)caspase活性增高相關(guān) |
| 3.3.15 重組Sso0660蛋白酶展現(xiàn)caspase-8-like活性 |
| 3.3.16 重組Sso0661蛋白酶展現(xiàn)caspase-8-like的免疫活性 |
| 3.3.17 流式細(xì)胞分析Sso0660同源超表達(dá)菌株的PCD特征 |
| 3.3.18 共表達(dá)/共純化證實(shí)Sso0660和Sso0661形成復(fù)合物 |
| 3.3.19 Co-IP證實(shí)Sso0660和Sso0661形成蛋白復(fù)合物 |
| 3.3.20 金屬離子對重組Sso0660和Sso0661蛋白酶的影響 |
| 3.3.21 C_(416)參與Sso0660鏈間二硫鍵的形成 |
| 3.3.22 D278E改變Sso0660蛋白酶的切割與激活 |
| 3.3.23 "HExxxH"和"DDEG"模序與Sso0660的鋅結(jié)合相關(guān) |
| 4 討論與展望 |
| 4.1 SSO0660和SSO0661可能參與反螺旋酶活性的調(diào)節(jié) |
| 4.2 SSO0660的切割與激活機(jī)制 |
| 4.3 TLDD超家族與古菌的程序性死亡調(diào)控 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 附錄1 文中所用引物 |
| 附錄2 測序比對結(jié)果 |
| 博士期間學(xué)術(shù)成果 |
| 致謝 |
（8）OsDCL3b基因沉默對稻穗生長發(fā)育的影響（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 Dicer/Dicer-like蛋白基因的研究概況 |
| 1.1.1 Dicer/Dicer-like蛋白基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) |
| 1.1.2 Dicer/Dicer-like蛋白基因的功能 |
| 1.1.3 植物中Dicer-like蛋白基因的研究概況 |
| 1.2 水稻中Dicer-like蛋白基因的研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 水稻中Dicer-like蛋白基因的數(shù)量與分布 |
| 1.2.2 水稻中Dicer-like蛋白基因的功能研究 |
| 1.3 RNA干擾技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用 |
| 1.3.1 基因功能研究的基本方法 |
| 1.3.2 RNA干擾技術(shù)的基本原理 |
| 1.3.3 RNA干擾技術(shù)在基因功能研究中的應(yīng)用 |
| 1.4 本研究的主要內(nèi)容、目的和意義 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)主要用酶和試劑 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器和器械 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)用主要載體和菌株 |
| 2.1.4 實(shí)驗(yàn)植物材料 |
| 2.1.5 實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基的配制 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 秈稻93-11幼穗總RNA的提取 |
| 2.2.2 干涉目的片段的RT-PCR擴(kuò)增 |
| 2.2.3 轉(zhuǎn)基因沉默載體的構(gòu)建 |
| 2.2.4 基因沉默載體的遺傳轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.5 轉(zhuǎn)基因T_0代陽性植株的鑒定 |
| 2.2.6 轉(zhuǎn)基因T_2代陽性純合植株的獲得 |
| 2.2.7 熒光定量PCR分析 |
| 第三章 結(jié)果與分析 |
| 3.1 干涉目的片段的RT-PCR擴(kuò)增 |
| 3.2 OsDCL3b基因沉默載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 |
| 3.3 轉(zhuǎn)基因T_0代陽性植株的鑒定 |
| 3.4 轉(zhuǎn)基因T_2代陽性純合植株幼穗中OsDCL3b的表達(dá) |
| 3.5 轉(zhuǎn)基因T_2代陽性純合植株成熟期的表型分析 |
| 3.6 T_2代突變株與野生型水稻幼穗中小RNA的比較分析 |
| 3.6.1 18-36 nt小RNA的數(shù)量分布比較 |
| 3.6.2 突變體與對照幼穗中共有和特有小RNA的比較 |
| 3.6.3 突變體與對照幼穗中所測小RNA在染色體上的分布 |
| 第四章 討論 |
| 4.1 小分子RNA在生物體中的調(diào)控作用 |
| 4.2 植物中DCL類型與功能的多樣性 |
| 4.3 DCL蛋白基因在植株不同組織部位的差異表達(dá) |
| 4.4 植物中phased small RNA的加工生成 |
| 4.5 OsDCL3b基因的趨同進(jìn)化及其功能 |
| 附 縮略詞表 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀碩士學(xué)位期間的成果 |
（10）嗜熱微生物熱穩(wěn)定與熱適應(yīng)機(jī)制的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 嗜熱微生物概述 |
| 1.2 研究嗜熱微生物的意義 |
| 1.3 嗜熱微生物嗜熱機(jī)制的研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 細(xì)胞結(jié)構(gòu)層次上的研究 |
| 1.3.2 基因組(DNA)水平上的熱適應(yīng)機(jī)制的研究 |
| 1.3.3 轉(zhuǎn)錄組(RNA)水平上熱適應(yīng)機(jī)制的研究 |
| 1.3.4 蛋白質(zhì)水平上的熱適應(yīng)機(jī)制的研究 |
| 1.4 本論文的研究目的及意義 |
| 1.5 本論文的組織結(jié)構(gòu) |
| 第二章 蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定與嗜熱微生物熱適應(yīng)的關(guān)系 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 數(shù)據(jù)收集 |
| 2.2.2 同源蛋白的識(shí)別及分組 |
| 2.2.3 蛋白質(zhì)特性參數(shù)的計(jì)算 |
| 2.2.4 同源蛋白功能及COG注釋 |
| 2.2.5 統(tǒng)計(jì)HT-only組同源蛋白的fold結(jié)構(gòu) |
| 2.2.6 統(tǒng)計(jì)HT-only組同源蛋白的輔因子 |
| 2.3 結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 526個(gè)古細(xì)菌和真細(xì)菌中同源蛋白的識(shí)別 |
| 2.3.2 HT-only組的功能分析及三組同源蛋白的COG組成 |
| 2.3.3 氨基酸組成與蛋白質(zhì)特性參數(shù)的分析 |
| 2.3.4 HT-only組同源蛋白fold結(jié)構(gòu)及輔因子的使用 |
| 2.4 結(jié)論 |
| 第三章 氨基酸的熱穩(wěn)定性與嗜熱微生物熱適應(yīng)的關(guān)系 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 數(shù)據(jù)收集 |
| 3.2.2 數(shù)據(jù)處理 |
| 3.3 結(jié)果與討論 |
| 3.4 結(jié)論 |
| 第四章 總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 附錄 |
| 攻讀碩士期間發(fā)表的論文 |
四、超嗜熱菌中逆促旋酶的研究進(jìn)展（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]極端微生物及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 莊瀅潭,劉芮存,陳雨露,楊岑玥,余巖,王濤,王友亮,宋亞軍,滕越. 中國科學(xué):生命科學(xué), 2022(02)
- [2]新型GyrB/ParE抑制劑和LpxC抑制劑的設(shè)計(jì)合成與生物活性評(píng)價(jià)[D]. 代瑞陽. 西南交通大學(xué), 2017(10)
- [3]基于宏基因組學(xué)的深古菌進(jìn)化和代謝潛能研究[D]. 馮曉遠(yuǎn). 上海交通大學(xué), 2017(05)
- [4]嗜鹽蛋白酶SptC的成熟機(jī)制及其幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域功能的研究[D]. 張瑤心. 武漢大學(xué), 2014(01)
- [5]極端嗜酸氧化硫硫桿菌篩選及貧黃銅礦生物浸出研究[D]. 馮守帥. 江南大學(xué), 2014(12)
- [6]極端嗜鹽古生菌Natrinema屬遺傳操作系統(tǒng)的初步構(gòu)建及其啟動(dòng)子跨域啟動(dòng)活性的普遍性分析[D]. 呂杰. 武漢大學(xué), 2013(07)
- [7]硫磺礦硫化葉菌Sso0660和Sso0661基因的表達(dá)與功能研究[D]. 胡詠梅. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012(06)
- [8]OsDCL3b基因沉默對稻穗生長發(fā)育的影響[D]. 岳怡涵. 南昌大學(xué), 2012(12)
- [9]一個(gè)新的古菌類群——奇古菌門（Thaumarchaeota）[J]. 張麗梅,賀紀(jì)正. 微生物學(xué)報(bào), 2012(04)
- [10]嗜熱微生物熱穩(wěn)定與熱適應(yīng)機(jī)制的研究[D]. 王維. 山東理工大學(xué), 2010(12)
標(biāo)簽：微生物論文; 微生物發(fā)酵論文; 基因合成論文; 質(zhì)粒載體論文; 生物轉(zhuǎn)化論文;