一、肝細(xì)胞癌SCT表現(xiàn)特征與Rb,PCNA的關(guān)系（論文文獻(xiàn)綜述）
葉超毅[1]（2021）在《ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制》文中認(rèn)為研究背景PH（pulmonary hypertension,肺高血壓）一種嚴(yán)重的致死性疾病,主要表現(xiàn)為肺小血管重構(gòu)、肺血管阻力增加和繼發(fā)性右心衰竭。大量文獻(xiàn)表明PASMCs（pulmonary arterial smooth muscle cells,肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞）的過(guò)度增殖和遷移是PH發(fā)生發(fā)展的重要病理因素。ZIP12是鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員,可將細(xì)胞外鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。最新的研究發(fā)現(xiàn),ZIP12的表達(dá)上調(diào)與缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)游離鋅離子的升高和PASMCs的過(guò)度增殖有關(guān)。ZIP12基因敲除可抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞外鋅離子內(nèi)流及細(xì)胞增殖,改善肺血管重構(gòu),抑制肺動(dòng)脈壓力的升高。然而,ZIP12 在 MCT（monocrotaline,野百合堿）誘導(dǎo)的 PAH（pulmonary arterial hypertension,肺動(dòng)脈高壓）大鼠中的表達(dá)及其作用機(jī)制仍不明確。目的本研究的目的是觀察ZIP12在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中的表達(dá),并研究其在PASMCs增殖和遷移中的作用及可能機(jī)制。方法第一部分ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中的表達(dá)根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期制定的方案,采用間隔一周分2次腹腔注射20mg/kg的MCT建立PAH大鼠模型。在MCT給藥4周后,檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、RVHI（right ventricular hypertrophy index,右心室肥厚指數(shù)）和肺及右心組織形態(tài)學(xué)改變。采用免疫熒光和免疫組化染色檢測(cè)肺組織中ZIP12的表達(dá)及定位情況。RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,實(shí)時(shí)熒光定量 PCR）檢測(cè)肺組織中ZIP12mRNA的表達(dá)情況。Western blot檢測(cè)肺組織中ZIP12、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA 和 cyclin D1 的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。第二部分ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用從MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠和對(duì)照組大鼠肺動(dòng)脈分離并培養(yǎng)PASMCs。通過(guò)形態(tài)學(xué)和α-SMA免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。使用ZIP12單克隆抗體和細(xì)胞膜標(biāo)記探針DiO對(duì)PASMCs進(jìn)行染色,確定細(xì)胞內(nèi)ZIP12的表達(dá)定位。構(gòu)建ZIP12敲除和過(guò)表達(dá)慢病毒,分別轉(zhuǎn)染PAH-PASMCs和Ctrl-PASMCs。采用EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,5-乙炔基-2’-脫氧尿苷）摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。Western blot檢測(cè)ZIP12、PCNA和cyclin D1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。第三部分ZIP12參與野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制探索為了進(jìn)一步探討ZIP12調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制,首先通過(guò)Western blot檢測(cè)10%FBS（fetalbovine serum,胎牛血清）刺激的 Ctrl-PASMCs 和 PAH-PASMCs中AKT和ERK1/2的磷酸化。將ZIP12基因敲除和過(guò)表達(dá)慢病毒分別轉(zhuǎn)染PAH-PASMCs和Ctrl-PASMCs,檢測(cè)ZIP12沉默和過(guò)表達(dá)對(duì)AKT和ERK1/2磷酸化的影響。之后分別使用PI3K/AKT通路抑制劑（LY294002,10μM）和ERK通路抑制劑（U0126,10μM）對(duì)ZIP12過(guò)表達(dá)的PASMCs進(jìn)行預(yù)處理。采用EdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。Western blot檢測(cè)p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA 和 cyclin D1 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果第一部分ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中的表達(dá)MCT 給藥 4 周后,mPAP（mean pulmonary arterial pressure,平均肺動(dòng)脈壓）、RVHI、WA%（percentwall area,血管壁面積百分比）、WT%（percent wall thickness,血管壁厚度百分比）和遠(yuǎn)端動(dòng)脈肌化程度與對(duì)照組相比顯著升高（mPAP:Ctrl 19.07±2.53mmHg,PAH31.18±2.67mmHg,P<0.05;RVHI:Ctrl25.60±4.78%,PAH 50.55±6.77%,P<0.05;WA%:Ctrl61.93±5.03,PAH 94.08±2.49,P<0.05;WT%:Ctrl 23.15±5.80,PAH 72.05±6.96,P<0.05;非肌化血管:Ctrl 66.57±10.39%,PAH 18.38±9.04%,P<0.05;部分肌化血管:Ctrl 20.18±7.45%,PAH 31.05±7.34%,P<0.05;完全肌化血管:Ctrl 13.25±7.17%,PAH 50.57±12.53,P<0.05）,并且PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和血管周圍膠原沉積較對(duì)照組均明顯增多。右心室HE染色結(jié)果顯示,MCT誘導(dǎo)的PAH組心肌細(xì)胞橫截面積較正常對(duì)照組相比顯著增加（心肌細(xì)胞橫截面積:Ctrl 174±31.44μm2,PAH 443.88±69.89μm2,P<0.05）。RT-qPCR和Westernblot結(jié)果顯示,在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中ZIP12mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平較對(duì)照組相比均顯著升高（P<0.05）。免疫熒光和免疫組化染色結(jié)果顯示,ZIP12在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌層的表達(dá)明顯增強(qiáng)。此外,與對(duì)照組相比,MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中p-AKT、p-ERK1/2、PCNA和cyclin D1的蛋白表達(dá)水平顯著增加（P<0.05）,而AKT和ERK1/2的表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05）。第二部分ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用分離培養(yǎng)的PASMCs呈長(zhǎng)梭形,邊界清晰,經(jīng)α-SMA免疫熒光染色證實(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。細(xì)胞免疫熒光染色顯示ZIP12分布于細(xì)胞膜上。與Ctrl-PASMCs相比,PAH-PASMCs的增殖和遷移率顯著增加（細(xì)胞增殖率:Ctrl-PASMCs 11.06±1.32%,PAH-PASMCs25.23±3.62%,P<0.05;細(xì)胞遷移率:24h:Ctrl-PASMCs 21.24±2.90%,PAH-PASMCs 46.74±6.93%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 39.01±6.74%,PAH-PASMCs 77.93±11.76%,P<0.05）。通過(guò) Western blot檢測(cè)PCNA和cyclin D1的表達(dá)證實(shí)了上述結(jié)果（P<0.05）。這些作用可通過(guò)沉默 ZIP12 而得到顯著抑制（細(xì)胞增殖率:Ctrl-PASMCs 12.11±1.62%,PAH-PASMCs 21.53±2.47%,PAH-PASMCs+LV-shNC 19.93±4.56%,PAH-PASMCs+LV-shZIP 1214.14±1.85%,P<0.05;細(xì)胞遷移率:24h:Ctrl-PASMCs 23.02±3.62%,PAH-PASMCs 43.36±4.87%,PAH-PASMCs+LV-shNC 42.20±6.71%,PAH-PASMCs+LV-shZIP12 29.95±2.41%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 40.89±3.60%,PAH-PASMCs 82.34±7.06%,PAH-PASMCs+LV-shNC 76.46±5.60%,PAH-PASMCs+LV-shZIP1250.23±5.55%,P<0.05）。相反,過(guò)表達(dá)ZIP12能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移（細(xì)胞增殖率:Ctrl-PASMCs 12.46±1.23%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 10.90±1.61%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 18.03±0.77%,P<0.05;細(xì)胞遷移率:24h:Ctrl-PASMCs 26.11±3.39%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 20.92±8.79%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1260.28±9.81%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 44.58±3.80%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 37.67±10.65%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 77.03±10.06%,P<0.05）,上調(diào) PCNA和 cyclin D1 的表達(dá)（P<0.05）。第三部分ZIP12參與野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制探索Westernblot 結(jié)果顯示,10%FBS 刺激 PAH-PASMCs 誘導(dǎo)的 AKT 和 ERK1/2的磷酸化程度明顯高于Ctrl-PASMCs（P<0.05）。在PAH-PASMCs中沉默ZIP12顯著抑制AKT和ERK1/2的磷酸化（P<0.05）,然而在Ctrl-PASMCs中過(guò)表達(dá)ZIP12顯著促進(jìn)AKT和ERK1/2的磷酸化（P<0.05）。使用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002處理ZIP12過(guò)表達(dá)的Ctrl-PASMCs能夠部分抑制ERK1/2磷酸化的增加,而ERK通路抑制劑U0126對(duì)AKT的磷酸化沒有影響,表明AKT位于ERK1/2的上游。此外,LY294002能夠完全抑制ZIP12過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用,而U0126僅表現(xiàn)出部分抑制的作用（細(xì)胞增殖率:Ctrl-PASMCs 11.49±1.05%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 11.32±1.36%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1219.85±0.60%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+LY294002 4.81±1.30%,Ctr1-PASMCs+LV-ZIP12+U0126 15.31±0.39%,P<0.05;細(xì)胞遷移率:24h:Ctrl-PASMCs 30.29±3.22%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 20.94±6.01%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1257.48±8.76%,Ctrl-PASMCs±LV-ZIP12+LY294002 24.53±3.31%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+U0126 44.53±7.03%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 41.92±8.98%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 36.06±9.18%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 78.99±5.73%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+LY294002 36.74±2.15%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+U012660.91±8.04%,P<0.05）。結(jié)論1.ZIP12在MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織中表達(dá)升高;2.ZIP12參與了MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠PASMCs的過(guò)度增殖和遷移;3.ZIP12可通過(guò)AKT/ERK通路調(diào)控PASMCs的增殖和遷移。
胡博[2]（2021）在《長(zhǎng)鏈非編碼RNA CYTOR通過(guò)調(diào)節(jié)miR-125b-5p/KIAA1522軸影響肝細(xì)胞癌增殖、凋亡和細(xì)胞周期的機(jī)制研究》文中研究說(shuō)明背景:肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一種原發(fā)性肝臟惡性腫瘤,在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高、治療效果欠佳。隨著靶向治療藥物如索拉非尼、倫伐替尼,以及免疫治療藥物如免疫檢查點(diǎn)抑制劑的出現(xiàn),其預(yù)后得到一定的改善,但5年生存率仍舊不高。競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA間相互作用的新機(jī)制,即以長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）為主的非編碼RNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性共享微小RNA（microRNA,miRNA）來(lái)調(diào)節(jié)mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表達(dá),這種調(diào)節(jié)機(jī)制在癌癥的發(fā)病機(jī)理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及調(diào)節(jié)機(jī)制仍未被完全解釋,新的ceRNA調(diào)控軸亟待探究。lncRNA CYTOR是一種已被證實(shí)在多種腫瘤中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移等作用的非編碼基因,并可作為多種miRNA的內(nèi)源性海綿。然而,lncRNACYTOR作為ceRNA在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR為起點(diǎn),探索ceRNA調(diào)節(jié)機(jī)制在HCC中的應(yīng)用。材料與方法:通過(guò)檢索癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,獲得人類HCC的lncRNA、mRNA和miRNA數(shù)據(jù)集表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)臨床信息。下載基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus database,GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE62232和GSE84402的HCC相關(guān)RNA數(shù)據(jù)用于后續(xù)驗(yàn)證。借助在線數(shù)據(jù)分析工具,分析lncRNA CYTOR在多種腫瘤類型及HCC相關(guān)數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況。借助R語(yǔ)言分析lncRNA CYTOR在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC腫瘤組織及癌旁正常肝組織中的差異表達(dá)情況,以及其表達(dá)水平與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC患者總生存期（overall survival,OS）之間的關(guān)系。分析lncRNA CYTOR與常用臨床病理參數(shù),如性別、年齡、腫瘤分級(jí)、臨床分期和T、N、M分期之間的關(guān)聯(lián)性,并進(jìn)一步整合這些參數(shù),通過(guò)單因素及多因素Cox回歸分析探究lncRNA CYTOR獨(dú)立預(yù)測(cè)患者預(yù)后的能力。之后,識(shí)別TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC樣品中差異表達(dá)的miRNA,同時(shí)使用ENCORI軟件（starbase3.0）預(yù)測(cè)目標(biāo)lncRNA的靶向的miRNA,選擇差異分析中表達(dá)下調(diào)的miRNA與預(yù)測(cè)的miRNA做交集后得出候選miRNA。同理,基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析HCC樣品中差異表達(dá)的mRNA,并基于ENCORI軟件使用6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）預(yù)測(cè)候選 miRNA 靶向的mRNA,選擇差異分析中表達(dá)上調(diào)的mRNA與預(yù)測(cè)的mRNA做交集后得出候選的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）來(lái)識(shí)別與所篩選出的mRNA高表達(dá)相關(guān)的基因集和通路途徑,探索其潛在的功能。結(jié)果:lncRNACYTOR在多種癌癥的腫瘤組織（如結(jié)腸癌、腎透明細(xì)胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多個(gè)HCC相關(guān)數(shù)據(jù)集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相較于癌旁組織表達(dá)上調(diào)。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中,與癌旁正常組織相比,HCC組織中的lncRNACYTOR表達(dá)水平顯著增高（P<0.001）;且高表達(dá)患者組的OS較低表達(dá)患者組顯著縮短（P<0.001）。臨床病理參數(shù)關(guān)聯(lián)性分析顯示,lncRNACYTOR的表達(dá)水平與病理分級(jí)（Grade）顯著相關(guān),且G2與G1（P<0.01）、G3與G2（P<0.05）、G3與G1（P<0.001）和G4與G1（P<0.05）之間存在顯著性差異;該基因在臨床Ⅱ期（StageⅡ）的表達(dá)水平較臨床Ⅰ期（StageⅠ）顯著上調(diào)（P<0.001）,在T2期及T4期的表達(dá)水平較T1期顯著上調(diào)（P<0.001;P<0.05）。獨(dú)立預(yù)后分析表明lncRNA可獨(dú)立于上述臨床參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后（P<0.05）。ENCORI軟件分析得出miR-125b-5p可作為lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后續(xù)6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析得出KIAA1522及PODXL可作為miR-125b-5p的候選靶向mRNA。對(duì)二者進(jìn)行差異分析、生存分析及與miR-125b-5p的相關(guān)分析后,選擇KIAA1522作為目標(biāo)靶向mRNA。相較于癌旁組織,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC組織中表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.001）。GSEA富集分析結(jié)果表明,cell cycle信號(hào)通路、adherens junction信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、apoptosis信號(hào)通路和tight junction信號(hào)通路相關(guān)的基因集在高KIAA1522表達(dá)的表型中顯著富集。結(jié)論:探究lncRNA的表達(dá)情況、生物學(xué)功能,構(gòu)建新的lncRNA/miRNA/mRNA調(diào)控軸是研究HCC發(fā)病機(jī)制的有效手段。lncRNA在HCC組織中表達(dá)水平顯著上調(diào),與多種臨床病理參數(shù)相關(guān),且可作為HCC患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。此外,lncRNA CYTOR可通過(guò)靶向miR-125b-5p進(jìn)而調(diào)節(jié)KIAA1522的表達(dá)參與HCC的發(fā)生發(fā)展。背景:肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一種由多種病因引起腫瘤,目前仍是人類最常見、最致命的惡性腫瘤之一。因此,尋找新的、臨床上有效的HCC診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是基于第一部分生物信息學(xué)分析的結(jié)果,探索長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白編碼信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向調(diào)控作用及該調(diào)控軸在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。材料與方法:通過(guò)脂質(zhì)體將目的基因相關(guān)載體轉(zhuǎn)染至正常肝細(xì)胞（HHL-5）及幾種HCC細(xì)胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）檢測(cè) HCC 細(xì)胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表達(dá),并篩選實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。免疫組化檢測(cè)KIAA1522在HCC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試驗(yàn)證實(shí)lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522間的調(diào)控關(guān)系。之后,利用CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)試劑盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染條件下HCC細(xì)胞的增殖情況,采用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后HCC細(xì)胞周期的變化,使用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）觀察轉(zhuǎn)染后 HCC 細(xì)胞的凋亡情況;并通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（western blot,WB）分析檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:轉(zhuǎn)染后,相較于HHL-5細(xì)胞,Hep3b細(xì)胞中上述基因的表達(dá)均是最為顯著的,故選擇Hep3b細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共轉(zhuǎn)染組和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共轉(zhuǎn)染組Hep3b細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)合WB檢測(cè)結(jié)果顯示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC細(xì)胞的增殖,并下調(diào)了 Ki-67和PCNA的蛋白表達(dá);抑制miR-125b-5p或KIAA1522的過(guò)度表達(dá)則促進(jìn)了細(xì)胞的增殖并上調(diào)了 Ki-67和PCNA的蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞儀分析結(jié)合WB檢測(cè)結(jié)果顯示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下調(diào)了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表達(dá)而上調(diào)了 p21表達(dá);抑制miR-125b-5p或KIAA1522的過(guò)度表達(dá)則升高了 S期及G2/M期比值,并上調(diào)了 cyclin D1等蛋白的表達(dá)并下調(diào)了 p21表達(dá)。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)合WB檢測(cè)提示敲低lncRNA CYTOR可促進(jìn)Hep3b細(xì)胞凋亡,下調(diào)Bcl-2的表達(dá)同時(shí)上調(diào) Bax 的表達(dá)及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的過(guò)表達(dá)則抑制Hep3b細(xì)胞凋亡,上調(diào)Bcl-2的表達(dá)并下調(diào) Bax 的表達(dá)及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。結(jié)論:綜上所述,HCC中過(guò)表達(dá)的lncRNA CYTOR可通過(guò)靶向抑制miR-125b-5p進(jìn)而上調(diào)KIAA1522的表達(dá)水平,促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞凋亡。本研究為肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制注入了新的見解。
李玉強(qiáng)[3]（2021）在《組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶RIZ1介導(dǎo)的lncRNA HOTAIRM1失活對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制的研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的:在全球范圍內(nèi),肝癌是第二大最常見的癌癥死亡原因,每年導(dǎo)致超過(guò)700,000例死亡,它是一種侵襲性的惡性腫瘤,通常預(yù)后較差,五年生存率估計(jì)低于9%。作為重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制,組蛋白甲基化在許多生物學(xué)過(guò)程中都起著重要作用,與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白相互作用的鋅指蛋白1（retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene1,RIZ1）是一種甲基轉(zhuǎn)移酶,RIZ1能使組蛋白的H3K9甲基化成H3K9me1。長(zhǎng)非編碼RNA（lnc RNA）是一組長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼RNA。越來(lái)越多的證據(jù)表明,可能作為癌基因或抑癌基因的lnc RNA在人類疾病的病理生理中,尤其是在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。但是,Lnc RNA在肝癌中的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。鑒于此,本研究目的是探討組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶RIZ1是否可以介導(dǎo)lnc RNA HOTAIRM1啟動(dòng)子上的H3K9me1富集,通過(guò)靶向mi R-125b來(lái)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究其表達(dá)改變的情況及其可能發(fā)生的分子機(jī)制,進(jìn)而從一個(gè)新的角度闡述RIZ1和Lnc RNA HOTAIRM1在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮作用的機(jī)制。研究方法:1.研究RIZ1與lnc RNA HOTAIRM1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義（1）利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析RIZ1與lnc RNA HOTAIRM1在肝細(xì)胞癌組織表達(dá)水平及其臨床意義。（2）采用q RT-PCR檢測(cè)本科室收集的肝細(xì)胞癌患者組織樣本、血液樣本及細(xì)胞培養(yǎng)中RIZ1和HOTAIRM1表達(dá)情況及其臨床意義。（3）Western Blot和免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)定肝細(xì)胞癌患者組織樣本中RIZ1蛋白表達(dá)水平。2.研究組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶RIZ1介導(dǎo)的HOTAIRM1啟動(dòng)子上的H3K9me1富集對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響（1）構(gòu)建RIZ1和HOTAIRM1干擾慢病毒:LV-RIZ1-RNAi（97334-1）,LV-RIZ1-RNAi（97335-1）,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）;L V-HOTAIRM1-RNAi（97354-1）,LV-HOTAIRM1-RNAi（97355-1）,LV-HOTAIRM1-RNAi（97356-1）;及陰性對(duì)照病毒:KLLVCONO77（hu6-MCS-ubiquitin-EGFP-IRES-puro mycin）;HOTAIRM1過(guò)表達(dá)慢病毒:LV-HOTAIRM1（65150-1）,陰性對(duì)照病毒為C ON238（ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-pur-omycin）,摸索出慢病毒對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞感染的MOI和最佳感染條件。（2）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞后,研究RIZ1干擾后對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響;利用PI染色法檢測(cè)干擾RIZ1后對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞周期的影響;通過(guò)Annexin V-PE染色法檢測(cè)RIZ1干擾后對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響。（3）我們采用染色質(zhì)免疫沉淀（Ch IP）實(shí)驗(yàn)分析評(píng)估H3K9me1與HOTAIRM1啟動(dòng)子的結(jié)合。（4）采用Western Blot方法測(cè)定LV-RIZ1-RN Ai慢病毒轉(zhuǎn)染后,肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的H3K9me1表達(dá)情況;用q RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染LV-RIZ1-RNAi慢病毒后肝細(xì)胞癌細(xì)胞HOTAIRM1的表達(dá)水平。（5）用LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1共轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞,分析肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡的情況。3.研究lnc RNA HOTAI RM1與mi R-125b相互作用對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響及其臨床意義。（1）運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)lnc RNA HOTAIRM1的靶向mi RNA。（2）通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),驗(yàn)證HOTAIRM1是否可以直接結(jié)合mi R-125b,我們構(gòu)建了HOTAIR M1-wt熒光素酶報(bào)告基因載體和HOTAIRM1-mut 3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體,并進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析。（3）通過(guò)q RT-PCR測(cè)定用LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1慢病毒轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞后mi R-125b的表達(dá)水平。（4）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染后,通過(guò)q RT-PCR測(cè)定mi R-125b在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。（5）為了研究mi R-125b對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,我們構(gòu)建了LV-hsamir-125b-1慢病毒。（6）將慢病毒LV-hsa-mir-125b-1或LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1或LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌細(xì)胞后,分析肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡情況。（7）通過(guò)q RT-PCR檢測(cè)我們收集的肝細(xì)胞癌患者組織樣本、血液樣本及肝細(xì)胞系中mi R-125b的表達(dá)情況。結(jié)果:1.（1）利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肝細(xì)胞癌患者組織中的RI Z1與lnc RNA HOTAIRM1表達(dá)水平進(jìn)行分析。通過(guò)分析可以看出在肝細(xì)胞癌患者癌組織中,RIZ1的表達(dá)升高而HOTAIRM1的表達(dá)下降;分析發(fā)現(xiàn)RIZ1的表達(dá)與年齡和TNM分期無(wú)關(guān),與性別有關(guān),女性肝細(xì)胞癌患者癌組織樣本中RIZ1的表達(dá)比男性高;Kaplan-Meier分析表明,RIZ1的高表達(dá)與總生存期降低有關(guān);HOTAIR M1的表達(dá)量與肝細(xì)胞癌的Stage分級(jí)沒有明顯的差異;Kaplan-Meier分析表明,肝細(xì)胞癌患者HOTAIRM1的高表達(dá)與總生存期延長(zhǎng)沒有明顯的差異。（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:在肝細(xì)胞癌患者組織樣本中,癌組織中RIZ1高表達(dá);肝細(xì)胞癌患者血液樣本中RIZ1表達(dá)量比正常患者的表達(dá)量高;HCC-LM3、HEPG2、LO2肝細(xì)胞系中,HCC-LM3細(xì)胞中RIZ1高表達(dá)。在肝細(xì)胞癌患者組織樣本中,正常組織中HOTAIRM1高表達(dá);肝細(xì)胞癌患者血液樣本中HOTAIRM1表達(dá)量比正?；颊叩谋磉_(dá)量低;HCC-LM3、HEGP2、LO2肝細(xì)胞系中,LO2細(xì)胞中HOTAIRM1高表達(dá)。（3）Western Blot和免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)定結(jié)果顯示RIZ1在肝細(xì)胞癌患者癌組織中是高表達(dá)的。（4）分析發(fā)現(xiàn)RIZ1和HOTAIRM1的表達(dá)情況與患者腫瘤大小及腫瘤數(shù)量密切相關(guān),但其與患者年齡、性別、乙肝、肝硬化、AFP、門靜脈癌栓、腫瘤分化程度及TNM分期等因素?zé)o關(guān)。2.（1）LV-RIZ1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染HEPG2的最佳感染條件為,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）慢病毒+Hi Trans G P組,MO I=10;LV-RIZ1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染HCC-LM3的最佳感染條件為,LV-RIZ1-RNAi（97334-1）慢病毒+Hi Trans G P組,MOI=20;LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi共轉(zhuǎn)染HEPG2,最佳感染條件為,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）+LV-HOTAIRM1-RNAi（97355-1）慢病毒+Hi Trans G A組,MOI=10;LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1共轉(zhuǎn)染H CC-LM3的最佳感染條件為,LV-RIZ1-RNAi（97334-1）+LV-HOTAIRM1（65150-1）慢病毒+Hi Trans G P組,MOI=20。（2）Ch IP分析可評(píng)估H3K9me1與HOTAIRM1啟動(dòng)子的結(jié)合,并且我們觀察到HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞中H3K9me1與HOTAIRM1啟動(dòng)子之間的結(jié)合增加。（3）Western Blot方法測(cè)定結(jié)果顯示,LV-RIZ1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染后,HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞中的H3K9me1表達(dá)受到抑制。（4）用LV-RI Z1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染后,對(duì)HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞進(jìn)行分析,結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,抑制RIZ1的表達(dá)降低了HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞的增殖、侵襲、和遷移,增加了細(xì)胞的凋亡;細(xì)胞周期分析結(jié)果表明,對(duì)RIZ1的抑制增加了HEPG2和HCC-LM3 S期細(xì)胞的比例,結(jié)合細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說(shuō)明RIZ1干擾之后可促進(jìn)肝細(xì)胞癌停滯與S期。（5）LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒共轉(zhuǎn)染HEP G2細(xì)胞,HEPG2細(xì)胞中RIZ1的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1抑制的共同作用可逆轉(zhuǎn)R IZ1沉默對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡。（6）LV-RIZ1-RNAi+LV-HOT AIRM1共轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞,RIZ1抑制和HOTAIRM1過(guò)度表達(dá)共同作用進(jìn)一步抑制了HCC-LM3的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,增強(qiáng)了細(xì)胞的凋亡。3.（1）我們使用Star Base 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)HOTAIRM1的靶mi RNA,發(fā)現(xiàn)mi R-125b是HOTAIRM1的靶mi RNA。（2）我們構(gòu)建了HOTAIRM1-wt熒光素酶報(bào)告基因載體和HOTAIRM1-mut3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體,并進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因分析。結(jié)果表明,mi R-125b過(guò)表達(dá)導(dǎo)致HOTAIRM1-WT的熒光素酶活性顯著降低,而HOTAIRM1-MUT則沒有。這些結(jié)果表明,HOTAIRM1可以直接結(jié)合mi R-125b。（3）用LV-H OTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1慢病毒轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞和HCC-LM3細(xì)胞。結(jié)果表明,HOTAIRM1的過(guò)表達(dá)顯著抑制了mi R-125b的表達(dá),而HOTAIRM1的下調(diào)則反向支持了肝癌細(xì)胞中mi R-125b的表達(dá)。（4）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染H EPG2和HCC-LM3細(xì)胞,結(jié)果表明,RIZ1的沉默抑制了HEPG2和HCC-LM3細(xì)胞中mi R-125b的表達(dá)水平。（5）用LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1-RNAi+L V-hsa-mir-125b-1慢病毒轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞,HOTAIRM1在HEPG2細(xì)胞中的下調(diào)表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞增殖,侵襲和遷移;抑制了細(xì)胞的凋亡。和mi R-125b過(guò)表達(dá)共同作用進(jìn)一步促進(jìn)了HEPG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,抑制了細(xì)胞的凋亡。（6）用L V-HOTAIRM1或LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒轉(zhuǎn)染HCC-LM3細(xì)胞,結(jié)果表明,HOTAIRM1的過(guò)表達(dá)抑制了HCC-LM3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡,并且完全逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)HOTAIRM1和mi R-125b的共轉(zhuǎn)染結(jié)果。（7）肝細(xì)胞癌患者癌組織及血液樣本中mi R-125b高表達(dá),細(xì)胞培養(yǎng)樣本HCC-LM3細(xì)胞中mi R-125b高表達(dá)。（8）分析發(fā)現(xiàn)mi R-125b的表達(dá)情況與患者乙肝、腫瘤大小及腫瘤數(shù)量密切相關(guān),與患者年齡、性別、肝硬化、AFP、門靜脈癌栓、腫瘤分化程度及TNM分期等因素?zé)o關(guān)。結(jié)論:1.通過(guò)TCGA和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合我們收集的樣本進(jìn)行分析,結(jié)果表明肝細(xì)胞癌患者的組織和血液樣本中RIZ1表達(dá)水平上調(diào),而HOTAIRM1的表達(dá)下調(diào)。肝細(xì)胞系中,HCC-LM3細(xì)胞中RIZ1高表達(dá),LO2細(xì)胞中HOTAIRM1高表達(dá)。2.Kaplan—Meier生存曲線分析表明RIZ1的高表達(dá)與總生存期降低有關(guān),HOTAIRM1的高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者總生存期延長(zhǎng)沒有明顯的差異。3.RIZ1和HOTAIRM1的表達(dá)情況與患者腫瘤大小及腫瘤數(shù)量密切相關(guān),即RIZ1高表達(dá)與RIZ1低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織相比,其腫瘤體積相對(duì)較大,腫瘤數(shù)目相對(duì)較多;HOTAIRM1高表達(dá)與HOTAIRM1低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織相比,其腫瘤體積相對(duì)較小,腫瘤數(shù)目相對(duì)較少。4.肝細(xì)胞癌細(xì)胞中H3K9me1與HOTAIRM1啟動(dòng)子之間的結(jié)合增加;RIZ1的下調(diào)可以有效抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,增強(qiáng)細(xì)胞凋亡;再和HOTAIRM1過(guò)表達(dá)共同作用后進(jìn)一步抑制了肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,增強(qiáng)了細(xì)胞的凋亡;再和HOTAIRM1抑制共同作用后可逆轉(zhuǎn)RIZ1下調(diào)對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、和凋亡;說(shuō)明組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶RIZ1可以介導(dǎo)H3K9me1在HOTAIRM1啟動(dòng)子上的富集,從而調(diào)節(jié)了肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡。5.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明mi R-125b可通過(guò)直接結(jié)合與HOTAIRM1相互作用。mi R-125b在肝細(xì)胞癌患者癌組織及血液樣本中高表達(dá),在HCC-LM3細(xì)胞培養(yǎng)樣本中高表達(dá)。HOTAIRM1在HEPG2細(xì)胞中的下調(diào)表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞增殖,侵襲和遷移,抑制了細(xì)胞的凋亡。和mi R-125b過(guò)表達(dá)共同作用進(jìn)一步促進(jìn)了HEPG2細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,抑制細(xì)胞的凋亡。HOTAIRM1的過(guò)表達(dá)抑制了HCC-LM3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡,并且完全逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)HOTAIRM1和mi R-125b的共轉(zhuǎn)染結(jié)果。mi R-125b的表達(dá)情況與患者乙肝、腫瘤大小及腫瘤數(shù)量密切相關(guān),即mi R-125b高表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織與mi R-125b低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織相比,其腫瘤體積相對(duì)較大,腫瘤數(shù)目相對(duì)較多;乙肝陽(yáng)性患者中mi R-125b高表達(dá)的多,乙肝陰性患者中mi R-125b低表達(dá)的多。6.總之我們研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶RIZ1可以介導(dǎo)lnc RNA HOTAIRM1啟動(dòng)子上的H3K9me1富集,并通過(guò)靶向mi R-125b來(lái)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,這可以進(jìn)一步影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。從而為肝癌的治療提供新的靶標(biāo)和思路。
孟子琦[4]（2020）在《基于整合生物信息學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療三種常見腫瘤作用機(jī)制研究》文中研究指明研究背景在世界范圍內(nèi),肝癌、胰腺癌、肺癌高居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的前列,嚴(yán)重威脅著人們的生命健康,也給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。中藥注射劑在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),廣泛應(yīng)用于臨床。但由于中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)、多功能的特點(diǎn),導(dǎo)致藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、作用機(jī)制不清楚,增加了研究的難度,嚴(yán)重影響了國(guó)際化的進(jìn)程。復(fù)方苦參注射液具有清熱利濕,涼血解毒,散結(jié)止痛的作用,臨床上廣泛用于惡性腫瘤的治療,然而其作用機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)伴隨著生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展,新理念、新思路不斷涌現(xiàn),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)的結(jié)合成為提高中醫(yī)藥研究水平的重要路徑?；诖?本研究運(yùn)用整合生物信息學(xué)方法,分析探究復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的作用機(jī)制。研究目的通過(guò)生物信息學(xué)方法確認(rèn)肝癌、胰腺癌中的關(guān)鍵基因。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)、篩選復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,從系統(tǒng)層面揭示復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的多成分、多靶點(diǎn)、多通路復(fù)雜機(jī)制。研究方法1.生物信息學(xué)分析在肝癌關(guān)鍵基因研究中,從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載基因芯片數(shù)據(jù)集,使用limma包進(jìn)行差異表達(dá)分析,之后采用RobustRankAggreg包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析,篩選出共同被確認(rèn)為差異表達(dá)的基因。通過(guò)STRING獲取差異基因的蛋白互作信息,導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),并使用MCODE進(jìn)行模塊分析。通過(guò)DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析。利用KM plotter、GEPIA進(jìn)行生存分析、表達(dá)水平分析和關(guān)聯(lián)性分析。在胰腺癌關(guān)鍵基因研究中,從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和患者的臨床信息,利用WGCNA包構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、識(shí)別基因模塊并與臨床信息相關(guān)聯(lián)。通過(guò)Cytoscape對(duì)模塊進(jìn)行可視化,并使用CytoHubba確定關(guān)鍵基因。通過(guò)clusterProfiler包進(jìn)行GO富集分析,并通過(guò)DAVID進(jìn)行KGEE通路富集分析。采用survival包進(jìn)行單因素Cox回歸分析,隨后根據(jù)單因素的P值篩選基因進(jìn)行多因素Cox回歸分析,構(gòu)建生存相關(guān)的線性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型,通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組樣本的總體生存率差異情況。采用survivalROC包繪制ROC曲線,評(píng)價(jià)預(yù)后模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。2.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析在復(fù)方苦參注射液治療肝癌作用機(jī)制研究中,通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲得復(fù)方苦參注射液的化學(xué)成分,通過(guò) STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction、TCMSP 獲取化學(xué)成分的靶點(diǎn)。通過(guò)TTD、GEO、TCGA獲得肝細(xì)胞癌相關(guān)基因。使用Cytoscape構(gòu)建“化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“化合物-肝細(xì)胞癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”,對(duì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。通過(guò)DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析。使用KM plotter、GEPIA進(jìn)行生存分析和關(guān)聯(lián)性分析。利用AutoDock進(jìn)行分子對(duì)接模擬。在復(fù)方苦參注射液治療胰腺癌作用機(jī)制研究中,通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲得復(fù)方苦參注射液的化學(xué)成分,通過(guò) STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction、TCMSP 獲取化學(xué)成分的靶點(diǎn)。通過(guò)合并TTD、TCGA以及WGCNA篩選出的關(guān)鍵基因得到胰腺癌相關(guān)基因。隨后通過(guò)STRING獲取蛋白互作信息。使用Cytoscape構(gòu)建“化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“化合物靶點(diǎn)-胰腺癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“藥物-化合物-蛋白互作靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”,并使用MCODE對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析。通過(guò)DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析。利用AutoDock+進(jìn)行分子對(duì)接模擬。在復(fù)方苦參注射液治療肺癌作用機(jī)制研究中,通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲得復(fù)方苦參注射液的化學(xué)成分,通過(guò)STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction獲取化學(xué)成分的靶點(diǎn),通過(guò)TTD、OMIM獲得肺癌相關(guān)基因。隨后通過(guò)STRING獲取蛋白互作信息。使用Cytoscape構(gòu)建“化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“肺癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“化合物-肺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”,對(duì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。通過(guò)DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析并通過(guò)systemsDock進(jìn)行分子對(duì)接模擬。研究結(jié)果1.生物信息學(xué)分析結(jié)果對(duì)13個(gè)肝細(xì)胞癌基因芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析,得到380個(gè)差異基因,包括293個(gè)下調(diào)基因和87個(gè)上調(diào)基因。通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與模塊分析得到1 1個(gè)關(guān)鍵基因（CDK1、CCNB2、CDC20、CCNB1、TOP2A、CCNA2、MELK、PBK、TPX2、KIF20A、AURKA）和2個(gè)重要模塊。富集分析表明,差異基因主要與代謝相關(guān)通路有關(guān),關(guān)鍵基因和模塊1與細(xì)胞周期密切相關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因均與肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。表達(dá)水平分析表明關(guān)鍵基因均在肝細(xì)胞癌中高表達(dá),關(guān)聯(lián)性分析表明CDK1的表達(dá)與其他關(guān)鍵基因的表達(dá)呈正相關(guān)。對(duì)TCGA胰腺癌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,共得到177個(gè)樣本和5000個(gè)基因用于WGCNA分析,并得到11個(gè)基因模塊。通過(guò)腫瘤分級(jí)、腫瘤分期和患者的生存狀態(tài)最終篩選出黑色模塊和藍(lán)色模塊作進(jìn)一步研究。GO富集分析顯示黑色模塊與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),藍(lán)色模塊與腫瘤的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。KEGG通路富集分析顯示,黑色模塊中的基因主要富集在細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路等通路上。藍(lán)色模塊中的基因主要富集在粘蛋白型O-聚糖的生物合成、花生四烯酸代謝、ECM-受體相互作用、緊密連接等通路上。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析,分別篩選出黑色模塊和藍(lán)色模塊中的5個(gè)關(guān)鍵基因（NCAPG、BUB1、CDK1、TPX2、DLGAP5;INAVA、MST1R、TMPRSS4、TMEM92、SFN）,且這些基因均在胰腺癌中高表達(dá)。生存分析得到5個(gè)基因構(gòu)建預(yù)后模型,其中TSPOAP1與胰腺癌患者生存時(shí)間呈正相關(guān),ADGRG6、GPR87、FAM111B、MMP28與胰腺癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。2.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果在復(fù)方苦參注射液治療肝癌作用機(jī)制研究中,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（BCHE、SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A、CDK1）,其中 CDK1 在肝細(xì)胞癌中高表達(dá),其余5個(gè)均為低表達(dá)。GO富集分析顯示,復(fù)方苦參注射液調(diào)控的與肝細(xì)胞癌有關(guān)的靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞周期、凋亡過(guò)程調(diào)控、代謝過(guò)程等生物過(guò)程中。KEGG通路富集分析表明,這些靶點(diǎn)主要與藥物代謝-細(xì)胞色素P450、花生四烯酸代謝等通路有關(guān)。此外,關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A的表達(dá)與CDK1的表達(dá)有很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。生存分析結(jié)果表明,CDK1與肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān),SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A與肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間呈正相關(guān)。在復(fù)方苦參注射液治療胰腺癌作用機(jī)制研究中,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析與模塊分析,篩選出6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（AKT1、MAPK1、MAPK3、EGFR、CDK1、JAK1）和3個(gè)重要模塊。GO富集分析顯示,3個(gè)重要模塊主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、JAK-STAT級(jí)聯(lián)、MAPK級(jí)聯(lián)、磷酸化,凋亡過(guò)程調(diào)控有關(guān)。KEGG通路富集分析表明,3個(gè)重要模塊顯著富集在細(xì)胞周期、ErbB信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等通路上。在復(fù)方苦參注射液治療肺癌作用機(jī)制研究中,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（CHRNA3、DRD2、PRKCA、CDK1、CDK2、CHRNA5、MMP1、MMP9）。GO 富集分析顯示,復(fù)方苦參注射液調(diào)控的與肺癌有關(guān)的靶點(diǎn)顯著富集在有絲分裂細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)磷酸化、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的調(diào)控、激酶活性等生物過(guò)程和分子功能中。KEGG通路富集分析表明,這些靶點(diǎn)主要參與癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖、PI3K-Akt信號(hào)通路、非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌等通路。研究結(jié)論本研究綜合運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法,在系統(tǒng)層面揭示了復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。初步闡釋了復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的作用機(jī)制可能與協(xié)同調(diào)控多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路有關(guān)。本研究可為中藥注射劑治療不同類型惡性腫瘤的作用機(jī)制研究提供線索和思路,為進(jìn)一步開展復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究以及促進(jìn)治療肝癌、胰腺癌、肺癌中藥的臨床合理應(yīng)用提供參考和借鑒。
張駿[5]（2020）在《羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體的制備及其抗肝細(xì)胞癌研究》文中研究說(shuō)明目的:肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率排在世界第五位,是世界第三高死亡率的腫瘤。目前有多種HCC治療方案,但是全球HCC患者5年生存率仍然低于5%,其主要原因是手術(shù)切除術(shù)、化學(xué)療法通常會(huì)有嚴(yán)重的副作用。因此,迫切需要尋找和研究出一種安全有效的新藥物或藥物傳遞系統(tǒng)來(lái)改善以上的弊端,從而到達(dá)預(yù)防和治療HCC的目的。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道狼毒、京大戟、蒲公英等中藥對(duì)多種腫瘤模型具有顯著抑制作用,而越來(lái)越多的研究表明中藥中的單體成分（雷公藤紅素、斑蝥素）對(duì)腫瘤性疾病具有一定的治療作用。羽扇豆醇是狼毒、京大戟、蒲公英等中藥中的主要化學(xué)成分,大量研究證實(shí)羽扇豆醇在多種腫瘤細(xì)胞系和癌癥模型中發(fā)揮了顯著的抗腫瘤作用。但是,由于羽扇豆醇存在不溶于水,生物利用度低等缺點(diǎn),從而限制了其開發(fā)使用。因此,需要一種新型藥物載體改善其作用性質(zhì)以及它的靶向性。本課題首先構(gòu)建一個(gè)具有肝靶向性長(zhǎng)循環(huán)能力的羽扇豆醇脂質(zhì)體,然后作用于HepG2細(xì)胞研究該制劑的靶向性以及腫瘤相關(guān)的蛋白信號(hào)通路,最后利用SB（睡美人轉(zhuǎn)座子）介導(dǎo)的高壓尾靜脈注射轉(zhuǎn)染AKT/c-Met誘導(dǎo)的小鼠HCC模型作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,進(jìn)一步驗(yàn)證最佳劑量下的羽扇豆醇肝靶向長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的抗腫瘤能力、靶向能力及其分子機(jī)制。本課題為羽扇豆醇給藥系統(tǒng)研究提供新思路,同時(shí)為基因轉(zhuǎn)染建立的小鼠原位肝細(xì)胞癌模型應(yīng)用于靶向給藥體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供新的依據(jù)。方法:1.采用HPLC建立羽扇豆醇含量測(cè)定的方法;采用超濾離心法、過(guò)膜法以及魚精蛋白沉淀法進(jìn)行篩選適合羽扇扇豆醇脂質(zhì)體包封率測(cè)定的方法;以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察適合脂溶性藥物的脂質(zhì)體制備方法;采用單因素試驗(yàn)法篩選影響羽扇豆醇普通脂質(zhì)體的因素,為后續(xù)羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體的制備工藝提供參考。2.以包封率和粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo),采用正交試驗(yàn)法,考察主要影響因素對(duì)羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體制備工藝的影響,優(yōu)選最佳制備工藝;考察不同的凍干保護(hù)劑對(duì)羽扇豆醇脂質(zhì)體包封率和粒徑的影響,優(yōu)選最佳凍干保護(hù)劑;采用TEM、SEM觀察脂質(zhì)體的形態(tài),動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)粒徑、PDI、ZETA電位;采用透析的方法考察游離羽扇豆醇、羽扇豆醇脂質(zhì)體、羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體的體外釋放行為,并對(duì)體外釋放進(jìn)行模擬方程擬合;以包封率和粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察游離羽扇豆醇、羽扇豆醇脂質(zhì)體、羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體的稀釋穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性以及血漿穩(wěn)定性。3.體外靶向性研究中,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相同劑量不同劑型的羽扇豆醇制劑對(duì)HepG2細(xì)胞攝取效果來(lái)進(jìn)行定性研究;采用HPLC檢測(cè)相同劑量不同劑型的羽扇豆醇制劑在HepG2細(xì)胞中的攝取量來(lái)進(jìn)行定量研究;體內(nèi)靶向性研究,采用活體成像儀進(jìn)行檢測(cè)相同劑量不同劑型的制劑在FVB小鼠體內(nèi)各臟器的分布情況。4.采用HPLC對(duì)相同劑量不同劑型的羽扇豆醇制劑在SD大鼠中不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度進(jìn)行檢測(cè),平均血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用DAS3.0軟件以非房室模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)矩?cái)M合分析。5.體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)中,采用CCK8法測(cè)定相同劑量不同劑型羽扇豆醇制劑對(duì)HepG2細(xì)胞生存率的影響;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相同劑量不同劑型羽扇豆醇制劑對(duì)細(xì)胞凋亡、周期的影響;采用Western blot檢測(cè)相同劑量不同劑型羽扇豆醇制劑對(duì)HepG2細(xì)胞AKT/mTOR和Ras/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。6.采用高壓尾靜脈轉(zhuǎn)染技術(shù),在FVB/N小鼠肝臟內(nèi)同時(shí)過(guò)表達(dá)AKT（帶有HA-Tag）和c-Met（帶有V5-Tag）進(jìn)行肝細(xì)胞癌模型造模,研究相同劑量不同劑型羽扇豆醇制劑對(duì)AKT/c-Met誘導(dǎo)的小鼠肝臟外觀、肝臟重量、病理學(xué)組織的影響;采用qPCR檢測(cè)相同劑量不同劑型羽扇豆醇制劑對(duì)AKT/c-Met誘導(dǎo)的HCC小鼠肝癌標(biāo)志物的影響;采用Western blot檢測(cè)相同劑量的不同劑型羽扇豆醇制劑對(duì)AKT/c-Met誘導(dǎo)的小鼠AKT/mTOR和Ras/MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。結(jié)果:1.建立了羽扇豆醇的HPLC含量測(cè)定方法;羽扇豆醇在氯仿中的溶解度最高,在水中不溶;最終確定過(guò)膜法為羽扇豆醇脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法,薄膜分散法為羽扇豆醇脂質(zhì)體的制備方法;通過(guò)單因素試驗(yàn)法確定了影響羽扇豆醇脂質(zhì)體制備工藝最大的因素是藥脂比、磷膽比、PEG2000-DSPE。2.通過(guò)正交試驗(yàn)工藝考察,包封率為考察指標(biāo),最終確定羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體最佳制備工藝為磷膽比7:1,藥脂比1:10,Gal-PEG-DSPE在處方中的質(zhì)量百分比為10%;以包封率和粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo),選擇蔗糖為凍干保護(hù)劑時(shí)所有比例粒徑和包封率均在合格范圍內(nèi),且在15%的質(zhì)量百分比的時(shí)候包封率最高,最終確定加入處方質(zhì)量比15%的蔗糖為凍干保護(hù)劑;釋放度考察中游離羽扇豆醇（Free Lupeol）在10h內(nèi)釋放了接近70%,而羽扇豆醇脂質(zhì)體（Lupeol-L）、羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體（Gal-Lupeol-L）在10 h內(nèi)只釋放了大約40%,動(dòng)力學(xué)擬合后發(fā)現(xiàn)Free Lupeol的釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程,Lupeol-L、Gal-Lupeol-L的釋放符合Weibull方程;稀釋穩(wěn)定性考察結(jié)果表明羽扇豆醇脂質(zhì)體在稀釋20倍的條件下比較穩(wěn)定,長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察結(jié)果表明羽扇豆醇凍干脂質(zhì)體在4℃冰箱存放6個(gè)月是穩(wěn)定的,溶血性考察結(jié)果表明Free Lupeol有輕微溶血,而Lupeol-L、Gal-Lupeol-L不溶血。3.體外靶向定性研究結(jié)果表明靶向組的攝取強(qiáng)度要高于游離藥物組和非靶向藥物組,定量研究結(jié)果表明Gal-Lupeol-L是游離Lupeol攝取量的1.65倍,是Lupeol-L攝取量的1.17倍（P<0.05）;體內(nèi)靶向性研究結(jié)果表明Gal-NR-L組在小鼠肝臟部位的熒光一直持續(xù)到24h,而游離NR和NR-L組的小鼠在肝臟部位的熒光5 h時(shí)基本消失。4.藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明羽扇豆醇靶向組的藥時(shí)曲線下面積約為游離藥物組的3倍;羽扇豆醇靶向組的平均滯留時(shí)間MRT和血漿半衰期T1/2分別約為游離藥物組的2.36倍和3.21倍。5.Free Lupeol、Lupeol-L、Gal-Lupeol-L作用于HepG2細(xì)胞24 h、48 h的IC50值分別為163μM、126μM、87μM,122μM、82μM、61μM;Free Lupeol、Lupeol-L、Gal-Lupeol-L的凋亡率分別為4.3%、8.73%、18.51%,Gal-Lupeol-L可以阻滯HepG2細(xì)胞于G2/M期;與Free Lupeol組相比,Gal-Lupeol-L組處理后的HepG2細(xì)胞AKT/mTOR相關(guān)蛋白（p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、FASN）、Ras/MAPK通路下游的主要效應(yīng)分子p-ERK1/2表達(dá)以及腫瘤增殖標(biāo)志物PCNA表達(dá)也都顯著降低。6.成功制備了高壓尾靜脈轉(zhuǎn)染AKT、c-Met質(zhì)粒共表達(dá)的肝細(xì)胞癌模型,Gal-Lupeol-L給藥組小鼠的肝臟指數(shù)和肝臟重量較游離組明顯減輕（P<0.05）;Gal-Lupeol-L組相較Free Lupeol組的小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)更為清晰,空泡減輕的更為明顯,胞漿更加豐富;與Free Lupeol和Lupeol-L組相比,Gal-Lupeol-L給藥后的小鼠肝臟AFP、GPC3、Epcam的mRNA表達(dá)水平降低的更為明顯（P<0.01）;與Free Lupeol處理組相比,Gal-Lupeol-L組處理后的AKT/c-MET誘導(dǎo)的HCC小鼠的AKT/mTOR相關(guān)蛋白（p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、FASN）、Ras/MAPK通路下游的主要效應(yīng)分子p-ERK1/2表達(dá)以及腫瘤增殖標(biāo)志物PCNA表達(dá)降低的更為明顯。結(jié)論:成功的制備了包封率高、粒徑小于200 nm的肝靶向羽扇豆醇脂質(zhì)體;相較于游離羽扇豆醇和非靶向羽扇豆醇脂質(zhì)體,它在體外和體內(nèi)都具有更好的靶向性;在藥動(dòng)學(xué)方面,羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體在體內(nèi)的平均滯留時(shí)間MRT和血漿半衰期T1/2都要優(yōu)于游離羽扇豆醇;羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體在體外對(duì)HepG2細(xì)胞顯示出比較好的細(xì)胞毒性、凋亡效率,對(duì)AKT/c-Met通路相關(guān)蛋白表達(dá)降低的效果更好;羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體對(duì)AKT/c-Met誘導(dǎo)的HCC小鼠具有一定的抗腫瘤作用并且相關(guān)通路抑制作用相較于游離羽扇豆醇和非靶向羽扇豆醇脂質(zhì)體更好。
余廷東[6]（2019）在《黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702的影響及TP53基因突變的原發(fā)性肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究》文中研究表明研究?jī)?nèi)容:本研究共分為四部分:1.黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702生物學(xué)行為的影響研究;2.黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702影響的全轉(zhuǎn)錄測(cè)序研究及差異表達(dá)分析;3.黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702影響的全轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析;4.黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702的影響與TP53突變的原發(fā)性肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析及驗(yàn)證目的:研究黃曲霉毒素B1（AFB1）在肝微粒體代謝后的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)肝細(xì)胞株HL-7702的影響材料和方法:AFB1+NADPH（2mM最終濃度）+肝微粒體（1.5mg/mL最終濃度）與PBS混合,放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育30分鐘,獲得AFB1在肝微粒體代謝后的次級(jí)代謝產(chǎn)物混合液。將上述混合液干預(yù)人肝細(xì)胞株HL-7702,培養(yǎng)箱中孵育30分鐘,PBS清洗三遍后加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用MTT法檢測(cè)24小時(shí)至96小時(shí)不同濃度AFB1對(duì)細(xì)胞株HL-7702的生長(zhǎng)活性的影響。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AFB1干預(yù)后24小時(shí)的HL-7702細(xì)胞株周期和凋亡情況。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)AFB1干預(yù)后24小時(shí)的HL-7702細(xì)胞株8羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）變化。Sanger法對(duì)AFB1干預(yù)后96小時(shí)的HL-7702細(xì)胞株進(jìn)行TP53 R249S突變檢測(cè)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和計(jì)算采用SPSS 22.0軟件包,作圖使用GraphPad Prism 6.0軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料的描述使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述。用t檢驗(yàn)對(duì)正態(tài)分布的計(jì)量資料分組之間進(jìn)行比較。P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異達(dá)到顯著性。結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示:HL-7702細(xì)胞在AFB1處理后24小時(shí)和48小時(shí),實(shí)驗(yàn)組（AFB1濃度為:0.001μM,0.005μM.0.025μM,0.125μM,0.625μM,1.25μM 和 2.5μM）、陽(yáng)性對(duì)照組及空白對(duì)照組之間細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著性差異,于AFB1處理后72小時(shí)至96小時(shí),各組細(xì)胞增殖活性出現(xiàn)顯著差異,不同濃度的AFB1處理的HL-7702細(xì)胞增殖活性均有不同程度降低,AFB1濃度越大,細(xì)胞增殖活性越低。細(xì)胞培養(yǎng)至96小時(shí),正常細(xì)胞組、對(duì)照組和AFB1濃度為0.00lμM組間細(xì)胞增殖活性差異統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性（P>0.05）,其余各組之間細(xì)胞增殖活性差異有顯著性（P<0.05）。2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)濃度為2μM和0.2μM AFB1干預(yù)的HL-7702細(xì)胞G1-G0期或G2-M期比例與濃度為0.02μM組比較均有顯著差異（P<0.05）。而濃度為0.02μM干預(yù)組與肝微粒體對(duì)照組和空白對(duì)照組比較,無(wú)顯著差異。3.濃度為2μM和0.2μM AFB1干預(yù)的HL-7702細(xì)胞8-OHdG含量較濃度為0.02μM干預(yù)組均顯著增加（P<0.001）,0.02μM干預(yù)組與肝微粒體對(duì)照組和空白對(duì)照組無(wú)顯著差異。4.濃度為2μM的AFB1在肝微粒體代謝后產(chǎn)物干預(yù)HL-7702細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)TP53 R249S第三位堿基G突變成T。結(jié)論:AFB1在肝微粒體代謝后的產(chǎn)物抑制人正常肝細(xì)胞株HL-7702生長(zhǎng)活性并導(dǎo)致G2/M細(xì)胞周期停滯,并呈濃度相關(guān)性;但AFB1在2μM及以下濃度短期干預(yù)未引起HL-7702細(xì)胞早期凋亡。AFB1在肝微粒體代謝后產(chǎn)物干預(yù)HL-7702細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)TP53 R249S第三位堿基G突變成T目的:用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)AFB1對(duì)肝細(xì)胞株HL-7702影響的全轉(zhuǎn)錄組變化情況,并進(jìn)行顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。材料和方法:實(shí)驗(yàn)組用AFB1（0.2μM）+NADPH（2mM最終濃度）+肝微粒體（1.5mg/mL最終濃度）,對(duì)照組用肝微粒體+NADPH,放入恒溫培養(yǎng)箱中孵育30分鐘,孵育后混合液干預(yù)HL-7702細(xì)胞30分鐘,PBS清洗三遍,然后加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。胰酶消化,收集細(xì)胞,標(biāo)注標(biāo)簽,液氮速凍,干冰運(yùn)輸至檢測(cè)公司進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和測(cè)序數(shù)據(jù)分析。結(jié)果:通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)AFB1影響肝細(xì)胞株HL-7702以下轉(zhuǎn)錄組顯著差異表達(dá):1.1027基因mRNA顯著差異表達(dá),其中上調(diào)432個(gè),下調(diào)595個(gè),GO富集分析顯示,AFB1引起mRNA顯著差異表達(dá)的基因主要參與了調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡、粘附、代謝、細(xì)胞化學(xué)刺激反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)和血管生成等生物學(xué)進(jìn)程。KEGG通路分析提示AFB1可能影響TNF信號(hào)通路、TGF-β、染色體重組、P53信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞周期、粘附和AMPK信號(hào)通路等。2.顯著差異表達(dá)lncRNA共29個(gè),其中上調(diào)15個(gè),下調(diào)14個(gè)。3.顯著差異表達(dá)的共miRNA9個(gè),其中上調(diào)3個(gè),下調(diào)6個(gè)4.顯著差異表達(dá)的circRNA共72個(gè),其中上調(diào)35個(gè),下調(diào)37個(gè)結(jié)論:AFB1顯著影響肝細(xì)胞株HL-7702的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA的表達(dá),對(duì)其顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行富集分析顯示:差異基因參與了細(xì)胞周期、增殖、凋亡、粘附和DNA損傷修復(fù)等生物學(xué)進(jìn)程。并可能參與調(diào)控TNF信號(hào)通路、TGF-β、染色體重組、P53信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞周期、粘附和AMPK等信號(hào)通路。目的:在轉(zhuǎn)錄組水平探索AFB1對(duì)肝細(xì)胞株HL-7702影響的各轉(zhuǎn)錄組變化之間的關(guān)聯(lián)性及其可能的相互調(diào)控機(jī)制。材料和方法:分析材料來(lái)源于論文第二部分全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。使用Novofinder（諾禾致源）、miRanda-3.3a、PITA、RNAhybrid、psRobot、GOSeq-topGO:Release 2.12、KOBAS:version 2.0、Cytoscape 等軟件對(duì)顯著差異表達(dá)的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,并構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果:1.AFB1影響細(xì)胞株HL-7702顯著差異表達(dá)的29個(gè)lncRNA和mRNA顯著差異表達(dá)的757個(gè)基因之間有共存或共表達(dá)的關(guān)系。其中l(wèi)ncRNAs上調(diào),伴隨mRNA上調(diào)的靶基因有234個(gè);lncRNAs下調(diào),伴隨mRNA下調(diào)的靶基因有439個(gè)。功能富集分析提示這些差異基因和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、分化、細(xì)胞代謝、DNA重組及損傷修復(fù)有關(guān),并和P53信號(hào)通路、癌癥相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)。2.AFB可能影響HL-7702細(xì)胞以下lncRNA與miRNA之間的調(diào)控:CDKN2B-AS1 與 hsa-miR-122-5p 和 hsa-miR-455-3p,CTD-3014M21.1 與hsa-miR-41 1-5p 和 hsa-miR-3591-3p,LINC00162 與 hsa-miR-3591-3p 和hsa-miR-494-3p,PP7080 與 hsa-miR-122-5p 和 hsa-miR-3690,PSMA3-AS1與 hsa-miR-455-3p 和 hsa-miR-41 1-5p,RP11-658F2.8 和 hsa-miR-31-5p,SBF2-AS1 與 hsa-miR-41 1-5p,SCARNA9 與 hsa-miR-379-5p。3.本研究發(fā)現(xiàn)9個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA（hsa-miR-455-3p、hsa-miR-41 1-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3690、hsa-miR-3591-3p）共調(diào)控534個(gè)mRNA顯著差異表達(dá)的靶基因?；蚋患治鎏崾具@些候選靶基因參與調(diào)控細(xì)胞分子功能、細(xì)胞代謝與發(fā)展進(jìn)程以及蛋白結(jié)合的調(diào)控,并參與調(diào)控細(xì)胞周期、PI3K-Akt信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路等。4.AFB1可能影響HL-7702細(xì)胞以下circRNA與基因之間的調(diào)控:hsacirc0078538-EZR、hsacirc0017348-ZNF124、novelcirc0005089-ZNF124、novelcirc0002289-CEP 128、novelcirc0000551-BIRC2)5.對(duì)全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析,共構(gòu)建出以6個(gè)miRNA（上調(diào):hsa-miR-455-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-31-5p;下調(diào):hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3690、hsa-miR-3591-3p）為核心的lncRNA-miRNA-gene 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)論:全轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析提示AFB1影響HL-7702細(xì)胞的lncRNA,miRNA,circRNA和mRNA之間存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系。用顯著差異表達(dá)的miRNA（hsa-miR-455-3p,hsa-miR-41 1-5p,hsa-miR-3 1-5p;hsa-miR-122-5p,hsa-miR-3690,hsa-miR-3591-3p）構(gòu)建出六個(gè) lncRNA-miRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目的:利用論文第二部分全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)TP53 R249S突變與不突變的HCC顯著差異的表達(dá)譜進(jìn)行聯(lián)合分析,挖掘AFB1與TP53 R249S突變HCC具有共同作用的分子標(biāo)志物。研究它們?cè)贖CC中TP53 R249S突變的作用,探索AFB1在其相關(guān)性HCC的發(fā)生及疾病進(jìn)展的機(jī)制。材料和方法:從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取HCC的表達(dá)譜（mRNA、lncRNA和miRNA）、臨床病理及預(yù)后資料,以TP53 R249S突變與否進(jìn)行分組,獲取顯著差異的表達(dá)譜信息,然后與論文第二部分差異表達(dá)的全轉(zhuǎn)錄測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析,取交集獲得候選差異表達(dá)譜信息。并在本中心已完成TP53 R249S突變測(cè)序的HCC樣本進(jìn)行驗(yàn)證,分析其與臨床病理及預(yù)后之間的關(guān)系。利用GO和KEGG進(jìn)行分子生物學(xué)功能及相關(guān)通路機(jī)制預(yù)測(cè)。TCGA原發(fā)性肝癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)表達(dá)差異分析采用EdgeR軟件包處理。候選表達(dá)譜差異基因癌和癌旁組織統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),其次,基因在TP53 R249S突變和非突變腫瘤和癌旁組織樣本的相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。比較突變組與非突變組、候選表達(dá)譜基因高表達(dá)和低表達(dá)組兩組間各項(xiàng)臨床因素的分布差異用卡方檢驗(yàn)。各臨床因素與臨床預(yù)后的分析采用Kaplan-Meier生存曲線、單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型。各組間曲線統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較采用Log Rank檢驗(yàn)。各個(gè)分組風(fēng)險(xiǎn)比（Hazard Ratio,HR）與 95%置信區(qū)間（Confidence Interval,CI）評(píng)估 TP53 R249S突變狀態(tài)以及基因表達(dá)量高低與臨床預(yù)后的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS 22.0,P<0.05被認(rèn)為差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。統(tǒng)計(jì)作圖采用GraphPad Prism 6.0軟件繪制。結(jié)果:1.AFB1干預(yù)后HL-7702細(xì)胞株的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC TP53 R249S突變的表達(dá)譜共同分析篩選出6個(gè)mRNA顯著差異表達(dá)的基因,包括上調(diào)基因:CTXN1、CDCP1、CALB2;下調(diào)基因:CRYAB、EN03、GPRC5A。未發(fā)現(xiàn)有共同顯著差異表達(dá)的lncRNA或miRNA。2.獨(dú)立樣本驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn) CDCP1、CALB2、CRYAB、EN03 和 GPRC5A 5個(gè)基因在癌組織中mRNA表達(dá)水平低于癌旁組織（P<0.05）,在TP53 R249S突變的癌組織中CALB2、CRYAB和GPRC5A的mRNA表達(dá)水平要高于TP53非突變的癌組織（P<0.05）。3.CDCP1和CTXN1可能與HBV DNA復(fù)制有顯著相關(guān)（兩者P=0.035）而CTXN1和GPRC5A可能與HCC的分化程度顯著相關(guān)（兩者P=0.047）。4.TP53 R249S突變與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC的TNM分期有關(guān)（P=0.039）,分期越晚,突變可能性越大。TP53 R249S非突變的患者總生存時(shí)間（t=1791 days）長(zhǎng)于存在突變患者（t=334 days）。對(duì)重要的復(fù)發(fā)生存時(shí)間而言,HCC患者攜帶非突變的TP53 R249S復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更低（HR=0.37,95%CI=0.19-0.73,P=0.003）5.生物信息學(xué)功能富集分析提示CALB2、CRYAB和GPRC5A可能與TP53基因存在調(diào)控關(guān)系。結(jié)論:全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC TP53 R249S突變的表達(dá)譜共同分析篩選出6個(gè)mRNA顯著差異表達(dá)的基因,包括CTXN1、CDCP1、CALB2、CRYAB、EN03、GPRC5A。其中CALB2、CRYAB 和GPRC5A可能參與TP53基因調(diào)控以及與TP53 R249S突變相關(guān)。TP53 R249S突變與HCC患者不良預(yù)后有關(guān)。
陳天馳[7]（2019）在《HJURP抑制p21表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖的分子機(jī)制研究》文中研究指明背景:肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）大約占肝癌的75%,是一種病死率很高的惡性腫瘤。雖然針對(duì)肝細(xì)胞癌的治療方法較多,但根治性的治療手段仍舊是手術(shù)切除和肝移植。目前,HCC患者術(shù)后的高復(fù)發(fā)率和死亡率是導(dǎo)致患者術(shù)后五年總生存率偏低（僅為18%）的重要原因。要提高HCC的治療效果,除了醫(yī)療診治技術(shù)手段的不斷提升,了解該疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并找出合適的干預(yù)治療靶點(diǎn)亦十分重要。同時(shí),肝癌的眾多生物學(xué)功能中,腫瘤細(xì)胞不受控制地增殖是肝細(xì)胞癌進(jìn)展的重要原因之一。綜上,研究HCC增殖過(guò)程中的關(guān)鍵分子機(jī)制有望為該疾病的治療提供新的理論基礎(chǔ)及治療策略。目的:本課題旨在研究HJURP分子促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖的分子機(jī)制,并在肝癌細(xì)胞系和臨床大樣本中驗(yàn)證該分子的表達(dá)水平并探究其臨床意義。首先,從體外構(gòu)建HJURP穩(wěn)定敲低及過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型,其次,在體外和體內(nèi)水平上驗(yàn)證該分子能夠調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的生物學(xué)功能,最終,深入闡明HJURP抑制p21表達(dá)的具體信號(hào)通路及分子機(jī)制。材料與方法:1、從浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科收集219對(duì)肝癌及匹配的癌旁組織標(biāo)本,從醫(yī)院病歷系統(tǒng)中統(tǒng)計(jì)相關(guān)的臨床病理信息,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)HJURP分子在HCC組織及癌旁組織的表達(dá)水平,分析HJURP與臨床病理特征及HCC患者預(yù)后的相關(guān)性;2、從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中提取HJURP分子在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)數(shù)據(jù),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;3、通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)肝癌細(xì)胞系HCC-LM3,Huh7進(jìn)行轉(zhuǎn)染,構(gòu)建穩(wěn)定敲低細(xì)胞株,用MHCC-97H細(xì)胞構(gòu)建HJURP過(guò)表達(dá)細(xì)胞株,運(yùn)用CCK-8、流式細(xì)胞周期檢測(cè)、克隆形成及裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證HJURP促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖的生物學(xué)功能,并用western免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期G1期相關(guān)的關(guān)鍵蛋白;4、在HJURP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型中,運(yùn)用western免疫印跡、免疫熒光驗(yàn)證HJURP調(diào)控抑癌分子p21的核漿穿梭,利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)p21的泛素化水平,并用免疫組織化學(xué)的方法在組織標(biāo)本中證實(shí)HJURP與p21的表達(dá)呈負(fù)相關(guān);5、在HJURP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞株中,運(yùn)用western免疫印跡實(shí)驗(yàn)通過(guò)信號(hào)通路的抑制劑及激活劑驗(yàn)證HJURP通過(guò)抑制MAPK/ERK1/2和激活A(yù)KT/GSK3β信號(hào)通路從而調(diào)控p21的出核及泛素化降解;6、通過(guò)功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)HJURP促進(jìn)p21泛素化降解的關(guān)鍵E3泛素化連接酶為SKP2。結(jié)果:1、在219對(duì)肝癌臨床標(biāo)本中,免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)定量熒光PCR的結(jié)果證實(shí)HJURP在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,且74.54%的腫瘤組織中HJURP呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)。同時(shí),western免疫印跡的結(jié)果提示,在6種常見的肝癌細(xì)胞系中,HJURP的表達(dá)也比正常肝細(xì)胞系高;2、體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,HJURP敲低明顯降低肝癌細(xì)胞的CCK-8吸光度和克隆形成、裸鼠皮下成瘤的能力,且引起肝癌細(xì)胞的G1期阻滯。在過(guò)表達(dá)HJURP后,肝癌細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng);3、HJURP促進(jìn)p21蛋白從細(xì)胞核穿梭至細(xì)胞漿。同時(shí),HJURP抑制p21發(fā)生在翻譯后水平上。蛋白質(zhì)免疫共沉淀的結(jié)果證實(shí),HJURP促進(jìn)p21的泛素化降解,主要是被E3泛素化連接酶SKP2降解;4、HJURP敲低之后,p21主要表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi),且p-ERK1/2與p-GSK3β的表達(dá)增加,p-AKT的表達(dá)降低,HJURP過(guò)表達(dá)之后,p-ERK1/2與p-GSK3β的表達(dá)降低。此外,敲低HJURP之后加入ERK1/2通路抑制劑U0126和AKT通路激動(dòng)劑SC-79后,p-ERK1/2與p-GSK3β的表達(dá)得到回復(fù),且肝癌細(xì)胞的增殖能力也能夠得到一定程度的回復(fù);5、肝癌臨床標(biāo)本中的免疫組織化學(xué)的結(jié)果表明,HJURP高表達(dá)的標(biāo)本中有69.5%呈現(xiàn)p21低表達(dá),同時(shí)HJURP低表達(dá)的標(biāo)本中有66.7%的標(biāo)本呈現(xiàn)p21高表達(dá);6、通過(guò)對(duì)臨床標(biāo)本對(duì)應(yīng)的臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果提示HJURP高表達(dá)患者的總體生存率明顯低于HJURP低表達(dá)者,且HJURP的高表達(dá)與腫瘤的大小及腫瘤的AJCC分期有相關(guān)性。結(jié)論:1、HJURP在肝癌組織中呈明顯高表達(dá),且與肝細(xì)胞癌的增殖功能及HCC患者的不良預(yù)后相關(guān);2、敲低及過(guò)表達(dá)HJURP可以分別顯著降低和增加肝細(xì)胞癌的增殖功能,且HJURP促進(jìn)p21從細(xì)胞核穿梭至胞漿,并被SKP2泛素化降解;3、MAPK/ERK1/2和AKT/GSK3β信號(hào)通路參與HJURP抑制p21表達(dá)的生物學(xué)過(guò)程,是HJURP促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖的潛在分子機(jī)制。
李自雄[8]（2018）在《乙肝病毒large S基因及其變異促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理研究背景:基于全球的腫瘤登記數(shù)據(jù),肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的發(fā)病率在男性和女性腫瘤中分別位列第五位和第九位,而每年因HCC而死亡的患者,在男性和女性腫瘤中排列為第二位和第六位。中國(guó)每年新發(fā)HCC和因其死亡人數(shù)均約占到世界范圍內(nèi)的50%左右。我國(guó)HCC患者絕大部分是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性感染導(dǎo)致的;而且HBV慢性感染人群基數(shù)龐大,這是引起HCC高發(fā)的最主要原因之一。HBV large S基因（preS1/preS2/S）編碼了病毒顆粒的表面蛋白,是病毒感染肝細(xì)胞、機(jī)體抗原識(shí)別表位和引起HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵影響因素。前期大量的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,該基因片段preS區(qū)的相關(guān)變異是促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素。但是何種preS變異序列,以及這些變異是通過(guò)何種機(jī)制導(dǎo)致了HCC的發(fā)生,目前尚無(wú)相關(guān)研究能夠完全闡明。研究目的:證實(shí)影響HBV慢性感染患者發(fā)生HCC的危險(xiǎn)因素,闡明何種HBV preS區(qū)的基因變異能促進(jìn)HCC的發(fā)生;在體外實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)這些變異序列所引起的癌癥相關(guān)表型的改變和調(diào)控的下游基因與其作用機(jī)制;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,驗(yàn)證large S序列及變異的致炎、致癌效果。為后續(xù)如何預(yù)防慢性HBV感染患者發(fā)生HCC和進(jìn)行相應(yīng)的治療,提供理論依據(jù)。研究方法:應(yīng)用納入2114位HBV慢性感染者隊(duì)列,設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增患者外周血中HBV基因組preS區(qū)片段,采用sanger測(cè)序的方法,序列比對(duì)后鑒定相關(guān)preS變異。納入患者人口學(xué)資料、臨床一般信息和治療信息等,采用COX單因素和多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析方法,促進(jìn)HCC發(fā)生和患者肝病相關(guān)死亡的風(fēng)險(xiǎn)因素。應(yīng)用HBV large S基因野生型和篩選出的三種變異型序列,構(gòu)建相關(guān)慢病毒載體,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系;通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、裸鼠皮下荷瘤等表型,觀察相關(guān)基因序列對(duì)細(xì)胞惡性表型的影響。測(cè)定不同細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)譜芯片,比較分析large S基因及其變異調(diào)控的下游基因。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR）、免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot,WB）等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究其可能的調(diào)控機(jī)制。將相關(guān)基因序列構(gòu)建Sleeping Beauty相關(guān)載體,用尾靜脈注射的方式表達(dá)于小鼠肝臟。闡明變異型large S基因所致小鼠肝臟炎癥狀態(tài)和肝細(xì)胞癌的發(fā)生情況。通過(guò)小鼠肝臟RNA表達(dá)譜芯片的測(cè)定,比較分析large S基因及相關(guān)變異在動(dòng)物體內(nèi)的調(diào)控的基因及參與的信號(hào)通路。后續(xù)相關(guān)分子的免疫組化等實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證靶分子的表達(dá)水平,進(jìn)一步驗(yàn)證large S基因及其變異調(diào)控的作用機(jī)制。研究結(jié)果:該研究第一部分,人群隊(duì)列的研究結(jié)果顯示,2114例HBV慢性感染患者隊(duì)列,隨訪的中位時(shí)間為8.92年,總共隨訪18406人年。在隨訪期間內(nèi),共有209例患者發(fā)生HCC,發(fā)生率為9.89%（209/2114）。經(jīng)COX回歸分析后,我們得出男性患者、高年齡患者、肝硬化、HBV C2基因亞型、未使用抗病毒治療、高直接膽紅素（>7mmol/L）、甲胎蛋白陽(yáng)性、低白蛋白水平（<35g/L）、低血小板計(jì)數(shù)（<100×109 g/L）是促進(jìn)HCC發(fā)生的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。此外,HBV基因組preS區(qū)中C3116T和T31C突變促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展。在HBV慢性感染者體內(nèi),C2為主要基因亞型（73.1%）,由C2基因亞型所引起的HCC發(fā)生,占83.3%（125/150）。HBV C2基因亞型相關(guān)preS變異,如G2950A、G2951A、A2962G、C2964A、A3054T、C3063G、T3069G和A3120T,均促進(jìn)了HCC的發(fā)生。preS區(qū)相關(guān)變異的組合,如G2950A/G2951A/A2962G/C2964A（mutation 1）,促進(jìn)了HCC的發(fā)生（HR 2.51,95%CI,1.10-5.74;P=0.030）;聯(lián)合突變C3116T/T31C（mutation 2）變異也增加了HBV慢性感染患者HCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（HR1.57,95%CI,1.07-2.31;P=0.022）。此外,preS2 deletion（>5bp）在使用抗病毒治療的人群中,促進(jìn)了HCC發(fā)生（HR 2.81,95%CI,1.27-6.22;P=0.011）。課題第二部分,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HBV large S基因deletion序列較wild type序列顯著提高了細(xì)胞增殖能力、軟瓊脂克隆能力和裸鼠皮下荷瘤能力（P<0.05）。但三種變異型large S序列（mutation 1、mutation 2和deletion）對(duì)細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等細(xì)胞轉(zhuǎn)移運(yùn)動(dòng)能力沒有提升,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在轉(zhuǎn)染目的基因后,mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,野生型large S基因主要影響了細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)進(jìn)程。Mutation 1、mutation 2和deletion序列與wild type基因比較后發(fā)現(xiàn),三種變異均降低了細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)免疫相關(guān)基因的表達(dá),并上調(diào)了癌癥相關(guān)的信號(hào)通路。基因定量的結(jié)果也證實(shí)了促進(jìn)凋亡的相關(guān)基因OLR和PMAIP1在變異組中低于wild type組,且抑制凋亡基因BIRC3和BIRC2則在變異組中高于wild type組。癌癥相關(guān)基因的表達(dá)水平,如STAT3信號(hào)通路在deletion組中,其表達(dá)水平較wild type組高（P=0.027）。Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,STAT3分子的表達(dá)水平在三種變異組中高于野生型large S組,但磷酸化后的p-STAT3蛋白表達(dá)量在各組間未見明顯差異。在STAT3分子抑制劑stattic作用下,各組間的細(xì)胞增殖趨于一致。而在STAT3信號(hào)通路激動(dòng)劑IL-6作用下,各組間的細(xì)胞增殖能力有顯著的提高,并增大了組間差異。相關(guān)交互作用分析顯示,三種變異型large S基因與炎癥因子,協(xié)同通過(guò)IL-6/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)了HepG2細(xì)胞的增殖。通過(guò)構(gòu)建好的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)3種變異型large S基因?qū)е滦∈蟮纳嫫谑艿讲煌潭鹊慕档?。三種變異型基因（mutation 1、mutation 2和deletion）引起小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生率,較wild type有不同程度的提高,分別為36.4%（4/11）、57.1%（4/7）、66.7%（4/6）,(Ptrend=0.023)。肝臟實(shí)物圖和H&E染色鏡下可見表達(dá)HBV large S基因的小鼠肝臟炎癥狀態(tài)明顯,肝細(xì)胞呈現(xiàn)出水腫、變性;在嚴(yán)重?cái)D壓狀態(tài)下,肝臟特征性結(jié)構(gòu)不明顯。肝癌相關(guān)特異性分子CK18、細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67和PCNA的免疫組化評(píng)分,在mutation 1、mutation 2和deletion組中均較vector組或wild type組顯著提高（P<0.05）。小鼠肝臟的mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示:野生型large S基因的表達(dá),調(diào)節(jié)了細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)激,以及癌癥相關(guān)相關(guān)信號(hào)的激活。Mutation 1、mutation 2和preS2 deletion序列的表達(dá)后與野生型large S基因比較,這些相關(guān)均進(jìn)一步的上調(diào)了小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)炎癥與癌癥相關(guān)基因集,以及癌癥相關(guān)信號(hào)通路的激活。小鼠外周血中相關(guān)分子ELISA結(jié)果顯示,炎-癌轉(zhuǎn)化相關(guān)細(xì)胞因子IL-5、IL-6和IL-12均表現(xiàn)為,wild type組中的表達(dá)較vector組高,而三種變異型組較wild type組高。此外,表達(dá)三種變異型large S基因的小鼠肝臟中,STAT3和p-STAT3分子的表達(dá)評(píng)分均較vector組與wild type組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。上述結(jié)果表明,三種large S基因變異,尤其是preS2 deletion可與小鼠體內(nèi)的炎癥狀態(tài),共同通過(guò)激活I(lǐng)L-6/STAT3相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展。研究結(jié)論:本課題通過(guò)隊(duì)列研究證實(shí)了眾多臨床指標(biāo)和HBV基因preS區(qū)相關(guān)突變是慢乙肝患者發(fā)生HCC的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)preS區(qū)的組合突變（G2950A/G2951A/A2962G/C2964A,C3116T/T31C和preS2 deletion）,具有促進(jìn)慢性HBV感染者發(fā)生HCC的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中,證實(shí)三種變異型large S基因,尤其是preS2 deletion序列可通過(guò)上調(diào)STAT3分子的表達(dá),激活癌癥相關(guān)信號(hào)通路,促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展。小鼠模型中,也證實(shí)了三種變異型large S基因的表達(dá)具有促進(jìn)小鼠肝臟炎癥、癌癥的作用。本課題充分解釋了HBV large S基因preS區(qū)相關(guān)突變促癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制,為防控HCC的發(fā)生,提供了新的思路。
龐小娟[9]（2014）在《肝細(xì)胞癌發(fā)展中PPARγ磷酸化修飾的機(jī)制及調(diào)控作用》文中認(rèn)為原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一,其病程短、發(fā)展快、死亡率高,列為世界腫瘤死亡率的第三位。據(jù)國(guó)際癌癥研究中心（IARC）統(tǒng)計(jì):我國(guó)每年死于肝癌約34萬(wàn)人,占全世界肝癌死亡人數(shù)的55%以上。加之肝癌患者的5年生存率極低,從而使之成為威脅我國(guó)人口健康最重大的疾病之一。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌,發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,成因不明,已知誘因包括肝炎病毒感染、肝硬化、肝臟長(zhǎng)期慢性炎癥、黃曲霉毒素?cái)z入等。HCC的發(fā)展是一個(gè)多階段且復(fù)雜的過(guò)程,染色體異常、遺傳多態(tài)性、基因突變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控異常等皆為決定HCC發(fā)展的重要因素。值得注意的是:轉(zhuǎn)錄因子功能模式與肝細(xì)胞癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系已被眾多研究所證實(shí),過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）即為其中一個(gè)重要的與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。PPARy是細(xì)胞內(nèi)重要的核受體,也是代謝相關(guān)疾病的重要藥物靶點(diǎn)。前期研究報(bào)道指出:PPARγ配體對(duì)多種腫瘤如HCC、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等具有抑制作用,特別是在HCC治療方面,PPARγ活性調(diào)控被譽(yù)為是一種潛在的有前途的治療手段。盡管PPARy活性調(diào)控已被證實(shí)在許多HCC實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭芯哂杏绊慔CC發(fā)展的效應(yīng),但其中的分子機(jī)制還處于探討時(shí)期。特別是在PPARy翻譯后修飾（post-translational modifications,PTM）功能解析方面,尚未有任何研究建立PPARy翻譯后修飾與HCC發(fā)生發(fā)展之間的確切關(guān)系。本研究基于臨床中出現(xiàn)的現(xiàn)象——HCC病人肝癌組織切片中出現(xiàn)PPARγSer84位的磷酸化高表達(dá),這種現(xiàn)象雖然未經(jīng)大量臨床標(biāo)本分析所證實(shí),但卻提示我們:PPARγSer84可能與HCC的發(fā)展具有內(nèi)在聯(lián)系,因此,本論文從研究PPARγ磷酸化在HCC病程發(fā)展中的確切作用出發(fā),首次探討了兩者之間的聯(lián)系及可能的分子機(jī)制。本論文研究工作包括以下四方面:一、PPARγ磷酸化與HCC發(fā)展的關(guān)系1.HCC自發(fā)模型構(gòu)建及PPARy磷酸化分析:使用化學(xué)誘變劑二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine,DEN）誘導(dǎo)小鼠HCC自發(fā)模型,測(cè)量并觀察在12個(gè)月實(shí)驗(yàn)期間,小鼠的體重,生長(zhǎng)以及死亡情況;通過(guò)病理切片分析與HCC相關(guān)標(biāo)志物（Ki67、PCNA和AFP）分析,證實(shí)小鼠HCC模型誘導(dǎo)成功;免疫組化、western blot結(jié)果分析顯示,與正常肝組織相比,HCC小鼠肝臟中磷酸化PPARy（Ser82）的表達(dá)水平顯著升高:EMSA結(jié)果表明,小鼠肝癌組織中PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降;值得注意的是:隨著HCC發(fā)展進(jìn)程的變化,PPARy磷酸化的表達(dá)水平逐漸升高,提示PPARy磷酸化與小鼠HCC的惡性進(jìn)展具有內(nèi)在聯(lián)系。2.裸鼠模型構(gòu)建與體內(nèi)實(shí)驗(yàn):首先運(yùn)用ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems包裝過(guò)表達(dá)野生型（wild type,WT）、非磷酸化（S84A）和磷酸化（S84D）PPARy的慢病毒顆粒并感染HepG2細(xì)胞,Blasticidin藥物進(jìn)行細(xì)胞抗性篩選,得到PPARγW1、PPARγ384A和PPARyS84D穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞株;接著將三種穩(wěn)轉(zhuǎn)的HepG2細(xì)胞接種于裸鼠皮下,構(gòu)建HCC異位模型。測(cè)量實(shí)驗(yàn)期間,小鼠的體重、腫瘤體積、生長(zhǎng)以及死亡情況。結(jié)果顯示:PPARγS84D中腫瘤的生長(zhǎng)速度最快、瘤體最重,這組腫瘤中PCNA的表達(dá)水平最高;與PPARβWT相比,PPARγS84A腫瘤生長(zhǎng)速度慢、瘤體重量輕、PCNA表達(dá)水平低,但瘤體重量的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明PPARy磷酸化介導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng),引起腫瘤生長(zhǎng)加快,并促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。3.人病理標(biāo)本中PPARy磷酸化分析:收集臨床17例肝癌病人HCC樣本,進(jìn)行病理切片及腫瘤標(biāo)志物檢測(cè);運(yùn)用免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,12例病人中出現(xiàn)了 HCC區(qū)域PPARy磷酸化表達(dá)水平高于癌旁肝組織,70%的比例提示PPARγ磷酸化對(duì)人HCC的發(fā)展可能有促進(jìn)作用。因?yàn)槲茨苁占銐蛘辉囼?yàn)的病理標(biāo)本數(shù),所以此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅起參考作用。二、MEK/ERK激酶介導(dǎo)的PPARy磷酸化及其對(duì)HCC發(fā)展的影響1.MEK/ERK激酶活性分析:在DEN誘導(dǎo)的HCC動(dòng)物模型中,運(yùn)用免疫組化、western blot對(duì)MEK/ERK激酶水平進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與PPARγ磷酸化程度相平行,PPARy磷酸化上游激酶ERK1/2的表達(dá)水平增加,同時(shí)對(duì)ERK1/2的上游激酶MEK的分析顯示磷酸化MEK表達(dá)水平上升,ERK1/2與MEK磷酸化水平皆顯著高于正常C57小鼠的肝組織;運(yùn)用免疫組化分析肝癌病人HCC樣本,亦發(fā)現(xiàn)在癌組織中,磷酸化ERK1/2和磷酸化MEK的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。這些結(jié)果提示:在HCC發(fā)展中,PPARγ磷酸化程度增加可能是由于MEK/ERK激活所致。2.抑制MEK/ERK激酶活性可降低PPARy磷酸化水平:為進(jìn)一步證實(shí)MEK/ERK激活導(dǎo)致PPARy磷酸化,我們運(yùn)用SMMC 7721、Hep3B、HepG2和Hepa1-6建立了體外分析的細(xì)胞模型,運(yùn)用MEK激酶抑制劑PD0325901處理肝癌細(xì)胞,以觀察是否可通過(guò)抑制激酶的活性,而改變PPARy磷酸化的表達(dá)水平。Western blot分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)MEK/ERK被抑制后,PPARγ磷酸化水平降低,熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果亦顯示:PPARγ磷酸化水平被抑制同時(shí),PPARγ轉(zhuǎn)錄活性提高,說(shuō)明通過(guò)抑制MEK/ERK,可以降低PPARγ磷酸化進(jìn)而提高PPARy的轉(zhuǎn)錄活性。與此同時(shí),運(yùn)用MTT和流式分析肝癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期狀態(tài),發(fā)現(xiàn)PPARy磷酸化水平降低后,肝癌細(xì)胞增殖速度被抑制,細(xì)胞周期阻滯在G1期,值得注意的是,動(dòng)態(tài)分析結(jié)果顯示在0,24,48hr時(shí)間段內(nèi),HCC細(xì)胞增殖力與PPARγ磷酸化程度呈正相關(guān)。3.MEK/ERK對(duì)PPARγ磷酸化作用的體內(nèi)分析:在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上,我們進(jìn)一步運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行MEK/ERK對(duì)PPARy磷酸化效應(yīng)分析,實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建HepG2裸鼠種植瘤模型,等腫瘤體積達(dá)到100 mm3時(shí),將小鼠隨機(jī)分為DMSO、羅格列酮（rosiglitazone,RSG）、PD0325901、RSG+PD0325901 四組,腹腔注射給藥28天,分析抑制MEK/ERK是否可抑制PPARy磷酸化,觀察RSG是否協(xié)同PD0325901,增效其抑制HCC惡性進(jìn)展的功能。結(jié)果顯示:抑制MEK/ERK后,PPARγ磷酸化程度顯示降低,腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩,腫瘤體積減小,RSG對(duì)PPARγ磷酸化表達(dá)水平的抑制程度較小、對(duì)腫瘤生長(zhǎng)速度和腫瘤體積沒有影響,RSG和PD0325901聯(lián)合用藥與單獨(dú)使用PD0325901的效果接近。三、PPARγ磷酸化對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響1.PPARy磷酸化增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖:對(duì)表達(dá)PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞株進(jìn)行NimbleGen全基因組表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)分析,GO分析報(bào)告顯示,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖能力的基因差異表達(dá)顯著富集,進(jìn)一步運(yùn)用Q-PCR驗(yàn)證芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):與PPARγWT、PPARγS84A相比,PPARγS84D細(xì)胞中促增殖基因表達(dá)顯著升高;進(jìn)一步運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)以及CFSE流式檢測(cè)結(jié)果亦證實(shí):PPARγS84D細(xì)胞增殖能力顯著高于PPARγWT與PPARγS84A細(xì)胞,說(shuō)明肝癌細(xì)胞中PPARγ磷酸化后改變了下游轉(zhuǎn)錄模式,使腫瘤細(xì)胞增殖力顯著增強(qiáng)。2.PPARy磷酸化抑制肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯:進(jìn)一步通過(guò)流式分析檢測(cè)HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的細(xì)胞周期變化,結(jié)果顯示:PPARγS84DHepG2細(xì)胞中,處于G1期的細(xì)胞數(shù)目減少,而S期細(xì)胞數(shù)目增加,說(shuō)明PPARy磷酸化抑制細(xì)胞周期阻滯;Q-PCR對(duì)周期調(diào)控分子的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明:PPARy磷酸化降低了控制G1期的蛋白依賴性激酶抑制子（p18、p21和p27）的表達(dá)水平,促進(jìn)cyclin A的表達(dá),說(shuō)明PPARy磷酸化后,可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控分子對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行干擾,使細(xì)胞周期阻滯減弱。3.PPARγ磷酸化對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡不產(chǎn)生影響:以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)充分證明:PPARy磷酸化可通過(guò)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖與抑制肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯,而促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。運(yùn)用Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示:在PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D穩(wěn)轉(zhuǎn)的HepG2細(xì)胞中,細(xì)胞凋亡沒有顯著差異。四、肝癌細(xì)胞糖酵解重要功能基因分析1.芯片分析:在驗(yàn)證了 MEK/ERK激酶介導(dǎo)的PPARy磷酸化對(duì)HCC發(fā)展產(chǎn)生確切影響的基礎(chǔ)之上,運(yùn)用生物信息學(xué)分析法對(duì)PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行全基因組表達(dá)譜進(jìn)行分析,根據(jù)評(píng)分及生物信息學(xué)方法對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)PPARy磷酸化顯著影響細(xì)胞糖酵解途徑中的重要的功能酶。與PPARγS84A相比,PDK-1、PGK1、PFK2等酶在PPARγS84D細(xì)胞中發(fā)生了上調(diào);進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行Q-PCR進(jìn)驗(yàn)證,結(jié)果與芯片分析數(shù)據(jù)相符,驗(yàn)證了芯片數(shù)據(jù)所指示糖酵解途徑差異表達(dá),說(shuō)明PPARγ磷酸化對(duì)肝癌細(xì)胞的糖酵解產(chǎn)生了影響。2.葡萄糖和乳酸檢測(cè):根據(jù)芯片數(shù)據(jù),我們運(yùn)用葡萄糖、乳酸分析法在HepG2及三種PPARγHepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)株中進(jìn)行了細(xì)胞分解葡萄糖能力的分析,結(jié)果顯示:與PPARγS84D細(xì)胞株相比,PPARγWT和 PPARγS84A都對(duì)葡萄糖攝入量顯著減少,用MEK抑制劑PD0325901處理HepG2后,細(xì)胞表現(xiàn)出極顯著的葡萄糖吸收和乳酸釋放量。說(shuō)明PPARy磷酸化可伴隨細(xì)胞糖酵解增強(qiáng),這也解釋了肝癌細(xì)胞快速生長(zhǎng)的原因。綜上所述,本論文研究工作首次建立了 PPARy磷酸化與HCC發(fā)展之間的聯(lián)系,即PPARγ磷酸化對(duì)HCC發(fā)展具有促進(jìn)作用?；谠撋飳W(xué)效應(yīng)的發(fā)現(xiàn),我們進(jìn)行了進(jìn)一步的細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究工作,發(fā)現(xiàn)MEK/ERK激酶為介導(dǎo)PPARy磷酸化的關(guān)鍵激酶,抑制MEK/ERK激酶可加強(qiáng)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞增殖,從而表現(xiàn)出對(duì)HCC發(fā)展的良好遏制作用,提示與PPARγ磷酸化修飾相關(guān)的分子節(jié)點(diǎn)在介導(dǎo)HCC發(fā)展中的重要性。研究還發(fā)現(xiàn)PPARγ磷酸化后,其下游轉(zhuǎn)錄模式發(fā)生了變化,導(dǎo)致差異表達(dá)基因富集于糖酵解途徑,糖酵解水平增高使肝癌細(xì)胞保持快速生長(zhǎng),促進(jìn)HCC向惡性化程度發(fā)展。
王伯慶[10]（2013）在《CBX4在肝細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及其對(duì)肝癌預(yù)后的影響和分子機(jī)制》文中研究指明目的：CBX4（Chromobox4）最初被證實(shí)具有E3連接酶活性,參與了染色質(zhì)重組與轉(zhuǎn)錄抑制,能維持上皮干細(xì)胞的干性,阻止其衰老。截至目前,CBX4與腫瘤的關(guān)系研究很少,本研究旨在檢測(cè)CBX4在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)情況,分析CBX4表達(dá)與原發(fā)性肝癌術(shù)后預(yù)后的關(guān)系,初步探討CBX4在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的作用。同時(shí)考察敲低CBX4基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的哪些惡性表型產(chǎn)生影響,初步闡釋相關(guān)的分子機(jī)制。方法：1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）和Western Blot分別檢測(cè)原發(fā)性肝癌術(shù)后標(biāo)本的癌組織和癌旁正常肝組織中CBX4的mRNA豐度和蛋白表達(dá)水平；2)免疫組織化學(xué)檢測(cè)有完整臨床預(yù)后資料的246例石蠟包埋原發(fā)性肝癌和癌旁組織標(biāo)本中CBX4的蛋白表達(dá)；3)用Pearson Chi-Square Kruskal-Wallis tests法分析CBX4表達(dá)與原發(fā)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系,Kaplan-Meier method/log-rank test分析與預(yù)后有關(guān)的因素,多因素Cox回歸模型篩選分析和預(yù)后有關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；4)分別在原發(fā)性肝癌的細(xì)胞株,BEL7402和QGY7703細(xì)胞中,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小RNA干擾片段,敲低內(nèi)源性CBX4。通過(guò)MTT細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞克隆形成能力；5)敲低肝癌細(xì)胞內(nèi)源性CBX4后,用胸腺嘧啶核苷雙阻斷方法使BEL7402和QGY7703細(xì)胞同步化于G1/S交界處,然后釋放進(jìn)入S期,流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)入S期的比例；6)敲低內(nèi)源性CBX4后,Western blot檢測(cè)下游與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的靶基因變化。結(jié)果：1)CBX4在原發(fā)性肝癌組織較癌旁正常肝組織表達(dá)上調(diào)。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的8對(duì)配對(duì)新鮮標(biāo)本中,癌組織CBX4的mRNA豐度比癌旁肝組織升高；Western blot檢測(cè)相同的8對(duì)配對(duì)標(biāo)本中,癌組織中CBX4蛋白表達(dá)也比癌旁肝組織升高；2)246例原發(fā)性肝癌手術(shù)切除標(biāo)本,用IHC染色評(píng)分后分析,發(fā)現(xiàn)CBX4在原發(fā)性肝癌患者中存在表達(dá)失調(diào)。與癌旁組織相比,肝癌組織中CBX4蛋白表達(dá)明顯上調(diào),且主要定位在肝癌細(xì)胞的胞漿：3)CBX4表達(dá)在原發(fā)性肝癌中的臨床意義。免疫組化結(jié)果顯示,CBX4表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者的臨床病理特征密切相關(guān),主要包括：血清AFP水平（P=0.036）,腫瘤大小（P=0.029）,病理分化（P=0.033）,臨床TNM分期（P=0.032）。原發(fā)性肝癌患者胞漿CBX4高表達(dá)者預(yù)后差,總生存期（overall survival, OS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（recurrence free survival, RFS）比CBX4低表達(dá)的患者縮短（OS, P=0.003; RFS,P=0.012）。多因素Cox回歸分析顯示,CBX4漿表達(dá)和肝腫瘤數(shù)目是原發(fā)性肝癌患者總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。4)分別在肝癌細(xì)胞株BEL7402和QGY7703敲低內(nèi)源性CBX4能夠降低原發(fā)性肝癌細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞克隆形成能力；敲低內(nèi)源性CBX4后,細(xì)胞的增殖活性降低,克隆形成數(shù)減少,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；5)敲低內(nèi)源性CBX4后,原發(fā)性肝癌細(xì)胞由G1/S交界處進(jìn)入S期的細(xì)胞比例較對(duì)照組減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,即細(xì)胞由G1/S轉(zhuǎn)換點(diǎn)進(jìn)入S期的速度減慢：6)CBX4基因可以通過(guò)抑制PCNA和cyclinE2,上調(diào)p16影響原發(fā)性肝癌細(xì)胞增殖和G1/S關(guān)鍵點(diǎn)的轉(zhuǎn)換。結(jié)論：1)CBX4在原發(fā)性肝癌中較癌旁肝組織表達(dá)上調(diào)；2)CBX4主要定位在肝癌組織的細(xì)胞胞漿；3)CBX4胞漿表達(dá)水平與原發(fā)性肝癌患者預(yù)后呈反向相關(guān),CBX4可以作為原發(fā)性肝癌術(shù)后預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)；4)CBX4與原發(fā)性肝癌細(xì)胞惡性增殖和克隆形成能力密切相關(guān)；5)CBX4基因可以通過(guò)PCNA而維持原發(fā)性肝癌細(xì)胞的快速增殖活性；6)CBX4可以通過(guò)調(diào)控cyclinE2和p16影響肝癌細(xì)胞的周期進(jìn)展。
二、肝細(xì)胞癌SCT表現(xiàn)特征與Rb,PCNA的關(guān)系（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問(wèn)題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問(wèn)題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過(guò)程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁(yè)面大小,采用多級(jí)分層頁(yè)表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁(yè)表轉(zhuǎn)換過(guò)程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過(guò)主支變革、控制研究對(duì)象來(lái)發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過(guò)調(diào)查文獻(xiàn)來(lái)獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過(guò)具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來(lái)分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過(guò)創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來(lái)間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、肝細(xì)胞癌SCT表現(xiàn)特征與Rb,PCNA的關(guān)系（論文提綱范文）
（1）ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制（論文提綱范文）
| 附錄 中英文縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中的表達(dá) |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、結(jié)論 |
| 第二部分 ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、結(jié)論 |
| 第三部分 ZIP12參與野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制探索 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、結(jié)論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC39A/ZIPs和SLC30A/ZnTs的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
（2）長(zhǎng)鏈非編碼RNA CYTOR通過(guò)調(diào)節(jié)miR-125b-5p/KIAA1522軸影響肝細(xì)胞癌增殖、凋亡和細(xì)胞周期的機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 英文縮略詞表 |
| 第一部分: 應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選新的肝細(xì)胞癌相關(guān)的lncRNA/miRNA/mRNA調(diào)控軸 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料與方法 |
| 第三章 結(jié)果 |
| 第四章 討論 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分: lncRNA CYTOR/miR-125b-5p/KIAA1522調(diào)控軸在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系中的作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料與方法 |
| 第三章 結(jié)果 |
| 第四章 討論 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 非編碼RNA在肝細(xì)胞癌發(fā)生與發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用及臨床應(yīng)用(文獻(xiàn)綜述) |
| 第一章 引言 |
| 第二章 作為ceRNA的ncRNA及其它ncRNA在肝細(xì)胞癌發(fā)展中的可能作用及機(jī)制 |
| 第三章 ncRNA在HCC診斷及預(yù)后中的臨床應(yīng)用 |
| 第四章 結(jié)論、局限性和展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 博士期間發(fā)表論文情況 |
| 致謝 |
（3）組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶RIZ1介導(dǎo)的lncRNA HOTAIRM1失活對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略語(yǔ) |
| 第一部分:RIZ1與lncRNA HOTAIRM1 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 主要試劑和儀器 |
| 2.1.1 主要試劑和耗材 |
| 2.1.2 主要儀器 |
| 2.2 研究對(duì)象 |
| 2.2.1 TCGA和 GEPIA數(shù)據(jù) |
| 2.2.2 組織樣本與資料 |
| 2.2.3 血液樣本與資料 |
| 2.2.4 細(xì)胞 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù) |
| 2.3.2 組織總RNA提取 |
| 2.3.3 細(xì)胞總RNA的提取 |
| 2.3.4 血液RNA的提取 |
| 2.3.5 瓊脂糖凝膠電泳 |
| 2.3.6 肝細(xì)胞癌組織樣本HE染色 |
| 2.3.7 肝細(xì)胞癌組織樣本免疫組織化學(xué)染色 |
| 2.3.8 RIZ1 一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR |
| 2.3.9 lncRNA HOTAIRM1 熒光定量PCR |
| 2.3.10 Western Blot方法測(cè)定蛋白水平 |
| 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)研究RIZ1與lncRNA HOTAIRM1 在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平及其臨床意義。 |
| 3.1.1 肝細(xì)胞癌患者癌組織和正常組織中RIZ1 的表達(dá)情況 |
| 3.1.2 RIZ1 表達(dá)水平與組織臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 |
| 3.1.3 RIZ1 表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系 |
| 3.1.4 肝細(xì)胞癌患者癌組織和正常組織中HOTAIRM1 的表達(dá)情況 |
| 3.1.5 HOTAIRM1 表達(dá)水平與病理分期的關(guān)系 |
| 3.1.6 HOTAIRM1 表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系 |
| 3.2 RIZ1 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3 HOTAIRM1 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.4 RIZ1 在肝細(xì)胞癌患者組織樣本中的蛋白表達(dá) |
| 3.4.1 Western Blot方法測(cè)定RIZ1 在肝細(xì)胞癌患者組織樣本中的蛋白表達(dá) |
| 3.4.2 免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)定RIZ1 在肝細(xì)胞癌患者組織樣本中的蛋白表達(dá) |
| 3.5 組織和細(xì)胞樣本RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 |
| 3.6 科室組織樣本中RIZ1和HOTAIRM1 在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達(dá)情況 |
| 3.7 科室血液樣本中RIZ1和HOTAIRM1 的表達(dá)情況 |
| 3.8 L02、HEPG2 和 HCC-LM3 細(xì)胞中RIZ1 和 HOTAIRM1 的表達(dá)情況 |
| 3.9 科室組織樣本中RIZ1和HOTAIRM1 的表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分:組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶RIZ1 介導(dǎo)的HOTAIRM1 啟動(dòng)子上的H3K9me1 富集對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 主要試劑和儀器 |
| 2.1.1 主要試劑 |
| 2.1.2 主要儀器 |
| 2.2 研究對(duì)象 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3.1 LO2 人永生化肝細(xì)胞、HEPG2 人肝癌細(xì)胞和HCC-LM3 人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存。 |
| 2.3.2 染色質(zhì)免疫沉淀(Ch IP)實(shí)驗(yàn) |
| 2.3.3 慢病毒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 |
| 2.3.4 細(xì)胞總RNA的提取 |
| 2.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) |
| 2.3.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) |
| 2.3.7 CCK8 實(shí)驗(yàn) |
| 2.3.8 細(xì)胞周期檢測(cè) |
| 2.3.9 細(xì)胞凋亡檢測(cè) |
| 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 LO2 人永生化肝細(xì)胞、HEPG2 人肝癌細(xì)胞和HCC-LM3 人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài) |
| 3.2 構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒的的測(cè)序結(jié)果 |
| 3.2.1 構(gòu)建RIZ1-RNAi慢病毒質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果 |
| 3.2.2 構(gòu)建HOTAIRM1-RNAi慢病毒質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果 |
| 3.2.3 構(gòu)建LV-HOTAIRM1 慢病毒引物的測(cè)序結(jié)果 |
| 3.3 ChIP分析H3K9me1與HOTAIRM1 啟動(dòng)子的結(jié)合 |
| 3.4 慢病毒對(duì)HEPG2和HCC-LM3 細(xì)胞的感染MOI和最佳感染條件 |
| 3.4.1 LV-RIZ1-RNAi慢病毒感染的MOI和最佳感染條件 |
| 3.4.2 LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi干擾慢病毒共感染HEPG2,感染的MOI和最佳感染條件 |
| 3.4.3 LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1 慢病毒共感染HCC-LM3,感染的MOI和最佳感染條件 |
| 3.5 LV-RIZ1-RNAi慢轉(zhuǎn)染后肝細(xì)胞癌細(xì)胞中H3K9me1 的表達(dá)情況 |
| 3.6 RIZ1 對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖活性的影響 |
| 3.7 RIZ1 對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響 |
| 3.8 RIZ1 對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移的影響 |
| 3.9 RIZ1 對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞周期的影響 |
| 3.10 RIZ1 對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響 |
| 3.11 RIZ1 的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1 抑制的共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響 |
| 3.12 RIZ1 的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1 抑制的共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響 |
| 3.13 RIZ1 的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1 抑制的共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移的影響 |
| 3.14 RIZ1 的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1 過(guò)表達(dá)的共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響 |
| 3.15 RIZ1 的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1 過(guò)表達(dá)的共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響 |
| 3.16 RIZ1 的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1 過(guò)表達(dá)的共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移的影響 |
| 3.17 RIZ1 的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1 抑制的共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響 |
| 3.18 RIZ1 的下調(diào)表達(dá)和HOTAIRM1 過(guò)表達(dá)的共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分:lncRNA HOTAIRM1與miR-125b相互作用對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響及其臨床意義 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要試劑 |
| 2.1.2 主要儀器 |
| 2.2 研究對(duì)象 |
| 2.2.1 細(xì)胞 |
| 2.2.2 組織樣本與資料 |
| 2.2.3 血液樣本與資料 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3.1 lncRNA HOTAIRM1 靶向miRNA預(yù)測(cè) |
| 2.3.2 HEPG2 人肝癌細(xì)胞和HCC-LM3 人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.3.3 慢病毒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 |
| 2.3.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) |
| 2.3.5 miR-125b 熒光定量 PCR |
| 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 預(yù)測(cè)HOTAIRM1 的靶miRNA |
| 3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) |
| 3.3 慢病毒對(duì)HEPG2和HCC-LM3 細(xì)胞的感染MOI和最佳感染條件 |
| 3.3.1 LV-HOTAIRM1 慢病毒感染的MOI和最佳感染條件 |
| 3.3.2 LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒感染的MOI和最佳感染條件 |
| 3.3.3 LV-hsa-mir-125b-1 慢病毒感染的MOI和最佳感染條件 |
| 3.3.4 LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1 慢病毒共感染的MOI和最佳感染條件 |
| 3.3.5 LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1 慢病毒共感染的MOI和最佳感染條件 |
| 3.4 HOTAIRM1 表達(dá)與miR-125b表達(dá)之間的關(guān)系 |
| 3.5 RIZ1 表達(dá)與miR-125b表達(dá)之間的關(guān)系 |
| 3.6 miR-125b在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)情況 |
| 3.7 HOTAIRM1 干擾和miR-125b過(guò)表達(dá)共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響 |
| 3.8 HOTAIRM1 過(guò)表達(dá)和miR-125b過(guò)表達(dá)共同作用對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響 |
| 3.9 miR-125b熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.10 科室組織樣本中miR-125b在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達(dá)情況 |
| 3.11 科室血液樣本中miR-125b的表達(dá)情況 |
| 3.12 細(xì)胞培養(yǎng)樣本中 miR-125b 的表達(dá)情況 |
| 3.13 科室組織樣本中 miR-125b 的表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià) |
| 綜述 lncRNA 與組蛋白甲基化在肝癌中的研究現(xiàn)狀及展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
（4）基于整合生物信息學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療三種常見腫瘤作用機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文縮略詞表 |
| 第一部分 文獻(xiàn)綜述 |
| 綜述一 復(fù)方苦參注射液抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展 |
| 綜述二 復(fù)方苦參注射液臨床應(yīng)用進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 前言 |
| 第二部分 基于整合生物信息學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療三種常見腫瘤作用機(jī)制研究 |
| 一、基于生物信息學(xué)的肝癌關(guān)鍵基因研究 |
| 1 資料與方法 |
| 2 技術(shù)路線 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 二、基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療肝癌作用機(jī)制研究 |
| 1 資料與方法 |
| 2 技術(shù)路線 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 三、基于生物信息學(xué)的胰腺癌關(guān)鍵基因研究 |
| 1 資料與方法 |
| 2 技術(shù)路線 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 四、基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療胰腺癌作用機(jī)制研究 |
| 1 資料與方法 |
| 2 技術(shù)路線 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 五、基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療肺癌作用機(jī)制研究 |
| 1 資料與方法 |
| 2 技術(shù)路線 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 結(jié)語(yǔ) |
| 1 研究成果 |
| 2 研究的創(chuàng)新與特色 |
| 3 研究的展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 在學(xué)期間主要研究成果 |
（5）羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體的制備及其抗肝細(xì)胞癌研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 前言 |
| 第一章 處方前研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 藥品及試劑 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 脂質(zhì)體中羽扇豆醇含量測(cè)定方法的建立 |
| 2.2 羽扇豆醇脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法及制備方法的考察 |
| 2.3 羽扇豆醇溶解度的測(cè)定 |
| 2.4 羽扇豆醇普通脂質(zhì)體影響因素考察 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.1 羽扇豆醇含量測(cè)定方法的建立 |
| 3.2 羽扇豆醇包封率及制備方法的考察結(jié)果 |
| 3.3 羽扇豆醇溶解度測(cè)定結(jié)果 |
| 3.4 羽扇豆醇普通脂質(zhì)體影響因素考察結(jié)果 |
| 4 小結(jié)與討論 |
| 第二章 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體制備工藝及表征 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 藥品及試劑 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 正交試驗(yàn)法優(yōu)化羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體處方 |
| 2.2 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體凍干工藝的考察 |
| 2.3 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體理化性質(zhì)的考察 |
| 2.4 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體穩(wěn)定性的考察 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.1 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體制備工藝的考察結(jié)果 |
| 3.2 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體凍干保護(hù)劑考察結(jié)果 |
| 3.3 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體理化性質(zhì)的考察結(jié)果 |
| 3.4 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體制劑穩(wěn)定性考察結(jié)果 |
| 4 小結(jié)與討論 |
| 第三章 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體體內(nèi)和體外靶向性研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 藥品及試劑 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體體外靶向性研究 |
| 2.2 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體體內(nèi)靶向性研究 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.1 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體體外靶向性研究結(jié)果 |
| 3.2 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體體內(nèi)靶向性研究結(jié)果 |
| 4 小結(jié)與討論 |
| 第四章 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體藥代動(dòng)力學(xué)研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 藥品及試劑 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 |
| 2.2 血漿樣品的處理 |
| 2.3 羽扇豆醇體內(nèi)分析方法的考察 |
| 2.4 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.1 羽扇豆醇體內(nèi)分析方法的建立 |
| 3.2 血藥濃度測(cè)定結(jié)果 |
| 3.3 平均血藥濃度-時(shí)間曲線 |
| 3.4 統(tǒng)計(jì)矩?cái)M合分析 |
| 4 小結(jié)與討論 |
| 第五章 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體對(duì)HepG2 細(xì)胞行為學(xué)研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 藥品及試劑 |
| 1.2 抗體 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 細(xì)胞復(fù)蘇 |
| 2.2 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.3 細(xì)胞凍存 |
| 2.4 工作液的配制 |
| 2.5 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) |
| 2.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) |
| 2.7 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) |
| 2.8 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體促細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.1 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.4 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體促細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究結(jié)果 |
| 4 小結(jié)與討論 |
| 第六章 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體體內(nèi)藥效學(xué)研究 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 藥品及試劑 |
| 1.2 抗體 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 質(zhì)粒的提取及鑒定 |
| 2.2 質(zhì)粒溶液的配制 |
| 2.3 高壓尾靜脈轉(zhuǎn)染造模 |
| 2.4 分組與給藥 |
| 2.5 小鼠腫瘤檢測(cè) |
| 2.6 蘇木精-伊紅(HE)染色 |
| 2.7 肝組織中RNA的提取和q RT-PCR(即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測(cè) |
| 2.8 羽扇豆醇靶向脂質(zhì)體抗AKT/c-MET誘導(dǎo)HCC分子機(jī)制研究 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.1 質(zhì)粒酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.2 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體對(duì)AKT/c-Met誘導(dǎo)FVB小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 |
| 3.3 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體對(duì)AKT/c-Met誘導(dǎo)小鼠肝臟病理學(xué)變化的影響 |
| 3.4 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體對(duì)AKT/c-Met誘導(dǎo)小鼠的肝臟肝細(xì)胞癌標(biāo)志物表達(dá)水平的影響 |
| 3.5 羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體對(duì)AKT/c-Met誘導(dǎo)的HCC小鼠肝臟的AKT/mTOR以及Ras/MAPK相關(guān)蛋白的影響 |
| 4 小結(jié)與討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 結(jié)語(yǔ) |
| 附錄1 文獻(xiàn)綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄2 在讀博士期間發(fā)表的論文 |
| 致謝 |
（6）黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702的影響及TP53基因突變的原發(fā)性肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究（論文提綱范文）
| 個(gè)人簡(jiǎn)歷 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第一部分 黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702生物學(xué)行為的影響研究引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702影響的全轉(zhuǎn)錄測(cè)序研究及差異表達(dá)分析引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702影響的全轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第四部分 黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702的影響與TP53基因突變的原發(fā)性肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析及驗(yàn)證 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 全文總結(jié) |
| 附錄1 |
| 附錄2 |
| 附錄3 |
| 綜述 黃曲霉毒素B1體內(nèi)代謝與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文 |
（7）HJURP抑制p21表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖的分子機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 緒論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第一部分 HJURP在肝癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平及其臨床病理意義 |
| 前言 |
| 1 HJURP在臨床標(biāo)本和細(xì)胞系中的表達(dá)情況及與患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.3 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì) |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2 討論 |
| 3 結(jié)論 |
| 第二部分 HJURP抑制p21表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖的作用及其分子機(jī)制研究 |
| 前言 |
| 1 通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HJURP促進(jìn)肝癌的增殖 |
| 1.1 驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.3 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2 HJURP通過(guò)抑制p21的表達(dá)促進(jìn)肝癌的增殖 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3 HJURP通過(guò)E3泛素化連接酶SKP2促進(jìn)p21的泛素化降解 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3 統(tǒng)計(jì)方法 |
| 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4 HJURP通過(guò)MAPK/ERK1/2和AKT/GSK3β信號(hào)通路促進(jìn)p21出核 |
| 4.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.3 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 5 討論 |
| 6 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡(jiǎn)歷及在學(xué)期間所取得的科研成果 |
（8）乙肝病毒large S基因及其變異促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 摘要 Abstract 主要英文縮寫詞表 第一部分 |
| 慢性HBV感染人群隊(duì)列中l(wèi)arge |
| S基因相關(guān)變異與患者HCC發(fā)生率及死亡率的相關(guān)研究 前言 一、材料 二、方法 三、結(jié)果 四、討論 第二部分 |
| HBV |
| large |
| S基因及變異在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中的作用與機(jī)制研究 前言 一、材料 二、方法 三、結(jié)果 四、討論 參考文獻(xiàn) 附錄 綜述 參考文獻(xiàn) 在讀期間發(fā)表論文和科研工作情況 致謝 |
（9）肝細(xì)胞癌發(fā)展中PPARγ磷酸化修飾的機(jī)制及調(diào)控作用（論文提綱范文）
| 縮略詞 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 綜述 |
| 一、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)簡(jiǎn)介 |
| 1. HCC的風(fēng)險(xiǎn)因子 |
| 2. HCC的發(fā)病機(jī)制 |
| 3. HCC的治療方法 |
| 二、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ( Peroxisome proliferator-activatedreceptorγ,PPARγ) |
| 1. PPARγ的結(jié)構(gòu)和組織學(xué)分布 |
| 2. PPARγ的配體 |
| 3. PPARγ的生物學(xué)功能 |
| 4. PPARγ的翻譯后修飾 |
| 三、細(xì)胞增殖 |
| 1. 周期和細(xì)胞增殖 |
| 2. 代謝與細(xì)胞增殖 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 PPARγ磷酸化與HCC發(fā)展的關(guān)系 |
| 一、實(shí)驗(yàn)材料和方法 |
| 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1. PPARγ磷酸化與小鼠HCC發(fā)展的關(guān)系 |
| 1.1 DEN誘導(dǎo)小鼠HCC模型建立 |
| 1.2 PPARγ磷酸化在DEN誘導(dǎo)的HCC中表達(dá)水平升高 |
| 1.3 DEN誘導(dǎo)的HCC中PPARγ轉(zhuǎn)錄活性下降 |
| 1.4 PPARγ磷酸化與HCC發(fā)展進(jìn)程相關(guān) |
| 2. 裸鼠模型構(gòu)建與體內(nèi)實(shí)驗(yàn) |
| 2.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞株的建立 |
| 2.2 磷酸化抑制PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性 |
| 2.3 PPARγ磷酸化促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng) |
| 3. 人病理標(biāo)本中PPARγ磷酸化分析 |
| 三、討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 MEK/ERK激酶介導(dǎo)的PPARγ磷酸化及其對(duì)HCC發(fā)展的影響 |
| 一、實(shí)驗(yàn)材料和方法 |
| 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1. MEK/ERK激酶活性分析 |
| 2. 抑制MEK/ERK激酶活性可降低PPARγ磷酸化水平 |
| 2.1 MEK/ERK的抑制導(dǎo)致PPARγ磷酸化表達(dá)下降 |
| 2.2 MEK/ERK介導(dǎo)的PPARγ磷酸化的下降對(duì)HCC細(xì)胞增殖和周期的影響 |
| 3. MEK/ERK對(duì)PPARγ磷酸化作用的體內(nèi)分析 |
| 三、討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第四部分 PPARγ磷酸化對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 |
| 一、實(shí)驗(yàn)材料和方法 |
| 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1. 基因芯片與細(xì)胞增殖檢測(cè) |
| 1.1 基因芯片分析 |
| 1.2 HCC細(xì)胞增殖檢測(cè) |
| 2. 細(xì)胞周期分析及周期調(diào)控分子檢測(cè) |
| 三、討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第五部分 肝癌細(xì)胞有氧糖酵解重要功能基因分析 |
| 一、實(shí)驗(yàn)材料和方法 |
| 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1. 芯片分析 |
| 2. 葡萄糖和乳酸檢測(cè) |
| 三、討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 總結(jié)與展望 |
| 附錄 |
| 致謝 |
（10）CBX4在肝細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及其對(duì)肝癌預(yù)后的影響和分子機(jī)制（論文提綱范文）
| 摘要 Abstract 前言 第一部分 CBX4在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系 |
| 引言 |
| 1 研究?jī)?nèi)容與方法 |
| 1.1 研究對(duì)象 |
| 1.2 試劑與材料 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.4 質(zhì)量控制 |
| 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) 第二部分 CBX4基因在原發(fā)性肝癌中的生物學(xué)功能 |
| 引言 |
| 1 研究?jī)?nèi)容與方法 |
| 1.1 研究對(duì)象 |
| 1.2 試劑與材料 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.4 質(zhì)量控制 |
| 1.5 統(tǒng)計(jì)方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) 結(jié)論 致謝 參考文獻(xiàn) 綜述 |
| 參考文獻(xiàn) 攻讀博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 個(gè)人簡(jiǎn)歷 導(dǎo)師評(píng)閱表 |
四、肝細(xì)胞癌SCT表現(xiàn)特征與Rb,PCNA的關(guān)系（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]ZIP12在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制[D]. 葉超毅. 福建醫(yī)科大學(xué), 2021(02)
- [2]長(zhǎng)鏈非編碼RNA CYTOR通過(guò)調(diào)節(jié)miR-125b-5p/KIAA1522軸影響肝細(xì)胞癌增殖、凋亡和細(xì)胞周期的機(jī)制研究[D]. 胡博. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2021(02)
- [3]組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶RIZ1介導(dǎo)的lncRNA HOTAIRM1失活對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制的研究[D]. 李玉強(qiáng). 中國(guó)醫(yī)科大學(xué), 2021(02)
- [4]基于整合生物信息學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療三種常見腫瘤作用機(jī)制研究[D]. 孟子琦. 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2020(04)
- [5]羽扇豆醇肝靶向脂質(zhì)體的制備及其抗肝細(xì)胞癌研究[D]. 張駿. 湖北中醫(yī)藥大學(xué), 2020(08)
- [6]黃曲霉毒素B1對(duì)人肝細(xì)胞株HL-7702的影響及TP53基因突變的原發(fā)性肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D]. 余廷東. 廣西醫(yī)科大學(xué), 2019(08)
- [7]HJURP抑制p21表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖的分子機(jī)制研究[D]. 陳天馳. 浙江大學(xué), 2019(03)
- [8]乙肝病毒large S基因及其變異促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究[D]. 李自雄. 中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué), 2018(01)
- [9]肝細(xì)胞癌發(fā)展中PPARγ磷酸化修飾的機(jī)制及調(diào)控作用[D]. 龐小娟. 南京大學(xué), 2014(05)
- [10]CBX4在肝細(xì)胞癌中的生物學(xué)功能及其對(duì)肝癌預(yù)后的影響和分子機(jī)制[D]. 王伯慶. 新疆醫(yī)科大學(xué), 2013(02)
標(biāo)簽：肝細(xì)胞論文; 細(xì)胞增殖論文; 基因合成論文; 細(xì)胞轉(zhuǎn)染論文; 癌癥論文;