一、紫杉醇誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及對(duì)磷酸化Bcl-2的影響（論文文獻(xiàn)綜述）

李文杰^[1]（2021）在《雞貧血病毒VP3基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞的作用研究》文中研究指明雞貧血病毒VP3基因表達(dá)的凋亡蛋白Apoptin在正常細(xì)胞中無細(xì)胞毒性,而在腫瘤細(xì)胞中能夠特異性誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。表達(dá)雞貧血病毒VP3基因的重組腺病毒Ad-VT與Ad-VP3能夠在多種腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)Apoptin蛋白并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,且Ad-VT可以在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制起到溶瘤作用。癌癥是人類死亡的主要原因之一。2020年乳腺癌超越肺癌成為發(fā)病率第一的癌癥;并且女性中乳腺癌的死亡率居女性癌癥死亡率首位。目前針對(duì)乳腺癌的治療方法副作用大,對(duì)轉(zhuǎn)移患者療效欠佳,并且患者經(jīng)治療后仍有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,仍然需要繼續(xù)尋找更有效地治療手段。在癌癥內(nèi)部有一部分細(xì)胞被稱為癌癥起始細(xì)胞或癌癥干細(xì)胞,這部分細(xì)胞在癌癥起始、治療抵抗、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用。這意味著,以乳腺癌干細(xì)胞為靶標(biāo)可能是根除乳腺癌的有前途的治療策略。迄今為止,還沒有針對(duì)癌癥干細(xì)胞的特定藥物。因此,誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞分化并靶向殺傷癌癥干細(xì)胞可能有助于開發(fā)針對(duì)癌癥的新的治療策略,在治療癌癥時(shí)可能具有臨床優(yōu)勢(shì)。本研究目的是富集分選表型為CD44+CD24-的乳腺癌干細(xì)胞,對(duì)其干細(xì)胞特性進(jìn)行分析。利用本課題組前期構(gòu)建的表達(dá)雞貧血病毒VP3基因的重組腺病毒Ad-VT與Ad-VP3作用于乳腺癌干細(xì)胞,分析重組腺病毒對(duì)細(xì)胞的殺傷作用、干性抑制及增加乳腺癌干細(xì)胞藥物敏感性的作用。通過靶向癌癥干細(xì)胞,誘導(dǎo)其分化,抑制其治療抗性尋找臨床癌癥治療的新策略。首先是采用無血清懸浮培養(yǎng)與磁珠分選方法富集分選乳腺癌干細(xì)胞,對(duì)其自我更新、分化、耐藥性等進(jìn)行分析;其次是利用重組腺病毒作用于乳腺癌干細(xì)胞,對(duì)乳腺癌干細(xì)胞中干細(xì)胞比例、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞遷移侵襲能力等進(jìn)行檢測(cè)分析;之后檢測(cè)重組腺病毒對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤形成能力的影響、體內(nèi)腫瘤殺傷作用;最后利用Ad-VT與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用于乳腺癌干細(xì)胞后,檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞中干細(xì)胞比例、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞遷移侵襲能力等,分析Ad-VT是否能夠使乳腺癌干細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性增強(qiáng),從而抑制癌癥干細(xì)胞的治療抗性。本研究主要取得如下結(jié)果:1.對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的干性特征進(jìn)行檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn),無血清培養(yǎng)條件下,乳腺癌干細(xì)胞能夠形成乳腺癌細(xì)胞球;血清誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示乳腺癌干細(xì)胞能夠分化增殖,自我更新能力強(qiáng)于乳腺癌細(xì)胞;干細(xì)胞調(diào)控因子表達(dá)上調(diào),過表達(dá)與人類腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的多個(gè)基因;對(duì)化療藥紫杉醇也具有一定的耐藥性。2.通過檢測(cè)重組腺病毒對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的體外抑制作用后發(fā)現(xiàn),Ad-VT與Ad-VP3作用下,CD44+CD24-細(xì)胞群比例降低,干細(xì)胞調(diào)控因子表達(dá)下調(diào),乳腺癌干細(xì)胞干性受到抑制;Ad-VT與Ad-VP3能夠抑制細(xì)胞增殖;對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示Ad-VT與Ad-VP3能夠誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞線粒體途徑的凋亡;細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示乳腺癌干細(xì)胞的遷移侵襲能力受到抑制。3.檢測(cè)重組腺病毒對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的小鼠體內(nèi)抑制作用。小鼠體內(nèi)成瘤結(jié)果顯示Ad-VT與Ad-VP3作用后的乳腺癌干細(xì)胞干性受到抑制,失去了體內(nèi)腫瘤形成的能力;將狀態(tài)良好的乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行小鼠皮下注射荷瘤,重組腺病毒對(duì)荷瘤成功的小鼠進(jìn)行注射治療,結(jié)果顯示Ad-VT與Ad-VP3對(duì)乳腺癌干細(xì)胞小鼠荷瘤模型具有體內(nèi)殺傷作用,能夠抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長。4.Ad-VT與紫杉醇聯(lián)合作用能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞耐藥性,Ad-VT與紫杉醇聯(lián)合使用后對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的干性抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡水平、對(duì)細(xì)胞的增殖抑制、遷移侵襲抑制均顯著強(qiáng)于Ad-VT單獨(dú)治療組及紫杉醇單獨(dú)治療組,并且聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)了對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的小鼠體內(nèi)腫瘤形成能力的抑制。綜上所述,經(jīng)富集分選的乳腺癌干細(xì)胞具有自我更新、分化、治療抗性等干細(xì)胞特性,表達(dá)VP3蛋白的重組腺病毒Ad-VT與Ad-VP3對(duì)乳腺癌干細(xì)胞具有一定的體內(nèi)外抑制作用,能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞干性,Ad-VT能夠增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性,抑制乳腺癌干細(xì)胞的治療抗性,增強(qiáng)化療藥紫杉醇抑制乳腺癌干細(xì)胞的作用。

崔璐璐^[2]（2021）在《DYNLT1調(diào)控細(xì)胞周期影響乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究》文中指出研究背景:根據(jù)WHO在2020年發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌（breast cancer,BC）已超過肺癌,成為全世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。預(yù)計(jì)在2021年底,將有超57萬名女性被新確證為乳腺癌,將有超過9萬名女性死于乳腺癌。近年乳腺癌的治療手段不斷的更新迭代,無論在化療方案的多樣性,還是手術(shù)方式更新和放射治療,尤其是靶向治療、內(nèi)分泌治療及免疫治療等不斷進(jìn)步,都為乳腺癌患者帶來了更多的獲益,大大延長了患者的總生存率和無疾病復(fù)發(fā)時(shí)間,盡管如此,但仍有30%40%的患者因復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡。尋找更多乳腺癌的有效治療靶點(diǎn),提高乳腺癌的防治效果一直是一個(gè)重大的醫(yī)學(xué)研究課題。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移通過惡性細(xì)胞的不斷增殖來實(shí)現(xiàn)的,細(xì)胞增殖包括4個(gè)細(xì)胞周期,在這4個(gè)細(xì)胞周期中,大量的基因參與其中。本研究團(tuán)隊(duì)在之前的研究中,通過比較兩對(duì)乳腺癌耐藥組織標(biāo)本中的轉(zhuǎn)錄差異基因,篩選出候選基因——DYNLT1。DYNLT1基因編碼的動(dòng)力蛋白輕鏈Tctex 1,是細(xì)胞質(zhì)中動(dòng)力蛋白復(fù)合物的幾個(gè)非催化輔助成分之一,主要參與將動(dòng)力蛋白連接到貨物和調(diào)節(jié)動(dòng)力蛋白功能的適配器蛋白中,為囊泡和細(xì)胞器提供馬達(dá),使其沿著微管在細(xì)胞內(nèi)逆行運(yùn)動(dòng)。研究表明,DYNLT1蛋白可參與多種細(xì)胞功能,包括膜細(xì)胞器的運(yùn)輸,有絲分裂紡錘體定向,核遷移和細(xì)胞遷移等。但DYNLT1在乳腺癌中的作用尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步探討DYNLT1在乳腺癌中的作用,本研究擬擬在細(xì)胞、動(dòng)物及臨床組織等多個(gè)層面,通過基因編輯干預(yù)DYNLT1的表達(dá),觀察DYNLT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長周期從而影響癌細(xì)胞對(duì)化療藥物紫杉醇敏感性,為尋找乳腺癌治療新的靶點(diǎn)提供思路。研究方法:1.利用公共平臺(tái)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù),通過生物信息分析了解DYNLT1表達(dá)與臨床預(yù)后指標(biāo)（如OS、RFS）的相關(guān)性。2.通過慢病毒sh RNA系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定敲低DYNLT1的ZR 75-30、BT 549乳腺癌細(xì)胞株;通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體構(gòu)建過表達(dá)DYNLT1的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株。3.通過CCK8和克隆形成來檢測(cè)敲低及過表達(dá)DYNLT1后,乳腺癌細(xì)胞增殖能力的變化;通過流式分析來檢測(cè)同步化后再釋放,不同時(shí)間點(diǎn)（0h、4h、8h、12h、18h和24h）細(xì)胞周期的改變;采用q RT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的變化。4.在敲低及過表達(dá)DYNLT1的乳腺癌細(xì)胞中,分別給予各周期抑制劑（thymidine、hydroxyurea、mimosine、nocodazole）處理,流式分析檢測(cè)細(xì)胞周期的變化,q RT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)。5.在敲低及過表達(dá)DYNLT1的乳腺癌細(xì)胞中,給予周期特異性化療藥物——紫杉醇,通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干預(yù)DYNLT1表達(dá)后細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物毒性的變化;通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)。6.通過免疫共沉淀收集蛋白并進(jìn)行質(zhì)譜分析,分析在DYNLT1表達(dá)水平不同狀態(tài)下,與DYNLT1結(jié)合的蛋白表達(dá)與細(xì)胞周期的關(guān)系。7.構(gòu)建敲低或過表達(dá)DYNLT1的乳腺癌細(xì)胞原位裸鼠脂肪墊成瘤模型,待瘤體長到100mm3后,將裸鼠分成兩組,給藥組及未給藥組,給藥組根據(jù)體重腹腔注射紫杉醇（Paclitaxel濃度為1.2mg/ml,10ul/g）,隔2天給藥一次。測(cè)量并記錄裸鼠體重及腫瘤生長情況。瘤體收集后,免疫組化檢測(cè)各組瘤體中DYNLT1、KI67及周期和凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。8.收集乳腺癌患者的臨床基本資料、病理資料及隨訪資料,結(jié)合免疫組化結(jié)果從臨床層面分析DYNLT1的表達(dá)與乳腺癌臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果:1.通過對(duì)公共數(shù)據(jù)庫TCGA的數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)在包括乳腺癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤中,DYNLT1在正常組織中的表達(dá)要明顯低于腫瘤組織;同時(shí),生存曲線分析發(fā)現(xiàn),在乳腺癌中,高表達(dá)DYNLT1顯著縮短患者的總生存時(shí)間（P<0.001）和無疾病復(fù)發(fā)時(shí)間（P<0.001）。2.通過CCLE（https://portals.broadinstitute.org/ccle）數(shù)據(jù)檢測(cè)DYNLT1在不同亞型乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),DYNLT1在ZR 75-30和BT 549乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)量較高,而在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)較低。在ZR 75-30和BT 549細(xì)胞中分別感染DYNLT1 sh RNA慢病毒。q RT-PCR和WB結(jié)果發(fā)現(xiàn),ZR 75-30DY-SH及BT 549 DY-SH細(xì)胞中DYNLT1的表達(dá)量較對(duì)照細(xì)胞（ZR 75-30 NC-SH及BT 549 NC-SH）分別降低了80.3%±5.7%（p<0.01）、83.2%±2.7%（p<0.01）;同時(shí),在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DYNLT1過表達(dá)載體,q RT-PCR和WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231 DY-Flag細(xì)胞中DYNLT1的表達(dá)量較對(duì)照組細(xì)胞MDA-MB-231NC-Flag升高2.0±0.2倍（p<0.01）。這些結(jié)果提示敲低及過表達(dá)DYNLT1的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功CCK8增殖實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)表明:與對(duì)照組細(xì)胞（ZR 75-30 NC-SH及BT 549 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后明顯抑制ZR 75-30 DY-SH及BT 549 DY-SH細(xì)胞的增殖能力;而過表達(dá)DYNLT1后,MDA-MB-231 DY-Flag細(xì)胞的增殖能力則明顯強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞（MDA-MB-231 NC-Flag）。3.通過流式細(xì)胞系分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組細(xì)胞（ZR 75-30 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后,同步化后釋放24h,G2/M期的比例為7.60%,顯著低于對(duì)照組的20.30%（p<0.01）;通過給予不同周期抑制劑后發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組細(xì)胞（ZR 75-30 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后,給藥后,G2/M的比例為14.89%,顯著低于對(duì)照組的35.46%（p<0.01）。4.通過IP實(shí)驗(yàn)將與DYNLT1結(jié)合的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與DYNLT1結(jié)合的蛋白G2/M期細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路中富集最多。5.CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn),敲低DYNLT1的穩(wěn)定株較對(duì)照組細(xì)胞對(duì)紫杉醇藥物（PTX）的敏感性增加,ZR 75-30細(xì)胞的IC50分別為:對(duì)照組10 ug/ml及敲低組4.5 ug/ml,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡也發(fā)現(xiàn),在相同藥物濃度下,DYNLT1敲低后與對(duì)照組細(xì)胞相比,細(xì)胞凋亡數(shù)量增多（ZR 75-30細(xì)胞在7.2 ug/ml時(shí)對(duì)照組與敲低組凋亡細(xì)胞比例分別為66%及82%,p<0.05）;BT 549細(xì)胞的IC50分別為:對(duì)照組12.5 ug/ml及敲低組6.0 ug/ml,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡也發(fā)現(xiàn),在相同藥物濃度下,DYNLT1敲低后與對(duì)照組細(xì)胞相比,細(xì)胞凋亡數(shù)量增多(BT 549細(xì)胞在5.4 ug/ml時(shí)對(duì)照組與敲低組凋亡細(xì)胞比例分別為（17.7%及45.8%,p<0.05）。6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明:在脂肪墊原位成瘤模型中,敲低DYNLT1后,腫瘤的生長速度明顯低于對(duì)照組;無論是對(duì)照組還是DYNLT1敲低組,給予紫杉醇腹腔注射后,腫瘤的生長速度均較未給藥組明顯減慢,但DYNLT1敲低組的瘤體縮小比例顯著大于對(duì)照組（p<0.01）。免疫組化實(shí)驗(yàn)（IHC）結(jié)果顯示:裸鼠瘤體組織中,DYNLT1敲低組細(xì)胞中,DYNLT1的蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組;同時(shí),DYNLT1敲低組中Ki67表達(dá)相較于對(duì)照組明顯減少,在未給藥組中可以發(fā)現(xiàn),Caspase3、Bcl2等相關(guān)凋亡蛋白在敲低組和對(duì)照組中無明顯差別,給予紫杉醇干預(yù)后,敲低DYNLT1組凋亡蛋白Caspase3表達(dá)明顯增高,而抗凋亡蛋白Bcl2在敲低組明顯減少。7.通過對(duì)33例乳腺癌臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色,其中PR組共11例,SD組共10例,PD組共12例,結(jié)果顯示在PR組比例為9%,SD組高表達(dá)DYNLT1的乳腺癌比例為30%,PD組比例為83.3%。結(jié)論:1.DYNLT1在乳腺癌中呈高表達(dá),其表達(dá)與乳腺患者的總生存時(shí)間以及無疾病復(fù)發(fā)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。2.DYNLT1主要通過影響細(xì)胞周期G2/M期促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。3.高表達(dá)DYNLT1顯著削弱乳腺癌細(xì)胞對(duì)M周期特異性化療藥紫杉醇的化療敏感性。

王楠^[3]（2021）在《干擾線粒體動(dòng)力學(xué)增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)替莫唑胺化療敏感性的機(jī)制研究》文中研究表明背景:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是顱內(nèi)惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤,由于腫瘤細(xì)胞浸潤性生長及常與重要腦功能區(qū)及神經(jīng)纖維束毗鄰的特點(diǎn),導(dǎo)致手術(shù)全切困難,術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)不可避免。目前初發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是最大化的手術(shù)切除+術(shù)后放化療的綜合治療方案。即便如此,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后仍不理想,疾病診斷后的中位生存期僅14.6-16.7個(gè)月?；熢谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療方案中的價(jià)值已被多個(gè)臨床研究證實(shí)。然而,由于血腦屏障的存在,臨床中常用的多種化療藥品在顱內(nèi)均不能達(dá)到有效的藥物治療濃度,目前膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的一線化療藥仍為替莫唑胺。替莫唑胺治療可以有效延長膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中位生存期約2個(gè)月。與此同時(shí),在臨床治療中發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)替莫唑胺治療的敏感性隨時(shí)間延長而下降,這可能與腫瘤細(xì)胞中多種固有及獲得性化療耐藥機(jī)制有關(guān)。近年來,隨著對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)及功能認(rèn)識(shí)的深入,人們愈加認(rèn)識(shí)到線粒體可能以多種形式參與到了腫瘤細(xì)胞的化療耐受過程,這也為我們克服膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的化療耐藥提供了新的思路。同時(shí),在化療過程中腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的多重化療耐藥的現(xiàn)象提示我們?cè)谀[瘤耐藥機(jī)制中存在一些共有的、核心的機(jī)制?；谀芰看x在細(xì)胞生命活動(dòng)中的核心地位,我們將目光投向了化療藥物誘導(dǎo)下腫瘤細(xì)胞的能量代謝模式變化及其發(fā)生機(jī)制,以期找到新的方式來克服膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的化療耐受,增強(qiáng)化療效果,改善預(yù)后。在內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激刺激的作用下,腫瘤細(xì)胞會(huì)以多種方式完成對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)動(dòng)、調(diào)配以適應(yīng)細(xì)胞不同的功能狀態(tài)。而線粒體動(dòng)力學(xué)是應(yīng)激條件下腫瘤細(xì)胞完成細(xì)胞能量代謝重編程的重要參與者。線粒體動(dòng)力學(xué)包括了線粒體的融合分裂、線粒體運(yùn)輸及線粒體自噬等過程。其中,線粒體分裂融合和線粒體自噬參與了細(xì)胞中線粒體系統(tǒng)質(zhì)量與數(shù)量的控制過程。線粒體分裂由GTP酶動(dòng)力蛋白Drp1及其受體Mff、Mid49/51等蛋白分子介導(dǎo)完成;線粒體融合由參與線粒體外膜融合的重要分子Mfn1/2及參與內(nèi)膜融合的關(guān)鍵分子Opa1介導(dǎo)完成。線粒體分裂融合可以實(shí)現(xiàn)受損線粒體之間結(jié)構(gòu)及功能上的互補(bǔ),并可以將嚴(yán)重?fù)p傷的線粒體從線粒體系統(tǒng)中排除以實(shí)現(xiàn)線粒體功能的優(yōu)化并有效減少有害代謝物的生成,而這在細(xì)胞器結(jié)構(gòu)水平上表現(xiàn)為線粒體形態(tài)學(xué)的變化。線粒體自噬可由多條通路介導(dǎo)完成,而PINK1-Parkin通路在線粒體自噬的諸多通路中處于中心地位,它可以將受損的線粒體與溶酶體融合降解,直接地、精確地控制著線粒體的數(shù)量,保證線粒體系統(tǒng)的健康工作。化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)線粒體形態(tài)學(xué)的變化已有較多研究報(bào)道,但其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,而線粒體質(zhì)量及數(shù)量的變化對(duì)細(xì)胞能量代謝有著重要的影響。這些變化在腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng)中扮演了什么樣的角色,是否能為腫瘤的化療增敏提供新的策略,這些尚無定論的問題構(gòu)成了本研究的主旨。即探討在一線化療藥物替莫唑胺作用下膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞線粒體動(dòng)力學(xué)的變化形式、背后機(jī)制及其對(duì)腫瘤細(xì)胞能量代謝的影響,并嘗試通過干預(yù)線粒體動(dòng)力學(xué)過程實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的化療增敏。方法:1.乳酸、葡萄糖、ATP和ROS檢測(cè)試劑盒及氧耗率（OCR）測(cè)定的方法對(duì)替莫唑胺等不同處理?xiàng)l件下SHG44、U87細(xì)胞及異體腫瘤組織的代謝模式及水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。2.蛋白免疫印跡（WB）和細(xì)胞免疫熒光的方法對(duì)不同處理?xiàng)l件下腫瘤細(xì)胞中多種目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行半定量研究。3.qPCR的方法對(duì)不同處理?xiàng)l件下目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估;提取細(xì)胞總DNA并以qPCR的方法對(duì)線粒體DNA拷貝數(shù)的變化進(jìn)行研究;并對(duì)替莫唑胺作用下線粒體DNA損傷水平進(jìn)行評(píng)估。4.以特異性線粒體熒光探針標(biāo)記線粒體以實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體數(shù)量及線粒體與各種目標(biāo)蛋白的共定位水平的評(píng)估。此外,對(duì)熒光標(biāo)記的線粒體進(jìn)行顯微鏡拍照后以Image J進(jìn)行后期處理實(shí)現(xiàn)對(duì)線粒體形態(tài)的量化評(píng)估。5.以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SHG44和U87細(xì)胞過表達(dá)TP53的方法研究P53蛋白對(duì)下游基因PINK1的表達(dá)調(diào)控效應(yīng)。6.細(xì)胞免疫熒光共定位的方法對(duì)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行評(píng)價(jià)。7.使用線粒體及細(xì)胞核等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)提取分離試劑盒對(duì)不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離,并結(jié)合WB的方法對(duì)各結(jié)構(gòu)中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行半定量研究。8.MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)不同處理?xiàng)l件下腫瘤細(xì)胞的活力進(jìn)行評(píng)價(jià)。9.流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同處理?xiàng)l件下SHG44和U87細(xì)胞的凋亡水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。10.克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)替莫唑胺和（或）WY14643體外抑制SHG44及U87細(xì)胞增殖的效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。11.以U87細(xì)胞建立裸鼠異體皮下荷瘤模型,在體內(nèi)驗(yàn)證替莫唑胺和（或）WY14643對(duì)腫瘤的生長抑制效應(yīng)。12.以透射電鏡評(píng)估不同處理?xiàng)l件下異體腫瘤組織細(xì)胞中線粒體形態(tài)學(xué)變化。13.免疫組織化學(xué)的方法對(duì)不同條件下組織細(xì)胞內(nèi)TP53及PINK1表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:1.替莫唑胺處理?xiàng)l件下,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SHG44和U87出現(xiàn)顯著的能量代謝模式變化,表現(xiàn)為氧耗率增加,葡萄糖攝取消耗增加,細(xì)胞內(nèi)ATP合成水平上調(diào),腫瘤細(xì)胞氧化磷酸化水平上升,且兩細(xì)胞株中均未出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加。2.在對(duì)替莫唑胺化療應(yīng)激條件下線粒體數(shù)量變化的評(píng)估中發(fā)現(xiàn),替莫唑胺的處理可以引起SHG44和U87細(xì)胞中線粒體數(shù)量的增加;在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)SHG44和U87細(xì)胞中PINK1的表達(dá)水平下調(diào),Parkin向線粒體的募集減少,PINK1的磷酸底物磷酸化泛素表達(dá)水平下調(diào),且線粒體與溶酶體的融合減少,即替莫唑胺的處理下調(diào)了SHG44和U87細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬通量,實(shí)現(xiàn)了線粒體數(shù)量的積累。3.替莫唑胺可以誘導(dǎo)SHG44和U87細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核DNA損傷,引起SHG44細(xì)胞線粒體DNA的損傷,并伴隨著顯著的TP53高表達(dá),而生物信息學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)TP53的高表達(dá)和PINK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),而在GBM組織學(xué)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。4.在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn),DNA損傷引起的野生型TP53過表達(dá)可以下調(diào)細(xì)胞中PINK1的表達(dá)水平從而下調(diào)線粒體自噬水平;而在過表達(dá)TP53的細(xì)胞中,同樣觀察到了PINK1表達(dá)的下調(diào);在TP53突變細(xì)胞株U251中,替莫唑胺可以誘導(dǎo)突變TP53和PINK1表達(dá)的上調(diào);在可以誘導(dǎo)DNA損傷而不引起TP53表達(dá)上調(diào)的低劑量替莫唑胺處理?xiàng)l件下,PINK1的表達(dá)并未出現(xiàn)下調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了野生型P53蛋白可以負(fù)性調(diào)控PINK1的表達(dá)。5.替莫唑胺處理可以誘導(dǎo)SHG44、U87細(xì)胞中線粒體融合水平的提高;進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中Drp1向線粒體的募集減少。6.在對(duì)替莫唑胺處理?xiàng)l件下Drp1轉(zhuǎn)位機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn),替莫唑胺的處理可以在短時(shí)間內(nèi)引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)ATP的供求失衡并激活A(yù)MPK;此外替莫唑胺的處理可以上調(diào)AMPK能量感知系統(tǒng)感受ATP變化的閾值。而激活的AMPK一方面可以促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)P53蛋白水平的上調(diào),另一方面調(diào)控了Drp1向線粒體轉(zhuǎn)位減少的過程并促進(jìn)了線粒體融合的發(fā)生。7.Drp1分子在SHG44和U87細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布存在差異,Drp1彌漫分布在SHG44細(xì)胞中,而在U87細(xì)胞核中濃聚。8.體外實(shí)驗(yàn)中,以線粒體分裂誘導(dǎo)劑WY14643和替莫唑胺聯(lián)用可以引起替莫唑胺-腫瘤活力曲線下移,增加腫瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性。而使用線粒體分裂抑制劑Mdivi1和替莫唑胺聯(lián)用得到了相反的結(jié)果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)WY14643可以干擾替莫唑胺誘導(dǎo)的線粒體融合過程,并在一定程度上抵消替莫唑胺誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)ATP合成水平上調(diào)的現(xiàn)象,增加SHG44和U87細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平。而WY14643與替莫唑胺聯(lián)用相較于單獨(dú)使用替莫唑胺可以增加細(xì)胞凋亡比例,并表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞單克隆形成抑制能力。9.在裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯恐邪l(fā)現(xiàn)WY14643和替莫唑胺聯(lián)用可以明顯抑制腫瘤生長;對(duì)腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用組腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平更高;透射電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WY14643可以一定程度抵消替莫唑胺誘導(dǎo)的線粒體的融合,腫瘤組織的ATP檢測(cè)提示W(wǎng)Y14643可以引起腫瘤組織中ATP水平下調(diào)。結(jié)論:1.替莫唑胺處理在SHG44和U87細(xì)胞中誘導(dǎo)的DNA損傷和反應(yīng)性的TP53高表達(dá)可以通過下調(diào)PINK1的表達(dá)水平從而減少Parkin分子向線粒體的募集、下調(diào)線粒體自噬通量,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中線粒體數(shù)量的積累。2.替莫唑胺處理SHG44和U87細(xì)胞引起的細(xì)胞內(nèi)能量供求失衡導(dǎo)致AMPK的激活,而激活的AMPK可以上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)TP53的表達(dá)水平而影響線粒體自噬水平;此外AMPK尚可以通過減少Drp1向線粒體的轉(zhuǎn)位促進(jìn)線粒體融合的發(fā)生,實(shí)現(xiàn)線粒體系統(tǒng)的質(zhì)量優(yōu)化。3.干擾線粒體融合過程可以提高替莫唑胺處理?xiàng)l件下腫瘤細(xì)胞中ROS水平,降低ATP水平,增加替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療的敏感性。4.替莫唑胺化療應(yīng)激條件下SHG44和U87細(xì)胞中線粒體數(shù)量的積累和質(zhì)量的優(yōu)化是氧化磷酸化水平提高的重要原因,而這種上調(diào)的氧化磷酸化水平參與了腫瘤細(xì)胞的化療耐藥過程;阻斷此代償反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)化療的增敏。

劉景晨^[4]（2021）在《三七總皂苷對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響》文中研究表明視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是具有高度侵襲性的眼部腫瘤,多見于5歲以內(nèi)兒童。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療效果依賴于早期發(fā)現(xiàn)和早期治療,但由于社會(huì)經(jīng)濟(jì)及醫(yī)療條件的限制,很多患兒在臨床的中晚期才獲得診治,療效不佳且致盲率和致殘率極高。目前對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療主要有化療、放療、手術(shù)治療及免疫治療等,其中以化療為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療是中晚期患兒最常用的方案。在臨床治療中,由于化療藥物的耐藥性和毒副作用的存在,導(dǎo)致部分患兒難于得到及時(shí)而有效的治療,因此需尋找毒副作用小且可負(fù)擔(dān)的治療手段或藥物。三七總皂苷是從傳統(tǒng)中藥三七中提取的生物活性成分,廣泛用于糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等眼科疾病的治療。近年來在肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞的研究中證實(shí)三七總皂苷具有明確的抗腫瘤活性,但目前尚未發(fā)現(xiàn)其用于眼部腫瘤研究的報(bào)道。目的:研究三七總皂苷對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響,以探索三七總皂苷抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的作用機(jī)制。方法:1.采用CCK-8實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)三七總皂苷及卡鉑對(duì)Y79細(xì)胞增殖的影響,并計(jì)算出兩種藥物的IC50值。參考CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、不同濃度（200、400、600ug/ml）三七總皂苷組及卡鉑陽性對(duì)照組,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)三七總皂苷對(duì)Y79細(xì)胞凋亡的影響,Western blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的m RNA和蛋白表達(dá)。2.在信號(hào)通路的研究中,通過CCK-8實(shí)驗(yàn)分析PI3K抑制劑LY294002對(duì)Y79細(xì)胞增殖的影響并計(jì)算出IC50。檢測(cè)陰性對(duì)照組和濃度梯度為200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml的三七總皂苷組細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。然后按陰性對(duì)照組、三七總皂苷組、聯(lián)合藥物組及PI3K抑制劑組對(duì)Y79細(xì)胞進(jìn)行分組處理,檢測(cè)各組Y79細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞中PI3K/AKT通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。3.使用流式細(xì)胞儀對(duì)陰性對(duì)照組、三七總皂苷組（濃度分別為200、400、600ug/ml）及卡鉑陽性對(duì)照組中Y79細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè),應(yīng)用Western blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的m RNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.與陰性對(duì)照組相比,三七總皂苷可以有效抑制Y79細(xì)胞的增殖（P<0.05）,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)三七總皂苷對(duì)Y79細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度值（IC50）分別為429.2ug/ml;343.8ug/ml,271.5ug/ml。卡鉑對(duì)Y79細(xì)胞的24小時(shí)IC50值為63.60ug/ml。三七總皂苷作用于Y79細(xì)胞后,細(xì)胞的凋亡率隨藥物濃度增加而升高（P<0.05）,其中600ug/ml三七總皂苷促Y79細(xì)胞凋亡的作用最明顯,其細(xì)胞凋亡率為22.30±1.08%。與陰性組相比,三七總皂苷處理后的Y79細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的m RNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）,促凋亡蛋白的活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表達(dá)量也顯著增加（P<0.05）,而凋亡抑制基因Bcl-2的m RNA和蛋白表達(dá)則受到抑制（P<0.05）,組間對(duì)比結(jié)果顯示,600ug/ml三七總皂苷對(duì)促凋亡基因的m RNA和蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)（P<0.05）,對(duì)Bcl-2的m RNA和蛋白抑制作用也最明顯（P<0.05）。三七總皂苷處理后的Y79細(xì)胞中Bax/Bcl-2值較陰性組明顯升高（P<0.01）,600ug/ml三七總皂苷組中的Bax/Bcl-2值高于200ug/ml組（P<0.001）和400ug/ml組（P<0.005）。2.CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PI3K抑制劑LY294002可以有效抑制Y79細(xì)胞的增殖,其對(duì)Y79細(xì)胞的24小時(shí)IC50值為26.25umol/L。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示三七總皂苷組、LY294002組及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率均高于陰性對(duì)照組（P<0.001）,聯(lián)合用藥組中Y79細(xì)胞的凋亡率最高,為35.59±0.85%。三七總皂苷處理Y79細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)PI3K及AKT1的總蛋白表達(dá)量與陰性組相比未見差異（P>0.05）,但PI3K/AKT通路中的磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT（Thr308）、p-AKT（Ser473）及p-m TOR的表達(dá)量明顯低于陰性對(duì)照組（P<0.05）,在三七總皂苷處理組中的磷酸化蛋白表達(dá)量隨藥物濃度的增加而梯度下降（P<0.05）。與陰性組相比,200ug/ml三七總皂苷對(duì)PI3K/AKT通路拮抗蛋白PTEN的表達(dá)無明顯影響（P>0.05）,但400ug/ml和600ug/ml三七總皂苷組中PTEN蛋白的表達(dá)量均明顯升高（P<0.01）。三七總皂苷組、聯(lián)合藥物組及PI3K抑制劑組中的促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表達(dá)量較陰性組明顯增加（P<0.05）。聯(lián)合藥物組中促凋亡蛋白的表達(dá)量高于三七總皂苷組和LY294002組（P<0.05）,各藥物處理組細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)量則均低于陰性組（P<0.01）,組間對(duì)比顯示聯(lián)合用藥對(duì)Bcl-2蛋白的抑制作用最強(qiáng)（P<0.005）,藥物處理后的Y79細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2值均明顯高于陰性組（P<0.005）,在聯(lián)合用藥組中的Bax/Bcl-2比值最高,為陰性組的2.62±0.16倍。3.按實(shí)驗(yàn)分組處理后,三七總皂苷各藥物組處于G0/G1期的Y79細(xì)胞百分率均顯著高于陰性組（P<0.01）,在600ug/ml三七總皂苷組中,G0/G1期Y79細(xì)胞所占百分比最高,為72.42±0.65%,而S期及G2/M期的細(xì)胞比例均低于陰性對(duì)照組（P<0.05）。三七總皂苷處理Y79細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)G0/G1期相關(guān)基因Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表達(dá)量較陰性組均明顯下降（P<0.05）,并具有濃度依賴性,在600ug/ml三七總皂苷組中下降最顯著（P<0.05）。結(jié)論:1.三七總皂苷能抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。2.三七總皂苷對(duì)Y79細(xì)胞的促凋亡作用可能是通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。3.三七總皂苷能通過抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)Y79細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

王文平^[5]（2021）在《重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性評(píng)價(jià)及重樓皂苷Ⅰ的肝毒性機(jī)制探究》文中認(rèn)為研究目的:藥源性肝損傷是一項(xiàng)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì),我國藥源性肝損傷的發(fā)病率逐年升高;重樓是一種臨床常用中藥,因其抗腫瘤活性日益受到重視。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重樓中3種重要的皂苷類成分,越來越多的研究和報(bào)道顯示其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均具有殺傷作用。但重樓在抗腫瘤作用的同時(shí)毒副作用研究較少,尤其是其單體類成分。本研究圍繞重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潛在毒性及其作用機(jī)制進(jìn)行深入的探索。以期為中藥重樓的臨床合理應(yīng)用以及基于重樓皂苷單體的藥物研發(fā)提供借鑒和參考。研究方法:（1）從細(xì)胞、模式生物-斑馬魚、動(dòng)物3個(gè)層面進(jìn)行了重樓皂苷單體的毒性評(píng)價(jià)。首先選擇了 9種細(xì)胞考察了重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的細(xì)胞毒性情況,包括3種肝細(xì)胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68細(xì)胞）,3種腎細(xì)胞（HK-2、HKC和293T細(xì)胞）和3種心臟細(xì)胞（H9c2、HUVEC和HCMEC細(xì)胞）;利用模式生物-斑馬魚模型考察不同濃度重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ對(duì)斑馬魚生存率的影響,確定了 LC50、LC10與最大非致死濃度（MNLC）;體視熒光顯微鏡觀察重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ給藥前后肝臟、腎臟和心臟的形態(tài),統(tǒng)計(jì)斑馬魚的腎臟水腫率、心率和心包水腫率。利用Image-Pro Plus 5.1.0軟件統(tǒng)計(jì)給予重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑馬魚肝臟面積和熒光強(qiáng)度、腎臟面積和熒光強(qiáng)度、心臟SV-BA距離,評(píng)價(jià)重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潛在肝、腎、心毒性;通過HE染色和TUNEL染色觀察斑馬魚給藥前后肝組織病理情況及肝細(xì)胞凋亡情況;通過小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn),得出LC50值。然后進(jìn)行小鼠血清生化檢測(cè)和組織病理切片分析。各個(gè)層面數(shù)據(jù)相互支持,補(bǔ)充驗(yàn)證,使研究基礎(chǔ)更加全面可靠,結(jié)論更加合理。（2）選用HepaRG細(xì)胞研究重樓皂苷Ⅰ的肝細(xì)胞毒性機(jī)制。利用酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、倒置熒光顯微鏡等對(duì)HepaRG細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）釋放、DAPI染色、活性氧（ROS）、線粒體膜電位（MMP）、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期等進(jìn)行測(cè)定,利用Western blot對(duì)凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè);選用HUVEC細(xì)胞研究重樓皂苷Ⅰ的心血管毒性機(jī)制。從抑制新血管生成和促進(jìn)心血管細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面評(píng)價(jià)了重樓皂苷Ⅰ的血管毒性機(jī)制。進(jìn)行了LDH釋放、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡、DAPI染色、細(xì)胞周期以及體外血管生成等研究,測(cè)定了近30個(gè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。（3）利用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)給藥組和對(duì)照組小鼠肝臟組織中的差異蛋白,對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò);采用IPA軟件進(jìn)一步篩選出與表型相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物;利用Q300靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究給藥組和對(duì)照組小鼠血清樣本中內(nèi)源性代謝物的變化情況。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠內(nèi)源性代謝物的輪廓變化。比較給藥前后小鼠血清樣本代謝譜的差異,尋找與重樓皂苷Ⅰ致肝毒性相關(guān)的代謝差異物及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape對(duì)蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)做關(guān)聯(lián)分析。采用PCR和Western blot技術(shù)對(duì)肝毒性機(jī)制中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。研究結(jié)果:（1）重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明顯的細(xì)胞毒性,能顯著的促進(jìn)H9c2細(xì)胞外其余8種細(xì)胞的凋亡,且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。對(duì)于H9c2細(xì)胞,3種皂苷均呈現(xiàn)出低劑量促進(jìn)增殖,高劑量抑制增殖的作用;斑馬魚實(shí)驗(yàn)結(jié)果:重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ對(duì)斑馬魚的LC50分別為121、213、570 ng/mL,LC10分別為109、178、456ng/mL,MNLC分別為99、146、357ng/mL;毒性器官評(píng)價(jià)方面,重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ對(duì)斑馬魚具有顯著的肝臟毒性,能明顯降低斑馬魚肝臟面積和熒光強(qiáng)度;重樓皂苷Ⅰ能顯著影響斑馬魚的心率,提示其具有心血管毒性;重樓皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑馬魚腎臟面積和熒光強(qiáng)度,具有一定的腎毒性,但3種皂苷均未造成腎水腫;斑馬魚病理切片顯示重樓皂苷Ⅰ給藥組的肝組織出現(xiàn)空泡和嚴(yán)重的肝細(xì)胞壞死;TUNEL染色結(jié)果顯示重樓皂苷Ⅰ給藥組出現(xiàn)了肝細(xì)胞凋亡;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果:小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),重樓皂苷Ⅰ具有體內(nèi)毒性,其LC50為24.5 mg/kg;給藥組血清中ALT、AST顯著升高,SOD降低;給藥組病理切片顯示出顯著的肝細(xì)胞損傷和脂肪樣變性以及一定的心臟毒性。（2）重樓皂苷Ⅰ肝細(xì)胞毒性機(jī)制:重樓皂苷Ⅰ顯著升高了 HepaRG細(xì)胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c從線粒體向胞漿中釋放,早期及晚期凋亡細(xì)胞增多,LDH的釋放量升高。改變了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。并且明顯激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表達(dá),且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系;重樓皂苷Ⅰ血管毒性機(jī)制:重樓皂苷Ⅰ顯著促進(jìn)了心血管細(xì)胞LDH的釋放,抑制細(xì)胞遷移和血管生成,改變周期分布,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。給藥后的細(xì)胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 種蛋白的表達(dá)均發(fā)生了改變。（3）蛋白組學(xué)結(jié)果:共篩選出302個(gè)差異蛋白,其中上調(diào)蛋白182個(gè),下調(diào)蛋白120個(gè)。差異蛋白具有氧化還原酶活性、催化活性等分子功能,參與了脂肪酸代謝、有機(jī)酸的代謝、藥物代謝、氧化還原過程等生物過程。主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等;Pathway結(jié)果顯示,差異蛋白在細(xì)胞色素P450酶對(duì)藥物的代謝、細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）等途徑上富集程度較高;PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要聚集在三個(gè)功能區(qū)域,包括細(xì)胞色素P450酶、脂質(zhì)代謝過程、氧化還原過程;IPA商業(yè)數(shù)據(jù)庫篩選出9個(gè)與肝毒性相關(guān)的差異蛋白作為潛在生物標(biāo)志物;代謝組學(xué)結(jié)果:給藥組代謝物輪廓明顯偏離對(duì)照組;通過多維和單維的差異代謝物的交集,篩選并初步鑒定出97種差異代謝物,25條代謝通路。結(jié)果歸納顯示重樓皂苷Ⅰ造成了體內(nèi)5個(gè)方面的代謝異常,包括氨基酸代謝、脂肪酸代謝、谷胱甘肽代謝、能量代謝、蛋白質(zhì)合成;其中D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,花生四烯酸代謝,氨酰tRNA生物合成等代謝通路影響值相對(duì)較高;代表性差異代謝物為花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、?；鈮A等。對(duì)全文中研究的重樓皂苷Ⅰ的肝毒性情況進(jìn)行了綜合分析,總結(jié)并推測(cè)了重樓皂苷Ⅰ造成肝毒性的機(jī)制。采用qPCR及Western blot驗(yàn)證了關(guān)鍵蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表達(dá),對(duì)推測(cè)的肝損傷機(jī)制進(jìn)行了初步驗(yàn)證。研究結(jié)論:（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝臟、腎臟、心血管細(xì)胞毒性;斑馬魚實(shí)驗(yàn)研究確定了 3種皂苷中毒性最強(qiáng)的為重樓皂苷Ⅰ,毒性最明確的毒性靶部位是肝臟和心血管;斑馬魚肝臟病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指標(biāo)、病理切片檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了重樓皂苷Ⅰ的肝臟和心臟毒性;（2）重樓皂苷Ⅰ肝細(xì)胞毒性機(jī)制為ROS應(yīng)激通路和死亡受體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;心血管毒性主要作用通路為VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信號(hào)通路,JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路和Bcl-2家族介導(dǎo)的凋亡通路,從誘導(dǎo)心血管細(xì)胞凋亡和抑制新生血管兩方面產(chǎn)生心血管毒性。（3）蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合全文數(shù)據(jù)推測(cè)重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)的肝毒性機(jī)制可能為CYP450酶和脂質(zhì)代謝介導(dǎo)的線粒體功能障礙為主體的肝細(xì)胞損傷。藥物影響了:①多種CYP450酶。主要包括Ⅰ相代謝酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代謝酶GSTA3和UGT1A1表達(dá)紊亂,呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。藥物在體內(nèi)的水解、代謝過程被減慢,隨著作用時(shí)間的延長,藥物毒性反應(yīng)增加。未被代謝的藥物作用可能作用于線粒體,造成線粒體功能障礙;也很有可能是Ⅱ相藥物代謝酶下調(diào),產(chǎn)生的毒性代謝中間產(chǎn)物作用于線粒體,進(jìn)一步產(chǎn)生了肝臟毒性;②脂質(zhì)代謝。線粒體損傷后β-氧化的功能受到影響,體內(nèi)的游離脂肪酸不能被氧化而轉(zhuǎn)化成甘油三脂,導(dǎo)致了體內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。同時(shí)ATP合成減少,供能障礙。脂質(zhì)蓄積還能產(chǎn)生脂毒性進(jìn)一步影響線粒體功能,產(chǎn)生過量ROS;③線粒體氧化應(yīng)激。過量的ROS生成誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激,釋放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,進(jìn)而激活caspase家族導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示藥物代謝酶CYP1A2顯著下調(diào)以及凋亡關(guān)鍵蛋白Bax表達(dá)上調(diào)。qPCR結(jié)果顯示凋亡相關(guān)基因P53、Bax以及Fas的表達(dá)均顯著上調(diào),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)佐證了機(jī)制推論的合理性。

曾衛(wèi)平^[6]（2021）在《初步探究菜薊苦素抑制黑色素瘤細(xì)胞生長的作用及機(jī)制》文中研究說明研究目的:黑色素瘤是一類早期容易轉(zhuǎn)移、死亡率很高的癌癥,目前對(duì)此疾病的主要以藥物治療為主,早期的原位黑色素瘤能夠手術(shù)治愈,目前進(jìn)展期的黑色素瘤治療藥物雖然已經(jīng)有了免疫和靶向藥物治療,但由于響應(yīng)率低和藥物毒副作用,他們的使用受到了限制。菜薊苦素是一種來源于多種植物的倍半萜內(nèi)酯,具有良好的生物學(xué)效應(yīng),具有潛在的抗癌作用。本課題通過觀察菜薊苦素對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究探討了菜薊苦素可以作為黑色素瘤治療藥物的可能性。研究方法:分別應(yīng)用0、5、10、20、40、60、80μM的菜薊苦素處理人黑色素瘤A375細(xì)胞和A2058細(xì)胞觀察細(xì)胞生長增殖情況,繪制細(xì)胞活力圖,計(jì)算IC50（藥物使存活細(xì)胞數(shù)量抑制為原有細(xì)胞數(shù)量一半時(shí)的藥物濃度）。通過Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL-2及PARP等的表達(dá)情況,來觀察菜薊苦素是否誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡,并檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin B1和CDK1的表達(dá)水平,來判斷菜薊苦素對(duì)黑色素瘤細(xì)胞周期的影響。用A375細(xì)胞種植在裸鼠皮下成瘤后,分成4組,分別用0（對(duì)照組）、10mg/Kg、20 mg/Kg、40 mg/Kg的菜薊苦素（濃度都是IC50）腹腔注射治療后宰殺裸鼠摘取腫瘤標(biāo)本觀察瘤體的生長情況。對(duì)用菜薊苦素干預(yù)24h的人黑色素瘤A375細(xì)胞和用DMSO（溶劑）處理的對(duì)照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析兩組差異基因表達(dá)情況,進(jìn)行GO、KEGG注釋、KEGG信號(hào)通路富集來初步探究菜薊苦素抑制黑色素瘤細(xì)胞生長的關(guān)鍵基因及可能機(jī)制。結(jié)果:應(yīng)用不同濃度的菜薊苦素處理人黑色素瘤A375細(xì)胞和A2058細(xì)胞,其生長受到抑制,IC50分別為:27.4μM和24.2μM。Western Blot檢測(cè)BAX蛋白、BCL-2蛋白及PARP蛋白的結(jié)果顯示:干預(yù)的菜薊苦素濃度越高,BAX蛋白、PARP蛋白表達(dá)明顯上調(diào),BCL-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào),Western Blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白B1（Cyclin B1）和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶1（CDK1）結(jié)果顯示:干預(yù)的菜薊苦素的濃度越高,Cyclin B1的表達(dá)明顯上調(diào),CDK1的表達(dá)明顯下調(diào)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,腹腔注射的菜薊苦素劑量越高,抑制皮下成瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤的生長越明顯,且對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。菜薊苦素干預(yù)后的A375細(xì)胞與未用菜薊苦素處理的A375細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示:一共有348個(gè)差異表達(dá)的基因,其中上調(diào)的差異基因有272個(gè),下調(diào)的差異基因有76個(gè)。根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析,IL-6、CXCL-8和SERPINE是明顯上調(diào)的差異基因中轉(zhuǎn)錄的蛋白是連通性最好的幾種蛋白,CENPA、B3GAT1、AURKB是明顯下調(diào)的差異基因中連通性最好的蛋白,在黑色素瘤的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中具有重要的地位,可能與黑色素瘤的生長增殖有極重要的關(guān)系。根據(jù)KEGG信號(hào)通路富集散點(diǎn)圖,其中富集的信號(hào)通路有TNF信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路、NF-kappa b信號(hào)通路和Erb B信號(hào)通路。結(jié)論:1、菜薊苦素在體外可能是通過促進(jìn)黑色素瘤A375和A2058細(xì)胞的凋亡和阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程從而抑制其生長增殖且抑制效果隨藥物濃度增加越明顯,其IC50分別為27.4μM和24.2μM。2、菜薊苦素在體內(nèi)能夠明顯抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞誘導(dǎo)的裸鼠皮下成瘤模型中黑色素瘤瘤體的生長,且對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。3、菜薊苦素抑制黑色素瘤細(xì)胞生長的機(jī)制可能與TNF信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路、NF-kappa b信號(hào)通路和Erb B信號(hào)通路相關(guān)。

祖瑪麗^[7]（2021）在《絞股藍(lán)皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究》文中研究指明研究目的:絞股藍(lán)Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥,在我國西南少數(shù)民族地區(qū)應(yīng)用廣泛,是傳統(tǒng)壯醫(yī)的常用草藥之一,用于治療各種疾病,壯藥名為gocaetmbaw。絞股藍(lán)皂苷gypenoside L和gypenoside LI是從絞股藍(lán)中分離提取的皂苷類活性成分,為一對(duì)同分異構(gòu)體。已有研究表明gypenoside L和gypenoside LI對(duì)多種癌細(xì)胞的生長具有抑制作用,但其在乳腺癌中的藥理作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。2020年世衛(wèi)組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)顯示乳腺癌發(fā)病率居全球第一,女性生命健康受到嚴(yán)重威脅,目前對(duì)乳腺癌的治療方式主要有手術(shù)、內(nèi)分泌治療、化療、放療以及靶向治療等。由于缺乏有效的靶向治療,高度轉(zhuǎn)移性三陰乳腺癌（TNBC）的治療仍具有很大的挑戰(zhàn)性。E2F1轉(zhuǎn)錄因子為E2F家族成員之一,參與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡。臨床數(shù)據(jù)表明E2F1異常上調(diào)經(jīng)常發(fā)生在各種類型的癌癥中,與惡性進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)。ERCC6L是SNF2家族成員之一,參與染色質(zhì)重塑、DNA重組和DNA修復(fù),與多種癌癥進(jìn)展有關(guān)。因此,本課題目的是探究絞股藍(lán)皂苷gypenoside L和gypenoside LI對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的抑制作用及分子機(jī)制。研究方法及結(jié)果:細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)證明gypenoside L和gypenoside LI均可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移,還可誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡,而且gypenoside LI的藥效要強(qiáng)于gypenoside L,尤其對(duì)于三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。RNA-seq 測(cè)序、KEGG 和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）發(fā)現(xiàn)gypenoside L和gypenoside LI均可通過調(diào)控細(xì)胞周期發(fā)揮作用。流式周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)gypenoside L可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,gypenoside LI使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。GO分析發(fā)現(xiàn)gypenoside L與細(xì)胞分裂、染色體分離有關(guān);而gypenoside LI主要影響DNA復(fù)制。Metascape在線工具分析發(fā)現(xiàn)gypenoside LI下調(diào)的差異基因集或周期相關(guān)基因集主要受E2F1調(diào)控,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及rescue實(shí)驗(yàn)證實(shí)gypenoside LI可通過抑制E2F1使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,還可通過下調(diào)E2F1抑制ERCC6L的表達(dá)。而gypenoside L則不調(diào)控E2F1的表達(dá)。此外,gypenoside LI與siE2F1聯(lián)合處理可發(fā)揮協(xié)同作用,使gypenoside LI在低濃度條件下便可殺死腫瘤細(xì)胞。而gypenoside L雖然不能抑制E2F1的表達(dá),但可下調(diào)ERCC6L,結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫推測(cè)這可能與有絲分裂有關(guān)。此外,Western blot結(jié)果顯示gypenoside L和gypenoside LI均不能改變p53的表達(dá)。由此可見,gypenoside L和gypenoside LI這對(duì)同分異構(gòu)體發(fā)揮抗腫瘤作用并不依賴p53途徑。結(jié)論:本研究證明gypenoside L和gypenoside LI可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用均不依賴p53途徑,但是二者的作用機(jī)制卻有所不同:gypenoside L可使乳腺癌細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期,而 gypenoside LI阻滯在G0/G1期;同時(shí),gypenoside LI可通過E2F1下調(diào)ERCC6L的表達(dá),而gypenoside L卻不改變E2F1的表達(dá),結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析推測(cè)下調(diào)ERCC6L可能與有絲分裂途徑有關(guān)。

黃莉^[8]（2020）在《PEITC調(diào)控結(jié)腸癌凋亡的機(jī)制研究及安全性評(píng)估》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率占所有惡性腫瘤第三位,死亡率位于第五位,給人類的健康帶來了巨大的威脅。結(jié)腸癌的病因不明確,發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,早期基本無癥狀。手術(shù)是治療結(jié)腸癌的主要方法,早期患者可以通過手術(shù)達(dá)到根治的效果,而中晚期患者通過手術(shù)很難根治,手術(shù)后容易轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)。而針對(duì)不能進(jìn)行手術(shù)的患者,以化療為基礎(chǔ)的綜合治療模式可以有效改善患者生存。異硫氰酸苯乙酯（PEITC）是十字花科植物的硫代葡萄糖苷降解產(chǎn)物,被報(bào)道可以降低腫瘤的發(fā)生率,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長,且對(duì)正常組織細(xì)胞無任何毒副作用。目前研究認(rèn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是PEITC可以抑制癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制,而理解PEITC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)于了解其作為臨床上有用的化學(xué)預(yù)防或治療劑是必不可少的。我們前期發(fā)現(xiàn)PEITC抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,并且對(duì)正常腸的上皮細(xì)胞無影響,但其機(jī)制尚不清楚。因此,本論文將深入研究PEITC誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑及其分子機(jī)制,并通過裸鼠成瘤模型驗(yàn)證PEITC對(duì)結(jié)腸癌腫瘤的抑制效果和作用機(jī)制,最后對(duì)PEITC的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。我們選用了 2種不同的結(jié)腸癌細(xì)胞系（HCT116和SW620）及正常腸上皮細(xì)胞（NCM460）,用不同濃度的PEITC進(jìn)行處理,通過MTT法、流式細(xì)胞儀、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)20 μM PEITC的PEITC可以顯著性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,而對(duì)正常腸上皮細(xì)胞無影響。我們進(jìn)一步通過western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEITC促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9的表達(dá),通過JC-1和DCFH-DA方法發(fā)現(xiàn)PEITC抑制線粒體內(nèi)膜膜電勢(shì)并促進(jìn)ROS產(chǎn)生,提示通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們分離細(xì)胞質(zhì)組分后通過western blot檢測(cè)Cyto-c和SMAC的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PEITC促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SMAC的表達(dá),流式細(xì)胞儀結(jié)果進(jìn)一步表明PEITC通過SMAC誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。通過anti-SMAC進(jìn)行免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,co-IP）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PEITC作用后可促進(jìn)SMAC與Survivin的相互作用,發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。PEITC通過ERK和JNK蛋白的磷酸化促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及增加細(xì)胞凋亡比例,表明PEITC通過ERK/JNK通路介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。利用結(jié)腸癌裸鼠成瘤模型評(píng)價(jià)PEITC的抑癌效果及安全性,通過皮下接種法建立裸鼠成瘤模型,發(fā)現(xiàn)PEITC抑制結(jié)腸癌皮下移植腫瘤的生長,并促進(jìn)裸鼠結(jié)腸癌皮下腫瘤中線粒體途徑凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9、SMAC蛋白表達(dá),抑制Survivin蛋白表達(dá),對(duì)裸鼠血常規(guī)三系細(xì)胞和肝腎功能均無影響。我們研究表明PEITC通過SMAC/Survivin信號(hào)通路調(diào)控線粒體途徑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明PEITC抑制裸鼠皮下移植腫瘤的生長,并通過SMAC/Survivin信號(hào)介導(dǎo)線粒體途徑的凋亡,而不影響裸鼠肝腎功能、血常規(guī)三系細(xì)胞。本論文將為結(jié)腸癌的臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)和新的方向。

孫欣慰^[9]（2020）在《KIF15對(duì)卵巢癌增殖和凋亡的影響及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的卵巢癌（Ovarian Cancer,Ov Ca）是在婦科惡性腫瘤中致死率排名第一位的腫瘤。卵巢癌起病隱匿,難于早期診斷,大部分患者在診斷時(shí)已進(jìn)展至晚期。由于缺乏可靠的指標(biāo),卵巢癌的早期診斷和預(yù)后都是亟待解決的臨床難題。此外,雖然卵巢癌的靶向治療不斷發(fā)展,但由于低應(yīng)答率和耐藥性的問題,仍有相當(dāng)一部分患者難以從現(xiàn)有的靶向治療中獲益?；诖?尋找在卵巢癌早期就能夠幫助診斷和預(yù)測(cè)患者預(yù)后情況,以及有望作為卵巢癌治療靶點(diǎn)的新的生物標(biāo)記物,成為卵巢癌診斷和治療領(lǐng)域迫切需要解決的問題。生物信息學(xué)是生命科學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)相結(jié)合形成的一門新興的交叉學(xué)科。近年來,隨著GEO、TCGA等多個(gè)全球性腫瘤數(shù)據(jù)庫不斷建立和完善,腫瘤數(shù)據(jù)庫的信息提取和深入挖掘已經(jīng)成為了腫瘤研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。利用生物信息學(xué)方法挖掘腫瘤數(shù)據(jù)庫的已有數(shù)據(jù),有針對(duì)性地獲取腫瘤相關(guān)分子,是獲得有效生物標(biāo)記物、篩選信號(hào)通路分子進(jìn)而揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展內(nèi)在機(jī)制的高效方法,運(yùn)用該方法能夠大大提高篩選診斷、預(yù)后和治療靶標(biāo)的效率和可靠性。因此,在本課題中,我們擬通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫、TCGA數(shù)據(jù)庫等在線數(shù)據(jù)庫中的卵巢癌相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,分析獲得卵巢癌m RNA表達(dá)譜中的差異表達(dá)基因,結(jié)合多種生物信息學(xué)方法從這些差異表達(dá)基因中篩選獲得能夠顯著影響卵巢癌患者生存期、幫助預(yù)測(cè)患者預(yù)后情況的生物標(biāo)記物,再通過對(duì)目的基因功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究,進(jìn)一步了解目的基因在卵巢癌中發(fā)揮的作用及其調(diào)控機(jī)制,為該分子作為輔助診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)因子或進(jìn)一步作為治療靶標(biāo)應(yīng)用于臨床,提供理論依據(jù)。材料與方法1.GEO卵巢癌基因芯片數(shù)據(jù)挖掘、差異表達(dá)基因分析和目的基因篩選1)GEO卵巢癌數(shù)據(jù)集的檢索、篩選和下載;使用R軟件從質(zhì)量灰度、權(quán)重、殘差、殘差符號(hào)、RLE、NUSE和RNA降解等多個(gè)方面對(duì)擬進(jìn)行分析的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估;2)對(duì)選取的4個(gè)GEO卵巢癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理,剔除不合格樣本后,使用RMA算法分別進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化和log2處理,再將對(duì)照組和腫瘤組數(shù)據(jù)進(jìn)行合并、匯總,通過Affymetrix平臺(tái)的芯片注釋文件,將探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為基因名稱;分別對(duì)每個(gè)卵巢癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)分析;3)使用DAVID在線工具對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析;根據(jù)GO分析結(jié)果對(duì)增殖相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選;4)使用Kaplan-Meier Plotter工具進(jìn)行備選基因的OS和PFS生存分析,并繪制生存曲線;5)使用Oncomine公共數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行備選基因表達(dá)分析和驗(yàn)證;6)使用GEPIA數(shù)據(jù)庫對(duì)候選基因在不同分期的卵巢癌中的表達(dá)進(jìn)行分析。2.KIF15在卵巢癌的表達(dá)驗(yàn)證和體內(nèi)外功能研究1)利用GTEx來源的人體正常組織RNA-seq數(shù)據(jù)和TCGA來源的卵巢癌樣本RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)KIF15在正常人體組織器官的表達(dá)和在卵巢癌中的差異表達(dá)進(jìn)行分析;2)利用文獻(xiàn)中報(bào)道的干細(xì)胞指數(shù)m RNAsi數(shù)據(jù),采用WGCNA法揭示KIF15與卵巢癌干細(xì)胞增殖的相關(guān)性;3)免疫組化法檢測(cè)卵巢癌組織芯片中KIF15蛋白的表達(dá),并對(duì)免疫組化染色結(jié)果的評(píng)估;4)使用CCLE腫瘤細(xì)胞數(shù)據(jù)庫獲得45種卵巢癌細(xì)胞株的KIF15 m RNA數(shù)據(jù),了解KIF15 m RNA在卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)譜;5)Real time-PCR檢測(cè)包括卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780、HO8910和Ovcar-3,宮頸癌細(xì)胞株Hela、Siha和C33a,肺腺癌細(xì)胞株A549、胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87等多種腫瘤細(xì)胞株中KIF15 m RNA的表達(dá);6)對(duì)卵巢癌細(xì)胞株進(jìn)行sh RNA慢病毒轉(zhuǎn)染,Real-time PCR和Western Blot法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率;7)Celigo法細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK8法檢測(cè)KIF15敲減后細(xì)胞增殖情況;8)FACS法和Caspase3-7法檢測(cè)KIF15敲減后細(xì)胞凋亡情況;9)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物活體成像,觀察成瘤情況,并對(duì)瘤體進(jìn)行抗KIF15免疫組化染色。3.敲降KIF15卵巢癌細(xì)胞樣本的基因表達(dá)譜檢測(cè)與生物信息學(xué)分析1)對(duì)SKOV3細(xì)胞進(jìn)行Sh RNA慢病毒感染,RT-PCR法驗(yàn)證敲降KIF15的效率;2)從A260/A280比值、RIN值和28s/18s比值三個(gè)指標(biāo),對(duì)總RNA的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估;3)使用3′IVT反應(yīng)法對(duì)基因芯片進(jìn)行檢測(cè);4)從質(zhì)量灰度、權(quán)重、殘差、殘差符號(hào)、RLE、NUSE等多個(gè)方面對(duì)基因芯片質(zhì)量進(jìn)行分析;5)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析;6)運(yùn)用基因富集分析工具Fun Rich、Clue GO和GSEA等不同方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能和信號(hào)通路的富集分析,篩選出凋亡相關(guān)的通路;4.敲降KIF15卵巢癌細(xì)胞樣本的磷酸化蛋白芯片檢測(cè)與生物信息學(xué)分析1)使用磷酸化蛋白芯片對(duì)敲降KIF15的SKOV3細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)原始圖片進(jìn)行掃描和分析;2)依據(jù)m RNA基因表達(dá)譜的分析結(jié)果從磷酸化蛋白芯片的數(shù)據(jù)中篩選出對(duì)應(yīng)的凋亡相關(guān)通路及通路上的分子,構(gòu)建磷酸化蛋白核心網(wǎng)絡(luò);3)分別從m RNA水平和蛋白水平對(duì)三條信號(hào)通路上的分子作重疊性分析,確定三條凋亡相關(guān)通路的交叉分子,驗(yàn)證敲降KIF15是通過調(diào)控三條凋亡相關(guān)通路交聯(lián)形成的網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮促凋亡作用的。結(jié)果1.GEO卵巢癌基因芯片數(shù)據(jù)挖掘、差異表達(dá)基因分析和目的基因篩選結(jié)果1)經(jīng)過多個(gè)指標(biāo)的評(píng)估,認(rèn)為本研究選用的芯片質(zhì)量較為可靠,可以進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析;2)以|Log FC|≥1.5和p<0.05為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn);GSE40595數(shù)據(jù)集包含上調(diào)基因2544個(gè),下調(diào)基因52個(gè);GSE18520數(shù)據(jù)集包含上調(diào)基因582個(gè),下調(diào)基因580個(gè);GSE38666數(shù)據(jù)集包含上調(diào)基因1487個(gè),下調(diào)基因205個(gè);GSE36668數(shù)據(jù)集包含上調(diào)基因2216個(gè),下調(diào)基因108個(gè);4個(gè)數(shù)據(jù)集具有共同上調(diào)差異表達(dá)基因183個(gè),下調(diào)差異表達(dá)基因7個(gè);3)GO分析結(jié)果中,我們選取p值最小的前10位GO分類,其中與增殖相關(guān)的有5個(gè),包括“cell division”,“mitotic nuclear division”,“cell proliferation”,“mitotic sister chromatid segregation”和“chromosome segregation”。在這5個(gè)GO分類的共42個(gè)基因中,存在17個(gè)富集于2個(gè)或2個(gè)以上細(xì)胞增殖相關(guān)GO分類的基因（SAC3D1,NUF2,FAM83D,TPX2,KIF11,ZWINT,CDCA3,NDC80,PTTG1,BUB1B,KIF15,KIF18B,SPAG5,CENPF,CDC20,CDK1 and KIF2C）;4)在Kaplan-Meier Plotter中進(jìn)行生存分析,上述17個(gè)基因中,BUB1B,CDK1,CENPF,FAM83D、TPX2和KIF15等6個(gè)基因均與卵巢癌患者的總生存率（OS,p<0.01）和無進(jìn)展生存率（PFS,p<0.05）呈負(fù)相關(guān);5)在Oncomine數(shù)據(jù)庫中,上述6個(gè)基因除FAM83D外均有權(quán)威數(shù)據(jù)集TCGA支持其m RNA在卵巢癌組織中存在差異表達(dá),因此我們對(duì)其余5個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步分析;6)BUB1B,CDK1,CENPF,TPX2和KIF15 m RNA的表達(dá)均與stage I-II期卵巢癌患者的PFS和OS呈明顯負(fù)相關(guān),且這些基因高表達(dá)于I-II期卵巢癌患者時(shí)較卵巢癌患者總體具有更大的風(fēng)險(xiǎn)比HR值;7)BUB1B、CENPF和KIF15在不同分期的卵巢癌組織中表達(dá)具有顯著性差異,且早期（stage II）表達(dá)高于中晚期（stage III和IV）,這種差異在KIF15（F=5.03,p值=0.00692）高于BUB1B（F=4.7,p值=0.00954）和CENPF（F=3.8,p值=0.0232）。2.KIF15在卵巢癌的表達(dá)驗(yàn)證和體內(nèi)外功能研究結(jié)果1)KIF15 m RNA在人體正常組織器官中,除骨髓外,均為低表達(dá);在卵巢癌組織中存在過表達(dá);2)WGCNA分析揭示了KIF15與卵巢癌細(xì)胞的干性調(diào)控相關(guān),并參與卵巢癌干細(xì)胞的增殖調(diào)控;3)免疫組化染色提示KIF15蛋白僅存在于胞漿中。在90例不同病理類型的卵巢癌組織中,有68例（75.6%）存在KIF15蛋白的高表達(dá),22例（24.4%）低表達(dá),而在10例癌旁組織中,有2例（20%）高表達(dá),其余8例（80%）均為低表達(dá),KIF15蛋白在卵巢癌和癌旁組織中表達(dá)水平的差異具有顯著性（p<0.05）;該組織芯片中除去10例癌旁組織和10例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腺癌,其余80例卵巢癌組織中,包括64例臨床分期為I-II期的樣本,其中KIF15高表達(dá)樣本有49例（76.6%）;其余16例III-IV期樣本中,KIF15高表達(dá)的有11例（68.8%）。在不同的病理類型中,5例透明細(xì)胞癌中有3例KIF15高表達(dá)（60%）),11例粘液性腺癌中有8例高表達(dá)（72.7%）,1例子宮內(nèi)膜樣腺癌為高表達(dá),其余63例漿液性腺癌中,有49例（77.8%）高表達(dá)KIF15在不同的病理類型中,5例透明細(xì)胞癌中有3例KIF15高表達(dá)（60%）),11例粘液性腺癌中有8例高表達(dá)（72.7%）,1例子宮內(nèi)膜樣腺癌為高表達(dá),其余63例漿液性腺癌中,有49例（77.8%）高表達(dá)KIF15。上述結(jié)果提示,KIF15蛋白在早期卵巢癌患者的組織中就有廣泛的高表達(dá),在不同病理類型的卵巢癌中均有廣泛的高表達(dá),沒有明顯的病理類型特異性。在包括婦科常見惡性腫瘤卵巢癌、宮頸癌和肺腺癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的10種腫瘤細(xì)胞株中,SKOV3的KIF15 m RNA表達(dá)最高,HO8910表達(dá)最低,其余8種細(xì)胞株的KIF15 m RNA表達(dá)量都介于這兩種細(xì)胞株之間,本課題將SKOV3和HO8910兩種細(xì)胞株作為我們后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞株;4)Sh RNA慢病毒對(duì)SKOV3的敲減效率為83.1%,HO8910的敲減效率為61.0%,可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要;5)Celigo細(xì)胞計(jì)數(shù):將Day5這個(gè)觀察時(shí)間節(jié)點(diǎn)的SKOV3細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)與Day1的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較,Sh Control的細(xì)胞增殖倍數(shù)是7.63±0.11倍,Sh KIF15組的細(xì)胞增殖倍數(shù)是1.24±0.03倍,組間比較具有顯著性差異(t檢驗(yàn),p值=6.82701×10-8);HO8910細(xì)胞Sh Control的增殖倍數(shù)是5.65±0.19倍,Sh KIF15組的增殖倍數(shù)是1.72±0.07倍,組間比較也具有顯著性差異(t檢驗(yàn),p值=7.10173×10-11),提示敲降KIF15能夠顯著抑制細(xì)胞增殖;6)CCK8法檢測(cè):SKOV3 Sh Control組Day5的OD值是Day1 OD值的4.095±0.0294倍,Sh KIF15組Day5的OD值是Day1 OD值的2.483±0.038倍,HO8910Sh Control組Day5的OD值是Day1 OD值5.11±0.0291倍,Sh KIF15組Day5的OD值是Day1 OD值的2.416±0.0268倍,同種細(xì)胞組間進(jìn)行比較,均具有顯著性差異(t檢驗(yàn),SKOV3 p值=1.11593×10-12,HO8910 p值=3.85188×10-15),進(jìn)一步驗(yàn)證了敲降KIF15能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖;7)FASC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:在慢病毒感染后的72h對(duì)KIF15敲減后SKOV3和HO8910細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè),SKOV3細(xì)胞Sh KIF15組凋亡細(xì)胞的比例是6.4±0.255%,Sh Control組的凋亡細(xì)胞比例是2.98±0.192%,HO8910 Sh KIF15組的凋亡細(xì)胞比例是10.58±0.577%,Sh Control組的凋亡細(xì)胞比例是4.03±0.142%。兩種細(xì)胞Sh KIF15組的凋亡細(xì)胞比例均顯著高于sh Control組(t檢驗(yàn),SKOV3 p值=5×10-5,HO8910 p值=4×10-5),提示敲降KIF15能夠顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡;8)Caspase3-7法檢測(cè)細(xì)胞凋亡:該方法所檢測(cè)的發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)弱程度與Caspase-3/7的活性成正比。在SKOV3和HO8910細(xì)胞中,sh KIF15組的發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度（即Caspase活性的指標(biāo)）均明顯高于Sh Control組（t檢驗(yàn),SKOV3 p值=0.000847283,HO8910 p值=0.000283606）,提示sh KIF15組細(xì)胞凋亡率顯著高于Sh Control組,進(jìn)一步驗(yàn)證了KIF15敲減能夠顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡;9)動(dòng)物活體成像:注射Sh Control慢病毒感染的SKOV3的NC組10只裸鼠注射部位均顯示不同強(qiáng)弱程度的熒光表達(dá),提示皮下均有瘤體形成;而注射Sh KIF15慢病毒感染的SKOV3的KD組10只裸鼠,僅有1只裸鼠注射部位可見熒光信號(hào),其余裸鼠均未見有明顯的熒光信號(hào),提示僅有1只裸鼠皮下有瘤體形成;10)裸鼠皮下成瘤:NC組的瘤體重量是1.482±0.273g,KD組只獲得一枚皮下成瘤樣本,腫瘤是0.061g,NC組的瘤體重量與KD組比具有顯著性差異（t檢驗(yàn),p值=8.442×10-11）,提示KIF15敲減后的SKOV3細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力明顯下降;11)NC組瘤體抗KIF15免疫組化染色呈棕褐色,KD組呈淡黃色,提示在上述荷瘤實(shí)驗(yàn)所獲得的瘤體中,KD組瘤體中的KIF15蛋白表達(dá)明顯低于NC組。3.敲降KIF15的SKOV3細(xì)胞樣本的基因表達(dá)譜檢測(cè)與生物信息學(xué)分析1)總RNA質(zhì)量分析:6個(gè)待測(cè)樣本RNA純度較高,完整性較好,質(zhì)量合格,適合進(jìn)行基因芯片分析;2)基因芯片質(zhì)量分析:本研究中所用芯片和樣本均質(zhì)量可靠,這也是后續(xù)實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)分析可靠性的保證;3)差異表達(dá)基因分析結(jié)果:KD組與NC組進(jìn)行比較,以|FC|≥1.5,p value值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,篩選出表達(dá)上調(diào)基因134個(gè),下調(diào)基因309個(gè);4)Funrich軟件功能和通路富集分析:在上調(diào)基因中,可以觀察到生物過程主要富集于核酸代謝、細(xì)胞通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程,信號(hào)通路主要富集于Er Bb、TRAIL、PI3K/Akt等腫瘤相關(guān)通路和細(xì)胞粘附（Cell adhesion）相關(guān)通路中;在下調(diào)基因中,富集基因比例排在前三位的生物過程分別是蛋白代謝、抗凋亡（Anti-apoptosis）和蛋白定位,且信號(hào)通路富集（p<0.05）的前11條通路中有4條都與凋亡（Apoptosis）相關(guān),依次是凋亡因子介導(dǎo)反應(yīng)（Apoptotic factor-mediated reponse）,SMAC介導(dǎo)的IAP caspase復(fù)合物的解離（SMAC mediated dissociation of IAP:caspase complex）,SMAC結(jié)合IAPs（SMAC binds to IAPs）和SMAC介導(dǎo)凋亡反應(yīng)（SMAC mediated apoptotic response）;5)Clue GO法通路富集分析:Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三條信號(hào)通路是所有通路富集分析結(jié)果中囊括基因最多、最主要的通路,且均與凋亡相關(guān);6)GSEA法富集分析:Apoptosis和TNFαsignaling via NFkb是上述差異基因的凋亡相關(guān)分子特征。4.敲降KIF15的SKOV3細(xì)胞樣本的磷酸化蛋白芯片檢測(cè)與生物信息學(xué)分析1)在蛋白水平上,敲降KIF15引起了Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三條凋亡相關(guān)信號(hào)通路的激活;2)Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三條凋亡相關(guān)信號(hào)通路在m RNA水平和蛋白水平均存在相互交聯(lián),構(gòu)成凋亡相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò);3)三條凋亡相關(guān)通路在m RNA水平上的交叉分子為MAP3K14和TNF,在蛋白水平上的交叉分子為NFk B-p105/p50,Phospho-Ser337、IKK-beta,Phospho-Tyr199、NFk B-p65,Phospho-Ser529和IKK-gamma,Phospho-Ser31,上述蛋白分子均存在顯著的磷酸化,提示功能的激活。結(jié)論KIF15是卵巢癌中具有早期輔助診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的增殖相關(guān)基因。敲降在卵巢癌KIF15能夠在體外顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,在體內(nèi)亦能夠明顯抑制卵巢癌細(xì)胞成瘤。這種作用是敲降KIF15抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的共同結(jié)果。敲降KIF15通過Apoptosis、TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三條凋亡信號(hào)通路相互交聯(lián)形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的激活促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。因而,KIF15有望作為有效的治療靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床。

劉明陽^[10]（2020）在《人參皂苷Rg3抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制研究》文中研究指明研究背景:骨肉瘤是發(fā)源于間充質(zhì)干細(xì)胞的惡性腫瘤。骨肉瘤的發(fā)病年齡呈現(xiàn)雙峰分布,常發(fā)病于青少年或老年人。由于大多數(shù)的骨肉瘤患者在診斷時(shí)時(shí)就有轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移性,故幾乎所有患者在手術(shù)切除的之前或之后都會(huì)接受多種藥物聯(lián)合化療?；颊咄褪芏容^差,且復(fù)發(fā)幾率較高。人參是一種原產(chǎn)于東北亞的草本植物,在東亞地區(qū)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用。作為人參中主要的活性物質(zhì)之一,人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用在近年來越來越引起人們的重視。人參皂苷Rg3的甾體結(jié)構(gòu)使得它可以與細(xì)胞膜、膜結(jié)合離子通道、以及胞內(nèi)和胞外的受體相互作用來改變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平以來發(fā)揮抗腫瘤作用。研究方法:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了人參皂苷Rg3對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、HOS和U2OS增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響和對(duì)細(xì)胞周期作用。我們又進(jìn)一步選擇MG-63細(xì)胞作為研究對(duì)象,應(yīng)用western blot、定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)、小干擾RNA等實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)一步探究人參皂苷Rg3誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、凋亡以及細(xì)胞周期阻滯的具體作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3以劑量依賴的方式抑制三種骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、HOS以及U2OS的增殖。流式細(xì)胞術(shù)則驗(yàn)證人參皂苷Rg3的促三種肉瘤細(xì)胞系的凋亡。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了人參皂苷Rg3可以抑制三種骨肉瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲。WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)人參皂苷Rg3處理的的骨肉瘤細(xì)胞MG-63中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平與未加藥的對(duì)照組相比有顯著性地升高。Western blot和定量PCR證實(shí)人參皂苷Rg3組caspase-3的基因和蛋白表達(dá)水平增加,流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)人參皂苷Rg3組細(xì)胞凋亡水平升高。而當(dāng)我們使用代表性自噬通路抑制劑3-MA和人參皂苷Rg3同時(shí)作用于MG-63細(xì)胞時(shí),WB實(shí)驗(yàn)和定量PCR顯示3-MA可以顯著逆轉(zhuǎn)由人參皂苷Rg3導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的變化。而用小干擾RNA技術(shù)沉默LC3基因可以顯著逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rg3導(dǎo)致的MG-63細(xì)胞的凋亡和遷移侵襲受限。WB實(shí)驗(yàn)顯示人參皂苷Rg3可以使p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTORC1/mTORC1表達(dá)水平降低,而LC3/β-actin的表達(dá)水平增高,而加入PI3K激動(dòng)劑IGF-1則可以逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rg3導(dǎo)致的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTORC1/mTORC1和LC3/β-actin表達(dá)水平的變化。流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)經(jīng)人參皂苷Rg3處理的骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、HOS、U2OS處于G0/G1的細(xì)胞的比例上升,處于S期的細(xì)胞比例下降。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人參皂苷Rg3處理的MG-63細(xì)胞中cyclinA、cyclinB的表達(dá)未見明顯改變,而cyclinD1、CDK-4以及CDK-6的表達(dá)量顯著下降,上游調(diào)節(jié)因子p53、p21的表達(dá)量顯著上升。用小干擾RNA技術(shù)沉默p53基因可以顯著逆轉(zhuǎn)人參皂苷Rg3導(dǎo)致的周期阻滯作用和p21、cyclinD1、CDK4、CDK6表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:人參皂苷Rg3通過抑制PI3K/Akt/mTORC1,降低自噬抑制因子mTORC1的表達(dá),引發(fā)細(xì)胞的自噬,LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平的增高,繼而引起凋亡基因caspase-3轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的升高并最終導(dǎo)致MG-63細(xì)胞的凋亡。同時(shí),人參皂苷Rg3可以通過激活p53/p21來抑制G1期向S期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵性蛋白cyclinD1和CDK-4、CDK-6的表達(dá)和活性使骨肉瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期。

二、紫杉醇誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及對(duì)磷酸化Bcl-2的影響（論文開題報(bào)告）

（1）論文研究背景及目的

此處內(nèi)容要求：

首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。

寫法范例：

本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。

（2）本文研究方法

調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。

觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。

實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。

文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。

實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。

定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。

定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。

跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。

功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。

模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。

三、紫杉醇誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及對(duì)磷酸化Bcl-2的影響（論文提綱范文）

（1）雞貧血病毒VP3基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞的作用研究（論文提綱范文）

（2）DYNLT1調(diào)控細(xì)胞周期影響乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究（論文提綱范文）

（3）干擾線粒體動(dòng)力學(xué)增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)替莫唑胺化療敏感性的機(jī)制研究（論文提綱范文）

（4）三七總皂苷對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響（論文提綱范文）

（5）重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性評(píng)價(jià)及重樓皂苷Ⅰ的肝毒性機(jī)制探究（論文提綱范文）

（6）初步探究菜薊苦素抑制黑色素瘤細(xì)胞生長的作用及機(jī)制（論文提綱范文）

（7）絞股藍(lán)皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究（論文提綱范文）

（8）PEITC調(diào)控結(jié)腸癌凋亡的機(jī)制研究及安全性評(píng)估（論文提綱范文）

（9）KIF15對(duì)卵巢癌增殖和凋亡的影響及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析（論文提綱范文）

（10）人參皂苷Rg3抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制研究（論文提綱范文）

四、紫杉醇誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及對(duì)磷酸化Bcl-2的影響（論文參考文獻(xiàn)）

• [1]雞貧血病毒VP3基因?qū)θ橄侔└杉?xì)胞的作用研究[D]. 李文杰. 廣西大學(xué), 2021(01)
• [2]DYNLT1調(diào)控細(xì)胞周期影響乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究[D]. 崔璐璐. 廣州醫(yī)科大學(xué), 2021
• [3]干擾線粒體動(dòng)力學(xué)增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)替莫唑胺化療敏感性的機(jī)制研究[D]. 王楠. 吉林大學(xué), 2021(01)
• [4]三七總皂苷對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響[D]. 劉景晨. 大理大學(xué), 2021(09)
• [5]重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性評(píng)價(jià)及重樓皂苷Ⅰ的肝毒性機(jī)制探究[D]. 王文平. 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2021(02)
• [6]初步探究菜薊苦素抑制黑色素瘤細(xì)胞生長的作用及機(jī)制[D]. 曾衛(wèi)平. 汕頭大學(xué), 2021(02)
• [7]絞股藍(lán)皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究[D]. 祖瑪麗. 中央民族大學(xué), 2021(12)
• [8]PEITC調(diào)控結(jié)腸癌凋亡的機(jī)制研究及安全性評(píng)估[D]. 黃莉. 南方醫(yī)科大學(xué), 2020(06)
• [9]KIF15對(duì)卵巢癌增殖和凋亡的影響及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析[D]. 孫欣慰. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué), 2020(07)
• [10]人參皂苷Rg3抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖及其分子機(jī)制研究[D]. 劉明陽. 吉林大學(xué), 2020(01)

標(biāo)簽：乳腺癌論文;  細(xì)胞凋亡論文;  線粒體論文;  視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤論文;  細(xì)胞毒性論文;