一、慢性乙型肝炎病人樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究（論文文獻(xiàn)綜述）
閆丹丹[1]（2016）在《β-葡聚糖對慢性乙型肝炎患者免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的:乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是影響人類身體健康的主要病毒之一。HBV在機(jī)體內(nèi)持續(xù)感染進(jìn)而導(dǎo)致宿主發(fā)生慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）,慢性乙型肝炎惡化,成為肝硬化和原發(fā)性肝癌,因此,慢性乙型肝炎的防止和治療成為當(dāng)今一項(xiàng)重要的醫(yī)學(xué)課題。外周血是免疫應(yīng)答的重要場所,其所含的所有免疫細(xì)胞中除巨噬細(xì)胞具有直接吞噬、清除的作用外,外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）產(chǎn)生的如干擾素、IL-12等免疫調(diào)節(jié)因子在免疫調(diào)節(jié)中也扮演重要角色。樹突狀細(xì)胞是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞,在激活初始T細(xì)胞進(jìn)而激發(fā)初始免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。葡聚糖有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和調(diào)節(jié)代謝等作用,是一種免疫活性最強(qiáng)并且最容易被人體吸收的非特異性的免疫調(diào)節(jié)劑。本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)CHB患者外周血DC細(xì)胞及PBMC細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測β-葡聚糖對PBMC及DC細(xì)胞表型的影響,探討在CHB患者發(fā)病機(jī)制中,β-葡聚糖在免疫調(diào)節(jié)中的作用,為開展慢性乙型肝炎的細(xì)胞免疫治療方法和開發(fā)新型的抗CHB疫苗提供重要的科學(xué)依據(jù)。方法:1采集10名健康對照組外周血,經(jīng)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,分別使用有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做DC細(xì)胞培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞表面CD11c、CD86的表達(dá)水平。2收集在石家莊市第五醫(yī)院就診的CHB患者30例,健康對照組12例,采集外周血8 mL,使用EDTA抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,分別做DC細(xì)胞和PBMC細(xì)胞培養(yǎng),分組成四組,分別為未刺激組,LPS組和β-葡聚糖組。在培養(yǎng)的過程中用倒置顯微鏡間斷觀察細(xì)胞的大小、形態(tài)及生長情況。3使用APC-CD11c、PE-Cy7-CD86、FITC-CD80抗體（各2μL）標(biāo)記DC細(xì)胞;使用APC-CD11c、PE-Cy7-CD3、FITC-CD4、PE-CD8a和Percp-CD56抗體（各2μL）標(biāo)記PBMC細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測各細(xì)胞的表達(dá)量。4匯總整理所有數(shù)據(jù)、并應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1、有血清培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)DC細(xì)胞,細(xì)胞在形態(tài)上基本無差別,在數(shù)量上差別不明顯,流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞表面CD11c、CD86,兩組比較CD11c表達(dá)有差異,有血清培養(yǎng)基組略高于無血清培養(yǎng)基組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,CD86+表達(dá)無差異（P>0.05）。2、DC細(xì)胞培養(yǎng)與刺激中,使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞,慢性乙型肝炎患者DC細(xì)胞與健康對照組DC細(xì)胞相比較,密度較低;使用LPS、β-葡聚糖刺激24小時(shí)后,與未刺激組比較,兩組細(xì)胞生長旺盛,胞體較大,具有典型的樹枝狀凸起;LPS組細(xì)胞成熟較β-葡聚糖組細(xì)胞早。3、流式細(xì)胞儀檢測慢性乙型肝炎患者DC細(xì)胞與健康對照組DC細(xì)胞表面CD11c、CD80、CD86,結(jié)果顯示,健康對照組與慢性乙型肝炎患者未刺激組、LPS組和β-葡聚糖組的外周血DC細(xì)胞表面CD11c+的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;CD80+、CD86+的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,健康對照組CD80+、CD86+的表達(dá)均高于HBV患者;且給予不同處理后,未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組兩兩比較,CD80+、CD86+的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;不同刺激因子CD80+、CD86+的表達(dá)量按從低到高的順序排列依次為未刺激組<β-葡聚糖組<LPS組。4、PBMC細(xì)胞培養(yǎng)與刺激中,使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞,加入刺激培養(yǎng)2 d后,未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組細(xì)胞在形態(tài)上無區(qū)別。5、流式細(xì)胞儀檢測各組PBMC細(xì)胞中CD11c+的表達(dá),對照組與病例組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組兩兩比較,CD11c+的表達(dá)差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。病例組與對照組比較,CD3+CD4+的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;慢乙肝患者、健康對照組中未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組兩兩比較,CD3+CD4+的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,CD3+CD4+的表達(dá)量依次為未刺激組<β-葡聚糖組<LPS組。CD3+CD8a+的表達(dá),健康對照組與患者兩組比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,健康對照組未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組均大于患者未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組,慢乙肝患者、健康對照組中未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組兩兩比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,CD3+CD8a+的表達(dá)量依次為未刺激組<β-葡聚糖組<LPS組。CD3-CD56+的表達(dá)健康對照組與患者兩組比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,健康對照組未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組均大于患者未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組;慢乙肝患者、健康對照組未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組兩兩比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,CD3-CD56+的表達(dá)量依次為未刺激組<β-葡聚糖組<LPS組。CD3+CD56+的表達(dá),健康對照組與患者兩組比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;健康對照組未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組均大于患者未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組,慢乙肝患者、健康對照組中未刺激組、LPS組、β-葡聚糖組兩兩比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,CD3+CD56+的表達(dá)量依次為未刺激組<β-葡聚糖組<LPS組。結(jié)論:1、慢性乙型肝炎患者免疫功能低下與DC細(xì)胞成熟狀態(tài)明顯低下密切相關(guān),LPS和β-葡聚糖刺激可促進(jìn)DC增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞成熟。2、DC細(xì)胞在LPS和β-葡聚糖的刺激下,DCs成熟度基本無變化,抗原提呈能力增強(qiáng)。3、慢性乙型肝炎患者體內(nèi)Th細(xì)胞的數(shù)量與健康對照組無明顯差異,而慢性乙型肝炎患者體內(nèi)CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞的數(shù)量均小于健康對照組,從而造成慢乙肝患者的免疫耐受。4、LPS、β-葡聚糖刺激PBMC細(xì)胞后,CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞表達(dá)量增加,NKT細(xì)胞減少。5、β-葡聚糖具有免疫調(diào)節(jié)功能,有助于改善慢性乙型肝炎患者的免疫耐受狀態(tài),為慢性乙型肝炎的免疫治療提供新思路。
國家中醫(yī)藥管理局國家中醫(yī)臨床研究基地辦公室[2]（2013）在《我國16個(gè)重點(diǎn)病種的國家中醫(yī)臨床研究基地論文統(tǒng)計(jì)表（2008年～2013年）》文中認(rèn)為
何芳[3]（2009）在《HBV慢性感染不同狀態(tài)下肝郁脾虛與肝膽濕熱證患者外周血樹突狀細(xì)胞及其功能研究》文中提出第一部分健康人外周血樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定目的：建立樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DCs）體外培養(yǎng)的方法。方法：取健康人新鮮外周血,經(jīng)密度梯度離心法分離,獲得單個(gè)核細(xì)胞,取貼壁細(xì)胞在含重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）1000U/ml.重組人白細(xì)胞介素4（rh1L-4）500U/ml完全培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs,用倒置顯微鏡觀察其體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)特征,透射電鏡分析DCs細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),流式細(xì)胞儀檢測其表型分子的表達(dá),并對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果：經(jīng)本實(shí)驗(yàn)體系從外周血PBMCs可誘導(dǎo)DCs生成量為每20ml約（1.2～3.6×106）,透射電鏡證實(shí)呈典型的DCs細(xì)胞形態(tài)學(xué),用流式細(xì)胞儀檢測DCs的表型分子的表達(dá)分別為FITC-CD1a49.52±5.11％、PE-HLA-DR 91.19±4.29％、FITC-CD8059.42±7.05％、PE-CD86 86.21±2.39％。結(jié)論：利用rhGM-CSF和rhIL-4可以從外周血中擴(kuò)增出大量DCs,為DCs的深入研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。第二部分HBV慢性感染不同狀態(tài)下肝郁脾虛與肝膽濕熱證患者外周血樹突狀細(xì)胞及其功能研究目的：觀察HBV慢性感染不同狀態(tài)肝郁脾虛證和肝膽濕熱證患者外周血樹突狀細(xì)胞的功能變化,了解慢性HBV感染兩證型的免疫表達(dá)特點(diǎn),為中醫(yī)辨證提供客觀化依據(jù),并為進(jìn)一步認(rèn)識HBV感染慢性化本虛實(shí)質(zhì)提供參考。方法：本研究分別從HBV慢性感染不同狀態(tài)經(jīng)辯證屬于肝郁脾虛或肝膽濕熱證的患者外周血來源的PBMCs進(jìn)行體外培養(yǎng),以倒置顯微鏡和電鏡觀察DCs外部形態(tài)和超微結(jié)構(gòu),應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測DCs的表面分子HLA-DR、CD80、CD86、CD1a的表達(dá),并用ELISA試劑盒檢測DCs上清液中IL-12分泌水平,采用MTT法檢測其同種異體混合淋巴細(xì)胞增殖的能力以比較DCs在慢性HBV感染不同階段兩證型中的功能特點(diǎn),并以10例健康人為對照組。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,分析兩證型間DCs各指標(biāo)的差異。結(jié)果：（1）形態(tài)學(xué)觀察：從慢性HBV感染患者及正常人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞,用GM-CSF+IL-4細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng),均可獲得典型的樹突狀細(xì)胞,病人和正常人在細(xì)胞形態(tài)上無明顯差別：（2）慢性HBV感染者DCs的表面分子、細(xì)胞因子IL-12的分泌及誘導(dǎo)MLR的能力明顯低于正常人（P<0.05）,尤以慢性HBV攜帶者降低更明顯；（3）在免疫耐受狀態(tài)（即慢性HBV攜帶者）下,證屬肝郁脾虛者的DCs的表面分子CD86 （66.83±6.53％）、CD80（15.19±3.37％）、HLA-DR（78.40±6.68%）表達(dá)均較肝膽濕熱證CD86（79.35±3.15）. CD80（25.69±6.13％）. HLA-DR（85.70±7.34％）低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,而CD1a差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；證屬肝郁脾虛者DCs分泌IL-12的含量及DCs刺激T細(xì)胞的反應(yīng)能力均較肝膽濕熱證低,但兩證差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在免疫清除狀態(tài)（即慢性乙型肝炎）下,證屬肝郁脾虛者的DCs的表面分子CD86（81.22±3.39％）.CD80（30.56±6.55％）.CD1a（45.19±6.99％）、HLA-DR（86.26±4.91％）均較肝膽濕熱證CD86（87.04±2.70％）.CD80（36.60±11.79％）、CD1a（47.52±6.17％）、HLA-DR（92.66±2.51％）低,但只有CD86、HLA-DR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,而CD80、CD1a差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。證屬肝郁脾虛者DCs分泌IL-12的含量及DCs刺激T細(xì)胞的反應(yīng)能力均較肝膽濕熱證低,且兩證差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（4）在免疫耐受期和免疫清除期同屬肝郁脾虛證其DCs表面分子的表達(dá)分別是CD86（66.83±6.53％）、CD80（15.19±3.3％）、CD1a（45.43±7.56％）、HLADR （78.40±6.68％）;CD86（81.22±3.39％）.CD80（30.56±6.55％）.CD1a（45.19±6.99％）、HLA-DR（86.26±4.91％）,兩者比較CD86、CD80. HLADR差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在免疫耐受期和免疫清除期同屬肝膽濕熱證其DCs的表達(dá)分別是CD86（79.35±3.14％）、CD80（25.69±6.13％）、CD1a（46.94±7.02％）、HLADR （85.70±7.34％）；CD86（87.04±2.70％）、CD80（36.60±11.79％）、CD1a（47.52±6.17％）、HLA-DR（92.66±2.51％）,兩者比較CD86、CD80、HLADR差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在辯證同屬肝郁脾虛證在免疫耐受期患者DCs分泌IL-12和DCs刺激同種異體T細(xì)胞反應(yīng)能力較免疫清除期低,且兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,而辯證同屬肝膽濕熱證其免疫耐受期患者DCs分泌IL-12和DCs刺激同種異體T細(xì)胞反應(yīng)能力較免疫清除期低,且兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：慢性HBV感染兩證型均表現(xiàn)為DCs存在表型缺失和功能下調(diào),提示其細(xì)胞免疫功能均降低,肝郁脾虛型細(xì)胞免疫功能降低更明顯,從而難于清除HBV,更易于HBV慢性化,因此,DCs的表型及功能檢測在疾病的同一階段可為中醫(yī)辯證分型提供客觀化指標(biāo),反映兩證型免疫表達(dá)的特點(diǎn)及免疫學(xué)內(nèi)涵,以期更好地為臨床辨治服務(wù)；但從中醫(yī)辯證角度來看,在HBV感染不同狀態(tài)同屬肝郁脾虛證或肝膽濕熱證,其免疫學(xué)特點(diǎn)是否真正存在顯著性差異值得進(jìn)一步研究,以期更好認(rèn)識乙肝證型的實(shí)質(zhì)。
石慶鳳[4]（2008）在《自體樹突狀細(xì)胞疫苗治療乙型肝炎病毒感染者的免疫機(jī)制研究》文中研究指明第一章HBcAg/HBeAg對人樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響目的在已研究的HBsAg對體外培養(yǎng)的人自體樹突狀細(xì)胞治療性疫苗表型和功能的影響基礎(chǔ)上,研究HBcAg/HBeAg對體外培養(yǎng)的人自體樹突狀細(xì)胞治療性疫苗表型和功能的影響。方法1、取20例健康志愿者外周靜脈血,肝素抗凝,以密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞。以GM-CSF,IL-4刺激,常規(guī)培養(yǎng)獲得DC。再分別加入TNF-α、HBcAg+TNF-α、HBeAg+TNF-α刺激后,依次分組為:mDC組、HBcAg+mDC組、HBeAg+mDC組。2、在培養(yǎng)第10天檢測各組樹突狀細(xì)胞的表型以及分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12p70的變化。3、mDC組、HBcAg+mDC組、HBeAg+mDC組樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的自體懸浮淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng):在培養(yǎng)第7天與自體懸浮淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)5天,在培養(yǎng)結(jié)束前12h加入1μCi/孔3H甲基胸腺嘧啶,用液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的自體懸浮淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)（cpm值）。4、mDC組、HBcAg+mDC組、HBeAg+mDC組樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒活性:以HepG2為靶細(xì)胞,在第13天以乳酸脫氫酶法,按CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書,檢測樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞毒活性。結(jié)果1、分別加入TNF-α、HBcAg+TNF-α、HBeAg+TNF-α刺激后,在光鏡下各組均可見大量具有樹突樣突起的懸浮細(xì)胞,成簇分布。觀察發(fā)現(xiàn)HBcAg+mDC組的樹突狀細(xì)胞聚集最早最明顯,凋亡較多,3天后細(xì)胞數(shù)量明顯減少。2、觀察各組中樹突狀細(xì)胞CD83、CD86、HLA-ABC的水平: HBcAg+mDC組和HBeAg+mDC組高于mDC組（P<0.01）; HBcAg+mDC組高于HBeAg+mDC組（P<0.01）。3、HBcAg和HBeAg可顯著增強(qiáng)mDC分泌IFN-γ、IL-12p70的量（P<0.01）。IL-12p70的分泌量HBcAg+mDC組低于HBeAg+mDC組。4、HBcAg+mDC、HBeAg+mDC、mDC組樹突狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)的混合淋巴細(xì)胞增殖和殺傷效應(yīng)均較顯著,與HBcAg、HBeAg、自體懸浮淋巴細(xì)胞增殖和殺傷效應(yīng)相比有顯著性差異（P<0.01）。HBcAg+mDC、HBeAg+mDC兩組與mDC誘導(dǎo)組之間的增殖和殺傷效應(yīng)也具有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)論1、樹突狀細(xì)胞作為治療性疫苗在體外培養(yǎng),受TNF-α、HBcAg+TNF-α、HBeAg+TNF-α刺激后會有不同程度的分化、成熟或凋亡。2、隨著樹突狀細(xì)胞的成熟,樹突狀細(xì)胞表達(dá)CD83、CD86、HLA-ABC的水平相應(yīng)有不同程度的提高。3、隨著樹突狀細(xì)胞的成熟,其分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12p70的量相應(yīng)有不同程度的增加。4、隨著樹突狀細(xì)胞的成熟,其體外誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖及殺傷功能均有不同程度的增強(qiáng)。第二章IL-10,TNF-α對慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞的影響目的研究IL-10和TNF-α對慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞的分化與功能的影響。方法1、健康志愿者和慢性乙型肝炎患者各15例,取外周靜脈血,分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）,常規(guī)培養(yǎng)獲得DC組。2、培養(yǎng)期間用IL-10刺激的為imDC組;TNF-α刺激的為mDC組;先后用IL-10,TNF-α刺激的為imDC+TNF-α組。3、各組收獲細(xì)胞后分別檢測反映DC成熟度的各種分子及其體外誘導(dǎo)的自體淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)。結(jié)果1、源于慢性乙型肝炎患者的常規(guī)培養(yǎng)的DC在數(shù)量,HLA-A, B, C、HLA-DR、CD86表達(dá),IL-12p70分泌及其誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng),均低于健康者組（P<0.01）。2、mDC組:源于慢性乙型肝炎患者的mDC與健康者mDC表達(dá)的HLA-DR、HLA-A, B, C、CD86比較無顯著性差異;兩組mDC誘導(dǎo)自體淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)和分泌的IL-12p70均明顯增加,比較有顯著性差異（P<0.01）。3、imDC組:兩組imDC的HLA-A, B, C、HLA-DR、CD86較mDC組低表達(dá),分泌的IL-12p70極低,不能強(qiáng)烈激活誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng),與常規(guī)培養(yǎng)DC組比較有顯著性差異（P<0.01）。4、imDC+ TNF-α組:加入TNF-α刺激后HLA-A, B, C、HLA-DR、CD86仍低表達(dá),分泌的IL-12p70和淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)仍較低。5、健康對照組、慢性乙型肝炎組的上清夜中IL-21的ELISA檢測值均較低,無顯著性差異。結(jié)論1、慢性乙型肝炎患者DC經(jīng)TNF-α刺激后可同健康者一樣高表達(dá)HLA-DR,HLA-A, B, C,CD86,但分泌IL-12p70仍較低,考慮為等量采集靜脈血經(jīng)相同方法培養(yǎng)后慢性乙型肝炎組在懸浮細(xì)胞數(shù)量上明顯少于健康對照組所致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明慢性乙型肝炎患者DC的狀態(tài)雖然存在缺陷但在TNF-α的刺激下仍可向成熟分化。2、使用IL-10抑制DC的發(fā)育成熟結(jié)果表明慢性乙型肝炎患者DC的數(shù)量,表達(dá)HLA-DR、HLA-A, B, C、CD86,誘導(dǎo)的自體淋巴細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子與未用IL-10相比有一定差距。3、IL-10抑制的樹突狀細(xì)胞再加入TNF-α仍能保持不成熟的狀態(tài),其表面共刺激分子在接受TNF-α刺激后仍低表達(dá),但是否能在致病微生物等致病抗原的刺激下仍能保持抑制狀態(tài)還有待進(jìn)一步研究。4、IL-10可有效抑制DC的成熟,在慢性乙型肝炎患者和健康者兩組間無明顯差異,說明慢性乙型肝炎患者的DC和健康者一樣可進(jìn)行調(diào)控,這是所有HBV感染者進(jìn)行免疫治療的基礎(chǔ)。
黃振宇[5]（2007）在《HBV感染不同狀態(tài)下樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DCs）是一種最具潛能的抗原提呈細(xì)胞,其對抗原進(jìn)行捕獲、加工,處理后提呈給組織相容性復(fù)合物（majorhistocompability complex,MHC）-Ⅰ、Ⅱ類分子,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖,在增強(qiáng)或調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起著決定性作用。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染者DCs的相關(guān)研究目前愈來愈受到眾多學(xué)者的關(guān)注。本課題擬研究慢性乙型肝炎不同感染階段外周血來源DCs的功能特點(diǎn),比較DCs中HBV不同滴度時(shí)DCs的功能差異,并研究CpG ODN能否促進(jìn)DCs成熟,增強(qiáng)DCs功能,從而進(jìn)一步揭示HBV感染不同狀態(tài)下DCs的免疫功能。方法本研究對10例慢性乙型肝炎患者、10例HBV攜帶者及10例健康對照者外周血來源DCs進(jìn)行體外培養(yǎng),應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測DCs的表面分子HLA-DR、CD80、CD86的表達(dá),ELISA檢測DCs培養(yǎng)上清IL-12水平,以比較DCs在慢性乙型肝炎不同感染階段的功能特點(diǎn);同時(shí)運(yùn)用熒光定量PCR的方法,對12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性患者及10例血清HBV-DNA陰性患者外周血來源DCs內(nèi)的HBV-DNA進(jìn)行了檢測,并比較DCs中HBV不同滴度時(shí)DCs的功能差異;通過予以含非甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸鏈（unmethylated CpG motif containingoligodeoxynucleotides,CpG ODN）干預(yù),研究CpG ODN能否有效促進(jìn)DCs成熟,增強(qiáng)DCs功能。結(jié)果（1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,體外用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（加GM-CSF和IL-4）誘導(dǎo)人的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral bloodmononuclear cells,PBMCs）來培養(yǎng)DCs,24小時(shí)后可見貼壁單核細(xì)胞聚集成大小不等葡萄串狀,粘附于培養(yǎng)板底,第3天可見這部分細(xì)胞體積增大,第4天可見部分細(xì)胞懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液,第5天可見這部分細(xì)胞數(shù)目增多,部分細(xì)胞出現(xiàn)許多毛刺。第7天培養(yǎng)液中飄浮著大量有明顯樹突狀的大個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)。將培養(yǎng)7天的DCs收集在透射電鏡下觀察,每個(gè)視野充滿DCs,可見細(xì)胞體積較大,細(xì)胞表面突起比較豐富,胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,線粒體結(jié)構(gòu)較清楚,溶酶體豐富,核大而圓,核膜清晰,染色質(zhì)分布較均勻。慢性乙型肝炎患者及HBV攜帶者HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率較正常對照組普遍降低,但HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)水平在慢性乙型肝炎患者及HBV攜帶者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA檢測培養(yǎng)第7天DCs上清IL-12水平,發(fā)現(xiàn)在DCs培養(yǎng)上清液中,IL-12的表達(dá)水平在慢性乙型肝炎患者及攜帶者明顯低于正常人,而慢性乙型肝炎患者與攜帶者之間則無明顯差異。（2）對12例慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性患者及10例血清HBV-DNA陰性患者外周血來源DCs內(nèi)的HBV-DNA進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn):12例血清HBV-DNA陽性患者,其中有7例其DCs內(nèi)可檢測到HBV-DNA,5例DCs內(nèi)未檢出HBV-DNA,DCs內(nèi)HBV-DNA檢出率為58.3%。流式細(xì)胞儀分析顯示,正常人的HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)陽性率均在58%以上,而慢性乙型肝炎血清HBV-DNA陽性組及血清HBV-DNA陰性組HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率較正常人組普遍降低,尤以血清HBV-DNA陽性組下降更為明顯。7例DCs HBV-DNA陽性組及15例DCs HBV-DNA陰性組HLA-DR、CD80和CD86的表達(dá)率亦較正常人組普遍降低,尤以DCs HBV-DNA陽性組下降更為明顯。DCs培養(yǎng)上清IL-12水平在血清HBV-DNA陽性組明顯低于血清HBV-DNA陰性組及正常人組,血清HBV-DNA陽性組又低于血清HBV-DNA陰性組。而IL-12的表達(dá)水平在DCs HBV-DNA陽性組明顯低于DCs HBV-DNA陰性組及正常人組,DCs HBV-DNA陰性組又低于正常人組。相關(guān)分析顯示,DCs表面分子的表達(dá)及DCs分泌IL-12水平與血清及DCs HBV載量均呈顯著負(fù)相關(guān)。（3）將培養(yǎng)第6天的DCs,加入CpG ODN繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后,透射電鏡觀察CpG ODN刺激后DCs與完全培養(yǎng)基對照組DCs相比,其表面的突起豐富、增粗,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多,空泡減少甚至消失。用流式細(xì)胞儀分析顯示,CpG ODN刺激組CD80、CD86及HLA-DR的表達(dá)陽性率在慢性乙型肝炎組、HBV攜帶者組及正常人組均完全培養(yǎng)基對照組明顯升高。完全培養(yǎng)基對照組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽性率在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組及攜帶者組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽性率較正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。CpG ODN刺激組HLA-DR、CD86、CD80的表達(dá)陽性率在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組HLA-DR、CD86的表達(dá)陽性率較攜帶者組及正常人組明顯下降,但攜帶者組和正常人組之間比較卻無顯著性差異;慢性乙型肝炎組及攜帶者組CD80的表達(dá)陽性率正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。ELISA檢測CpG ODN刺激組及完全培養(yǎng)基對照組IL-12的水平,發(fā)現(xiàn)CpG ODN刺激組DCs分泌IL-12的水平無論在慢性肝炎組、攜帶者組及正常人組均較完全培養(yǎng)基對照組明顯升高。完全培養(yǎng)基對照組及CpG ODN刺激組DCs分泌IL-12水平在慢性乙型肝炎組、攜帶者組及正常人組之間比較發(fā)現(xiàn):慢性乙型肝炎組及攜帶者組DCs分泌IL-12水平較正常人組明顯下降,但慢性乙型肝炎組和攜帶者組之間比較卻無顯著性差異。結(jié)論（1）慢性乙型肝炎患者及無癥狀攜帶者均存在著DCs表型和功能的缺失。（2）慢性乙肝患者外周血DCs亦能受到HBV的感染,而且DCs的表型以及分泌IL-12能力與血清及DCs內(nèi)HBV載量均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。（3）CpG ODN能夠明顯促進(jìn)慢性乙型肝炎患者外周血DCs成熟,為CpG ODN成為治療慢性乙型肝炎的一種新方法提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
蓋麗麗[6]（2007）在《小柴胡片對慢性乙肝患者外周血樹突狀細(xì)胞抗原遞呈的影響》文中認(rèn)為研究目的1．了解正常人與慢乙肝患者外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（dendritic cell DC）是否具有功能上的差異，探討慢乙肝患者體內(nèi)HBV持續(xù)感染的機(jī)制。2．從細(xì)胞免疫學(xué)角度評價(jià)小柴胡片治療前后慢乙肝病人外周血DC的抗原提呈功能的變化，并探討打破HBV持續(xù)感染狀態(tài)可能辦法。3．探索HBcAg負(fù)載對DC抗原提呈能力及刺激CTL特異性活化的影響，從而嘗試將HBcAg負(fù)載作為刺激慢乙肝病人DC功能恢復(fù)或上調(diào)的新辦法。研究方法1．慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)：收集臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)良好臨床應(yīng)答的5例患者的肝素抗凝外周血，用密度梯度離心法分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)／孔，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁培養(yǎng)3小時(shí)后，獲得單核細(xì)胞，再添加rhGM-CSF和rhIL-4終濃度分別達(dá)到100ng／ml和500U／ml，置37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，至第7天添加rhTNF-α，使其終濃度達(dá)到60ng／ml，繼續(xù)培養(yǎng)至第11天，熒光顯微鏡下采集成熟DC的圖像。收集培養(yǎng)的DC，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面標(biāo)志CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)水平，并將DC與自體T淋巴細(xì)胞進(jìn)行自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（AMLR）鑒定DC刺激T細(xì)胞增殖的能力。2．HBcAg負(fù)載對DC刺激細(xì)胞增殖能力和CTL分泌IFN-γ水平的影響：我們引入了具有極強(qiáng)免疫原性的HBcAg刺激培養(yǎng)治療后的慢乙肝患者DC，通過流式細(xì)胞術(shù)和自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（AMLR）分析負(fù)載前后DC表面標(biāo)志表達(dá)水平和刺激淋巴細(xì)胞增殖能力的變化，再利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT），分析抗原負(fù)載后DC對于CTL的活化，特別是IFN-γ的分泌水平的變化，考察慢性乙型肝炎患者治療后臨床指標(biāo)的改善與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫功能之間是否存在聯(lián)系。3．HBcAg負(fù)載的DC對CTL應(yīng)答的影響：CTL應(yīng)答的強(qiáng)弱可以通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)進(jìn)行判定。我們將治療后的慢乙肝患者DC用HBcAg負(fù)載后作為刺激細(xì)胞與自體的外周血淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)為效應(yīng)細(xì)胞，以人肝癌細(xì)胞系HepG2和轉(zhuǎn)染了HBV病毒的HepG2.2.1.5細(xì)胞作為靶細(xì)胞，運(yùn)用乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)（LDH釋放試驗(yàn)）檢測CTL對兩種靶細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)而評價(jià)HBcAg負(fù)載DC對CTL應(yīng)答能力的作用。研究結(jié)果1．成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出5例正常人及5例獲得臨床應(yīng)答的慢乙肝患者外周血單核來源DC，并進(jìn)行了鑒定：培養(yǎng)11天后，在熒光顯微鏡下可以看到細(xì)胞體積明顯增大，胞體可見大量毛發(fā)樣突起，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈半懸浮生長狀態(tài)，細(xì)胞增殖不明顯，具備典型DC的形態(tài)學(xué)特征；正常人群與CHB患者的外周血DC在分子表面標(biāo)志CD1a、CD80、CD83、CD86的表達(dá)分別為（49.8±3.3）％VS（40.5±2.9）％、（75.0±1.2）％VS（43.3±1.9）％、（21.3±2.8）％VS（6.8±1.4）％、（56.0±1.1）％VS（72.3±3.0）％，兩組間比較有顯著差異（P＜0.01）；而HLA-DR則分別為（95.7±1.2）％和（96.7±1.0）％，兩組間比較無顯著差異（P=0.120）；正常人和CHB患者DC與自體T細(xì)胞在1：60混合比的刺激指數(shù)SI分別為（2.20±0.14）VS（1.84±0.03），兩者比較有顯著差異（t=5.722，P=0.000）2．CHB患者接受治療前后CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)率分別為（40.5±2.9）％VS（41.1±2.6）％、（43.3±1.9）％VS（44.1±2.0）％、（6.8±1.4）％VS（8.6±0.8）％、（72.3±3.0）％VS（73.1±2.3）％和（96.7±1.0）％VS（97.1±0.7）％，治療前后無顯著差異（P=0.748，0.488，0.122，0.543，0.503）；經(jīng)HBcAg刺激的DC與無HBcAg刺激的DC相比，兩者的分子表面標(biāo)志表達(dá)率也基本無太大的改變，但其中的CD83的表達(dá)分別為（11.0±1.2）％和（8.6±0.8）％，兩者比較有顯著差異（P＜0.05）；在最適混合比培養(yǎng)下，正常人組與CHB治療前、CHB治療后（無HBcAg負(fù)載）和CHB治療后（HBcAg負(fù)載）的DC刺激增殖SI分別為：2.20±0.14、1.85±0.03、1.95±0.03、2.06±0.02和1.95±0.03，組間比較有顯著差異（P＜0.000，P＜0.005，P＜0.000）。HBcAg負(fù)載DC刺激PBLs與無HBcAg負(fù)載DC刺激PBLs均能活化較多的CTL，并分泌出較高水平的IFN-γ，5例CHB病人分別用HBcAg負(fù)載的DC刺激PBLs，均顯示出強(qiáng)烈的刺激CTL分泌IFN-γ的作用，與無HBcAg負(fù)載的DC相比，其刺激強(qiáng)度有顯著差異（P＜0.05）。3．5例接受治療的CHB患者的外周血單核來源DC經(jīng)過HBcAg刺激后，對于兩種靶細(xì)胞——HepG2和HepG2.2.1.5細(xì)胞的殺傷率分別為（57.93±3.00）％和（77.73±3.63）％，兩者間比較有顯著差異（t=-16.284，P=.000）；未經(jīng)HBcAg刺激的DC對兩種靶細(xì)胞——HepG2和HepG2.2.1.5細(xì)胞的殺傷率分別為（47.42±2.02）％和（64.45±1.76）％，兩者間比較也有顯著差異（t=-24.559，P=0.000）；無HBcAg負(fù)載DC刺激自體PBLs與未受DC刺激的自體PBLs對兩種靶細(xì)胞HepG2和HepG2.2.1.5細(xì)胞的殺傷率之間也有顯著差異（t=-13.527，P=0.000；t=-15.526，P=0.000）；HBcAg負(fù)載DC刺激自體PBLs與未受DC刺激的自體PBLs對兩種靶細(xì)胞HepG2和HepG2.2.1.5細(xì)胞的殺傷率之間也有顯著差異（t=-3.881，P=0.001；t=-22.345，P=0.000）；5例接受治療的CHB患者DC經(jīng)HBcAg刺激或無HBcAg刺激與HepG2反應(yīng)產(chǎn)生CTL殺傷率各自進(jìn)行比較，分別為：（56.40±1.57）％VS（46.60±4.12）％、（59.17±2.64）％VS（49.20±0.46）％、（55.67±0.71）％VS（48.00±1.44）％、（58.23±1.10）％VS（46.60±0.89）％和（62.00±0.44）％VS（46.70±0.75）％，病例1經(jīng)HBcAg刺激與否的自身比較無顯著差異（t=2.83，P=0.104），病例2、3、4、5經(jīng)HBcAg刺激與否的自身比較均有顯著差異（P=0.016，0.010，0.006.0.001）；5例慢性乙型肝炎患者DC經(jīng)HBcAg刺激或無HBcAg刺激與HepG2.2.1.5反應(yīng)產(chǎn)生CTL殺傷率各自進(jìn)行比較，分別為：（74.67±1.29）％VS（61.90±0.60）％、（81.77±0.72）％VS（63.73±0.21）％、（74.17±1.40）％VS（64.47±0.85）％、（76.33±1.34）％VS（65.73±1.21）％和（81.70±1.45）％VS（64.40±0.70）％，5個(gè)病例經(jīng)HBcAg刺激與否的自身比較均有顯著差異（P=0.003，0.000，0.012.0.005，0.006）。研究結(jié)論1．CHB患者外周血DC刺激自體淋巴細(xì)胞增殖能力下降。我們認(rèn)為，DC的刺激增殖能力下降與其表面黏附分子的表達(dá)下降有一定關(guān)系，可能是表面黏附分子的表達(dá)下降導(dǎo)致DC抗原提呈能力的下降，進(jìn)而影響了DC的刺激增殖能力。提高CHB患者DC的抗原提呈能力可能有助于HBV感染者體內(nèi)的病毒清除。2．慢乙肝病人接受小柴胡湯治療前后DC的表面標(biāo)志表達(dá)水平無顯著差異，但治療后的表達(dá)呈上升趨勢，表明治療后CHB患者外周血DC的黏附分子的表達(dá)得到了一定程度上調(diào)，經(jīng)HBcAg刺激后CD83表達(dá)水平的上調(diào)，可能與DC的成熟度提高、抗原提呈能力的恢復(fù)有一定關(guān)系；綜合表面標(biāo)志表達(dá)水平、AMLR和ELISPOT的結(jié)果，我們認(rèn)為，HBcAg負(fù)載可以使治療后患者的DC抗原提呈能力得到上調(diào)或恢復(fù)，從而使DC啟動(dòng)的Th和CTL細(xì)胞免疫應(yīng)答得到增強(qiáng)或恢復(fù)。3．CHB患者DC經(jīng)HBcAg沖擊后，能有效提呈HBcAg，誘導(dǎo)HBcAg特異性CTL反應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，慢性乙型肝炎患者單核細(xì)胞來源的DC經(jīng)HBcAg抗原沖擊后，能有效的誘導(dǎo)HBV特異性CTL。該結(jié)果為DC作為免疫佐劑進(jìn)行慢性乙型肝炎免疫治療提供了有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。小柴胡湯作為治療慢乙肝的有效方劑已被大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其具有免疫調(diào)節(jié)作用，對多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)均有影響。考慮入選本次研究的患者僅接受了小柴胡湯片劑的治療，并未進(jìn)行西醫(yī)臨床的抗病毒治療，結(jié)合我們整個(gè)DC功能的實(shí)驗(yàn)究結(jié)果分析，可以推斷，小柴胡湯片劑可能對患者外周血DC的抗原提呈功能的恢復(fù)或上調(diào)具有一定作用，因而可能使免疫功能得到一定提高。
趙文雙,郭蘭英,額爾敦[7]（2007）在《樹突狀細(xì)胞治療慢性乙型肝炎研究進(jìn)展》文中研究指明
張恒輝,何豫,趙鴻,樸文花,劉茂昌,席宏麗,于敏,王貴強(qiáng)[8]（2005）在《樹突狀細(xì)胞體外刺激對HBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞影響的研究》文中研究說明目的探討通過聚肌胞體外作用樹突狀細(xì)胞后改善慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞功能,并在體外活化自身T細(xì)胞獲得高頻數(shù)HBV特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）的方法。方法分離慢性乙型肝炎病人外周血單個(gè)核細(xì)胞,在粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM CSF）和白細(xì)胞介素4（IL4）的誘導(dǎo)下培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞。培養(yǎng)的第7天加入聚肌胞刺激獲得成熟樹突狀細(xì)胞,經(jīng)HBVcore1827肽負(fù)載后與自身T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),通過酶聯(lián)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)法（Elispot）及MHC肽四聚體法（Tetramer）比較病人T細(xì)胞未經(jīng)自身樹突狀細(xì)胞刺激組、經(jīng)HBVcore1827肽負(fù)載的自身樹突狀細(xì)胞刺激組、經(jīng)聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽負(fù)載的自身樹突狀細(xì)胞刺激組中HBV特異性的CTL的功能和頻數(shù)。結(jié)果慢性乙型肝炎病人外周血單核細(xì)胞體外經(jīng)GM CSF和IL4誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)化為樹突狀細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中聚肌胞的刺激可顯著上調(diào)樹突狀細(xì)胞表面分子CD80、CD83的表達(dá)（P<0.01）,促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟。Elispot法檢測分泌IFNγ的CTL的頻數(shù)病人T細(xì)胞未經(jīng)自身樹突狀細(xì)胞刺激組分泌頻數(shù)為（9～28）/1×105T細(xì)胞,均值16;經(jīng)HBVcore1827肽負(fù)載的自身樹突狀細(xì)胞刺激組頻數(shù)為（30～67）/1×105T細(xì)胞,均值為46;經(jīng)聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽負(fù)載的自身樹突狀細(xì)胞刺激組頻數(shù)為（59～130）/1×105T細(xì)胞,均值為98。三組數(shù)據(jù)?
蔡大川[9]（2004）在《1、整體重組酵母活菌治療性疫苗抗HBV實(shí)驗(yàn)研究 2、人臍帶血來源樹突狀細(xì)胞抗HBV治療實(shí)驗(yàn)研究》文中研究表明目的：借助酵母菌的表達(dá)和免疫特性，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)乙型肝炎表面抗原及表面抗原與截短的熱休克蛋白70的重組酵母菌，然后以整體活菌形式免疫BALB/C小鼠，作為一種針對HBV的治療性疫苗，探索一種可有效活化機(jī)體抗HBV細(xì)胞免疫的免疫策略。方法：以基因工程技術(shù)構(gòu)建內(nèi)含HBsAg的重組啤酒酵母和畢赤酵母以及 HSP70（1-370）-HBsAg的重組畢赤酵母,以完整活菌形式于BALB/C小鼠皮下進(jìn)行4次免疫后,用ELISA法檢測其對乙型肝炎表面抗原的體液免疫及小鼠脾細(xì)胞與HBsAg共孵育后細(xì)胞因子的分泌情況；以[3H]摻入法測定小鼠脾細(xì)胞對HBsAg特異性的細(xì)胞增殖反應(yīng)。結(jié)果：在兩種重組酵母組中都成功誘導(dǎo)了小鼠體內(nèi)乙型肝炎表面抗體的產(chǎn)生，顯示乙型肝炎表面抗原抗原性并未受到影響。在重組啤酒酵母組中，通過[3H]摻入法可見HBsAg特異性的細(xì)胞增殖反應(yīng)；在重組畢赤酵母組中，細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示重組畢赤酵母活菌可以誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌更多的IL-2，但對IL-4、γ-IFN的分泌無影響。結(jié)論：整體重組酵母活菌具有疫苗特性,可在小鼠體內(nèi)激發(fā)體液免疫及一定程度的細(xì)胞免疫反應(yīng)。重組酵母活菌用于激發(fā)機(jī)體抗HBV<WP=9>細(xì)胞免疫是一個(gè)全新的思路，重組酵母的用量、注射方式等有待進(jìn)一步研究。
李若冰,陳紅松,費(fèi)然,叢旭,孫婧,魏來,王宇[10]（2002）在《慢性乙型肝炎病人外周血樹突狀細(xì)胞功能的研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的 體外培養(yǎng)慢性乙型肝炎病人的樹突狀細(xì)胞 ,并從細(xì)胞表型和功能方面與正常人樹突狀細(xì)胞進(jìn)行比較。方法 從慢性乙型肝炎病人及正常人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞 ,加入含 10 0 0U/mlGM CSF和 5 0 0U/mlIL 4的無血清培養(yǎng)基AIM V體外培養(yǎng) ,獲得樹突狀細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子TNF α對樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的影響 ,IL 12ELISA試劑盒檢測樹突狀細(xì)胞分泌IL 12的水平 ,并采用MLR方法檢測樹突狀細(xì)胞刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果 1.慢性乙型肝炎病人的外周血單個(gè)核細(xì)胞用AIM V培養(yǎng)及細(xì)胞因子誘導(dǎo)后 ,可獲得成熟的具有典型形態(tài)的樹突狀細(xì)胞 ,加入TNF α后 ,IL 12分泌增高 ,CD83表達(dá)增加 ;2 .病人樹突狀細(xì)胞與正常人比較 ,CD80表達(dá)較正常人的低 （P <0 .0 5 ） ,刺激同種異體T細(xì)胞增殖能力低于正常人。結(jié)論 1.慢性乙型肝炎病人的樹突狀細(xì)胞與正常人一樣可用AIM V無血清培養(yǎng)基及特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)在體外大量獲得 ;2 .慢性乙型肝炎病人的樹突狀細(xì)胞與正常人相比較在功能上降低 ,在形態(tài)數(shù)量上差異無顯著意義。
二、慢性乙型肝炎病人樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會科學(xué)用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、慢性乙型肝炎病人樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究（論文提綱范文）
（1）β-葡聚糖對慢性乙型肝炎患者免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略詞表 |
| 前言 |
| 文獻(xiàn)綜述 原發(fā)性肝癌的免疫治療進(jìn)展 |
| 1、自然殺傷細(xì)胞(Natural killer,NK) |
| 2、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC) |
| 3、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer,CIK) |
| 4、嵌合抗原受體(chimericantigen receptor,CAR)的T細(xì)胞(CAR-T) |
| 5、小結(jié) |
| 第一章 不同培養(yǎng)基對樹突狀細(xì)胞的影響 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 研究資料 |
| 1.2 試劑 |
| 1.3 主要試劑的配制 |
| 1.4 主要儀器 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 細(xì)胞的分離與培養(yǎng) |
| 2.1.1 血液標(biāo)本的采集 |
| 2.1.2 分離PBMC |
| 2.1.3 DC細(xì)胞的刺激和培養(yǎng) |
| 2.1.4 細(xì)胞的收集 |
| 2.2 細(xì)胞形態(tài)的觀察 |
| 2.3 流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)細(xì)胞表面CD11c、CD86 細(xì)胞的表達(dá) |
| 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 細(xì)胞生長狀況 |
| 3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) |
| 3.3 所培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá) |
| 3.3.1 兩組所培養(yǎng)細(xì)胞CD11c~+表達(dá)率的比較 |
| 3.3.2 兩組所培養(yǎng)細(xì)胞CD86~+表達(dá)率的比較 |
| 4 討論 |
| 第二章 β-葡聚糖對慢性乙型肝炎患者免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 病例資料 |
| 1.2 試劑 |
| 1.3 主要試劑的配制 |
| 1.4 主要儀器 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 血液標(biāo)本的無菌采集 |
| 2.2 DC細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 2.2.1 分離PBMC |
| 2.2.2 DC細(xì)胞的體外培養(yǎng) |
| 2.2.3 DC細(xì)胞的刺激 |
| 2.2.4 DC細(xì)胞的收集 |
| 2.2.5 細(xì)胞形態(tài)的觀察 |
| 2.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD11c、CD80、CD86 的表達(dá) |
| 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 2.3 PBMC細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 2.3.1 分離PBMC |
| 2.3.2 細(xì)胞的刺激和培養(yǎng) |
| 2.3.3 細(xì)胞的收集 |
| 2.3.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察 |
| 2.3.5 流式細(xì)胞儀檢測PBMC表面CD11c、CD3、CD4、CD8a和 CD56 的表達(dá)情況 |
| 2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 PBMC的獲取 |
| 3.2 DC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.2.1 各組DC細(xì)胞形態(tài)的觀察 |
| 3.2.2 各組DC細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)情況 |
| 3.3 PBMC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.1 各組PBMC細(xì)胞形態(tài)的觀察 |
| 3.3.2 各組PBMC細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間取得的科研成果清單 |
（3）HBV慢性感染不同狀態(tài)下肝郁脾虛與肝膽濕熱證患者外周血樹突狀細(xì)胞及其功能研究（論文提綱范文）
| 英文縮略詞 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 正文 |
| 第一部分 健康人外周血樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定 |
| 一 材料和方法 |
| 二 結(jié)果 |
| 三 討論 |
| 四 小結(jié) |
| 第二部分 HBV慢性感染不同狀態(tài)下肝郁脾虛與肝膽濕熱證患者樹突狀細(xì)胞及其功能究 |
| 一 材料與方法 |
| 二 結(jié)果 |
| 三 討論 |
| 四 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 1. 綜述 |
| 2. 攻讀碩士學(xué)位期間主要研究成果及發(fā)表論文 |
（4）自體樹突狀細(xì)胞疫苗治療乙型肝炎病毒感染者的免疫機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 英漢縮略語名詞對照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 論文正文 自體樹突狀細(xì)胞疫苗治療乙型肝炎病毒感染者的免疫機(jī)制研究 |
| 前言 |
| 第一章 HBcAg/HBeAg 對人樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 第二章 IL-10，TNF-α對慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞的影響 |
| 1 材料和方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 致謝 |
| 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（5）HBV感染不同狀態(tài)下樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)研究（論文提綱范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、英漢對照表 |
| 四、論文正文 |
| 前言 |
| 第一章 慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其功能的測定 |
| 1.1 材料與方法 |
| 1.2 結(jié)果 |
| 1.3 討論 |
| 第二章 HBV感染不同狀態(tài)下HBV-DNA水平與DCs功能的關(guān)系 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.3 討論 |
| 第三章 CpG ODN對慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞功能的影響 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.3 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 五、綜述 |
| 綜述一 樹突狀細(xì)胞及其與肝臟疾病的關(guān)系 |
| 綜述二 CpG ODN的免疫學(xué)功能及應(yīng)用研究進(jìn)展 |
| 六、攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文 |
| 七、致謝 |
（6）小柴胡片對慢性乙肝患者外周血樹突狀細(xì)胞抗原遞呈的影響（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章: 文獻(xiàn)研究 |
| 第一節(jié): 中醫(yī)學(xué)對慢性乙肝的認(rèn)識 |
| 1. 病因病機(jī) |
| 2. 治療方面 |
| 第二節(jié): 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對慢性乙肝的認(rèn)識 |
| 1. 發(fā)病機(jī)理 |
| 2. 治療方面 |
| 第三節(jié): 小柴胡湯治療慢性乙肝的研究概況 |
| 1. 小柴胡湯治療慢性乙肝符合中醫(yī)學(xué)的辨證論治規(guī)律 |
| 2. 藥理作用研究 |
| 3. 臨床療效研究 |
| 第二章: 實(shí)驗(yàn)研究 |
| 第一節(jié): 試驗(yàn)一 慢性乙肝病毒感染者外周血樹突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng) |
| 1. 材料與方法 |
| 2. 結(jié)果 |
| 3. 討論 |
| 第二節(jié): 實(shí)驗(yàn)二 HBcAg負(fù)載對DC刺激增殖能力和CTL分泌IFN-水平的影響 |
| 1. 材料與方法 |
| 2. 結(jié)果 |
| 3. 討論 |
| 第三節(jié): 實(shí)驗(yàn)三 HBcAg負(fù)載的樹突狀細(xì)胞對CTL應(yīng)答的影響 |
| 1. 材料與方法 |
| 2. 結(jié)果 |
| 3. 討論 |
| 第三章: 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄一 |
| 附錄二 |
| 致謝 |
（7）樹突狀細(xì)胞治療慢性乙型肝炎研究進(jìn)展（論文提綱范文）
| 1 DC的生物學(xué)功能 |
| 2 慢性乙肝患者DC的功能狀況 |
| 3 治療慢性乙肝的DC疫苗 |
| 4 問題與展望 |
（8）樹突狀細(xì)胞體外刺激對HBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞影響的研究（論文提綱范文）
| 對象與方法 |
| 一、對象 |
| 二、方法 |
| 結(jié)果 |
| 1. 樹突狀細(xì)胞的擴(kuò)增、表型鑒定及Poly |
| 2. Elispot檢測HBV特異性的分泌IFN-γ |
| 3. Tetramer 流式細(xì)胞技術(shù)檢測HBVcore18-27 |
| 討論 |
（9）1、整體重組酵母活菌治療性疫苗抗HBV實(shí)驗(yàn)研究 2、人臍帶血來源樹突狀細(xì)胞抗HBV治療實(shí)驗(yàn)研究（論文提綱范文）
| 英文縮寫及中英文對照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 論文正文 |
| 前 言 |
| 第一部分 整體重組酵母活菌治療性疫苗抗HBV實(shí)驗(yàn)研究 |
| 一、 整體重組啤酒酵母活菌治療性疫苗抗HBV治療初步研究 |
| 第一節(jié) 乙型肝炎表面抗原酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 |
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 第二節(jié) 重組表達(dá)載體在酵母內(nèi)的表達(dá)與鑒定 |
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3l |
| 第三節(jié) 整體基因重組啤酒酵母免疫用于抗HBV的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 二、 整體重組畢赤酵母活菌治療性疫苗抗HBV治療的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 第二部分 人臍血來源樹突狀細(xì)胞抗.HBV治療實(shí)驗(yàn)研究 |
| 一、 人臍血樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及生物學(xué)特性的研究 |
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 二、 人臍血來源樹突狀細(xì)胞用于抗HBV的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 討 論 |
| 全文小結(jié) |
| 本課題的創(chuàng)新點(diǎn) |
| 附: SiRNA用于抗HBV治療的初步研究 |
| 材料與方法 |
| 結(jié) 果 |
| 討 論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 全文參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述一:樹突狀細(xì)胞和HBV持續(xù)感染 |
| 文獻(xiàn)綜述二:樹突狀細(xì)胞抗腫瘤臨床治療方案研究進(jìn)展 |
| 文獻(xiàn)綜述三:RNAi技術(shù)用于抗HBV、HCV治療研究進(jìn)展 |
| 文獻(xiàn)綜述四:HBV宮內(nèi)感染研究進(jìn)展 |
| 致 謝 |
| 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（10）慢性乙型肝炎病人外周血樹突狀細(xì)胞功能的研究（論文提綱范文）
| 對象與方法 |
| 結(jié)果 |
| 1.樹突狀細(xì)胞的表型測定: |
| 2.樹突狀細(xì)胞對TNF-α的反應(yīng)性的比較: |
| 3.樹突狀細(xì)胞的免疫刺激活性: |
| 討論 |
四、慢性乙型肝炎病人樹突狀細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]β-葡聚糖對慢性乙型肝炎患者免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用[D]. 閆丹丹. 河北師范大學(xué), 2016(04)
- [2]我國16個(gè)重點(diǎn)病種的國家中醫(yī)臨床研究基地論文統(tǒng)計(jì)表（2008年～2013年）[J]. 國家中醫(yī)藥管理局國家中醫(yī)臨床研究基地辦公室. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2013(05)
- [3]HBV慢性感染不同狀態(tài)下肝郁脾虛與肝膽濕熱證患者外周血樹突狀細(xì)胞及其功能研究[D]. 何芳. 湖南中醫(yī)藥大學(xué), 2009(04)
- [4]自體樹突狀細(xì)胞疫苗治療乙型肝炎病毒感染者的免疫機(jī)制研究[D]. 石慶鳳. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2008(04)
- [5]HBV感染不同狀態(tài)下樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)研究[D]. 黃振宇. 中南大學(xué), 2007(12)
- [6]小柴胡片對慢性乙肝患者外周血樹突狀細(xì)胞抗原遞呈的影響[D]. 蓋麗麗. 廣州中醫(yī)藥大學(xué), 2007(02)
- [7]樹突狀細(xì)胞治療慢性乙型肝炎研究進(jìn)展[J]. 趙文雙,郭蘭英,額爾敦. 中國感染控制雜志, 2007(01)
- [8]樹突狀細(xì)胞體外刺激對HBV特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞影響的研究[J]. 張恒輝,何豫,趙鴻,樸文花,劉茂昌,席宏麗,于敏,王貴強(qiáng). 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2005(17)
- [9]1、整體重組酵母活菌治療性疫苗抗HBV實(shí)驗(yàn)研究 2、人臍帶血來源樹突狀細(xì)胞抗HBV治療實(shí)驗(yàn)研究[D]. 蔡大川. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2004(03)
- [10]慢性乙型肝炎病人外周血樹突狀細(xì)胞功能的研究[J]. 李若冰,陳紅松,費(fèi)然,叢旭,孫婧,魏來,王宇. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2002(13)
標(biāo)簽：樹突狀細(xì)胞論文; β-葡聚糖論文; 細(xì)胞增殖論文; 健康論文; 乙肝論文;