一、煙草叢頂病穴TBTV雪傳毒特性及寄主范圍研究（論文文獻(xiàn)綜述）
竇寶存[1]（2020）在《煙草叢頂病毒不依賴(lài)帽子翻譯中的遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作》文中指出RNA病毒的不依賴(lài)帽子翻譯調(diào)控元件主要包括兩類(lèi):位于基因組5’端的核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)（Internal Ribosome Entry Site,IRES）和位于基因組3’端的不依賴(lài)帽子翻譯調(diào)控元件（3’Cap-Independent Translation Element,3’CITE）。其中3’CITE結(jié)合的翻譯起始復(fù)合物,大多是由遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作呈遞到基因組5’端起始翻譯。參與遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作的5’端區(qū)域是否受到臨近RNA序列或結(jié)構(gòu)的影響,這方面的研究很少。煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）基因組5’端沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)（m7GPPPN）,3’端也沒(méi)有poly（A）尾,依賴(lài)其3’非翻譯區(qū)（Untranslated Region,UTR）的不依賴(lài)帽子翻譯調(diào)控元件BTE招募翻譯起始因子進(jìn)行不依賴(lài)帽子翻譯,需要遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作的協(xié)同調(diào)控。前期研究表明,基因組5’末端區(qū)域（RI區(qū)）是造成多個(gè)TBTV分離物翻譯效率差異的主要區(qū)域之一。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)嵌合突變體的突變和體外翻譯實(shí)驗(yàn)分析基因組5’端區(qū)域的RNA序列對(duì)遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作的影響,發(fā)現(xiàn)調(diào)控TBTV不依賴(lài)帽子翻譯的遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作受到“精妙的開(kāi)關(guān)”調(diào)控。具體結(jié)果如下:1.嵌合突變體TB-MDI（1-511）的p35蛋白表達(dá)量相對(duì)于野生型明顯下降,而嵌合突變體擁有與野生型TBTV一樣的BTE結(jié)構(gòu);以遠(yuǎn)距離互作可能受影響為研究切入點(diǎn),在嵌合突變體TB-MDI（1-511）的5’末端增加額外的5’UTR序列（AGGTTACGAT）。新增加1個(gè)拷貝的5’UTR序列,p35蛋白的表達(dá)量并沒(méi)有變化;新增加2個(gè)拷貝的5’UTR序列,p35蛋白表達(dá)量恢復(fù)到野生型水平。說(shuō)明弱毒分離物TB-MDI的RI區(qū)（1-511nt）可能存在特有的突變,該突變限制了嵌合突變體TB-MDI（1-511）的遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作;而額外2個(gè)拷貝的5’UTR序列插入則可以恢復(fù)遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作。2.以TB-MDI（1-511）+2*5U為基礎(chǔ),突變不同位置的5’UTR序列中參與遠(yuǎn)距離互作的堿基（AGGTTACGAT,下劃線(xiàn)標(biāo)出參與互作的堿基）,分析3個(gè)5’UTR序列恢復(fù)翻譯效率的機(jī)制。突變3’端的5’UTR,突變體翻譯水平降低至TB-MDI（1-511）+2*5U的30%。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)突變中間的5’UTR,翻譯水平提高至野生型水平;突變5’端的5’UTR,突變體翻譯水平降低至50%。同樣在此基礎(chǔ)上繼續(xù)突變中間的5’UTR,翻譯水平略有降低,但變化并不明顯。而5’UTR突變體的BTE區(qū)域內(nèi)的潛在回復(fù)突變體無(wú)法回復(fù)翻譯水平。說(shuō)明3個(gè)5’UTR序列對(duì)于翻譯效率的恢復(fù)既有數(shù)量效應(yīng)又有位置效應(yīng)。3.比較TBTV不同分離物的1-511的序列,翻譯效率較低的弱毒分離物（TB-MDI、TB-MDII、TB-JC）與野生型相比,存在9個(gè)共有突變位點(diǎn),分別是第1位的A突變?yōu)镚、147位的A突變?yōu)镃、291位的U突變?yōu)镃、299位的A突變?yōu)閁、300位的U突變?yōu)镃、340位的U突變?yōu)镃、405位的A突變?yōu)閁、407位的U突變?yōu)镃和464位的G突變?yōu)镃。其中三處造成了明顯的RNA結(jié)構(gòu)變化,分別是第299-300位堿基處、第405/407位堿基處和第464位堿基處。針對(duì)這些突變位點(diǎn)構(gòu)建兩種類(lèi)型的突變體:以TBTV-Ch為基礎(chǔ)將這些位置的堿基分別突變?yōu)槿醵痉蛛x物的對(duì)應(yīng)位置堿基,翻譯水平變化不明顯;以嵌合突變體TB-MDI（1-511）為基礎(chǔ),將這些位置的堿基分別突變?yōu)門(mén)BTV-Ch的對(duì)應(yīng)位置堿基,翻譯水平有一定的上升。以TBTV-Ch為基礎(chǔ)組合突變兩處堿基及以上,翻譯水平明顯降低;以TB-MDI（1-511）為基礎(chǔ)組合突變,翻譯水平明顯上升。說(shuō)明第299-300位、第405/407位和第464位堿基的共有突變,通過(guò)限制遠(yuǎn)距離的RNA-RNA互作而降低了不依賴(lài)帽子的翻譯效率,且同步突變對(duì)翻譯的抑制效應(yīng)強(qiáng)于單處突變的抑制效應(yīng)。以上結(jié)果說(shuō)明,在p35蛋白低水平表達(dá)的TBTV分離物的1-511 nt范圍內(nèi)存在特定的突變位點(diǎn)限制不依賴(lài)帽子翻譯所需的遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作,即TBTV不依賴(lài)帽子翻譯相關(guān)的遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作存在精細(xì)的調(diào)控開(kāi)關(guān)。
張未[2]（2019）在《煙草叢頂病病原病毒復(fù)合體各組分傳播特性的研究》文中研究表明煙草叢頂病（Tobacco bushy top disease,TBTD）是一種毀滅性很大的煙草病害,在我國(guó)云南省多個(gè)煙區(qū)流行并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。煙草叢頂病也是我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)的僅此一例由黃癥病毒科（Luteoviridae）和幽影病毒屬（Umbravirus）病毒復(fù)合侵染引起的病害,并且是植物病毒病害。該病害的病毒復(fù)合體成分復(fù)雜,包含了 5種RNA成分,除了一個(gè)尚未定性的病毒RNA之外,其他4種分別是煙草脈扭病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）、煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）這兩者為主要致病病毒,以及煙草叢頂病毒衛(wèi)星RNA（Tobacco bushy top virus satellite RNA,TBTV SatRNA）和煙草脈扭病毒伴隨 RNA（Tobacco vein distorting virus associate RNA,TVDVaRNA）。為了研究該病害病原病毒復(fù)合體各組分的傳播特性,增加對(duì)該植物病毒的各個(gè)RNA組分相互作用關(guān)系的進(jìn)一步理解,本文從以下幾方面進(jìn)行了深入的研究:首次明確了 TVDV、TBTV、TBTVSatRNA和TVDVaRNA三者之間的相互作用關(guān)系。通過(guò)已構(gòu)建的TVDV、TBTV、TBTV SatRNA和TVDVaRNA農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒侵染性克隆對(duì)其相互作用關(guān)系進(jìn)行了深入研究。被單獨(dú)接種TVDV的植株沒(méi)有表現(xiàn)出明顯癥狀,但TVDV可以單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制并系統(tǒng)感染,還可以通過(guò)蚜蟲(chóng)進(jìn)行傳播;同時(shí)接種TVDV和TBTV SatRNA的植株也沒(méi)有明顯癥狀,并且檢測(cè)不到TBTVSatRNA,TBTVSatRNA單獨(dú)無(wú)法進(jìn)行復(fù)制和系統(tǒng)感染,并且不能通過(guò)蚜蟲(chóng)進(jìn)行傳播;同時(shí)接種TVDV及TBTV的植株癥狀輕微,兩者RNA可以復(fù)制和系統(tǒng)感染,通過(guò)蚜蟲(chóng)可以從本氏煙傳播到烤煙上;同時(shí)接種TVDV、TBTV和TBTVSatRNA,植株黃化癥狀較重,側(cè)枝較多,但仍比接種已知4種的植株癥狀輕,三種病毒RNA均可以復(fù)制和系統(tǒng)感染,并且均可以通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播。但TVDV與TBTV共同侵染的烤煙,在通過(guò)蚜蟲(chóng)傳向其他烤煙時(shí),并未成功,而衛(wèi)星RNA存在時(shí)三者都可以傳到其他烤煙上。為了獲得煙草叢頂病病原病毒復(fù)合體中尚未定性的病毒RNA序列,我們建立了一種應(yīng)用基于轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序技術(shù)的針對(duì)植物病毒鑒定的方法。通過(guò)提純煙草叢頂病病原病毒粒子,利用深度測(cè)序的技術(shù)對(duì)其中的病毒總RNA的成分進(jìn)行了研究。在深度測(cè)序獲得序列的基礎(chǔ)上,應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)測(cè)序得到的序列進(jìn)行注釋篩選,提取候選序列,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)候選序列進(jìn)行驗(yàn)證。在樣品中獲得了多個(gè)新的呼腸孤病毒科（Reoviridae）病毒的RNA序列片段,并在部分煙草叢頂病侵染的植株內(nèi)檢測(cè)到上述序列,同時(shí)對(duì)上述病毒的來(lái)源進(jìn)行了探討。本次研究幫助我們加深對(duì)煙草叢頂病的病原病毒復(fù)合體的了解認(rèn)識(shí),也加深了對(duì)植物病毒相互作用機(jī)制及傳播特性的理解,為防治和研究黃癥病毒/幽影病毒復(fù)合體引起植物病害提供思路。
王德亞[3]（2017）在《煙草叢頂病毒不依賴(lài)帽子翻譯機(jī)制的RNA結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與分子進(jìn)化》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）屬于番茄叢矮病毒科幽影病毒屬,基因組由一條正義單鏈RNA（+ssRNA）組成,全長(zhǎng)約4,152 nt。5’端缺乏帽子結(jié)構(gòu)（m7GPPPN）,3’末端也不帶poly（A）尾,編碼4個(gè)ORF,包括復(fù)制酶組分p35蛋白及其-1位移碼產(chǎn)物p98蛋白（RNA依賴(lài)RNA聚合酶,RdRp）,運(yùn)動(dòng)蛋白p26和p27。前人研究表明,TBTV基因組的3’UTR含有不依賴(lài)帽子翻譯元件BTE,可以調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)。本文分析了BTE在全長(zhǎng)TBTV中對(duì)p35蛋白翻譯的調(diào)控作用以及對(duì)TBTV在BY-2原生質(zhì)體中的RNA積累的作用。另外從中國(guó)云南地區(qū)克隆了3個(gè)新的TBTV弱毒分離物,發(fā)現(xiàn)其p35表達(dá)量相對(duì)于野生型（TBTV-Ch）明顯降低,且p35表達(dá)量降低與BTE元件的結(jié)構(gòu)變異相關(guān)。利用體外翻譯系統(tǒng)WGE,以TBTV基因組全長(zhǎng)RNA為材料全面分析其不依賴(lài)帽子翻譯,發(fā)現(xiàn)TBTV基因組中除BTE外還存在至少1種類(lèi)型的不依賴(lài)帽子翻譯元件。具體結(jié)果如下:（1）TBTV全基因組克隆及分子進(jìn)化:通過(guò)5’RACE和3’RACE結(jié)合一步RT-PCR的方法,克隆得到3個(gè)新的弱毒分離物TBTV-JC（KM016224）、TBTV-MD-I（KM016225）和TBTV-MD-II（KM067277）。基因組全長(zhǎng)均為4,152 nt;與之前報(bào)道的TBTV分離物不同,第一個(gè)堿基是鳥(niǎo)嘌呤（G）而不是腺嘌呤（A）。序列一致性比對(duì)發(fā)現(xiàn)ORF1編碼區(qū)是TBTV基因組中變化最大的區(qū)域（75.0%-99.2%）;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示各基因獨(dú)立進(jìn)化;在已報(bào)道的7個(gè)TBTV分離物中共發(fā)現(xiàn)32個(gè)疑似的重組事件。（2）BTE元件對(duì)于TBTV翻譯和復(fù)制的影響:通過(guò)螢火蟲(chóng)熒光素酶（Fluc）載體和TBTV全長(zhǎng)RNA的體外翻譯分析,發(fā)現(xiàn)BTE元件發(fā)揮調(diào)控不依賴(lài)帽子翻譯作用的核心分子特征包括3方面:SL-I的17 nt保守序列;與5’UTR形成遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作的SL-III A;BTE本身的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。BTE的突變也影響TBTV在BY-2原生質(zhì)體中的RNA積累,說(shuō)明BTE通過(guò)調(diào)控蛋白翻譯從而影響病毒的致病性。（3）TBTV不同分離物體內(nèi)RNA積累量分析:3個(gè)TBTV弱毒分離物在煙草原生質(zhì)體中的RNA積累量是野生型的30%-40%。而其p35蛋白的表達(dá)量是野生型的25%,38%和20%,表明p35表達(dá)量降低可能與其弱致病力相關(guān)。（4）TBTV不同分離物p35蛋白表達(dá)差異的分子機(jī)制:嵌合病毒的體外翻譯表明,造成弱毒分離物p35蛋白表達(dá)量降低的主要調(diào)控區(qū)域是RI區(qū)（基因組5’端的500 nt）和包含BTE的RV區(qū)（3’端的3,138 nt到3,885 nt區(qū)間）。對(duì)于RV區(qū)而言,弱毒分離物中BTE內(nèi)的點(diǎn)突變幾乎不影響p35表達(dá),而B(niǎo)TE區(qū)域外則存在降低p35表達(dá)的突變U3580→A3580。進(jìn)一步的RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),在p35表達(dá)量低的TBTV分離物和嵌合病毒中均發(fā)現(xiàn)含有典型BTE結(jié)構(gòu)的比例很低;而p35表達(dá)量高的TBTV分離物則含有高比例的典型BTE結(jié)構(gòu)特征。利用SHAPE技術(shù)分析TBTV不同分離物和嵌合病毒的BTE區(qū)域的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)TBTV弱毒分離物以及RV嵌合病毒的BTE區(qū)域均發(fā)生了明顯結(jié)構(gòu)變化。說(shuō)明BTE的結(jié)構(gòu)變異是導(dǎo)致TBTV弱毒分離物p35蛋白表達(dá)降低的分子基礎(chǔ),且此BTE結(jié)構(gòu)變異由BTE區(qū)域外的突變?cè)斐?。這是首次關(guān)于不依賴(lài)帽子翻譯元件在特定RNA病毒不同分離物間結(jié)構(gòu)進(jìn)化的報(bào)道。對(duì)于RI區(qū)而言,其降低p35蛋白表達(dá)的機(jī)制在于突變?cè)斐?’端的局部結(jié)構(gòu)變化,進(jìn)而抑制了5’UTR與BTE的SL-III A形成遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作。因此,TBTV弱毒分離物的p35低表達(dá)的分子基礎(chǔ)是BTE元件的結(jié)構(gòu)變異以及遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作的抑制。（5）TBTV中新的不依賴(lài)帽子翻譯元件:通過(guò)對(duì)TBTV 3’UTR區(qū)域的系列缺失實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)TB-D9（4040-4099）和TB-D10（4093-4152）的缺失會(huì)明顯降低p35蛋白的表達(dá),通過(guò)Mflod預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)4003-4152形成獨(dú)立結(jié)構(gòu)域,并且利用SHAPE技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)D9和D10的缺失突變并沒(méi)有影響B(tài)TE元件的活性結(jié)構(gòu)。反式競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)也證明了4003-4152區(qū)對(duì)于p35不依賴(lài)帽子翻譯的調(diào)控作用。因此,在TBTV的3’UTR還存在除BTE之外的不依賴(lài)帽子翻譯調(diào)控元件。利用In line-proing技術(shù)分析4003-4152的結(jié)構(gòu),包含5個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)和3個(gè)假節(jié)點(diǎn)。此結(jié)構(gòu)與TCV的3’UTR的結(jié)構(gòu)類(lèi)似,也可能存在TSS結(jié)構(gòu)。
于成明[4]（2017）在《煙草叢頂病毒RNA依賴(lài)RNA聚合酶的-1型移碼翻譯機(jī)制研究》文中認(rèn)為煙草叢頂病是由番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）幽影病毒屬（Umbravirus）成員煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）和黃癥病毒科（Luteoviridae）成員煙草扭脈病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）復(fù)合侵染引起的一種系統(tǒng)性侵染病害。TBTV基因組為一條正義單鏈RNA,全長(zhǎng)4,152個(gè)核苷酸,5’端沒(méi)有帽子,3’端沒(méi)有poly（A）尾,共有4個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）。ORF1編碼35 KDa蛋白,ORF1的C末端與ORF2的N端有8個(gè)密碼子的重疊區(qū),ORF2編碼63 KDa蛋白。ORF1通過(guò)-1位的移碼翻譯機(jī)制表達(dá)產(chǎn)生TBTV RNA依賴(lài)的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）,其分子量約等于ORF1和ORF2的分子量之和。本研究在已經(jīng)完成TBTV RdRp-1位移碼翻譯表達(dá)的定性分析基礎(chǔ)上,主要對(duì)TBTV RdRp的-1位移碼翻譯機(jī)制的多層次調(diào)控元件進(jìn)行定位和結(jié)構(gòu)特征分析。首先通過(guò)序列分析,初步定位了-1型移碼必需的七核苷酸滑動(dòng)序列（特征為:XXx YYY Z,X為任何堿基、Y通常為A或U、Z是除G外的任何堿基,X和x可以是形同堿基也可以是不同堿基）是946GGAUUUU。G946A、U950C、U952G的突變可導(dǎo)致移碼效率降低到野生型的20%40%,說(shuō)明946GGAUUUU為T(mén)BTV RdRp的-1位移碼所需的七核苷酸滑動(dòng)序列。在定位了七核苷酸滑動(dòng)序列的前提下,在其下游構(gòu)建3個(gè)不同類(lèi)型的突變體:缺失三個(gè)堿基(952UGC-De)、插入3個(gè)堿基(955CAU-In)、插入6個(gè)堿基(955CAUCAC-In),分析七核苷酸滑動(dòng)序列與其下游潛在的局部RNA結(jié)構(gòu)的距離對(duì)移碼效率的影響。突變?cè)囼?yàn)表明,七核苷酸滑動(dòng)序列與下游潛在RNA結(jié)構(gòu)元件之間的距離為69個(gè)堿基時(shí),可保證正常的移碼效率。在Mfold分析預(yù)測(cè)TBTV RNA結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,通過(guò)RNA結(jié)構(gòu)體外分析技術(shù)---SHAPE分析七核苷酸滑動(dòng)序列下游的RNA結(jié)構(gòu),分析表明七核苷酸滑動(dòng)序列下游存在3個(gè)大小不等的莖環(huán)結(jié)構(gòu),并且存在一個(gè)假結(jié)點(diǎn)。突變分析表明,這3個(gè)莖環(huán)均參與TBTV RdRp的-1位移碼,并且假結(jié)點(diǎn)的存在對(duì)于-1位移碼至關(guān)重要。通過(guò)構(gòu)建覆蓋TBTV全基因組的18個(gè)亞克隆RNA片段,結(jié)合凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）定位了遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作的區(qū)域,位于亞克隆S5和亞克隆S18。其中S5（880-1120）包含-1位移碼所需的七核苷酸滑動(dòng)序列和下游RNA結(jié)構(gòu);而S18是TBTV的3’末端區(qū)域。利用線(xiàn)性化切割結(jié)構(gòu)分析（In-lineprobing）技術(shù)分析了S5區(qū)域的結(jié)構(gòu)以及與S18發(fā)生遠(yuǎn)距離互作后的結(jié)構(gòu),初步定位了遠(yuǎn)距離互作的2個(gè)潛在位點(diǎn),分別位于七核苷酸滑動(dòng)序列的第一個(gè)莖環(huán)和第三個(gè)莖環(huán);利用線(xiàn)性化切割結(jié)構(gòu)分析（In-lineprobing）技術(shù)分析了TBTV 3’末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)以及與S5發(fā)生遠(yuǎn)距離互作后的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)距離互作位點(diǎn)位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)Pr的Loop區(qū)域。通過(guò)突變分析確認(rèn)了莖環(huán)Pr中參與遠(yuǎn)距離互作的位點(diǎn)是4137ACU,其突變降低移碼效率至野生型的20%左右。本研究定位了TBTV RdRp-1位移碼機(jī)制的多層次調(diào)控元件:七核苷酸滑動(dòng)序列946GGAUUUU,以及位于下游69 nt處的3個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)和1個(gè)假結(jié)點(diǎn),同時(shí)TBTV 3’末端莖環(huán)結(jié)構(gòu)Pr的Loop區(qū)域與移碼位點(diǎn)下游的莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成2處遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作。該研究對(duì)于正單鏈RNA病毒-1位移碼翻譯調(diào)控機(jī)制提出了新的調(diào)控模型,提供了新的研究數(shù)據(jù),同時(shí)為煙草病毒病的防治提供了新的靶標(biāo)和數(shù)據(jù)支持。
馬普權(quán),劉芳,譚冠林,田芝花,李凡[5]（2015）在《云南煙草叢頂病復(fù)合病原物的寄主范圍》文中指出云南煙草叢頂病是由煙草叢頂病毒（TBTV）、煙草扭脈病毒（TVDV）、煙草叢頂病毒類(lèi)似衛(wèi)星RNA（Sat-TBTV）以及煙草扭脈病毒相關(guān)RNA（TVDVaRNA）復(fù)合侵染引起的一種危險(xiǎn)性煙草病害。利用帶毒煙蚜（Myzus persicae）對(duì)12種植物進(jìn)行蚜蟲(chóng)傳毒接種試驗(yàn),傳毒時(shí)間為15 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn):接種的辣椒、酸漿等茄科植物表現(xiàn)褪綠、黃化和皺縮等癥狀,而黃瓜、菜豆等非茄科植物未表現(xiàn)明顯癥狀。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)接種植物中云南煙草叢頂病病原物的種類(lèi),發(fā)現(xiàn)酸漿、假酸漿、曼陀羅、番茄、矮牽牛和辣椒6種茄科作物均能感染云南煙草叢頂病中的4種病原物,而黃瓜、西葫蘆、昆諾藜、豇豆、菜豆和油菜等6種植物只能感染云南煙草叢頂病中的部分病原物。其中,煙草扭脈病毒（TVDV）的檢出率最高,為83.3%,表明TVDV在病害的發(fā)生及流行中起了重要作用,通過(guò)蚜蟲(chóng)傳毒方式可以將云南煙草叢頂病中的部分病原物分開(kāi),有利于研究不同病原物在癥狀的形成及流行中的作用,同時(shí)為其他多種病毒復(fù)合侵染引起植物病害的研究提供參考。
王國(guó)魯[6]（2014）在《煙草叢頂病毒復(fù)制酶的移碼翻譯調(diào)控和基因組復(fù)制的定量研究系統(tǒng)的初創(chuàng)》文中研究說(shuō)明煙草叢頂病由幽影病毒屬（Umbravirus）成員煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus, TBTV）及黃癥病毒科（Luteoviridae）的煙草扭脈病毒（Tobacco vein distorting virus, TVDV）復(fù)合侵染引起。TBTV的基因組是一條（+）ssRNA,由4152個(gè)核苷酸組成；推測(cè)編碼4個(gè)蛋白。ORF1編碼35kD的蛋白,ORF1的C端與ORF2的N端有8個(gè)密碼子的重疊,ORF2編碼63kD的蛋白。通過(guò)同源比對(duì)推測(cè)ORF2蛋白可能是通過(guò)-1位的移碼翻譯機(jī)制得到表達(dá),存在形式為ORF1/ORF2的融合蛋白。本論文首先完成了ORF2移碼翻譯表達(dá)機(jī)制的定性。PCR擴(kuò)增TBTV的ORF1序列并克隆到原核表達(dá)載體pEHISTEV中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)TBTV ORF1蛋白。利用切膠純化的ORF1蛋白免疫新西蘭大耳白兔制備并獲得高效價(jià)的抗血清（1：243000）。經(jīng)抗原親和純化從抗血清中得到特異性和靈敏度俱佳的ORF1多克隆抗體。Western blot分析顯示,TBTV ORF1多克隆抗體既可用于檢測(cè)田問(wèn)發(fā)病的煙草叢頂病葉樣品,也可檢測(cè)在體內(nèi)和體外翻譯體系中的TBTV ORF1蛋白的表達(dá)。其中,在體外翻譯系統(tǒng)中,利用所制備的ORF1多克隆抗體,還檢測(cè)到以O(shè)RF1/ORF2融合蛋白形式存在的的表達(dá)產(chǎn)物,完成了對(duì)ORF2移碼翻譯機(jī)制的定性,移碼效率約為1%。然后,嘗試創(chuàng)建ORF2移碼翻譯機(jī)制的定量研究體系。將海腎熒光素酶的ORF融合進(jìn)TBTV的ORF2中,構(gòu)建了移碼機(jī)制定量研究的基礎(chǔ)載體。以此載體為基礎(chǔ),構(gòu)建了一系列的突變體（點(diǎn)突變、缺失突變等）,對(duì)在體外翻譯體系和體內(nèi)翻譯體系中移碼機(jī)制的定量研究進(jìn)行了初步探索。同時(shí)為解釋該定量體系中出現(xiàn)的問(wèn)題,制備了海腎熒光素酶（Rluc）的多克隆抗體,并進(jìn)行了抗原親和純化；目前基本完成ORF2移碼翻譯機(jī)制的定量研究體系的創(chuàng)建,利用ORF1和Rluc的抗體分別檢測(cè)ORF1和ORF2-Rluc的表達(dá),其比值為移碼的效率。為建立基因組復(fù)制的定量研究體系,首先通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增到ORF1/ORF2融合蛋白序列并克隆到原核表達(dá)載體pMAL-C2X中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)TBTV ORF1/ORF2蛋白,經(jīng)過(guò)親和層析純化得到可溶性的目的蛋白。體外實(shí)驗(yàn)表明,該融合蛋白的酶活力較低,基因組復(fù)制的定量研究體系的條件有待優(yōu)化。另外,原核表達(dá)并純化了TBTV的ORF3和ORF4蛋白,為后期研究TBTV編碼的蛋白間互作以及蛋白與基因組RNA的互作儲(chǔ)備實(shí)驗(yàn)材料。
李曉靜[7]（2014）在《三七病毒病病原種類(lèi)鑒定及其相關(guān)病毒分子變異分析》文中指出三七是我國(guó)中藥材中的一顆明珠，具有非常重要的藥用和醫(yī)療保健價(jià)值。但因其特殊的生長(zhǎng)、管理?xiàng)l件，很容易造成病毒病的發(fā)生，該病害的發(fā)生嚴(yán)重影響三七的生活力，降低三七的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。但到目前為止，有關(guān)三七病毒病的研究很少，而且現(xiàn)有的研究也僅僅停留在三七病毒病原物的鑒定層面上。植物病毒病被稱(chēng)作是“植物的癌癥”，防治植物病毒病最重要的工作首先就是要明確病毒病原物，然后才能通過(guò)分析各個(gè)病原物的傳播方式、寄主范圍及發(fā)生規(guī)律等方面防控病毒病的發(fā)生。鑒于此，本文旨在通過(guò)對(duì)三七病毒病病原物開(kāi)展進(jìn)一步的鑒定研究，探明三七病毒中除三七Y病毒（Panax virus Y，PnVY）外的其他種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)種，明確其寄主范圍，確定病毒分離物/復(fù)合體與癥狀類(lèi)型的相關(guān)性，為進(jìn)一步深入開(kāi)展相關(guān)病毒的致病性分子機(jī)理、病害的監(jiān)測(cè)和預(yù)報(bào)以及有效防控提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)，并對(duì)國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域的相關(guān)研究工作起到一定的借鑒和推動(dòng)作用。本文以三七病葉為材料提取dsRNA及提純病毒，并嘗試以dsRNA為模板構(gòu)建cDNA文庫(kù)得到可能的病毒種類(lèi)，以三七病毒提純產(chǎn)物為材料通過(guò)電鏡技術(shù)和SDS-PAGE、質(zhì)譜分析技術(shù)分別進(jìn)行病毒粒子形態(tài)觀(guān)察及可能的病毒種類(lèi)初步鑒定。結(jié)果經(jīng)dsRNA、提純病毒及電鏡技術(shù)等再次驗(yàn)證三七病樣除了PnVY之外還存在不止一種病毒病原物。而由于提取的dsRNA濃度過(guò)低，致使沒(méi)能成功完成對(duì)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示三七病樣中可能存在大豆矮縮病毒（Soybean dwarf virus，SbDV），但經(jīng)SbDV特異性引物檢測(cè)及序列分析，并未在該批三七病樣中檢測(cè)到SbDV。應(yīng)用雙生病毒（geminiviruses）的基因組DNA及衛(wèi)星（betasatellite）的DNA檢測(cè)通用引物和中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的特異性引物，在三七病樣YWSh03中檢測(cè)到了的TYLCCNV和TYLCCNB，并獲得了TYLCCNV和TYLCCNB的全長(zhǎng)基因組序列。然后將含有TYLCCNV及TYLCCNB侵染性克隆的農(nóng)桿菌菌懸液、菌落接種至三七葉片上，并且通過(guò)獲毒的粉虱對(duì)三七進(jìn)行傳毒試驗(yàn)。結(jié)果農(nóng)桿菌接種的三七苗都表現(xiàn)為黃化癥狀，而粉虱傳毒的三七苗癥狀不明顯，但通過(guò)PCR檢測(cè)均能檢測(cè)到TYLCCNV和TYLCCB。通過(guò)分子生物學(xué)和生物學(xué)的方法證實(shí)了TYLCCNV及TYLCCNB對(duì)三七的侵染，完成了柯赫氏法則的驗(yàn)證，這是TYLCCNV及TYLCCNB侵染人參屬植物的首次報(bào)道。以三七病葉、dsRNA和病毒提純產(chǎn)物為接種材料，將其摩擦接種于供試植株中，接種一月之久，大部分寄主表現(xiàn)出褪綠黃化的癥狀，但經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后，PnVY的寄主只有有茄科的黃煙、辣椒和豆科的豇豆。對(duì)文山、紅河、昆明、曲靖等地的三七種植園進(jìn)行了病害調(diào)查和相關(guān)病毒的檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)三七病毒病的癥狀類(lèi)型多樣，發(fā)病率逐年增加，且田間表現(xiàn)復(fù)合癥狀的居多。初步建立了PnVY和TYLCCNV的雙重PCR檢測(cè)體系，該體系能夠快速及時(shí)準(zhǔn)確的對(duì)三七田間這兩種病毒的發(fā)生開(kāi)展檢測(cè)及分析。運(yùn)用雙重PCR檢測(cè)體系對(duì)不同地區(qū)三七病樣的PnVY和TYLCCNV的帶毒率進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)由兩種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象較多，復(fù)合侵染率在38.7%50.0%之間，且從整體來(lái)講，PnVY對(duì)三七的侵染率最高。獲得了5個(gè)PnVY分離物的全基因組序列、6個(gè)TYLCCNV分離物基因組全序列及4個(gè)TYLCCNB的基因組全序列，并對(duì)其進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析，推測(cè)三七病毒病復(fù)雜多樣的癥狀類(lèi)型可能與TYLCCNV及TYLCCNB無(wú)太大相關(guān)性，但可能與PnVY的基因組結(jié)構(gòu)相關(guān)，尤其是PnVY的P1蛋白可能與三七癥狀多樣性相關(guān)。
李夏蓮[8]（2012）在《侵染煙草、蘿卜的蕪菁花葉病毒CP基因序列差異及煙蚜傳毒能力研究》文中研究表明煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。在煙草生產(chǎn)中煙草花葉病發(fā)生普遍,對(duì)煙葉產(chǎn)量和烤煙質(zhì)量造成巨大損失,嚴(yán)重制約煙區(qū)煙葉生產(chǎn)。煙草花葉病可由煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）,馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）以及近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）侵染引起。田間主要由煙蚜（Myzus persicae Sulzer）進(jìn)行非持久性傳播。目前,TuMV在煙田發(fā)生已呈現(xiàn)出逐年擴(kuò)散的趨勢(shì)。田間癥狀表現(xiàn)更加復(fù)雜并已造成嚴(yán)重危害,已成為煙草作物上的一種新的病毒病害。TuMV主要侵染十字花科作物,田間侵染煙草的TuMV是否發(fā)生變異,介體蚜蟲(chóng)傳毒能力有何變化,目前尚無(wú)研究和報(bào)道。本論文以侵染煙草的蕪菁花葉病毒和介體煙蚜為對(duì)象,應(yīng)用媒介昆蟲(chóng)學(xué)及分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)手段,比較研究了重慶地區(qū)煙草花葉病病原種類(lèi)、煙田有翅蚜發(fā)生動(dòng)態(tài)與煙草花葉病發(fā)生的關(guān)系、影響蚜蟲(chóng)傳毒能力的侵染煙草和蘿卜的TuMV外殼蛋白CP基因序列差異,煙蚜不同實(shí)驗(yàn)種群傳播煙草TuMV的能力,為蚜傳非持久性病毒傳毒機(jī)制研究以及煙草TuMV的綜合治理提供依據(jù)。本論文主要研究結(jié)果如下：1武隆煙區(qū)有翅蚜發(fā)生動(dòng)態(tài)與煙草花葉病發(fā)生的關(guān)系通過(guò)對(duì)武隆煙區(qū)煙田黃板誘蚜及鑒定發(fā)現(xiàn),誘集的有翅蚜主要有4種,即煙蚜、蘿卜蚜、大豆蚜,棉蚜。其中煙蚜數(shù)量最多,所占比例最大。但僅有煙蚜能夠在煙株上定殖。田間煙草花葉病的發(fā)生與有翅蚜的遷入動(dòng)態(tài)緊密相關(guān)。2011年武隆煙區(qū)煙草花葉病在7月上旬始發(fā),到7月中下旬盛發(fā),至7月底8月初煙草花葉病的發(fā)生趨于平穩(wěn)。而有翅蚜遷入煙田的高峰期為7月中旬,加上煙草花葉病的潛育期,結(jié)果表明煙草花葉病的發(fā)生和有翅蚜遷入數(shù)量的增加在時(shí)間上相吻合。2煙草花葉病病原的檢測(cè)鑒定從武隆煙區(qū)采集的100多個(gè)煙草花葉病樣品中隨機(jī)選取24個(gè)待測(cè)樣品進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明,24個(gè)檢測(cè)樣品均感染了TMV、CMV、PVY、TuMV,4種病毒100%復(fù)合侵染,但各病毒含量有顯著的差異。其中PVY含量最高,TuMV次之,CMV最低。結(jié)果表明武隆煙區(qū)田間煙草花葉病病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重,PVY、TuMV己成為武隆煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)毒原。3侵染煙草和蘿卜TuMV CP基因的克隆及序列分析克隆了侵染煙草和蘿卜上的TuMV的CP基因,其核苷酸序列長(zhǎng)度分別是986bp和984bp,分別編碼326個(gè)和307個(gè)氨基酸。對(duì)二者CP核苷酸序列、氨基酸序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)在TuMV的CP核苷酸序列上有14個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化,在氨基酸序列上有8個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變,但是二者CP基因編碼的氨基酸均含有蚜蟲(chóng)傳播TuMV所必需的DAG基序。相似性比較結(jié)果表明,本研究克隆的兩個(gè)CP基因序列的核苷酸相似性為98.6%,氨基酸相似性為96.4%。4煙蚜傳播TuMV的傳毒效率研究取食不同寄主的煙蚜傳播TuMV的效率不同。在每健株接獲毒無(wú)翅成蚜10頭的條件下,取食煙草的煙蚜傳毒效率最高,發(fā)病率為85%,取食蘿卜的次之,發(fā)病率為65%,取食甘藍(lán)的煙蚜最低,發(fā)病率為40%；同時(shí),取食煙草的煙蚜導(dǎo)致供試煙株發(fā)病時(shí)間最早,取食甘藍(lán)的最晚,蘿卜次之。不同蟲(chóng)口密度下煙蚜傳毒效率差異顯著。5個(gè)處理按照供試煙株發(fā)病率高低順序依次排列是：20頭=15頭>10頭>5頭>1頭,其中,蟲(chóng)口密度是15,20頭時(shí),煙蚜傳毒效率最高,供試煙株發(fā)病率達(dá)到100%,發(fā)病時(shí)間出現(xiàn)最早；而蟲(chóng)口密度為1頭時(shí),煙蚜傳毒效率最低,供試煙株的發(fā)病率為25%,發(fā)病時(shí)間也較晚。
龍亞芹,王萬(wàn)東,左瑞娟,李凡,尹朝先,陳海如[9]（2011）在《煙草叢頂病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表達(dá)、抗血清制備及應(yīng)用》文中研究說(shuō)明為制備煙草叢頂病毒（TBTV）ORF3和ORF4多克隆抗體,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龍陵分離物（TBTV-BSLLi）的ORF3和ORF4,亞克隆至pMD18-T載體中,經(jīng)測(cè)序正確后,將該基因插入原核表達(dá)載體pET28a（+）中,通過(guò)熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（plysS）,以IPTG誘導(dǎo)6×His融合蛋白的表達(dá),并經(jīng)Ni2+親和柱層析純化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的純化體系,獲得了高純度的ORF3、ORF4蛋白。用純化的蛋白免疫大白兔,獲得高效價(jià)的特異性抗血清。DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,制備的抗血清可用于田間煙草（Nicotiana tabacumL.）樣品及傳播介體的檢測(cè)。本研究為用血清學(xué)方法檢測(cè)該病毒提供了基礎(chǔ)條件。
李華[10]（2008）在《煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）病株及溫度對(duì)煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育的影響》文中指出煙蚜Myzus persicae（Sulzer）又名桃蚜,是我國(guó)各煙區(qū)煙草上的主要害蟲(chóng)之一,也是傳播馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）的主要媒介昆蟲(chóng)。近幾年來(lái)的調(diào)查研究表明,馬鈴薯Y病毒（PVY）在我國(guó)煙區(qū)為害成逐年上升的趨勢(shì)。本文對(duì)重慶煙區(qū)煙草上的PVY病原進(jìn)行了分離和鑒定,測(cè)定了煙蚜傳播馬鈴薯Y病毒（PVY）的能力,并從煙草PVY病株、溫度對(duì)煙蚜種群生命表參數(shù)的影響三方面研究了煙草PVY病株、溫度對(duì)煙蚜種群系統(tǒng)的作用。本文主要研究結(jié)果如下:1煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）病原的分離與鑒定利用PVY的鑒別寄主三生煙和枯斑寄主莧色藜對(duì)PVY進(jìn)行了分離,并用鑒別寄主譜和間接EUSA對(duì)分離的PVY進(jìn)行了生物學(xué)和血清學(xué)鑒定,建立了PVY實(shí)驗(yàn)室毒源。在進(jìn)行病毒鑒定時(shí),待測(cè)病毒在云煙85、云煙87、普通煙、心葉煙和三生煙上呈現(xiàn)系統(tǒng)花葉癥狀,葉片上有斑駁,稍微扭曲畸形;在莧色藜上呈現(xiàn)局部枯斑癥狀;在千日紅上不侵染。待測(cè)病毒樣品OD＞0.5,樣品OD/陰性對(duì)照OD≥2,這表明待測(cè)病毒為馬鈴薯Y病毒（PVY）。2煙蚜傳播馬鈴薯Y病毒（PVY）的研究利用毒源植物飼毒法研究了煙蚜傳播馬鈴薯Y病毒的獲毒時(shí)間、傳毒時(shí)間、傳毒蚜量以及不同蟲(chóng)態(tài)對(duì)傳毒效應(yīng)的影響。結(jié)果表明:煙蚜在0.5min時(shí)間就能獲毒或傳毒,而且發(fā)病率隨著獲毒時(shí)間與傳毒時(shí)間的增加而提高。當(dāng)獲毒時(shí)間和傳毒時(shí)間超過(guò)3min時(shí),發(fā)病率提高幅度減緩。每株煙株1頭煙蚜成蟲(chóng)便可傳毒,傳毒煙蚜數(shù)量在1頭/株到3頭/株時(shí),隨著煙蚜數(shù)量增加,發(fā)病率提高得比較明顯,當(dāng)煙蚜數(shù)量大于等于5頭/株時(shí),發(fā)病率提高的趨勢(shì)就減緩了。若蚜（2-3齡）、無(wú)翅成蚜與有翅成蚜均可傳毒,無(wú)翅成蚜與有翅成蚜比若蚜（2-3齡）的傳毒能力強(qiáng)。3煙草PVY病株及溫度對(duì)煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育的影響在19℃、22℃、25℃、28℃和31℃恒溫條件下,研究了在健康煙株上和PVY病株上煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)仔量的情況。研究表明,隨著溫度的升高,在健康煙株上煙蚜的繁殖期、繁殖后期和成蟲(chóng)壽命都顯著縮短,產(chǎn)仔量也明顯減少。19℃時(shí)煙蚜的繁殖期（20.705d）、成蟲(chóng)壽命（24.589d）、產(chǎn)仔量（47.10頭）都達(dá)到最大值,31℃時(shí)繁殖期（4.061d）、成蟲(chóng)壽命（7.242d）、產(chǎn)仔量（6.06頭）都降到最小值。凈增值率R0和世代平均周期T在19℃時(shí)最大,在31℃時(shí)最小;周限增長(zhǎng)率λ與內(nèi)稟增長(zhǎng)率rm在25℃時(shí)最大,在31℃時(shí)最小;種群加倍時(shí)間t在25℃時(shí)最小,31℃時(shí)最大。總體看來(lái)25℃為煙蚜最適溫度。隨著溫度的升高,在PVY病株上煙蚜的繁殖期、成蟲(chóng)壽命和產(chǎn)仔量也都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。19℃時(shí)煙蚜的繁殖期（19.013d）、成蟲(chóng)壽命（21.191d）、產(chǎn)仔量（38.347頭）最大。31℃時(shí)繁殖期（2.694d）和成蟲(chóng)壽命（5.611d）最短,產(chǎn)仔量最少（2.722頭）。凈增值率R0和世代平均周期T在19℃時(shí)最大,在31℃時(shí)最小;周限增長(zhǎng)率λ與內(nèi)稟增長(zhǎng)率rm在19℃和25℃時(shí)差異不大,內(nèi)稟增長(zhǎng)率rm在31℃時(shí)出現(xiàn)了最小的負(fù)值。在同一溫度下,在健康煙株上的煙蚜與PVY病株上的煙蚜相比,在發(fā)育歷期、產(chǎn)仔量以及生命表參數(shù)上都有顯著的差異,表現(xiàn)在煙蚜取食煙草PVY病株后其若蟲(chóng)期呈現(xiàn)延長(zhǎng)趨勢(shì),而繁殖期、成蟲(chóng)壽命都顯著縮短,產(chǎn)仔量也大大的減少。這說(shuō)明健康煙株比PVY病株適合煙蚜的生長(zhǎng)。因此,25℃的健康煙株最適合煙蚜的生長(zhǎng)。
二、煙草叢頂病穴TBTV雪傳毒特性及寄主范圍研究（論文開(kāi)題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問(wèn)題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問(wèn)題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀(guān)點(diǎn)或解決方法。
寫(xiě)法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過(guò)程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁(yè)面大小,采用多級(jí)分層頁(yè)表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁(yè)表轉(zhuǎn)換過(guò)程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀(guān)察法：用自己的感官和輔助工具直接觀(guān)察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過(guò)主支變革、控制研究對(duì)象來(lái)發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過(guò)調(diào)查文獻(xiàn)來(lái)獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過(guò)具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來(lái)分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過(guò)創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來(lái)間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、煙草叢頂病穴TBTV雪傳毒特性及寄主范圍研究（論文提綱范文）
（1）煙草叢頂病毒不依賴(lài)帽子翻譯中的遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 RNA病毒的不依賴(lài)帽子翻譯機(jī)制 |
| 1.1.1 RNA病毒的5’端核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(5’IRES) |
| 1.1.2 RNA病毒的3’端不依賴(lài)帽子翻譯調(diào)控元件(3’CITE) |
| 1.2 煙草叢頂病及煙草叢頂病毒 |
| 1.2.1 煙草叢頂病 |
| 1.2.2 煙草叢頂病毒 |
| 1.2.3 煙草叢頂病毒的不依賴(lài)帽子翻譯 |
| 1.3 研究目的及意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 質(zhì)粒、菌株、抗體 |
| 2.1.2 所用分子生物學(xué)試劑 |
| 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2.1.4 引物合成和測(cè)序 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 堿裂解法小量提質(zhì)粒 |
| 2.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) |
| 2.2.3 重疊PCR反應(yīng) |
| 2.2.4 酶切反應(yīng) |
| 2.2.5 連接反應(yīng) |
| 2.2.6 核酸的沉淀和濃縮 |
| 2.2.7 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的膠回收 |
| 2.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.2.9 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.10 菌落PCR篩選突變體質(zhì)粒 |
| 2.2.11 體外轉(zhuǎn)錄 |
| 2.2.12 小麥胚芽提取物(WGE)中的體外翻譯 |
| 2.2.13 考馬斯亮藍(lán)染色 |
| 2.2.14 Western Blot分析 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 TBTV RI區(qū)嵌合突變體通過(guò)影響遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作調(diào)控翻譯 |
| 3.2 TBTV RI區(qū)調(diào)控遠(yuǎn)距離互作的分子開(kāi)關(guān)定位 |
| 4 討論 |
| 4.1 3 ’CITE介導(dǎo)的翻譯增強(qiáng)機(jī)制 |
| 4.2 TBTV不依賴(lài)帽子翻譯中的3’CITE元件 |
| 4.3 TBTV不依賴(lài)帽子翻譯中的遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附表1引物列表 |
| 附表2質(zhì)粒列表 |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況 |
（2）煙草叢頂病病原病毒復(fù)合體各組分傳播特性的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、前言 |
| 1.1 煙草叢頂病研究概況 |
| 1.1.1 煙草叢頂病的發(fā)生與分布 |
| 1.1.2 煙草叢頂病的病原物 |
| 1.1.3 煙草叢頂病的分子生物學(xué)特性 |
| 1.2 煙草叢頂病癥狀和傳播途徑 |
| 1.2.1 煙草叢頂病癥狀 |
| 1.2.2 煙草叢頂病的寄主范圍 |
| 1.2.3 煙草叢頂病的傳播特性 |
| 1.3 幽影病毒屬相關(guān)研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 幽影病毒屬的基本特性 |
| 1.3.2 幽影病毒屬代表病害及基因組特性 |
| 1.3.2.1 花生叢簇病 |
| 1.3.2.2 胡蘿卜斑駁病毒 |
| 1.4 黃癥病毒科研究進(jìn)展 |
| 1.4.1 馬鈴薯卷葉病毒屬代表病毒及生物學(xué)特性 |
| 1.4.2 馬鈴薯卷葉病毒 |
| 1.4.3 大麥黃矮病毒 |
| 1.5 植物病毒互作機(jī)制的研究 |
| 1.5.1 植物病毒傳播特性 |
| 1.5.2 黃癥病毒科與幽影病毒屬病毒及其衛(wèi)星RNA在傳播中的關(guān)系 |
| 1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒侵染性克隆 |
| 1.6.1 農(nóng)桿菌 |
| 1.6.2 農(nóng)桿菌滲濾 |
| 1.7 目的與意義 |
| 二、材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供試材料 |
| 2.1.2 相關(guān)試劑及儀器 |
| 2.1.3 儀器設(shè)備 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 病毒復(fù)合體組分互作研究 |
| 2.2.1 農(nóng)桿菌浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.1.1 質(zhì)粒提取 |
| 2.2.1.2 GV3101感受態(tài)細(xì)胞制備 |
| 2.2.1.3 電擊轉(zhuǎn)化GV3101感受態(tài)細(xì)胞 |
| 2.3 TVDV、TBTV、TBTV SatRNA、TVDVaRNA不同組合接種實(shí)驗(yàn) |
| 2.3.1 單菌落培養(yǎng) |
| 2.3.2 擴(kuò)大培養(yǎng) |
| 2.3.3 滲濾Buffer液重懸浮 |
| 2.3.4 農(nóng)桿菌滲濾接種病毒方法 |
| 2.3.5 植物總RNA的提取 |
| 2.3.6 去除基因組DNA |
| 2.3.7 RT-PCR檢測(cè) |
| 2.3.8 蚜蟲(chóng)傳播實(shí)驗(yàn) |
| 2.3.9 提取蚜傳煙樣總RNA |
| 2.3.10 RT-PCR檢測(cè) |
| 2.4 未定性病毒RNA組分序列鑒定 |
| 2.4.1 制備煙草叢頂病侵染的煙草樣品 |
| 2.4.2 病毒粒體的提純方法: |
| 2.4.3 未定性病毒RNA組分測(cè)序鑒定 |
| 2.4.3.1 RNA質(zhì)檢、定量及純化 |
| 2.4.3.2 建庫(kù) |
| 三 結(jié)果與分析 |
| 3.1 煙草叢頂病病原病毒復(fù)合體各個(gè)RNA組分的蚜蟲(chóng)傳播關(guān)系 |
| 3.1.1 農(nóng)桿菌滲濾接種侵染實(shí)驗(yàn) |
| 3.1.1.1 各種不同侵染組合總RNA RT-PCR驗(yàn)證 |
| 3.1.1.2 不同侵染組合在本氏煙上的癥狀 |
| 3.1.2 蚜蟲(chóng)傳播實(shí)驗(yàn) |
| 3.1.2.1 本氏煙蚜傳烤煙總RNA RT-PCR驗(yàn)證 |
| 3.1.2.2 不同病毒組合經(jīng)蚜蟲(chóng)從本氏煙向其他烤煙傳播后植株癥狀 |
| 3.1.2.3 不同病毒組合經(jīng)蚜蟲(chóng)從烤煙向烤煙傳播 |
| 3.2 病毒組分RNA5序列鑒定 |
| 3.2.1 病毒提純 |
| 3.2.2 RNA質(zhì)檢、定量及純化 |
| 四 結(jié)論和討論 |
| 4.1 煙草叢頂病病原病毒復(fù)合體各組分不同組合在植物上引起的癥狀 |
| 4.2 煙草叢頂病病原病毒復(fù)合體中各組分的不同組合的蚜蟲(chóng)傳播特征 |
| 4.3 在煙草上發(fā)現(xiàn)的一種新的呼腸孤病毒 |
| 附錄一、英文縮略表 |
| 附錄二、候選序列 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
（3）煙草叢頂病毒不依賴(lài)帽子翻譯機(jī)制的RNA結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與分子進(jìn)化（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 真核細(xì)胞典型的依賴(lài)帽子翻譯起始 |
| 1.2 植物RNA病毒不依賴(lài)帽子翻譯機(jī)制的研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 植物RNA病毒的5’IRES元件 |
| 1.2.2 植物RNA病毒的3’CITE元件 |
| 1.3 植物RNA病毒的分子進(jìn)化 |
| 1.4 RNA結(jié)構(gòu)分析方法 |
| 1.5 煙草叢頂病毒的研究進(jìn)展 |
| 1.6 本研究的目的和意義 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 質(zhì)粒、菌株、抗體、懸浮細(xì)胞 |
| 2.1.2 煙草叢頂病樣品 |
| 2.1.3 所用載體及試劑 |
| 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2.1.5 引物合成和測(cè)序 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物總RNA的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR檢測(cè) |
| 2.2.3 重疊PCR |
| 2.2.4 cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE) |
| 2.2.4.1 cDNA5’末端快速擴(kuò)增(5’RACE) |
| 2.2.4.2 cDNA3’末端快速擴(kuò)增(3’RACE) |
| 2.2.5 核酸的沉淀和濃縮 |
| 2.2.6 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的膠回收 |
| 2.2.7 連接反應(yīng) |
| 2.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.2.9 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.10 菌落PCR篩選重組質(zhì)粒 |
| 2.2.11 Cracking快速鑒定 |
| 2.2.12 酶切鑒定法 |
| 2.2.13 酶切反應(yīng) |
| 2.2.14 堿裂解法小量提質(zhì)粒 |
| 2.2.15 體外轉(zhuǎn)錄 |
| 2.2.16 5 ’加帽體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 |
| 2.2.17 在麥胚提取物(WheatGermExtract)中的體外翻譯 |
| 2.2.18 擬南芥原生質(zhì)體的制備與侵染 |
| 2.2.18.1 擬南芥愈傷組織的培養(yǎng) |
| 2.2.18.2 原生質(zhì)體的制備 |
| 2.2.18.3 原生質(zhì)體的侵染 |
| 2.2.19 WesternBlot分析 |
| 2.2.20 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) |
| 2.2.21 RNA體外結(jié)構(gòu)分析技術(shù)---In-lineprobing |
| 2.2.22 RNA體外結(jié)構(gòu)分析技術(shù)-SHAPE(selective2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,SHAPE) |
| 2.2.22.1 RNA的處理 |
| 2.2.22.2 引物標(biāo)記 |
| 2.2.22.3 SHAPE反應(yīng) |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 TBTV新分離物全基因組克隆與序列進(jìn)化分析 |
| 3.1.1 TBTV新分離物的全基因組克隆 |
| 3.1.2 TBTV的分子變異與進(jìn)化分析 |
| 3.1.2.1 TBTV的分子變異 |
| 3.1.2.2 TBTV系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) |
| 3.1.2.3 TBTVRNA重組分析 |
| 3.2 TBTV不依賴(lài)帽子翻譯元件BTE元件的結(jié)構(gòu)特征 |
| 3.2.1 BTE元件對(duì)Fluc報(bào)告基因的調(diào)控作用驗(yàn)證 |
| 3.2.2 BTE元件對(duì)TBTV病毒全長(zhǎng)p35蛋白的翻譯調(diào)控作用 |
| 3.3 TBTV不依賴(lài)帽子翻譯元件BTE元件的分子進(jìn)化 |
| 3.3.1 TBTV不同分離物的復(fù)制效率與p35蛋白表達(dá)分析 |
| 3.3.2 TBTVp35蛋白差異表達(dá)的調(diào)控區(qū)域定位 |
| 3.3.3 RV區(qū)調(diào)控p35蛋白差異表達(dá)的分子基礎(chǔ) |
| 3.3.3.1 RV區(qū)中造成p35降低的突變位點(diǎn)定位 |
| 3.3.3.2 TBTV不同分離物中BTE的結(jié)構(gòu)變異與p35蛋白表達(dá)的關(guān)系 |
| 3.3.3.3 TBTV弱毒分離物的BTE結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致p35蛋白表達(dá)量的降低 |
| 3.3.4 RI區(qū)調(diào)控p35蛋白差異表達(dá)的內(nèi)在機(jī)理 |
| 3.4 TBTV不依賴(lài)帽子翻譯元件類(lèi)TSS元件的定位與結(jié)構(gòu)特征分析 |
| 3.4.1 TBTV中新的不依賴(lài)帽子翻譯元件定位 |
| 3.4.1.1 缺失定位 |
| 3.4.1.2 缺失突變體元件的結(jié)構(gòu)分析 |
| 3.4.1.3 類(lèi)TSS元件與BTE元件的翻譯活性分析 |
| 3.4.1.4 類(lèi)TSS元件的結(jié)構(gòu)特征 |
| 4 討論 |
| 4.1 TBTV分子進(jìn)化 |
| 4.2 TBTV中的不依賴(lài)帽子翻譯元件 |
| 4.3 類(lèi)BTE元件在TBTV不同分離物的結(jié)構(gòu)進(jìn)化分析 |
| 4.4 CITE的分子進(jìn)化 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況 |
| 附錄 |
（4）煙草叢頂病毒RNA依賴(lài)RNA聚合酶的-1型移碼翻譯機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 RNA病毒基因組的表達(dá)策略 |
| 1.2 真核生物常規(guī)性蛋白表達(dá)機(jī)制 |
| 1.2.1 翻譯的起始 |
| 1.2.2 翻譯的延伸 |
| 1.2.3 翻譯的終止 |
| 1.2.4 核糖體的再循環(huán) |
| 1.3 RNA病毒采用的非典型蛋白翻譯表達(dá)機(jī)制 |
| 1.3.1 核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)（Internal Ribosome Entry Site，IRES）策略 |
| 1.3.2 滲漏掃描（Leaky scanning）策略 |
| 1.3.3 非AUG起始（Non-AUG initiation）策略 |
| 1.3.4 核糖體分流（Ribosome shunting）策略 |
| 1.3.5 翻譯的重起始（Reinitiation）策略 |
| 1.3.6 核糖體跳躍(Stop-Carry on/Ribosomal skipping)策略 |
| 1.3.7 通讀(Readthrough)策略 |
| 1.3.8 移碼（Frameshifting）策略 |
| 1.3.9 移碼與通讀的異同點(diǎn) |
| 1.4 煙草叢頂病毒（Tobacco bushy top virus, TBTV） |
| 1.5 研究的目的與意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 質(zhì)粒、菌株 |
| 2.1.2 分子生物學(xué)試劑 |
| 2.1.3 主要試驗(yàn)儀器 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） |
| 2.2.2 重疊延伸PCR |
| 2.2.3 核酸的沉淀及濃縮 |
| 2.2.4 質(zhì)?；蚱蔚拿盖?/td> |
| 2.2.5 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的切膠回收 |
| 2.2.6 連接反應(yīng) |
| 2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α 的轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.8 質(zhì)粒小量提?。▔A裂解法） |
| 2.2.9 體外轉(zhuǎn)錄制備RNA |
| 2.2.10 RNA沉淀濃縮 |
| 2.2.11 體外翻譯（在WGE中）及檢測(cè) |
| 2.2.12 Western Blot分析 |
| 2.2.13 核酸 5’末端的同位素標(biāo)記及后處理 |
| 2.2.13.1 RNA的脫磷酸化反應(yīng) |
| 2.2.13.2 RNA的 5'末端標(biāo)記反應(yīng) |
| 2.2.13.3 RNA片段的同位素標(biāo)記反應(yīng)的后處理 |
| 2.2.14 EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝膠遷移 |
| 2.2.14.1 RNA的變性---自然復(fù)性（Slow-cool down）處理 |
| 2.2.14.2 RNA-RNA結(jié)合試驗(yàn) |
| 2.2.15 線(xiàn)性化切割結(jié)構(gòu)分析（In-line probing） |
| 2.2.15.1 堿水解marker反應(yīng) |
| 2.2.15.2 Rnase T1酶解反應(yīng) |
| 2.2.15.3 線(xiàn)性化切割反應(yīng) |
| 2.2.16 SHAPE |
| 2.2.16.1 RNA folding反應(yīng) |
| 2.2.16.2 RNA modification反應(yīng) |
| 2.2.16.3 Primer extension and RNA sequencing反應(yīng) |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 TBTV Rd Rp -1 型移碼相關(guān)的七核苷酸滑動(dòng)序列 |
| 3.1.1 TBTV Rd Rp -1 型移碼的七核苷酸滑動(dòng)序列預(yù)測(cè) |
| 3.1.2 TBTV -1 型移碼的七核苷酸滑動(dòng)序列的突變分析 |
| 3.2 七核苷酸滑動(dòng)序列與下游二級(jí)結(jié)構(gòu)元件之間的距離效應(yīng) |
| 3.3 調(diào)控TBTV Rd Rp -1 型移碼的局部RNA元件 |
| 3.3.1 TBTV -1 型移碼位點(diǎn)附近的調(diào)控區(qū)域突變分析 |
| 3.3.2 移碼區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的解析 |
| 3.3.3 移碼區(qū)莖環(huán)結(jié)構(gòu)突變體對(duì)移碼效率的影響 |
| 3.4 影響TBTV -1 型移碼的遠(yuǎn)距離互作元件 |
| 3.4.1 TBTV基因組中遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作區(qū)域的確定 |
| 3.4.2 TBTV 3’末端區(qū)域結(jié)構(gòu)分析以及遠(yuǎn)距離互作位點(diǎn)的定位 |
| 3.4.3 遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作位點(diǎn)的突變驗(yàn)證 |
| 3.4.4 與下游結(jié)構(gòu)元件發(fā)生遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作位點(diǎn)的定位 |
| 4 討論 |
| 4.1 七核苷酸滑動(dòng)序列的保守性 |
| 4.2 七核苷酸滑動(dòng)序列臨近下游的激發(fā)元件 |
| 4.3 假節(jié)點(diǎn)對(duì)移碼的影響 |
| 4.4 七核苷酸滑動(dòng)序列與臨近下游激發(fā)元件之間的距離關(guān)系 |
| 4.5 遠(yuǎn)距離互作元件 |
| 4.6 TBTV Rd Rp -1 位移碼調(diào)控模型 |
| 4.7 RNA結(jié)構(gòu)體外分析 |
| 4.8 體外翻譯體系（WGE）的應(yīng)用 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況 |
| 附錄 |
（5）云南煙草叢頂病復(fù)合病原物的寄主范圍（論文提綱范文）
| 1材料與方法 |
| 1.1感染煙草叢頂病的煙株 |
| 1.2傳毒蚜蟲(chóng) |
| 1.3測(cè)試寄主的培育 |
| 1.4蚜蟲(chóng)傳毒測(cè)試寄主范圍及TBTD相關(guān)病毒檢測(cè) |
| 1.5接種植物總RNA提取 |
| 1.6接種植物中TBTD的4種病原物RT-PCR檢測(cè) |
| 2結(jié)果與分析 |
| 2.1蚜蟲(chóng)傳毒接種寄主的癥狀反應(yīng) |
| 2.2RT-PCR檢測(cè)接種植物中云南煙草叢頂病的4種病原物 |
| 3討論 |
（6）煙草叢頂病毒復(fù)制酶的移碼翻譯調(diào)控和基因組復(fù)制的定量研究系統(tǒng)的初創(chuàng)（論文提綱范文）
| 縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 煙草叢頂病毒 |
| 1.2 RNA病毒基因組的表達(dá)策略 |
| 1.3 RNA病毒的基因組復(fù)制 |
| 1.4 本研究的研究目的和意義 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 質(zhì)粒、菌株、植物種子 |
| 2.1.2 感病葉片 |
| 2.1.3 分子生物學(xué)試劑 |
| 2.1.4 主要試驗(yàn)儀器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 質(zhì)粒小量提取(堿裂解法) |
| 2.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) |
| 2.2.3 重疊延伸PCR |
| 2.2.4 核酸的沉淀及濃縮 |
| 2.2.5 質(zhì)?；蚱蔚拿盖?/td> |
| 2.2.6 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的回收 |
| 2.2.7 連接反應(yīng) |
| 2.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)Rosetta制備 |
| 2.2.9 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)Rosetta的轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.10 菌落PCR篩選重組質(zhì)粒 |
| 2.2.11 原核表達(dá) |
| 2.2.12 原核表達(dá)產(chǎn)物的可溶性檢測(cè) |
| 2.2.13 可溶性蛋白的Ni-NTA Resin親和層析純化(His標(biāo)簽) |
| 2.2.14 可溶性蛋白的Amylose Resin親和柱層析純化(MBP標(biāo)簽) |
| 2.2.15 蛋白的切膠純化 |
| 2.2.16 抗血清的制備 |
| 2.2.17 間接ELISA測(cè)效價(jià) |
| 2.2.18 抗原親和純化 |
| 2.2.19 Western Blot分析 |
| 2.2.20 體外轉(zhuǎn)錄制備RNA |
| 2.2.21 體外翻譯及檢測(cè) |
| 2.2.22 原生質(zhì)體的侵染 |
| 2.2.23 RdRp介導(dǎo)的體外復(fù)制實(shí)驗(yàn) |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 TBTV復(fù)制酶的移碼翻譯機(jī)制的定量研究體系的創(chuàng)建 |
| 3.1.1 TBTV ORF1蛋白多克隆抗體的制備 |
| 3.1.1.1 TBTV ORF1原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.1.1.2 TBTV ORF1的原核表達(dá)及純化 |
| 3.1.1.3 TBTV ORF1抗血清的制備、效價(jià)測(cè)定以及免疫原性分析 |
| 3.1.1.4 TBTV ORF1抗血清的抗原親和純化 |
| 3.1.1.5 TBTV ORF1多抗的應(yīng)用性分析 |
| 3.1.2 TBTV ORF2移碼翻譯機(jī)制的定性 |
| 3.1.3 海腎熒光素酶(Renilla luciferase,Rluc)多克隆抗體的制備 |
| 3.1.3.1 Rluc原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.1.3.2 Rluc蛋白的原核表達(dá)及純化 |
| 3.1.3.3 Rluc抗血清的制備、效價(jià)測(cè)定以及免疫原性分析 |
| 3.1.3.4 Rluc抗血清的抗原親和純化 |
| 3.1.3.5 Rluc多抗的應(yīng)用性分析 |
| 3.1.4 TBTV移碼翻譯機(jī)制的定量研究體系的初步創(chuàng)建 |
| 3.2 TBTV RdRp介導(dǎo)的體外復(fù)制研究體系的創(chuàng)建 |
| 3.2.1 TBTV RdRp的獲得 |
| 3.2.1.1 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白的原核表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 3.2.1.2 TBTVORF1/ORF2融合蛋白的原核表達(dá)及可溶性分析 |
| 3.2.2 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白介導(dǎo)的體外復(fù)制體系的創(chuàng)建 |
| 3.2.2.1 RNA模板的制備 |
| 3.2.2.2 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白介導(dǎo)的體外復(fù)制體系的初試 |
| 3.3 其它工作 |
| 3.3.1 TBTV ORF3和ORF4蛋白的純化 |
| 3.3.2 涉及TBTV ORF2移碼定量研究的缺失突變載體的構(gòu)建 |
| 4 討論 |
| 4.1 關(guān)于原核表達(dá) |
| 4.2 關(guān)于抗血清/多克隆抗體的制備 |
| 4.3 關(guān)于TBTV ORF2的移碼翻譯機(jī)制定性及定量研究體系的創(chuàng)建 |
| 4.4 關(guān)于TBTV RdRp介導(dǎo)的基因組復(fù)制的研究體系的創(chuàng)建 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 附表1 引物列表 |
| 附表2 質(zhì)粒列表 |
（7）三七病毒病病原種類(lèi)鑒定及其相關(guān)病毒分子變異分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 三七病毒病病原鑒定的研究概況 |
| 1.2 PnVY 的發(fā)現(xiàn)及其基因組結(jié)構(gòu) |
| 1.3 馬鈴薯 Y 病毒屬病毒簡(jiǎn)介及部分基因功能 |
| 1.4 雙生病毒的研究概況 |
| 1.4.1 雙生病毒的分類(lèi)、寄主范圍及介體傳播 |
| 1.4.2 雙生病毒的危害 |
| 1.5 TYLCCNV 和 TYLCCNB 的研究概況 |
| 1.5.1 TYLCCNV 和 TYLCCNB 的生物學(xué)特性及其基因組結(jié)構(gòu) |
| 1.5.2 TYLCCNV 和 TYLCCNB 在中國(guó)的研究現(xiàn)狀 |
| 1.5.3 TYLCCNV 在云南的發(fā)生分布及其遺傳多樣性 |
| 1.6 研究目的及意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常用分子生物學(xué)試劑和儀器 |
| 2.1.2 常用緩沖液及培養(yǎng)基配方 |
| 2.1.3 菌種及載體 |
| 2.2 侵染三七的病毒種類(lèi)鑒定 |
| 2.2.1 三七病葉 dsRNA 的提取 |
| 2.2.2 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建 |
| 2.2.3 三七病葉的病毒提純 |
| 2.2.4 提純病毒的負(fù)染、SDS-PAGE 電泳及質(zhì)譜分析 |
| 2.2.5 三七病樣總核酸的提取 |
| 2.2.6 PnVY 寄主范圍的測(cè)定 |
| 2.2.7 檢測(cè)引物的序列 |
| 2.2.8 RT-PCR 及 PCR 檢測(cè) |
| 2.2.9 PCR 產(chǎn)物的純化回收、克隆及序列拼接、確認(rèn)及提交 |
| 2.2.10 TYLCCNV 及 TYLCCNB 對(duì)三七的侵染 |
| 2.3 三七病毒病田間調(diào)查及 PnVY、TYLCCNV 雙重 PCR 檢測(cè)方法建立 |
| 2.3.1 三七病毒病田間調(diào)查時(shí)間與地點(diǎn) |
| 2.3.2 CTAB 法提取總核酸 |
| 2.3.3 雙重 PCR 檢測(cè)方法的建立 |
| 2.3.4 田間樣品分子檢測(cè)統(tǒng)計(jì) |
| 2.4 侵染三七的 PnVY 及 TYLCCNV 不同分離物間全基因組分子變異 |
| 2.4.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.4.2 CTAB 法提取總核酸 |
| 2.4.3 引物的設(shè)計(jì)與序列 |
| 2.4.4 RT-PCR 檢測(cè)、純化回收，克隆及序列拼接、確認(rèn)及提交 |
| 2.4.5 不同 PnVY 分離物的基因組序列分析 |
| 2.4.6 不同 TYLCCNV 和 TYLCCNB 分離物的基因組序列分析 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 侵染三七的病毒種類(lèi)的鑒定 |
| 3.1.1 可能引起三七病毒病的其他病毒 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.1.2 TYLCCNV 及 TYLCCNB 對(duì)三七的侵染 |
| 3.1.3 dsRNA 電泳檢測(cè) |
| 3.1.4 cDNA 文庫(kù)構(gòu)建 |
| 3.1.5 電鏡觀(guān)察 |
| 3.1.6 SDS-PAGE 電泳及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析 |
| 3.1.7 SbDV 的 RT-PCR 檢測(cè) |
| 3.2 PnVY 寄主范圍測(cè)試 |
| 3.2.1 三七病樣 dsRNA 提取產(chǎn)物和提純病毒的 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.2.2 供試寄主的癥狀類(lèi)型及 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3 三七病毒病田間調(diào)查及 PnVY 和 TYLCCNV 分子檢測(cè) |
| 3.3.1 田間三七病毒病癥狀類(lèi)型 |
| 3.3.2 田間三七病毒病的發(fā)生特點(diǎn) |
| 3.3.3 雙重 RT-PCR 檢測(cè)體系的初步建立 |
| 3.3.4 田間三七病樣的 PnVY 和 TYLCCNV 分子檢測(cè)統(tǒng)計(jì) |
| 3.4 侵染三七的 PnVY 及 TYLCCNV 不同分離物的分子變異 |
| 3.4.1 不同 PnVY 分離物的基因組全序列分析 |
| 3.4.2 不同 TYLCCNV 分離物的基因組全序列比較分析 |
| 4 討論 |
| 4.1 三七病毒病可能的其他病原 |
| 4.1.1 dsRNA 分析技術(shù) |
| 4.1.2 ToMV、CMV 及 SbDV 等三七上可能存在的病毒病原 |
| 4.1.3 TYLCCNV 和 TYLCCNB 對(duì)三七的致病性及危害 |
| 4.1.4 PnVY 寄主范圍的測(cè)試 |
| 4.2 雙重 RT-PCR 檢測(cè) PnVY 與 TYLCCNV 體系的建立 |
| 4.3 三七病毒病的田間調(diào)查及癥狀類(lèi)型與病毒病原的相關(guān)性 |
| 4.4 不同 PnVY 分離物編 P1 的氨基酸變異 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡(jiǎn)介 |
| 發(fā)表的文章及授權(quán)專(zhuān)利 |
（8）侵染煙草、蘿卜的蕪菁花葉病毒CP基因序列差異及煙蚜傳毒能力研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 TuMV的研究進(jìn)展 |
| 1.1 TuMV的生物學(xué)特性 |
| 1.2 TuMV基因組結(jié)構(gòu)和功能 |
| 1.3 TuMV的CP基因研究進(jìn)展 |
| 1.4 TuMV的檢測(cè)鑒定技術(shù) |
| 2 煙蚜的研究進(jìn)展 |
| 2.1 煙蚜的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性 |
| 2.2 對(duì)煙株的危害 |
| 2.3 煙蚜傳播非持久性病毒的蚜傳機(jī)理 |
| 引言 |
| 第二章 武隆地區(qū)煙草花葉病和介體蚜蟲(chóng)發(fā)生情況田間調(diào)查 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試驗(yàn)材料 |
| 1.2 試驗(yàn)地點(diǎn) |
| 1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) |
| 1.4 試驗(yàn)方法 |
| 1.5 數(shù)據(jù)處理 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 蚜蟲(chóng)田間種群數(shù)量消長(zhǎng)動(dòng)態(tài) |
| 2.2 有翅蚜發(fā)生與煙草花葉病的關(guān)系 |
| 3 討論 |
| 第三章 煙草花葉病毒病樣品的病原種類(lèi)檢測(cè) |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 供試材料 |
| 1.2 試驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 病原種類(lèi) |
| 2.2 煙草TuMV流行分析 |
| 3 討論 |
| 第四章 侵染煙草和蘿卜的TuMV CP基因序列分析 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試驗(yàn)材料 |
| 1.2 試驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果分析 |
| 2.1 RT-PCR結(jié)果 |
| 2.2 RT-PCR產(chǎn)物的克隆及重組子鑒定 |
| 2.3 序列測(cè)定與分析 |
| 3 討論 |
| 第五章 煙蚜不同實(shí)驗(yàn)種群傳播煙草TuMV的能力 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試驗(yàn)材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 試驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 取食不同寄主的煙蚜傳毒效率測(cè)定 |
| 2.2 不同蟲(chóng)口密度下煙蚜傳毒效率測(cè)定 |
| 3 討論 |
| 結(jié)論與討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章 |
| 致謝 |
（9）煙草叢頂病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表達(dá)、抗血清制備及應(yīng)用（論文提綱范文）
| 1 結(jié)果 |
| 1.1 目的片段及序列測(cè)定 |
| 1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 1.3 重組ORF3和ORF4的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 |
| 1.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化 |
| 1.5 抗血清的制備及效價(jià)測(cè)定 |
| 1.6 抗血清的Western的鑒定 |
| 1.7 抗血清的初步應(yīng)用 |
| 1.7.1 DAS-ELISA檢測(cè)不同地區(qū)、煙株不同部位的帶毒率 |
| 1.7.2 DAS-ELISA檢測(cè)傳毒介體蚜蟲(chóng)的帶毒率 |
| 2 討論 |
| 3 材料與方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 RT-PCR擴(kuò)增 |
| 3.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆 |
| 3.2.3 ORF3和ORF4原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.2.4 ORF3、ORF4的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè) |
| 3.2.5 ORF3和ORF4融合蛋白的純化 |
| 3.2.6 TBTV ORF3和ORF4抗血清的制備及效價(jià)測(cè)定 |
| 3.2.7 抗血清的初步應(yīng)用 |
（10）煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）病株及溫度對(duì)煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育的影響（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 煙蚜研究進(jìn)展 |
| 1.1 煙蚜的寄主范圍和危害 |
| 1.2 煙蚜的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性 |
| 1.3 煙蚜的傳毒特性 |
| 2 煙草馬鈴薯Y病毒的研究進(jìn)展 |
| 2.1 煙草PVY的生物學(xué)特性 |
| 2.2 危害與癥狀 |
| 2.3 傳播途徑 |
| 2.4 分離方法 |
| 2.5 檢測(cè)方法 |
| 前言 |
| 第2章 煙草馬鈴薯Y病毒(PVY)的分離和鑒定 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 鑒別寄主鑒定結(jié)果 |
| 2.2 間接ELISA檢測(cè)結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第3章 煙蚜傳播馬鈴薯Y病毒(PVY)的研究 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 數(shù)據(jù)分析 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 不同獲毒時(shí)間對(duì)傳毒效應(yīng)的影響 |
| 2.2 煙蚜傳毒時(shí)間對(duì)傳毒效應(yīng)的影響 |
| 2.3 煙蚜數(shù)量對(duì)傳毒效應(yīng)的影響 |
| 2.4 不同蟲(chóng)態(tài)對(duì)傳毒效應(yīng)的影響 |
| 3 討論 |
| 第4章 煙草PVY病株及溫度對(duì)煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育的影響 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 試驗(yàn)方法 |
| 1.3 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) |
| 1.4 數(shù)據(jù)分析 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 溫度對(duì)煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)仔量的影響 |
| 2.2 煙草PVY病株對(duì)煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)仔量的影響 |
| 2.3 溫度對(duì)煙蚜存活率的影響 |
| 2.4 PVY病株對(duì)煙蚜存活率的影響 |
| 2.5 不同溫度下健康煙株上煙蚜的種群主要生命表參數(shù) |
| 2.6 不同溫度下PVY病株上煙蚜的種群主要生命表參數(shù) |
| 3 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 碩士研究生期間發(fā)表的論文 |
| 致謝 |
四、煙草叢頂病穴TBTV雪傳毒特性及寄主范圍研究（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]煙草叢頂病毒不依賴(lài)帽子翻譯中的遠(yuǎn)距離RNA-RNA互作[D]. 竇寶存. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020
- [2]煙草叢頂病病原病毒復(fù)合體各組分傳播特性的研究[D]. 張未. 云南大學(xué), 2019(03)
- [3]煙草叢頂病毒不依賴(lài)帽子翻譯機(jī)制的RNA結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與分子進(jìn)化[D]. 王德亞. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017(08)
- [4]煙草叢頂病毒RNA依賴(lài)RNA聚合酶的-1型移碼翻譯機(jī)制研究[D]. 于成明. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017(08)
- [5]云南煙草叢頂病復(fù)合病原物的寄主范圍[J]. 馬普權(quán),劉芳,譚冠林,田芝花,李凡. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)), 2015(03)
- [6]煙草叢頂病毒復(fù)制酶的移碼翻譯調(diào)控和基因組復(fù)制的定量研究系統(tǒng)的初創(chuàng)[D]. 王國(guó)魯. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014(01)
- [7]三七病毒病病原種類(lèi)鑒定及其相關(guān)病毒分子變異分析[D]. 李曉靜. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014(12)
- [8]侵染煙草、蘿卜的蕪菁花葉病毒CP基因序列差異及煙蚜傳毒能力研究[D]. 李夏蓮. 西南大學(xué), 2012(08)
- [9]煙草叢頂病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表達(dá)、抗血清制備及應(yīng)用[J]. 龍亞芹,王萬(wàn)東,左瑞娟,李凡,尹朝先,陳海如. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011(02)
- [10]煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）病株及溫度對(duì)煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育的影響[D]. 李華. 西南大學(xué), 2008(09)