一、THE CORRELATION BETWEEN THE EXPRESSION OF MULTIDRUG RESISTANCE RELATED GENE AND CELL APOPTOSIS AND CLINICAL SIGNIFICANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER（論文文獻(xiàn)綜述）

方世旭^[1]（2021）在《PAQR3逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥機(jī)制研究》文中研究說明目的:通過生物信息學(xué)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PAQR3在非小細(xì)胞肺癌順鉑敏感株及順鉑耐藥株的表達(dá)差異。通過實(shí)驗(yàn)探索PAQR3對非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥株A549/DDP細(xì)胞增殖,遷移,凋亡及順鉑耐藥的影響,并初步探討該影響機(jī)制是否與Ras/Raf/MEK/ERK信號通路有關(guān)。方法:1.在GEO數(shù)據(jù)庫中搜索基因芯片,篩選A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞中的差異表達(dá)基因,并選出存在差異表達(dá)的基因PAQR3進(jìn)行研究。2.在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中檢索PAQR3在肺癌中的表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。3.通過蛋白印跡（Western Blot,WB）及實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-q PCR）檢測A549及A549/DDP細(xì)胞中PAQR3的表達(dá)水平。其次,用帶有PAQR3高表達(dá)及低表達(dá)的慢病毒轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞,構(gòu)建A549/DDP細(xì)胞的PAQR3高表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（oe-PAQR3）、高表達(dá)對照組（oe-NC）、低表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株（Si-PAQR3）、低表達(dá)對照組（Si-PAQR3）。與A549/DDP細(xì)胞對比,MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測單個(gè)細(xì)胞的增殖能力,MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的順鉑耐藥,流式細(xì)胞檢測術(shù)檢測細(xì)胞的周期及凋亡情況。4.WB實(shí)驗(yàn)檢測Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)中相關(guān)信號蛋白改變情況,探索該信號通路在PAQR3逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥所發(fā)揮的作用,檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3。同時(shí),檢測MDR1、MRP1、γ-H2A.X及LRP1等DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.在GEO數(shù)據(jù)庫中篩選得到A549及A549/DDP差異表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)集（GSE108214）,通過GEO2R在線分析軟件,與A549細(xì)胞對比,PAQR3基因在A549/DDP中呈低表達(dá)（Log FC=-0.955）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。2.在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中,檢測到965例患者為PAQR3低表達(dá)患者,960例患者為PAQR3高表達(dá)患者,生存預(yù)后的值分別為:總生存期（Overall Survival,OS）的危險(xiǎn)比（Hazard Ratio,HR）為0.87,95%置信區(qū)間（Confidence Interval,CI）為0.76-0.98,P<0.05;首次疾病進(jìn)展期（First Progression,FP）的HR為0.81,95%CI:0.67-0.98,P<0.05,后進(jìn)展生存期（Post Progression Survival,PPS）的HR為0.85,95%CI:0.66-1.1,P=0.22。提示低表達(dá)PAQR3與不良的癌癥預(yù)后顯著相關(guān)。3.WB及RT-qPCR結(jié)果顯示,與A549細(xì)胞相比,PAQR3在A549/DDP細(xì)胞的表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05）。4.細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高表達(dá)PAQR3可抑制A549/DDP細(xì)胞的增殖、遷移和克隆形成,促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變。相反,低表達(dá)PAQR3可促進(jìn)A549/DDP細(xì)胞增殖、遷移和克隆形成,阻止細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞由G1向S期轉(zhuǎn)變。5.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A549細(xì)胞順鉑藥物半數(shù)抑制濃度（50%of Inhibiting Concentration,IC50）為6.314μg/m L,A549/DDP細(xì)胞的IC50為21.49μg/m L,耐藥指數(shù)為3.403。與A549/DDP細(xì)胞相比,構(gòu)建了過表達(dá)的A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性顯著增加,oe-NC的IC50為21.84μg/m L,oe-PAQR3組的IC50為5.257μg/m L,耐藥指數(shù)為4.1544,差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Si-NC組相比,Si-PAQR3組的A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性下降,Si-NC的IC50為23.5μg/m L,Si-PAQR3組的IC50為47.56μg/m L,耐藥指數(shù)為0.4941,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。6.WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高表達(dá)PAQR3可下調(diào)b-Raf、P-b-Raf、P-MEK1/2、P-ERK1/2的表達(dá),抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號通路而提高A549/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性,低表達(dá)的PAQR3可上調(diào)b-Raf、P-b-Raf、P-MEK1/2、P-ERK1/2的表達(dá),激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路,降低A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性。同時(shí),高表達(dá)PAQR3可上調(diào)Bax、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá),下調(diào)Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡達(dá)到逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的效果。低表達(dá)PAQR3可下調(diào)Bax、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá),上調(diào)Bcl-2的表達(dá),使細(xì)胞凋亡受阻,增強(qiáng)細(xì)胞對順鉑的耐藥性。高表達(dá)PAQR3可上調(diào)MDR1、MRP1、γ-H2A.X,提高A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性,低表達(dá)PAQR3可下調(diào)MDR1、MRP1,降低A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性。結(jié)論:1.與A549細(xì)胞相比,PAQR3在A549/DDP細(xì)胞顯著低表達(dá),PAQR3高表達(dá)可增加A549/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性,低表達(dá)的PAQR3可增加A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性。2.PAQR3可能通過阻滯Ras/Raf/MEK/ERK通路及下調(diào)MDR1,MRP1,γ-H2A.X蛋白等逆轉(zhuǎn)A549/DDP對順鉑的耐藥?？赡芡ㄟ^激活Bax/Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3信號通路阻止A549/DDP細(xì)胞的增殖,遷移及克隆形成,阻滯細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

張志瑩^[2]（2021）在《西黃丸治療非小細(xì)胞肺癌療效的系統(tǒng)評價(jià)及作用機(jī)制研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理研究背景:肺癌是臨床常見的惡性腫瘤,在世界范圍內(nèi),發(fā)病率在惡性腫瘤中居第二位,死亡率居第一位。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要類型,發(fā)展新的治療手段和方法,一直是NSCLC臨床需要解決的一大難題。NSCLC的中醫(yī)研究也在不斷發(fā)展,西黃丸作為具有確切臨床療效的經(jīng)典抗癌中藥名方,對NSCLC的治療也發(fā)揮了作用。既往的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)西黃丸可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境等多種作用機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用,但研究多圍繞乳腺癌、胃癌,對于治療肺癌的機(jī)制,僅涉及有效率、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)抑瘤率等,較為局限,因此,西黃丸治療NSCLC的研究還存在較大空間,值得進(jìn)一步深入。研究目的:本研究結(jié)合系統(tǒng)綜述、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多種方法,研究西黃丸治療NSCLC的相關(guān)機(jī)制,為西黃丸在臨床治療NSCLC提供更多的數(shù)據(jù)支持和科學(xué)依據(jù)。研究方法:1.首先通過系統(tǒng)綜述和meta分析,評價(jià)西黃丸在臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)中治療NSCLC的效果,評價(jià)指標(biāo)包括:近期客觀有效率、臨床癥狀改善、生活質(zhì)量、不良反應(yīng)等。2.通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),對西黃丸抗NSCLC的活性成分和主要作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。首先通過中藥數(shù)據(jù)庫BATMAN-TCM檢索西黃丸中所有的活性成分及對應(yīng)靶點(diǎn),然后通過疾病數(shù)據(jù)庫DisGeNET、GeneCards、OMIM檢索NSCLC相關(guān)基因,將西黃丸的作用靶點(diǎn)和NSCLC疾病靶點(diǎn)兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行映射,篩選重復(fù)靶點(diǎn),構(gòu)建“西黃丸-NSCLC-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集。將數(shù)據(jù)集導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),將獲得的網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件中進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析,獲得“西黃丸-NSCLC-靶點(diǎn)”的核心作用靶點(diǎn)。然后使用Metascape工具對核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物功能注釋,分析西黃丸抗NSCLC的主要信號通路和生物過程等。3.通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),進(jìn)行西黃丸抗NSCLC的藥效學(xué)驗(yàn)證。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測西黃丸對小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株LL/2增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移能力和侵襲能力的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,以C57/BL6小鼠Lewis肺癌皮下瘤為模型,將小鼠分為對照組、西黃丸低劑量組（0.617g/kg,每日灌胃兩次）、西黃丸中劑量組（1.233g/kg,每日灌胃兩次）、西黃丸高劑量組（2.466g/kg,每日灌胃兩次）、順鉑組（3 mg/kg,每周腹腔注射一次）,并另設(shè)無瘤的空白組。藥物干預(yù)15天,觀察小鼠的一般狀態(tài)、皮下移植瘤體積及重量、體重及內(nèi)臟系數(shù),并通過HE染色觀察腫瘤和肝臟的組織病理變化和皮下瘤的肺轉(zhuǎn)移,通過Ki-67免疫組化染色觀察對腫瘤增殖的影響,并通過流式細(xì)胞數(shù)檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和 CD3+CD4+/CD3+CD8+免疫分型。4.通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法,對西黃丸高劑量組和對照組的腫瘤組織進(jìn)行RNA測序,進(jìn)行mRNA差異分析和基因功能注釋,分析西黃丸抗小鼠Lewis肺癌的主要信號通路和生物過程等。5.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot,WB）,對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選出的目標(biāo)分子變化進(jìn)行檢測,包括熱休克蛋白（heatshockprotein,HSP）家族、雌激素受體（estrogenreceptor,ER）、維甲酸X受體（Retinoid X receptor,RXR）、過氧化物酶體增殖激活受體（peroxisome proliferator activated receptor,PPAR）等。研究結(jié)果:1.Meta分析結(jié)果顯示,西黃丸輔助治療NSCLC能夠提高近期客觀有效率,改善患者的臨床癥狀,提高患者的生活質(zhì)量。但在改善肝腎功能異常、改善消化道癥狀和血液系統(tǒng)抑制方面,西黃丸輔助治療并未有明顯獲益。2.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示,西黃丸共檢索到74個(gè)靶點(diǎn)可預(yù)測的活性成分,“西黃丸-NSCLC-靶點(diǎn)”的核心作用靶點(diǎn)共230個(gè),包括HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA1A、ESR1、ESR2、RXRA、RXRB、RXRG、PPARG、PPARA 等。西黃丸抗 NSCLC 的相關(guān)KEGG通路有癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、內(nèi)分泌抵抗、foxo信號通路、雌激素信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗、HIF-1信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、催乳素信號通路、Ras信號通路、黏著斑和非小細(xì)胞肺癌等。GO富集分析顯示,西黃丸抗NSCLC涉及的主要生物過程有細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、凋亡信號通路、對類固醇激素的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞死亡的正調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正調(diào)控等。3.藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,西黃丸含藥血清在體外對Lewis肺癌細(xì)胞株LL/2并無顯著的增殖抑制作用,西黃丸浸提液對LL/2有濃度依賴的抑制作用,作用24 h時(shí),西黃丸浸提液對LL/2細(xì)胞的IC50為1.830 mg/mL。流式結(jié)果顯示,作用24 h時(shí),西黃丸浸提液對LL/2細(xì)胞有明顯的促凋亡作用,能夠促進(jìn)LL/2細(xì)胞株向G2/M期轉(zhuǎn)化。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,作用24h時(shí),西黃丸浸提液能夠降低LL/2細(xì)胞株的遷移能力和侵襲能力,且這種作用呈濃度依賴性。在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型中,西黃丸對皮下腫瘤的生長抑制作用具有濃度依賴性,其中西黃丸高劑量組能夠抑制小鼠皮下瘤的生長,其劑量為臨床等效劑量的2倍。腫瘤的病理結(jié)果顯示,西黃丸高劑量組和順鉑組有大片的細(xì)胞壞死區(qū)。Ki-67免疫組化染色結(jié)果顯示,西黃丸和順鉑均能降低Ki-67陽性腫瘤細(xì)胞的個(gè)數(shù),西黃丸的這種作用與濃度關(guān)系不大。肝臟的病理結(jié)果顯示,各組的肝組織均為正常的肝實(shí)質(zhì),無明顯異常。脾細(xì)胞流式分型結(jié)果顯示,各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD4+/CD3+CD8+未見顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.對西黃丸高劑量組和對照組的皮下瘤進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序,結(jié)果篩選出406個(gè)差異基因,其中130個(gè)基因表達(dá)上調(diào),276個(gè)基因表達(dá)下調(diào),差異基因包括:Hspb7、Hspb1、Hspb6等。對差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,結(jié)果顯示,顯著性改變明顯的信號通路有:腫瘤壞死因子（tumornecrosis factor,TNF）信號通路、雌激素信號通路、胰島素分泌、環(huán)鳥苷酸依賴性蛋白激酶（cyclic guanosine monophosphate-dependent protein kinase,cGMP-PKG）信號通路、脂肪細(xì)胞中的脂肪分解調(diào)節(jié)、脂肪細(xì)胞因子信號通路、催產(chǎn)素信號通路、過氧化物酶體增殖激活受體信號通路等。5.PCR和WB結(jié)果顯示,西黃丸能夠降低小鼠Lewis肺癌腫瘤組織中Hspb6、Hspb7、Hspb1、Hspb2、Hspa1a、Hspa8、Hsph1 和的 mRNA 表達(dá)水平,且能夠降低 HSPB7、HSP27、HSP70、HSPH1蛋白的表達(dá)水平,升高HSC70的蛋白質(zhì)表達(dá)水平,而不影響HSP20、HSP90的蛋白質(zhì)水平。西黃丸能夠降低小鼠Lewis肺癌腫瘤組織中Esr1、Rxra、Krt19、Ppara、Ppard和Pparg的mRNA表達(dá)水平,并降低ER、RXRα蛋白的表達(dá),升高PPARδ和PPARγ的蛋白表達(dá),對KRT19和PPARα的表達(dá)水平無明顯影響。研究結(jié)論:1.西黃丸輔助治療NSCLC能夠提高近期客觀有效率,改善患者的臨床癥狀,提高患者的生存質(zhì)量。2.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,西黃丸通過多靶點(diǎn)、多通路作用于NSCLC,核心作用靶點(diǎn)包括HSP家族、ER等。3.西黃丸在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,均表現(xiàn)出抗小鼠Lewis肺癌的作用,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中無明顯毒性,其有效劑量為臨床等效劑量的2倍。其抗小鼠Lewis肺癌的機(jī)制可能與降低HSP27、HSP70、HSPH1、ER的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平,升高PPARγ的蛋白質(zhì)表達(dá)水平相關(guān)。

蔡曉燕^[3]（2021）在《MACC1、MRP、LRP與肺腺癌順鉑耐藥的相關(guān)性研究》文中指出背景肺腺癌是多發(fā)于支氣管黏膜上皮或大支氣管黏液腺的惡性腫瘤。肺腺癌易發(fā)于年齡偏小、無吸煙史的女性中,且臨床癥狀不明顯。肺腺癌雖然腫瘤組織生長緩慢,但多在早期就出現(xiàn)多發(fā)轉(zhuǎn)移,因此化療是目前臨床治療肺腺癌的主要方法之一,但大約三分之一的肺腺癌患者化療后會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥,導(dǎo)致化療失敗。多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞對多種化療藥物產(chǎn)生的交叉耐藥現(xiàn)象。當(dāng)今國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明,多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）、肺耐藥蛋白（LRP）、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）與肺腺癌的多藥耐藥相關(guān)。順鉑是臨床化學(xué)治療肺腺癌的基本藥物,肺腺癌患者對順鉑及順鉑類藥物表現(xiàn)出的耐藥性,是臨床化療肺腺癌療效較差的直接原因,因此研發(fā)更有效的新型化療藥物已迫在眉睫。目的1.考察肺腺癌組織細(xì)胞對順鉑的耐藥性。2.探究MACC1、MRP、LRP與肺腺癌順鉑耐藥的相關(guān)性,為臨床采用更為高效的順鉑化療方案治療肺腺癌提供實(shí)驗(yàn)室參考。方法1.取材及分組:收集手術(shù)切除的肺腺癌新鮮標(biāo)本75例,所有患者進(jìn)行手術(shù)前均未進(jìn)行放化療。每份標(biāo)本均分為2份:1份進(jìn)行原代細(xì)胞的體外培養(yǎng),以噻唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測肺腺癌細(xì)胞對含順鉑的藥敏試驗(yàn);1份標(biāo)本處理后以免疫組化法檢測腺癌組織細(xì)胞中MACC1、MRP、LRP的表達(dá)。2.藥敏實(shí)驗(yàn):采用MTT法檢測肺腺癌細(xì)胞對順鉑的總體耐藥性,考察不同分化程度、不同TNM分期肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。3.MACC1表達(dá)與肺腺癌順鉑耐藥之間的相關(guān)性:采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)考察肺腺癌組織細(xì)胞MACC1蛋白表達(dá)的情況,分析其表達(dá)情況與順鉑耐藥之間的相關(guān)性。4.MRP表達(dá)與肺腺癌順鉑耐藥之間的相關(guān)性:采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)考察肺腺癌組織細(xì)胞MRP蛋白表達(dá)的情況,分析其表達(dá)情況與順鉑耐藥之間的相關(guān)性。5.LRP表達(dá)與肺腺癌順鉑耐藥之間的相關(guān)性:采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)考察肺腺癌組織細(xì)胞LRP蛋白表達(dá)的情況,分析其表達(dá)情況與順鉑耐藥之間的相關(guān)性。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均帶入SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件系統(tǒng)處理。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,方差分析考察分化程度、TNM分期與肺腺癌對順鉑耐藥的相關(guān)性,Spearman相關(guān)分析考察MACC1、MRP、LRP與肺腺癌對順鉑耐藥性的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1.在選取的75例肺腺癌組織中,采用MTT法檢測肺腺癌細(xì)胞順鉑的耐藥性可知:32例（42.67%）對8.0μg.ml-1的順鉑耐藥,33例（44.00%）對6.0μg.ml-1的順鉑耐藥,31例（41.33%）對4.0μg.ml-1的順鉑耐藥,23例（30.67%）對2.0μg.ml-1的順鉑耐藥,且對4.0μg.ml-1順鉑的耐藥程度高于對2.0μg.ml-1順鉑的耐藥程度（P<0.05）,對4.0μg.ml-1和6.0μg.ml-1順鉑的耐藥性程度無差異,對6.0μg.ml-1和8.0μg.ml-1順鉑的耐藥性程度無差異。肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性與分化程度和TNM分期無關(guān)（P>0.05）。2.MACC1在75例肺腺癌組織中的表達(dá)情況為16例（21.33%）-、21例（28.00%）+、27例（36.00%）++、11例（14.67）+++,MACC1的表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性呈正相關(guān)（P<0.05）。3.MRP在75例肺腺癌組織中的表達(dá)情況為11例（14.66%）-、23例（30.67%）+、32例（42.67%）++、9例（12.00%）+++,MRP的表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性呈正相關(guān)（P<0.05）。4.LRP在75例肺腺癌組織中的表達(dá)情況為0例（0.00%）-、25例（33.33%）+、31例（41.33%）++、19例（25.34%）+++,LRP的表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論1.肺腺癌存在對順鉑的化療耐藥性。2.MACC1的表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性呈正相關(guān),參與介導(dǎo)肺腺癌對順鉑的耐藥。3.MRP的表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性呈正相關(guān),參與介導(dǎo)肺腺癌對順鉑的耐藥。4.LRP的表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性呈正相關(guān),參與介導(dǎo)肺腺癌對順鉑的耐藥。

余世龍^[4]（2020）在《鋅指蛋白300（ZNF300）參與非小細(xì)胞肺癌獲得性多藥耐藥和惡性進(jìn)展的作用及機(jī)制研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理背景肺癌目前仍然是位居全球腫瘤發(fā)病率和死亡率首位的惡性腫瘤。組織類型上肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）,其中,NSCLC占肺癌總類型的80-85%,肺腺癌是NSCLC的主要病理類型。近年來盡管以EGFR-TKIs為代表的靶向治療和以PD-1/PD-L1抑制劑為代表的免疫治療將具有相應(yīng)驅(qū)動(dòng)基因的晚期NSCLC患者生存期提高到了25-30月,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了傳統(tǒng)化療的8-10月,但因獲益人群的局限性,以鉑類抗癌藥物為主的聯(lián)合化療仍然是大部分NSCLC患者首選的一線治療方案,特別是不適合分子靶向治療或免疫治療的NSCLC患者、分子靶向治療或免疫治療失敗的NSCLC患者以及術(shù)后需要輔助化療的I-IIIa期NSCLC患者。順鉑（DDP）是鉑類藥物中最常用的化療藥物。順鉑對早期肺癌的抑制作用顯著,但在短期緩解之后,幾乎對順鉑治療有效的患者都會(huì)相繼出現(xiàn)多藥耐藥、復(fù)發(fā)和進(jìn)一步轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展,導(dǎo)致化療失敗,成為提高臨床肺癌治療效果的一大瓶頸。三十多年來,研究者對肺癌的順鉑耐藥進(jìn)行了大量研究并獲得了重要成果,但順鉑誘導(dǎo)的腫瘤耐藥表現(xiàn)出極其復(fù)雜的多因素性,其中一個(gè)嚴(yán)峻的現(xiàn)實(shí)是,針對目前已知的順鉑耐藥機(jī)制研發(fā)的小分子藥物并沒有達(dá)到預(yù)期的臨床抑癌效果。因此,進(jìn)一步深入挖掘順鉑誘發(fā)的肺癌耐藥機(jī)制是當(dāng)前亟待解決的重要課題。為了進(jìn)一步探討NSCLC獲得性耐藥機(jī)制,本研究在前期成功建立人NSCLC耐藥細(xì)胞A549/DDP的基礎(chǔ)上開展相關(guān)研究,具體研究內(nèi)容如下:1)NSCLC獲得性多藥耐藥細(xì)胞A549/DDP鑒定;2)耐藥相關(guān)基因的篩選和鑒定;3)ZNF300與NSCLC惡性進(jìn)展;4)ZNF300促進(jìn)NSCLC耐藥和惡性進(jìn)展的分子機(jī)制;5)淫羊藿苷和全反式維甲酸增強(qiáng)順鉑對腫瘤耐藥細(xì)胞殺傷作用的機(jī)制。本研究將為尋找腫瘤耐藥新靶點(diǎn),逆轉(zhuǎn)NSCLC耐藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1)DDP處理A549和A549/DDP細(xì)胞后,采用JC-1染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位（MMP）,ATP試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)ATP含量以及DCFH-DA探針標(biāo)記法檢測細(xì)胞內(nèi)氧自由基（ROS）,以比較DDP對兩種細(xì)胞線粒體功能的影響,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。采用CCK8藥敏實(shí)驗(yàn)檢測五種化療藥物對兩組細(xì)胞的IC50值,鑒定NSCLC耐藥細(xì)胞的多藥耐藥性。2)以差異倍數(shù)|FC|≥3為標(biāo)準(zhǔn)篩選基因表達(dá)譜芯片（A549/DDP vs.A549）中差異表達(dá)基因,并把該數(shù)據(jù)和DNA甲基化芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整合,篩選候選基因,爾后采用RT-PCR驗(yàn)證潛在侯選基因表達(dá)情況。RT-PCR和WB進(jìn)一步驗(yàn)證候選基因在五種肺癌細(xì)胞株及其耐藥株中的表達(dá)水平。BSP法檢測三株NSCLC細(xì)胞及其耐藥株中ZNF300啟動(dòng)子甲基化水平,WB檢測5-Azacitidine和Belinostat處理后各細(xì)胞中ZNF300水平。3)重組慢病毒過表達(dá)或沉默相應(yīng)細(xì)胞中靶基因表達(dá)后,CCK-8試劑檢測五種化療藥物對各種細(xì)胞IC50。流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度DDP誘導(dǎo)下各組細(xì)胞的凋亡情況。建立免疫缺陷鼠移植瘤模型,體內(nèi)驗(yàn)證靶基因?qū)SCLC腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響。4)Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞侵襲能力,劃痕愈合試驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移能力,失巢凋亡實(shí)驗(yàn)評估各組細(xì)胞集落形成能力和抗失巢凋亡能力,Ed U染色檢測各組細(xì)胞增殖率,流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期,鬼筆環(huán)肽染色激光共聚焦觀察細(xì)胞骨架形態(tài)。從Oncomine、Betastasis和Biogps等生物信息數(shù)據(jù)平臺(tái)下載靶基因表達(dá)數(shù)據(jù),分析靶基因與NSCLC臨床特征之間的相關(guān)性。免疫組化法檢測靶基因在肺癌標(biāo)本中的表達(dá)水平,并分析其臨床特點(diǎn)相關(guān)性。5)GO、KEGG和GSEA確定表達(dá)譜芯片中與耐藥細(xì)胞表型改變相關(guān)的信號通路（A549-ZNF300 vs.A549-ZNF300-NC）,WB驗(yàn)證相關(guān)通路核心蛋白表達(dá)。使用通路抑制劑和激動(dòng)劑體外驗(yàn)證靶基因調(diào)控NSCLC耐藥和惡性進(jìn)展的分子機(jī)制。6)ICA、ATRA和DDP處理時(shí),高內(nèi)涵系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察共培養(yǎng)細(xì)胞。WB檢測藥物處理后各組細(xì)胞的CD235a和CD61表達(dá)水平,SA-β-GAL染色檢測藥物處理后各組細(xì)胞衰老情況。RT-PCR檢測DDP對衰老基因和SASP相關(guān)基因表達(dá)影響。結(jié)果1)DDP處理后,A549/DDP細(xì)胞MMP改變、ROS水平顯著低于A549細(xì)胞（p<0.05）,而ATP含量顯著高于A549細(xì)胞（p<0.05）。DDP誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞的凋亡顯著低于A549細(xì)胞（p<0.05）。順鉑、吉西他濱、紫杉醇、多西他賽、培美曲塞對A549/DDP細(xì)胞的IC50顯著高于A549細(xì)胞（p<0.05）。2)A549/DDP和A549細(xì)胞的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)和甲基化數(shù)據(jù)整合后,初步篩選出140個(gè)候選基因,其中包括77個(gè)啟動(dòng)子低甲基化上調(diào)表達(dá)基因和63個(gè)啟動(dòng)子高甲基化下調(diào)表達(dá)基因。RT-PCR結(jié)果顯示,15個(gè)啟動(dòng)子低甲基化基因的表達(dá)上調(diào),25個(gè)啟動(dòng)子高甲基化基因的表達(dá)下調(diào)。候選基因ZNF300在A549/DDP、H520/DDP和H1650/DDP細(xì)胞中的水平顯著高于相應(yīng)親代細(xì)胞。5-Azacitidine處理后ZNF300在上述三種耐藥細(xì)胞的親代細(xì)胞中表達(dá)顯著性升高。3)成功建立ZNF300過表達(dá)細(xì)胞（A549-ZNF300）和低表達(dá)細(xì)胞（A549/DDP-sh ZNF300）。五種化療藥物對ZNF300高表達(dá)細(xì)胞的IC50顯著高于ZNF300低表達(dá)細(xì)胞（p<0.05）。順鉑誘導(dǎo)ZNF300高表達(dá)細(xì)胞的凋亡顯著性低于ZNF300低表達(dá)細(xì)胞（p<0.01）。DDP處理后,ZNF300低表達(dá)細(xì)胞形成的皮下移植瘤比ZNF300高表達(dá)細(xì)胞的重量和體積顯著縮小,證明ZNF300促進(jìn)NSCLC腫瘤細(xì)胞耐藥形成。4)體外實(shí)驗(yàn)表明,耐藥細(xì)胞的侵襲、遷移、集落形成和抗失巢凋亡能力均顯著強(qiáng)于藥敏細(xì)胞（p<0.05）,耐藥細(xì)胞的細(xì)胞增殖率顯著低于藥敏細(xì)胞（p<0.05）。相比藥敏細(xì)胞,耐藥細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯（p<0.05）,且具有更明顯的細(xì)胞偽足。生物學(xué)信息分析結(jié)果表明,ZNF300與NSCLC惡性進(jìn)展有關(guān)。免疫組化結(jié)果提示,ZNF300高表達(dá)與NSCLC患者病理分級、臨床分期、術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、區(qū)域性轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)呈正相關(guān),與患者OS呈負(fù)相關(guān)。5)與A549-ZNF300-NC細(xì)胞相比,A549-ZNF300細(xì)胞中大部分與生長分化因子和MAPK/ERK通路相關(guān)的基因（CD61,CD235a,p-ERK1/2,p-p38 MAPK）表達(dá)下調(diào),而大部分與細(xì)胞周期和癌癥干性相關(guān)的基因（PCNA,p15,Nanog,Oct-4）表達(dá)上調(diào)。AZD6244處理ZNF300低表達(dá)細(xì)胞后,p-ERK1/2、p-p38 MAPK和CD61下降,而p15和Nanog增加,細(xì)胞遷移、侵襲、抗凋亡和順鉑耐受性顯著增強(qiáng),細(xì)胞增殖減弱。而Hesperetin對ZNF300高表達(dá)細(xì)胞的作用相反。6)與藥敏細(xì)胞相比,ICA和ATRA能上調(diào)耐藥細(xì)胞中CD235a和CD61水平。細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),耐藥細(xì)胞對順鉑聯(lián)合ATRA或ICA的反應(yīng)比藥敏細(xì)胞更明顯。ICA和ATRA作用下,耐藥細(xì)胞被藥敏細(xì)胞吞噬的比例顯著高于藥敏細(xì)胞被耐藥細(xì)胞吞噬的比例。DDP、ICA和ATRA藥物處理后,耐藥細(xì)胞中SA-β-GAL陽染率明顯高于藥敏細(xì)胞,并且,耐藥細(xì)胞中衰老相關(guān)基因和SASP相關(guān)基因的表達(dá)顯著性高于藥敏細(xì)胞。結(jié)論1)ZNF300是NSCLC耐藥相關(guān)基因。2)ZNF300可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性生長,其高表達(dá)預(yù)示NSCLC患者預(yù)后不良。3)ZNF300通過抑制MAPK/ERK信號通路調(diào)控耐藥細(xì)胞緩慢周期表型和細(xì)胞分化。4)ZNF300通過抑制WEE1/MYT1和調(diào)控MYC/AURKA/BORA/PLK1信號軸激活CDK1從而調(diào)節(jié)耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期。5)ICA和ATRA通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化提高DDP對耐藥細(xì)胞抑癌作用。

趙曉龍^[5]（2020）在《外泌體在非小細(xì)胞肺癌鉑類耐藥中的作用和機(jī)制研究》文中研究表明研究背景目前,非小細(xì)胞肺癌鉑類耐藥仍然是造成大部分非小細(xì)胞肺癌患者療效差的的主要原因,然而非小細(xì)胞肺癌鉑類耐藥的具體機(jī)制尚未完全明了。鉑類耐藥是由多種因素造成的,其中外泌體和免疫調(diào)控介導(dǎo)的耐藥可能發(fā)揮重要作用。首先,外泌體是細(xì)胞分泌的攜帶生物活性物質(zhì)的納米級囊泡,根據(jù)前期研究基礎(chǔ),我們提出外泌體可能通過其攜帶的堿基切除修復(fù)關(guān)鍵基因APE1或某些micro RNA傳遞耐藥性。其次,位于腫瘤細(xì)胞上的免疫檢查點(diǎn)關(guān)鍵分子程序性細(xì)胞死亡受體配體1（PD-L1）和程序性細(xì)胞死亡受體（PD-1）結(jié)合可以抑制免疫反應(yīng),而機(jī)體的免疫狀態(tài)與化療療效密切相關(guān),由此我們推測,PD-L1單核苷酸多態(tài)性也可能對鉑類化療療效產(chǎn)生影響。本研究將從以上兩個(gè)層面對非小細(xì)胞肺癌鉑類耐藥機(jī)制進(jìn)行探索研究,為綜合評估非小細(xì)胞肺癌患者鉑類化療的有效性,采取相應(yīng)措施改善治療效果和預(yù)后提供理論依據(jù)。研究方法1.采用高速離心和外泌體提取試劑盒收集外泌體。用PKH26對外泌體染色后,激光共聚焦觀察其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的情況。將帶GST標(biāo)簽的APE1純化蛋白（GST-APE1）與A549細(xì)胞共同孵育后,觀察細(xì)胞內(nèi)GST-APE1的定位情況。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組細(xì)胞在不同濃度順鉑下的存活能力和凋亡率。采用Transwell實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞侵襲和遷移能力。采用APE1的功能抑制劑處理與不同分組外泌體共同孵育后的A549細(xì)胞,觀察處理后A549細(xì)胞在順鉑中的存活率以及-H2AX蛋白變化情況。選取接受鉑類化療方案治療的NSCLC患者共136例,對血漿外泌體進(jìn)行提取和鑒定。采用Western blot和ELISA法檢測血漿外泌體APE1表達(dá),采用免疫組化檢測組織APE1表達(dá)。根據(jù)實(shí)體腫瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),分為鉑類化療應(yīng)答組（CR+PR）和鉑類化療無應(yīng)答組（SD+PD）,觀察APE1表達(dá)水平與患者治療敏感性的關(guān)系。2.采用micro RNA芯片檢測順鉑（CDDP）處理后外泌體micro RNA的變化情況。采用mi R-1273a mimic、inhibitor或陰性對照轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞以構(gòu)建不同mi R-1273a表達(dá)水平的細(xì)胞。用CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)凋亡分析檢測不同表達(dá)水平的mi R-1273a對細(xì)胞在順鉑中存活能力和凋亡率的影響。將A549細(xì)胞與高表達(dá)mi R-1273a的外泌體共同孵育,研究高表達(dá)mi R-1273a外泌體對細(xì)胞在順鉑中存活能力的影響。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測mi R-1273a的靶基因,并用Western blot和q PCR進(jìn)行驗(yàn)證。選擇行鉑類化療方案的非小細(xì)胞肺癌患者共85例（其中36例用于國際合作研究）,用于臨床療效評價(jià)。RT-q PCR用于檢測血漿外泌體micro RNA水平;ELSIA用于檢測血漿SDCBP或APE1水平。3.收集281例行鉑類化療方案治療的非小細(xì)胞肺癌患者的血液樣本,并提取DNA。251名同期接受健康體檢的志愿者作為對照組。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)進(jìn)行基因型分型。用卡方檢驗(yàn)比較不同分組個(gè)體的基因型分布情況。用Kaplan-Meier分析和Cox單因素和多因素生存分析評價(jià)不同基因型患者的預(yù)后情況。研究結(jié)果1.成功收集到NSCLC源性外泌體,PKH26染色后可觀察到著色的外泌體進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)。A549細(xì)胞與外泌體共同孵育后,細(xì)胞對順鉑的敏感性下降,凋亡率降低,同時(shí)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都有所增強(qiáng)。順鉑處理A549細(xì)胞后,細(xì)胞和外泌體內(nèi)的APE1表達(dá)增高。與高表達(dá)APE1的外泌體共同孵育后,細(xì)胞對順鉑的敏感性下降,凋亡率降低,細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都有所增強(qiáng)。APE1的堿基切除修復(fù)功能在外泌體APE1介導(dǎo)的細(xì)胞對順鉑敏感性變化中發(fā)揮主要作用。在臨床樣本中,外泌體中的APE1是外周血中APE1存在的主要方式。與健康對照者相比,非小細(xì)胞肺癌患者外泌體APE1高表達(dá)。對鉑類化療無應(yīng)答組的患者血漿外泌體APE1的水平明顯高于對鉑類化療應(yīng)答組的患者。2.基因芯片結(jié)果顯示,與對照組相比,共有276個(gè)mi RNAs在順鉑刺激下產(chǎn)生的外泌體(EXOCDDP)中變化>2倍,其中mi R-1273a在這些mi RNAs中的表達(dá)差異最為顯著。過表達(dá)mi R-1273a增強(qiáng)了A549細(xì)胞對順鉑的敏感性,外泌體傳遞mi R-1273a同樣可以增強(qiáng)受體細(xì)胞對順鉑的敏感性。SDCBP（Syndecan binding protein）可能是mi R-1273a發(fā)揮作用的靶點(diǎn)之一。對鉑類化療無應(yīng)答組的患者血漿外泌體mi R-1273a的水平明顯低于對鉑類化療應(yīng)答組的患者。合作項(xiàng)目結(jié)果顯示,敲低A549細(xì)胞APE1后,外泌體中61個(gè)mi RNAs發(fā)生顯著性變化,其中mi R-130b和mi R-200c的變化可能與NSCLC鉑類化療的療效有關(guān)。3.對9個(gè)常見位點(diǎn)的PD-L1 SNP進(jìn)行檢測后,發(fā)現(xiàn)PD-L1 rs7866740在非小細(xì)胞肺癌患者中G等位基因頻率明顯高于對照組G等位基因頻率（P=0.001）。攜帶G等位基因的個(gè)體患NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于攜帶C等位基因的個(gè)體（OR=3.532,95%CI=1.232-10.129）。Kaplan-Meier分析表明,PD-L1 rs2890658 CA+AA基因型的PFS和OS明顯低于CC型（P<0.05）;PD-L1 rs822336 GC+CC的OS明顯低于GG型（P<0.05）。Cox生存分析顯示,攜帶PD-L1 rs2890658 CA+AA基因型的患者化療療效和預(yù)后較差（PFS:校正后HR=1.367,95%CI=1.0-1.8,P=0.038;OS:校正后HR=1.402,95%CI=1.0-1.9,P=0.026）。攜帶PD-L1 rs822336 GC+CC基因型的患者預(yù)后較差（校正后HR=1.393,95%CI=1.1-1.8,P=0.021）,但與療效無顯著相關(guān)性。研究結(jié)論1.鉑類藥物刺激下NSCLC外泌體APE1增高,高表達(dá)APE1的外泌體可以降低受體細(xì)胞對鉑類藥物的敏感性。2.APE1的堿基切除修復(fù)功能可能在外泌體APE1介導(dǎo)的鉑類化療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。3.非小細(xì)胞肺癌患者血漿外泌體APE1水平與非小細(xì)胞肺癌鉑類化療療效相關(guān)。4.外泌體mi R-1273a的下降與受體細(xì)胞鉑類敏感性下降有關(guān)。5.非小細(xì)胞肺癌患者血漿外泌體mi R-1273a水平與鉑類化療的療效有關(guān)。6.APE1可能通過調(diào)控外泌體mi R-130b和mi R-200c水平促進(jìn)NSCLC鉑類耐藥。7.PD-L1基因的rs7866740位點(diǎn)與NSCLC易感性有關(guān)。PD-L1基因的rs2890658和rs822336位點(diǎn)與NSCLC的預(yù)后有關(guān)。

程麗芳^[6]（2020）在《GBP1通過PGK1激活EMT通路進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥的功能和機(jī)制研究》文中研究說明研究背景肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤,雖然治療方法多樣,但其死亡率仍然居高不下。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要病理類型。厄洛替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）,它作為一個(gè)晚期EGFR驅(qū)動(dòng)基因陽性非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者一線治療的首選藥物,其使用明顯提升此類患者的臨床結(jié)局。但經(jīng)歷約10月的中位無進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）后,EGFR-TKI耐藥不可避免成為臨床常見的難題之一。至今,已提出MET擴(kuò)增、ERBB2擴(kuò)增、K-RAS突變或PTEN缺失等多種機(jī)制參與EGFR-TKI耐藥,但仍有一些機(jī)制不明。因此,進(jìn)一步探討厄洛替尼耐藥是需要解決的重要問題。本研究通過Gene expression omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫預(yù)測了鳥苷酸結(jié)合蛋白1（guanylate binding proteinl,GBP1）可能是一個(gè)與厄洛替尼耐藥相關(guān)的癌基因。通過單因素和多因素回歸分析確認(rèn)GBP1與NSCLC患者預(yù)后差相關(guān)。接著我們通過逐級增加厄洛替尼濃度增加而建立厄洛替尼耐藥株,并使用這些細(xì)胞分析沉默或過表達(dá)GBP1和厄洛替尼耐藥的關(guān)系,從而確認(rèn)GBP1參與厄洛替尼耐藥。為了探索GBP1在厄洛替尼耐藥中具體作用機(jī)制,我們進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)分析GBP1和磷酸甘油激酶1（phosphoglycerol kinase 1,PGK1）是否存在互作關(guān)系。最后,我們探索PGK1參與厄洛替尼耐藥的下游信號通路,通過回復(fù)和免疫組化（IHC）實(shí)驗(yàn)證實(shí)GBP1通過PGK1激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition,EMT）通路進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥。研究目的1,體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)探討GBP1是否參與非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥。2,探討GBP1參與調(diào)控非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥的分子機(jī)制。3,探討GBP1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者生存、臨床特征的關(guān)系。研究方法第一部分體外研究1 GBP1參與厄洛替尼耐藥的實(shí)驗(yàn)1.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（CCK-8）比較EGFR-TKI耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞的半數(shù)抑菌濃度（IC50）。1.2熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)（qRT-PCR）比較EGFR-TKI耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞GBP1基因的mRNA水平。1.3 Mann-Whitney檢測GBP1的mRNA水平與厄洛替尼耐藥的相關(guān)性。1.4 T790M位點(diǎn)突變檢測試劑盒檢測耐藥細(xì)胞是否存在T790M位點(diǎn)突變。1.5利用單因素和多因素Cox回歸分析非小細(xì)胞肺癌總生存時(shí)間和臨床特征的關(guān)系。2體外研究表明GBP1參與厄洛替尼耐藥的實(shí)驗(yàn)2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)比較沉默或過表達(dá)GBP1與對照組間的IC50值。2.2蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WB）比較沉默或過表達(dá)GBP1與對照組間GBP1的蛋白表達(dá)2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)比較沉默或過表達(dá)GBP1與對照組間GBP1的mRNA水平。2.4 免疫熒光試驗(yàn)探討與 PC9ER-NC+erlotinib 組比較,PC9ER-shGBP1+erlotinib組GBP1、PCNA熒光值變化。2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)分析不同濃度厄洛替尼作用下,PC9ER-shGBP1+erlotinib組與PC9ER--NC+erlotinib 組間的 IC50值。2.6流式凋亡實(shí)驗(yàn)比較沉默或過表達(dá)GBP1與對照組間的晚期凋亡細(xì)胞占比。2.7WB實(shí)驗(yàn)檢測與對照組比較,沉默或過表達(dá)GBP1組凋亡標(biāo)志物Bax、Bcl-2和cleaved PARP1蛋白表達(dá)變化。2.8流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)比較沉默或過表達(dá)GBP1與對照組間的G1期占比。2.9 WB實(shí)驗(yàn)檢測與對照組比較,沉默或過表達(dá)GBP1組細(xì)胞周期標(biāo)志物P21、Cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表達(dá)變化。第二部分體內(nèi)研究1體內(nèi)研究過表達(dá)GBP1實(shí)驗(yàn)1.1 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)比較 PC9ER-NC+erlotinib 組和 PC9ER-shGBP1+erlotinib 組間的移植瘤大小、重量。1.2 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)比較 PC9-NC+PBS 組、PC9-NC+erlotinib 組、PC9-GBP1+PBS組、PC9-GBP1+erlotinib組的移植瘤大小、重量。1.3 IHC實(shí)驗(yàn)檢測小鼠腫塊GBP 1、PCNA以及凋亡蛋白的表達(dá)。2體內(nèi)研究過表達(dá)GBP1組GBP1的WB和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)2.1 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測小鼠腫塊 PC9-NC+erlotinib 組與 PC9-GBP1+erlotinib 組間GBP1的mRNA水平。2.2 WB 實(shí)驗(yàn)檢測小鼠腫塊 PC9-NC+erlotinib 組與 PC9-GBP1+erlotinib 組間 GBP 1蛋白表達(dá)變化。2.3 IHC實(shí)驗(yàn)檢測小鼠腫塊PC9-NC+erlotinib組與 PC9-GBP1+erlotinib組間 P21、Cyclin D1蛋白的蛋白表達(dá)變化。第三部分 機(jī)制探討1 GBP1和PGK1互作的實(shí)驗(yàn)1.1 質(zhì)譜分析預(yù)測GBP1可能互作的蛋白。1.2 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析GBP1和PGK1的互作關(guān)系。1.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測GBP1和PGK1共定位關(guān)系。1.4 WB實(shí)驗(yàn)分析GBP1和PGK1的蛋白調(diào)控關(guān)系。2 GBP1通過PGK1誘導(dǎo)的EMT通路參與厄洛替尼耐藥的實(shí)驗(yàn)2.1 WB實(shí)驗(yàn)檢測與對照組比較,耐藥細(xì)胞沉默GBP1組、耐藥細(xì)胞沉默GBP1同時(shí)過表達(dá)GBP1組EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測耐藥細(xì)胞沉默PGK1組與對照組間的IC50值。2.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞間E-cadherin的mRNA水平。2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測耐藥細(xì)胞沉默E-cadherin組與對照組間的IC50值。2.5 WB實(shí)驗(yàn)分析PGK1和Twist的關(guān)系。2.6 IHC 實(shí)驗(yàn)分析了小鼠腫塊 PC9-NC+erlotinib 組與 PC9-GBP1+erlotinib 組間的EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。第四部分 臨床意義非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)GBP1與預(yù)后、臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系分析1 Kaplan-Meier生存分析GBP1和PGK1表達(dá)水平與總生存時(shí)間的關(guān)系。2 cBioportal數(shù)據(jù)庫分析GBP1的mRNA水平與PGK1的mRNA水平的相關(guān)性。3 Oncomine數(shù)據(jù)分析非小細(xì)胞肺癌GBP1表達(dá)與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性。研究結(jié)果第一部分GBP1在非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及意義1 GBP1參與厄洛替尼耐藥1.1與敏感細(xì)胞株相比,厄洛替尼在耐藥細(xì)胞株P(guān)C9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975 的 IC50值升高。1.2 與敏感細(xì)胞株相比,PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975中GBP1的mRNA水平升高。1.3 Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的GBP1與厄洛替尼耐藥性增強(qiáng)相關(guān)。1.4 PC9ER 及 HCC827ER 中未發(fā)現(xiàn) T790M 突變。1.5單因素分析與多因素分析結(jié)果表明,與總生存時(shí)間相關(guān)的因素是治療后腫瘤情況、GBP1表達(dá)水平。2體外研究表明GBP1調(diào)控厄洛替尼耐藥2.1與對照組相比,耐藥細(xì)胞沉默GBP1組GBP1蛋白表達(dá)減低。2.2與對照組相比,耐藥細(xì)胞沉默GBP1組GBP1的mRNA水平減低。2.3與對照組相比,耐藥細(xì)胞沉默GBP1組的IC50值減低。2.4 與 PC9ER-NC+erlotinib 組比較,GBP1、PCNA 在 PC9ER-shGBP1+erlotinib組有弱的熒光值。2.5在相同濃度的厄洛替尼作用下,與PC9ER-NC+erlotinib組比較,PC9ER-shGBP 1+erlotinib組的細(xì)胞存活率減低。2.6與對照組比較,耐藥細(xì)胞沉默GBP1組的晚期凋亡細(xì)胞占比增高。2.7與對照組比較,耐藥細(xì)胞沉默GBP1時(shí)Bcl-2和PCNA的蛋白表達(dá)減低,Bax和cleaved PARP1的蛋白表達(dá)增高。2.8與對照組比較,耐藥細(xì)胞沉默GBP1組的G1期占比增高。2.9與對照組比較,耐藥細(xì)胞沉默GBP1組的P21蛋白表達(dá)增高,Cycilin D1、CDK4和CDK6的蛋白表達(dá)減低。以上結(jié)果表明GBP1在厄洛替尼耐藥細(xì)胞高表達(dá),且提升的GBP1通過促進(jìn)凋亡,增加細(xì)胞G1期比例調(diào)控厄洛替尼耐藥。第二部分體內(nèi)研究表明GBP1參與厄洛替尼耐藥1過表達(dá)GBP1促進(jìn)厄洛替尼耐藥性1.1 與 PC9ER-NC+erlotinib 組比較,PC9ER-shGBP1+erlotinib 組的裸鼠移植瘤體積及重量均減少。1.2與PC9-NC+erlotinib組比較,PC9-GBP1+erlotinib組的裸鼠移植瘤體積及重量均減少。1.3 與 PC9-NC+erlotinib 組比較,PC9-GBP1+erlotinib 組的 GBP1、PCNA 和 Bcl-2蛋白表達(dá)升高,而cleaved PARP1蛋白表達(dá)減低。2過表達(dá)GBP1減少細(xì)胞周期G1期占比2.1 裸鼠腫塊中與 PC9-NC+erlotinib 組比較,PC9-GBP1+erlotinib 組 GBP1 的mRNA水平升高。2.2 裸鼠腫塊中與 PC9-NC+erlotinib 組比較,PC9-GBP1+erlotinib 組 GBP1 蛋白表達(dá)升高。2.3 裸鼠腫塊中與 PC9-NC+erlotinib 組比較,PC9-GBP1+erlotinib 組 P21 蛋白表達(dá)減低,Cyclin D1蛋白表達(dá)增高。以上結(jié)果表明在體內(nèi)研究中,過表達(dá)GBP1增加厄洛替尼耐藥性,減少細(xì)胞G1期比例。第三部分GBP1和PGK1互作促進(jìn)厄洛替尼耐藥1 GBP1和PGK1之間存在互作1.1質(zhì)譜分析預(yù)測GBP1可能互作的蛋白有MYL9、ANXA2、ALDOA、PGK1等。1.2免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（CoIP）確認(rèn)GBP1和PGK1的互作關(guān)系。1.3免疫熒光實(shí)驗(yàn)確認(rèn)GBP1和PGK1的共定位關(guān)系。1.4 GBP1在蛋白水平調(diào)控PGK1蛋白表達(dá)。2 GBP1通過PGK1誘導(dǎo)的EMT通路參與厄洛替尼耐藥2.1耐藥細(xì)胞沉默GBP1同時(shí)過表達(dá)GBP1,能回復(fù)耐藥細(xì)胞沉默GBP1對EMT相關(guān)蛋白的影響。2.2耐藥細(xì)胞沉默PGK1組與對照組比較,IC50值減低。2.3耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞相比,E-cadherin的mRNA水平減低。2.4耐藥細(xì)胞沉默E-cadherin組與對照組比較,IC50值增高。2.5 PGK1促進(jìn)Twist蛋白表達(dá)。2.6 裸鼠腫塊中與 PC9-NC+erlotinib 組比較,PC9-GBP1+erlotinib 組 PGK1、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)增高,而E-cadherin蛋白表達(dá)減低。以上結(jié)果表明GBP1通過PGK1激活的EMT通路調(diào)控厄洛替尼耐藥。第四部分GBP1表達(dá)與患者預(yù)后、病理分級的關(guān)系非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)GBP1與差的預(yù)后、高的腫瘤分級相關(guān)1高表達(dá)GBP1、PGK1的患者總生存時(shí)間和首次進(jìn)展時(shí)間縮短。2 GBP1的mRNA水平與PGK1的mRNA水平呈正相關(guān)。3非小細(xì)胞肺癌患者的病理分級與GBP1表達(dá)呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明GBP1的高表達(dá)提示非小細(xì)胞肺癌患者差的預(yù)后、高的病理分級。研究結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥細(xì)胞株中,GBP1無論蛋白表達(dá)還是mRNA水平均明顯提高。而且GBP1水平提高使厄洛替尼敏感細(xì)胞在體內(nèi)及體外獲得對厄洛替尼的耐藥性。同時(shí)上調(diào)的GBP1能減少凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),并誘導(dǎo)細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)換。GBP1和PGK1互作且通過EMT信號通路參與厄洛替尼耐藥調(diào)控。利用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)高表達(dá)GBP1提示總生存時(shí)間和首次進(jìn)展時(shí)間縮短?？傊?我們利用細(xì)胞株、動(dòng)物模型和臨床樣本證明GBP1表達(dá)變化調(diào)控厄洛替尼耐藥,提示在非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥中靶向GBP1可能是一個(gè)潛在的治療干預(yù)靶點(diǎn)。

孟子琦^[7]（2020）在《基于整合生物信息學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療三種常見腫瘤作用機(jī)制研究》文中研究表明研究背景在世界范圍內(nèi),肝癌、胰腺癌、肺癌高居惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的前列,嚴(yán)重威脅著人們的生命健康,也給家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。中藥注射劑在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢,廣泛應(yīng)用于臨床。但由于中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)、多功能的特點(diǎn),導(dǎo)致藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、作用機(jī)制不清楚,增加了研究的難度,嚴(yán)重影響了國際化的進(jìn)程。復(fù)方苦參注射液具有清熱利濕,涼血解毒,散結(jié)止痛的作用,臨床上廣泛用于惡性腫瘤的治療,然而其作用機(jī)制尚未完全闡明。近年來伴隨著生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展,新理念、新思路不斷涌現(xiàn),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)的結(jié)合成為提高中醫(yī)藥研究水平的重要路徑?；诖?本研究運(yùn)用整合生物信息學(xué)方法,分析探究復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的作用機(jī)制。研究目的通過生物信息學(xué)方法確認(rèn)肝癌、胰腺癌中的關(guān)鍵基因。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測、篩選復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和信號通路并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,從系統(tǒng)層面揭示復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的多成分、多靶點(diǎn)、多通路復(fù)雜機(jī)制。研究方法1.生物信息學(xué)分析在肝癌關(guān)鍵基因研究中,從GEO數(shù)據(jù)庫下載基因芯片數(shù)據(jù)集,使用limma包進(jìn)行差異表達(dá)分析,之后采用RobustRankAggreg包對數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析,篩選出共同被確認(rèn)為差異表達(dá)的基因。通過STRING獲取差異基因的蛋白互作信息,導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),并使用MCODE進(jìn)行模塊分析。通過DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析。利用KM plotter、GEPIA進(jìn)行生存分析、表達(dá)水平分析和關(guān)聯(lián)性分析。在胰腺癌關(guān)鍵基因研究中,從TCGA數(shù)據(jù)庫下載轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和患者的臨床信息,利用WGCNA包構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、識別基因模塊并與臨床信息相關(guān)聯(lián)。通過Cytoscape對模塊進(jìn)行可視化,并使用CytoHubba確定關(guān)鍵基因。通過clusterProfiler包進(jìn)行GO富集分析,并通過DAVID進(jìn)行KGEE通路富集分析。采用survival包進(jìn)行單因素Cox回歸分析,隨后根據(jù)單因素的P值篩選基因進(jìn)行多因素Cox回歸分析,構(gòu)建生存相關(guān)的線性風(fēng)險(xiǎn)評估模型,通過Kaplan-Meier生存曲線評估高、低風(fēng)險(xiǎn)組樣本的總體生存率差異情況。采用survivalROC包繪制ROC曲線,評價(jià)預(yù)后模型的預(yù)測準(zhǔn)確性。2.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析在復(fù)方苦參注射液治療肝癌作用機(jī)制研究中,通過文獻(xiàn)檢索獲得復(fù)方苦參注射液的化學(xué)成分,通過 STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction、TCMSP 獲取化學(xué)成分的靶點(diǎn)。通過TTD、GEO、TCGA獲得肝細(xì)胞癌相關(guān)基因。使用Cytoscape構(gòu)建“化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“化合物-肝細(xì)胞癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”,對網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。通過DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析。使用KM plotter、GEPIA進(jìn)行生存分析和關(guān)聯(lián)性分析。利用AutoDock進(jìn)行分子對接模擬。在復(fù)方苦參注射液治療胰腺癌作用機(jī)制研究中,通過文獻(xiàn)檢索獲得復(fù)方苦參注射液的化學(xué)成分,通過 STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction、TCMSP 獲取化學(xué)成分的靶點(diǎn)。通過合并TTD、TCGA以及WGCNA篩選出的關(guān)鍵基因得到胰腺癌相關(guān)基因。隨后通過STRING獲取蛋白互作信息。使用Cytoscape構(gòu)建“化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“化合物靶點(diǎn)-胰腺癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“藥物-化合物-蛋白互作靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”,并使用MCODE對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析。通過DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析。利用AutoDock+進(jìn)行分子對接模擬。在復(fù)方苦參注射液治療肺癌作用機(jī)制研究中,通過文獻(xiàn)檢索獲得復(fù)方苦參注射液的化學(xué)成分,通過STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction獲取化學(xué)成分的靶點(diǎn),通過TTD、OMIM獲得肺癌相關(guān)基因。隨后通過STRING獲取蛋白互作信息。使用Cytoscape構(gòu)建“化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“肺癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)”、“化合物-肺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”、“藥物-化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)”,對網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析。通過DAVID進(jìn)行GO和KEGG富集分析并通過systemsDock進(jìn)行分子對接模擬。研究結(jié)果1.生物信息學(xué)分析結(jié)果對13個(gè)肝細(xì)胞癌基因芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析,得到380個(gè)差異基因,包括293個(gè)下調(diào)基因和87個(gè)上調(diào)基因。通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與模塊分析得到1 1個(gè)關(guān)鍵基因（CDK1、CCNB2、CDC20、CCNB1、TOP2A、CCNA2、MELK、PBK、TPX2、KIF20A、AURKA）和2個(gè)重要模塊。富集分析表明,差異基因主要與代謝相關(guān)通路有關(guān),關(guān)鍵基因和模塊1與細(xì)胞周期密切相關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因均與肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。表達(dá)水平分析表明關(guān)鍵基因均在肝細(xì)胞癌中高表達(dá),關(guān)聯(lián)性分析表明CDK1的表達(dá)與其他關(guān)鍵基因的表達(dá)呈正相關(guān)。對TCGA胰腺癌轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,共得到177個(gè)樣本和5000個(gè)基因用于WGCNA分析,并得到11個(gè)基因模塊。通過腫瘤分級、腫瘤分期和患者的生存狀態(tài)最終篩選出黑色模塊和藍(lán)色模塊作進(jìn)一步研究。GO富集分析顯示黑色模塊與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),藍(lán)色模塊與腫瘤的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。KEGG通路富集分析顯示,黑色模塊中的基因主要富集在細(xì)胞周期、p53信號通路等通路上。藍(lán)色模塊中的基因主要富集在粘蛋白型O-聚糖的生物合成、花生四烯酸代謝、ECM-受體相互作用、緊密連接等通路上。通過網(wǎng)絡(luò)分析,分別篩選出黑色模塊和藍(lán)色模塊中的5個(gè)關(guān)鍵基因（NCAPG、BUB1、CDK1、TPX2、DLGAP5;INAVA、MST1R、TMPRSS4、TMEM92、SFN）,且這些基因均在胰腺癌中高表達(dá)。生存分析得到5個(gè)基因構(gòu)建預(yù)后模型,其中TSPOAP1與胰腺癌患者生存時(shí)間呈正相關(guān),ADGRG6、GPR87、FAM111B、MMP28與胰腺癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。2.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果在復(fù)方苦參注射液治療肝癌作用機(jī)制研究中,通過網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（BCHE、SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A、CDK1）,其中 CDK1 在肝細(xì)胞癌中高表達(dá),其余5個(gè)均為低表達(dá)。GO富集分析顯示,復(fù)方苦參注射液調(diào)控的與肝細(xì)胞癌有關(guān)的靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞周期、凋亡過程調(diào)控、代謝過程等生物過程中。KEGG通路富集分析表明,這些靶點(diǎn)主要與藥物代謝-細(xì)胞色素P450、花生四烯酸代謝等通路有關(guān)。此外,關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A的表達(dá)與CDK1的表達(dá)有很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。生存分析結(jié)果表明,CDK1與肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān),SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A與肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間呈正相關(guān)。在復(fù)方苦參注射液治療胰腺癌作用機(jī)制研究中,通過網(wǎng)絡(luò)分析與模塊分析,篩選出6個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（AKT1、MAPK1、MAPK3、EGFR、CDK1、JAK1）和3個(gè)重要模塊。GO富集分析顯示,3個(gè)重要模塊主要與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、JAK-STAT級聯(lián)、MAPK級聯(lián)、磷酸化,凋亡過程調(diào)控有關(guān)。KEGG通路富集分析表明,3個(gè)重要模塊顯著富集在細(xì)胞周期、ErbB信號通路、PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路等通路上。在復(fù)方苦參注射液治療肺癌作用機(jī)制研究中,通過網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（CHRNA3、DRD2、PRKCA、CDK1、CDK2、CHRNA5、MMP1、MMP9）。GO 富集分析顯示,復(fù)方苦參注射液調(diào)控的與肺癌有關(guān)的靶點(diǎn)顯著富集在有絲分裂細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)磷酸化、ERK1和ERK2級聯(lián)的調(diào)控、激酶活性等生物過程和分子功能中。KEGG通路富集分析表明,這些靶點(diǎn)主要參與癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖、PI3K-Akt信號通路、非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌等通路。研究結(jié)論本研究綜合運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法,在系統(tǒng)層面揭示了復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和信號通路。初步闡釋了復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的作用機(jī)制可能與協(xié)同調(diào)控多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路有關(guān)。本研究可為中藥注射劑治療不同類型惡性腫瘤的作用機(jī)制研究提供線索和思路,為進(jìn)一步開展復(fù)方苦參注射液治療肝癌、胰腺癌、肺癌的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究以及促進(jìn)治療肝癌、胰腺癌、肺癌中藥的臨床合理應(yīng)用提供參考和借鑒。

郭紅軍^[8]（2020）在《經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路與宮頸癌順鉑耐藥的關(guān)系研究》文中研究指明研究目的和意義宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一,嚴(yán)重危害女性健康和生命安全?；熓菍m頸癌重要的輔助治療手段,其效果對于降低患者死亡率,延長生存期和改善生活質(zhì)量十分關(guān)鍵。鉑類是宮頸癌治療的一線化療藥物,尤其是順鉑在宮頸癌治療中顯示出良好的效果。然而由于腫瘤異質(zhì)性、個(gè)體差異等因素,化療效果具有不確定性,腫瘤耐藥是導(dǎo)致宮頸癌化療失敗的最主要原因。目前關(guān)于宮頸癌耐藥的詳細(xì)機(jī)制尚未完全察明,探索耐藥產(chǎn)生的原因、尋找解決耐藥性的方法是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Wnt/β-catenin是最經(jīng)典的信號通路之一,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌、腎癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等人類腫瘤中均存在Wnt通路過度激活,認(rèn)為Wnt/β-catenin途徑可能是眾多腫瘤發(fā)生的共同通路?；熌退幨菍m頸癌患者治療失敗和預(yù)后不良的最主要原因,查明宮頸癌的化療耐藥機(jī)制,加深對宮頸癌耐藥過程中復(fù)雜信號通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的認(rèn)識,能為宮頸癌耐藥研究提供新的視角。本研究欲探討Wnt/β-catenin信號通路在宮頸癌順鉑耐藥中所發(fā)揮的作用及其作用機(jī)制。研究結(jié)果對于尋找宮頸癌耐藥相關(guān)的潛在分子靶點(diǎn),尋找解決耐藥性的方法具有重要價(jià)值,未來可能給宮頸癌的臨床治療帶來重大突破和進(jìn)展。研究方法第一部分:以原發(fā)性宮頸癌患者組織和復(fù)發(fā)性順鉑耐藥宮頸癌組織為研究對象,通過RNA-seq測序分析兩組中的基因表達(dá)差異,通過免疫組化、qPCR以及Western blot等分子生物學(xué)手段做進(jìn)一步的驗(yàn)證,通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)基因與病人預(yù)后的關(guān)系。第二部分:采用大劑量沖擊誘導(dǎo)法,用終濃度為10 μ g/ml的順鉑溶液誘導(dǎo)人宮頸癌SiHa、HeLa、C33A和CaSki細(xì)胞系,建立相應(yīng)的宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞模型,比較宮頸癌細(xì)胞和耐藥細(xì)胞在形態(tài)、耐藥性及其他生物學(xué)特性方面的差異。第三部分:用β-catenin真核表達(dá)載體和Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939單獨(dú)或聯(lián)合處理宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot檢測不同處理后宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中β-catenin及Wnt/β-catenin通路上Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled mRNA和蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測順鉑誘導(dǎo)下各組細(xì)胞的凋亡率,MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況。第四部分:用皮下注射法誘導(dǎo)建立宮頸癌順鉑SiHa耐藥細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,將裸鼠隨機(jī)分為對照組、順鉑組、β-catenin+順鉑組和XAV939+順鉑組,給予相應(yīng)干預(yù)后,觀察裸鼠一般情況和移植瘤生長情況,測量瘤體積,繪制移植瘤生長曲線,21天后處死動(dòng)物,取腫瘤組織,Tunel檢測移植瘤凋亡,免疫組化檢測核蛋白K i-67表達(dá),Western Blot檢測Wnt/β-catenin通路上Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled 蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果第一部分:RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)在3例復(fù)發(fā)性順鉑耐藥患者宮頸癌組織中存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活。應(yīng)用免疫組化、qPCR和Western blot等實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),與正常宮頸組織相比,β-catenin在原發(fā)性宮頸癌組織中表達(dá)增高,而在復(fù)發(fā)性順鉑耐藥的宮頸癌組織中β-catenin的表達(dá)較上述2組異常增高（P<0.05）,Western blot結(jié)果還表明Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白Survivin在復(fù)發(fā)性順鉑耐藥的宮頸癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌組織中β-catenin和Survivin表達(dá)與病人生存曲線的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中β-catenin和Survivin的表達(dá)與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān),β-catenin和Survivin的表達(dá)越高,病人生存時(shí)間越短。第二部分:1.經(jīng)誘導(dǎo)建立的宮頸癌SiHa/DDP、HeLa/DDP、C33A/DDP和CaSki/DDP細(xì)胞系的RI分別為12.34,7.92,7.13和17.65,表現(xiàn)出對順鉑中到重度耐藥。2.SiHa/DDP、HeLa/DDP、C33A/DDP 和 CaSki/DDP 細(xì)胞和各自親本細(xì)胞在順鉑誘導(dǎo)下的凋亡率分別為（3.3±0.64）%vs.（36.9±2.56）%,（8.56±1.27）%s.（47.55±3.78）%,（22.71±4.19）%vs.（47.44±6.97）%和（12.38±3.56）%vs.（58.44±5.63）%,耐藥細(xì)胞凋亡率均顯著低于其相應(yīng)的親本細(xì)胞（P<0.01）。3.SiHa、HeLa、C33A和CaSki細(xì)胞系中β-catenin mRNA和蛋白水平均較正常宮頸鱗狀上皮細(xì)胞（Ect1/E6E7）顯著升高（P<0.05）,SiHa、HeLa、C33A和CaSki順鉑耐藥細(xì)胞系中β-catenin mRNA和蛋白水平均較其親本細(xì)胞進(jìn)一步升高（P<0.05）。第三部分:1.在SiHa、HeLa、C33A和CaSki順鉑耐藥細(xì)胞中過表達(dá)β-catenin,其下游信號因子 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled mRNA和蛋白水平均顯著升高（P均<0.05）,Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939處理后,4 種耐藥細(xì)胞系中 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled 的 mRNA和蛋白水平均呈現(xiàn)下降趨勢。2.細(xì)胞增殖和凋亡結(jié)果顯示,隨著時(shí)間的延長,4種宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中β-catenin組細(xì)胞增殖能力最強(qiáng),凋亡不明顯,而β-catenin+XAV939組,增殖減弱,凋亡明顯,XAV939明顯抑制了細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第四部分:1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了宮頸癌順鉑耐藥SiHa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,與對照組相比,順鉑組和XAV939+順鉑組裸鼠移植瘤體積較對照組和β-catenin+順鉑組明顯下降,XAV939+順鉑組移植瘤體積較順鉑組明顯下降;對照組和β-catenin+順鉑組無明顯差異,移植瘤體積整體變化從大到小依次為對照組/β-catenin+順鉑組>順鉑組>XAV939+順鉑組。2.順鉑組、β-catenin+順鉑組、XAV939+順鉑組和對照組的凋亡指數(shù)分別為（16.26±1.34）%,（7.96±0.53）%、（27.33±1.78）%和（6.54±0.32）%。XAV939+順鉑組凋亡指數(shù)高于順鉑組（P<0.05）,且兩者均高于對照組（P<0.05）;β-catenin+順鉑組凋亡指數(shù)與對照組無顯著差異（P>0.05）。3.免疫組化結(jié)果顯示順鉑組移植瘤中Ki-67蛋白表達(dá)的平均光密度為（0.038+0.0120）,較對照組降低（P<0.05）,XAV939+順鉑組Ki-67蛋白表達(dá)的平均光密度為（0.024±0.008）,較對照組和順鉑組降低（P均<0.05）。4.對照組和 β-catenin+順鉑組中 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled的蛋白表達(dá)水平無顯著差異（P>0.05）,β-catenin+順鉑組β-catenin、Survivin、c-myc和MMP-2的蛋白水平較順鉑組顯著升高（P<0.05）;XAV939+順鉑組β-catenin、Survivin、c-myc蛋白水平較順鉑組則顯著降低（P<0.05）。研究結(jié)論1.在復(fù)發(fā)性順鉑耐藥的宮頸癌組織中存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活,而該通路在正常宮頸組織和原發(fā)性宮頸癌組織中的表達(dá)則比較弱,提示W(wǎng)nt/β-catenin與宮頸癌順鉑耐藥有密切關(guān)系。臨床大數(shù)據(jù)研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin激活與生存期存在負(fù)相關(guān)。2.Wnt/β-catenin信號通路在宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中異常活化,且其通路上關(guān)鍵因子Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)上調(diào)。3.Wnt/β-catenin信號通路過度激活能提高宮頸癌順鉑耐藥性,增強(qiáng)細(xì)胞的增殖活力,降低細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤的生長;抑制Wnt/β-catenin信號通路后能降低宮頸癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制裸鼠移植瘤的生長。4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Wnt/β-catenin信號通路活化降低宮頸癌耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性;抑制Wnt/β-catenin信號通路能提高宮頸癌對順鉑的敏感性,促進(jìn)順鉑的抗癌效果,Wnt/β-catenin抑制劑和順鉑兩者聯(lián)用能促進(jìn)順鉑的抗癌效果。

童琴^[9]（2020）在《MYCN調(diào)控HES1通過凋亡途徑參與小細(xì)胞肺癌化療耐藥的研究》文中指出研究背景肺癌是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤,已成為我國癌癥相關(guān)死亡的首要原因。小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）約占所有肺癌的13%-15%,具有高度侵襲性,生存期短,預(yù)后極差。盡管小細(xì)胞肺癌最初對化療敏感,但大多數(shù)患者會(huì)迅速產(chǎn)生耐藥性,從而導(dǎo)致化療失敗。因此,充分闡明小細(xì)胞肺癌耐藥性的分子機(jī)制對于提高一線化療療效和延長患者的生存有至關(guān)重要的意義。研究目的課題組前期利用基因表達(dá)譜芯片比較分析小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞（H69AR）和敏感細(xì)胞（H69）間基因表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株中MYCN的表達(dá)顯著高于敏感細(xì)胞株（2.3倍）,提示MYCN可能參與了 SCLC化療耐藥。本課題通過體外細(xì)胞和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確MYCN在SCLC化療耐藥中的作用;通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息分析尋找MYCN的下游信號分子,探討MYCN參與SCLC化療耐藥的分子機(jī)制,為下一步開展逆轉(zhuǎn)SCLC化療耐藥的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法及結(jié)果1.MYCN與小細(xì)胞肺癌多藥耐藥相關(guān)（1）siRNA下調(diào)細(xì)胞中的MYCN,CCK8結(jié)果顯示在MYCN下調(diào)的細(xì)胞中,化療藥物的IC50值明顯降低,藥物的敏感性顯著增加。（2）轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)細(xì)胞中的MYCN,CCK8結(jié)果顯示在MYCN上調(diào)的細(xì)胞中,化療藥物的IC50值明顯增加,藥物的敏感性顯著降低。（3）構(gòu)建慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后,進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn):下調(diào)MYCN可以減緩瘤體的增長速度,抑制瘤體的體積,增加化療敏感性;上調(diào)MYCN可以促進(jìn)瘤體的增長速度,增加瘤體的體積,減弱化療敏感性。2.MYCN通過影響細(xì)胞凋亡參與小細(xì)胞肺癌化療耐藥（1）在MYCN下調(diào)的細(xì)胞株中加入化療藥物,流式檢測提示小細(xì)胞肺癌細(xì)胞早期凋亡率明顯增加;Western Blot顯示BAX表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)減少。（2）在MYCN上調(diào)的細(xì)胞株中加入化療藥物,流式檢測提示小細(xì)胞肺癌細(xì)胞早期凋亡率明顯下降;Western Blot顯示BAX表達(dá)減少,Bcl-2表達(dá)增加。3.MYCN直接結(jié)合于HES1啟動(dòng)子區(qū),激活Notch通路（1）經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息分析,發(fā)現(xiàn)Notch通路可能受MYCN的調(diào)控。經(jīng)Western Blot驗(yàn)證,該通路上的NOTCH1,JAG2,HES1與MYCN的表達(dá)呈正相關(guān)。（2）CHIP-qPCR實(shí)驗(yàn)和熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MYCN可結(jié)合在HES1的啟動(dòng)子區(qū)域,并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。4.HES1參與MYCN介導(dǎo)的小細(xì)胞肺癌多藥耐藥（1）用siRNA干擾HES1的表達(dá),CCK8結(jié)果顯示化療藥物的IC50值明顯下降,藥物敏感性顯著增高。（2）在MYCN上調(diào)的細(xì)胞株中用Notch通路抑制劑FLI-06抑制HES1活性,可以挽救MYCN上調(diào)導(dǎo)致的耐藥性升高。（3）裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn):FLI-06聯(lián)合化療組皮下成瘤的體積較化療組及FLI-06組小,增長速率較化療組及FLI-06組慢。5.MYCN與小細(xì)胞肺癌患者的耐藥和生存相關(guān)（1）免疫組化技術(shù)分析小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織標(biāo)本,化療耐藥組中MYCN的陽性表達(dá)率明顯高于化療敏感組,且MYCN和HES1表達(dá)呈正相關(guān)。（2）生存分析提示MYCN高表達(dá)患者的生存時(shí)間較低表達(dá)患者短。結(jié)論1.MYCN與小細(xì)胞肺癌化療耐藥呈正相關(guān)。2.MYCN通過影響凋亡參與小細(xì)胞肺癌化療耐藥。3.MYCN調(diào)控Notch通路,并可直接結(jié)合在HES1啟動(dòng)子區(qū)域,促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。4.HES1與MYCN介導(dǎo)的小細(xì)胞肺癌化療耐藥相關(guān)。5.化療耐藥組中MYCN的陽性表達(dá)率明顯高于化療敏感組,MYCN高表達(dá)患者的生存時(shí)間短,臨床預(yù)后差。

張振華^[10]（2020）在《肺瘤平膏通過AMPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬影響肺癌順鉑耐藥的機(jī)制研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理研究背景肺癌是全球癌癥死亡的主要原因,非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌病例的75%-80%,所有分期的5年生存率約為10%-15%?；熓侵委熌[瘤和防止腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不可替代的常用的治療手段之一,但是在治療過程中出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的耐藥常常導(dǎo)致化療的失敗,最終導(dǎo)致患者的死亡。近年來研究發(fā)現(xiàn),自噬可以用來幫助腫瘤細(xì)胞逃避放化療或者其他治療介導(dǎo)的細(xì)胞死亡,最終導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。腫瘤形成后,在營養(yǎng)和能量不足時(shí),腫瘤細(xì)胞可以利用自噬清除受損的細(xì)胞器和循環(huán)利用正常細(xì)胞中的降解產(chǎn)物為自己供能,使腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的壓力下生存,同時(shí)自噬可以作為一種適應(yīng)性反應(yīng)使腫瘤細(xì)胞耐受放療化療等治療手段產(chǎn)生耐藥。肺瘤平膏（FLP）是具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、化痰止咳功效的中藥復(fù)方,前期研究表明肺瘤平膏能夠通過調(diào)控自噬抑制肺腺癌小鼠的生長和增殖,臨床上我們發(fā)現(xiàn)肺瘤平膏與化療藥聯(lián)用能夠增加患者對化療藥物的敏感性,但是其作用機(jī)制尚無研究。研究目的通過觀察FLP對肺癌化療耐藥荷瘤動(dòng)物模型中腫瘤組織及A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株中耐藥蛋白表達(dá)的影響,從自噬的角度揭示FLP逆轉(zhuǎn)化療耐藥的分子機(jī)制,旨在闡釋FLP逆轉(zhuǎn)耐藥的科學(xué)內(nèi)涵,同時(shí)為進(jìn)一步應(yīng)用中醫(yī)藥治療NSCLC提供科學(xué)依據(jù)。研究方法（1）采用A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株,接種到BALB/c裸鼠的右側(cè)腋下,建立A549/cis肺癌化療耐藥荷瘤動(dòng)物模型,用生理鹽水、FLP、DDP、FLP聯(lián)合DDP、自噬抑制劑氯喹（chloroquine,CQ）、DDP聯(lián)合CQ及FLP聯(lián)合DDP和CQ干預(yù)21天后,取材,測量瘤重,計(jì)算抑瘤率。用免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry,IHC）檢測腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)水平;（2）建立A549/cis肺癌化療耐藥荷瘤動(dòng)物模型,用生理鹽水、FLP、DDP、FLP聯(lián)合DDP、CQ、DDP聯(lián)合CQ及FLP聯(lián)合DDP和CQ干預(yù)21天后,用Western Blotting（WB）和IHC檢測腫瘤組織中耐藥相關(guān)蛋白MDR1和MRP1的表達(dá)水平;（3）建立A549/cis肺癌化療耐藥荷瘤動(dòng)物模型,用生理鹽水、FLP、DDP、FLP聯(lián)合DDP、CQ、DDP聯(lián)合CQ及FLP聯(lián)合DDP和CQ干預(yù)21天后,用WB和IHC檢測腫瘤組織中自噬相關(guān)蛋白LC3、p62、Beclin1、Atg3、Atg5和Atg7的表達(dá)水平,用免疫熒光檢測LC3的表達(dá)水平;（4）建立A549/cis肺癌化療耐藥荷瘤動(dòng)物模型,用生理鹽水、FLP、DDP、FLP聯(lián)合DDP、CQ、DDP聯(lián)合CQ及FLP聯(lián)合DDP和CQ干預(yù)21天后,用WB法檢測腫瘤組織中信號通路相關(guān)蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表達(dá)水平;（5）體外采用A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株,CCK-8法檢測肺瘤平膏對A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株增殖的影響,Annexin V/PI法檢測肺瘤平膏對A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株凋亡的影響:（6）體外采用A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株,用生理鹽水、FLP、DDP、FLP聯(lián)合DDP、CQ、DDP聯(lián)合CQ及FLP聯(lián)合DDP和CQ干預(yù)48h后,WB法檢測肺瘤平膏對A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株耐藥蛋白MDR1和MRP1表達(dá)的影響;（7）構(gòu)建雙熒光mRFP-GFP-LC3體系A(chǔ)549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株,用生理鹽水、FLP、DDP、FLP 聯(lián)合 DDP、CQ、DDP 聯(lián)合 CQ 及 FLP 聯(lián)合 DDP 和 CQ 干預(yù) 48h 后,高內(nèi)涵檢測A549/cis細(xì)胞株自噬蛋白LC3的表達(dá),WB法檢測肺瘤平膏對A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株自噬蛋白LC3、p62、Beclin1、Atg3和Atg7的表達(dá)水平;（8）體外采用A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株,用生理鹽水、FLP、DDP、FLP聯(lián)合DDP、CQ、DDP聯(lián)合CQ及FLP聯(lián)合DDP和CQ干預(yù)48h后,WB法檢測肺瘤平膏對A549/cis肺腺癌耐藥細(xì)胞株信號通路相關(guān)蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表達(dá)水平。研究結(jié)果（1）F+D組、D+C組和F+D+C組均能有效地抑制腫瘤,其抑瘤率分別為49.33%、47.43%和53.78%,其中F+D+C組的抑瘤效果最好。IHC檢測不同藥物干預(yù)21天后腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)發(fā)現(xiàn):FLP組、F+D組、D+C組和F+D+C組均能有效抑制Ki-67的表達(dá),其中D+C組與F+D+C組抑制Ki-67的表達(dá)最明顯。（2）DDP可以一定程度增加耐藥相關(guān)蛋白MDR1和MRP1的表達(dá);而FLP與DDP聯(lián)用、DDP與CQ聯(lián)用及FLP與DDP與CQ聯(lián)用均能明顯降低MDR1的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,IHC也表明這3組能明顯降低MRP1的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,綜上所述,FLP與DDP聯(lián)用能增加DDP的敏感性,其作用與DDP聯(lián)合CQ相當(dāng)。（3）間接免疫熒光法檢測LC3的表達(dá)發(fā)現(xiàn):經(jīng)DDP干預(yù)后特異性點(diǎn)狀分布增加,且結(jié)合WB和IHC的結(jié)果DDP能一定程度增加Atg3、Atg5和Atg7的表達(dá),同時(shí)能降低p62的表達(dá),表明DDP能一定程度誘導(dǎo)自噬。結(jié)合WB、IHC和免疫熒光檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn):FLP聯(lián)合DDP能夠抑制自噬的標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá),增強(qiáng)P62的表達(dá),同時(shí)不同程度地抑制自噬相關(guān)蛋白Atg3、Atg7及Beclin1的表達(dá),DDP聯(lián)合CQ組亦能夠有效抑制自噬的標(biāo)志物L(fēng)C3的表達(dá),增強(qiáng)P62的表達(dá),同時(shí)不同程度地抑制自噬相關(guān)蛋白Atg3、Atg5、Atg7及Beclin1的表達(dá),可見DDP能一定程度誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá);FLP與DDP聯(lián)用能夠抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),其效果接近于DDP聯(lián)用自噬抑制劑。（4）用WB檢測AMPK及mTOR相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn):AMPK及mTOR總蛋白表達(dá)量未見明顯異常,FLP聯(lián)合DDP可以降低p-AMPK的表達(dá),增加p-mTOR的表達(dá)。（5）FLP聯(lián)合化療藥DDP在體外能夠有效地抑制A549/cis耐藥株地增長,作用效果呈現(xiàn)時(shí)間依賴性,且與化療藥DDP聯(lián)合自噬抑制劑CQ作用相當(dāng),其中就某一時(shí)間點(diǎn)而言,FLP聯(lián)合化療藥聯(lián)合CQ對細(xì)胞株地抑制效果最佳;用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):FLP聯(lián)合化療藥DDP在體外能夠有效地促進(jìn)A549/cis耐藥株的凋亡。（6）FLP聯(lián)合化療藥DDP、DDP聯(lián)合CQ及三藥聯(lián)合在體外均能夠有效抑制MDR1的表達(dá),但對MRP1表達(dá)的影響不明顯。（7）雙熒光mRFP-GFP-LC3體系檢測FLP、DDP及CQ單獨(dú)或者聯(lián)合應(yīng)用干預(yù)A549/cis人肺腺癌耐藥細(xì)胞株48h后發(fā)現(xiàn):FLP與DDP聯(lián)用及與CQ三藥聯(lián)用能夠明顯地阻斷自噬流,抑制自噬,同時(shí)WB顯示:FLP聯(lián)合DDP和DDP聯(lián)合CQ均能夠抑制自噬的標(biāo)志物L(fēng)C3 Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá),增強(qiáng)P62的表達(dá),同時(shí)不同程度地抑制自噬相關(guān)蛋白Atg3和Atg7的表達(dá),三藥聯(lián)合除了能降低LC3、Atg3和Atg7的表達(dá),增強(qiáng)P62的表達(dá),還能降低Beclin1的表達(dá)。（8）FLP含藥血清與DDP聯(lián)用、DDP與自噬抑制劑CQ及三藥聯(lián)用能夠明顯抑制信號通路相關(guān)蛋白p-AMPK/AMPK的相對光密度值,同時(shí)提高p-mTOR/mTOR的相對光密度值。研究結(jié)論1、FLP與DDP聯(lián)用能夠有效地抑制A549/cis耐藥荷瘤小鼠腫瘤的生長和增殖,能有效地抑制A549/cis耐藥細(xì)胞株的增長,并促進(jìn)其凋亡。2、FLP與DDP聯(lián)用可以通過抑制自噬降低耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá),增加DDP的敏感性,逆轉(zhuǎn)耐藥。3、FLP與DDP聯(lián)用抑制自噬逆轉(zhuǎn)耐藥可能跟AMPK/mTOR信號通路有關(guān)。

二、THE CORRELATION BETWEEN THE EXPRESSION OF MULTIDRUG RESISTANCE RELATED GENE AND CELL APOPTOSIS AND CLINICAL SIGNIFICANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER（論文開題報(bào)告）

（1）論文研究背景及目的

此處內(nèi)容要求：

首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。

寫法范例：

本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。

（2）本文研究方法

調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。

觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。

實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。

文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。

實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。

定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。

定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識進(jìn)一步精確化。

跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。

功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。

模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。

三、THE CORRELATION BETWEEN THE EXPRESSION OF MULTIDRUG RESISTANCE RELATED GENE AND CELL APOPTOSIS AND CLINICAL SIGNIFICANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER（論文提綱范文）

（1）PAQR3逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥機(jī)制研究（論文提綱范文）

（2）西黃丸治療非小細(xì)胞肺癌療效的系統(tǒng)評價(jià)及作用機(jī)制研究（論文提綱范文）

（3）MACC1、MRP、LRP與肺腺癌順鉑耐藥的相關(guān)性研究（論文提綱范文）

（4）鋅指蛋白300（ZNF300）參與非小細(xì)胞肺癌獲得性多藥耐藥和惡性進(jìn)展的作用及機(jī)制研究（論文提綱范文）

（5）外泌體在非小細(xì)胞肺癌鉑類耐藥中的作用和機(jī)制研究（論文提綱范文）

（6）GBP1通過PGK1激活EMT通路進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥的功能和機(jī)制研究（論文提綱范文）

（7）基于整合生物信息學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療三種常見腫瘤作用機(jī)制研究（論文提綱范文）

（8）經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路與宮頸癌順鉑耐藥的關(guān)系研究（論文提綱范文）

（9）MYCN調(diào)控HES1通過凋亡途徑參與小細(xì)胞肺癌化療耐藥的研究（論文提綱范文）

（10）肺瘤平膏通過AMPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬影響肺癌順鉑耐藥的機(jī)制研究（論文提綱范文）

四、THE CORRELATION BETWEEN THE EXPRESSION OF MULTIDRUG RESISTANCE RELATED GENE AND CELL APOPTOSIS AND CLINICAL SIGNIFICANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER（論文參考文獻(xiàn)）

• [1]PAQR3逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥機(jī)制研究[D]. 方世旭. 遵義醫(yī)科大學(xué), 2021(01)
• [2]西黃丸治療非小細(xì)胞肺癌療效的系統(tǒng)評價(jià)及作用機(jī)制研究[D]. 張志瑩. 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2021(01)
• [3]MACC1、MRP、LRP與肺腺癌順鉑耐藥的相關(guān)性研究[D]. 蔡曉燕. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院, 2021(01)
• [4]鋅指蛋白300（ZNF300）參與非小細(xì)胞肺癌獲得性多藥耐藥和惡性進(jìn)展的作用及機(jī)制研究[D]. 余世龍. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué), 2020(07)
• [5]外泌體在非小細(xì)胞肺癌鉑類耐藥中的作用和機(jī)制研究[D]. 趙曉龍. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué), 2020(07)
• [6]GBP1通過PGK1激活EMT通路進(jìn)而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥的功能和機(jī)制研究[D]. 程麗芳. 南方醫(yī)科大學(xué), 2020(06)
• [7]基于整合生物信息學(xué)的復(fù)方苦參注射液治療三種常見腫瘤作用機(jī)制研究[D]. 孟子琦. 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2020(04)
• [8]經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路與宮頸癌順鉑耐藥的關(guān)系研究[D]. 郭紅軍. 鄭州大學(xué), 2020(02)
• [9]MYCN調(diào)控HES1通過凋亡途徑參與小細(xì)胞肺癌化療耐藥的研究[D]. 童琴. 南方醫(yī)科大學(xué), 2020(01)
• [10]肺瘤平膏通過AMPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬影響肺癌順鉑耐藥的機(jī)制研究[D]. 張振華. 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2020(04)

標(biāo)簽：肺癌論文;  順鉑論文;  肺腺癌論文;  西黃丸論文;  化療藥物論文;