一、Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in Hydra（論文文獻(xiàn)綜述）
陳秀萍[1]（2021）在《GnRH1對(duì)雞卵泡中MMP11/13及血管發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響及MMP11的轉(zhuǎn)錄調(diào)控》文中認(rèn)為雞的卵泡發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過程,卵巢卵泡的發(fā)育受到多個(gè)基因調(diào)控,且卵巢卵泡的生長和成熟伴隨著血管的新生和發(fā)育。下丘腦通過分泌GnRH調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育和性激素的分泌。在雞卵泡的生長發(fā)育過程中,伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和其組織抑制因子（TIMPs）相互作用對(duì)細(xì)胞間進(jìn)行調(diào)節(jié)。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在維持卵巢卵泡的發(fā)育中起著重要的作用,它能夠促進(jìn)新血管的生成和提高血管的通透性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在雞的卵泡細(xì)胞中GnRH1影響MMP11/13以及VEGFR2（KDR）的表達(dá),本研究對(duì)MMP11/13以及血管發(fā)育相關(guān)基因在雞卵巢卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)特征以及GnRH1與這些基因之間的調(diào)控作用進(jìn)行了分析。一、GnRH1、MMP11/13和VEGFA在雞卵巢卵泡組織中的表達(dá)分析免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,GnRH1、MMP11/13和VEGFA在卵巢基質(zhì)、3-5mm卵泡（SW）、6-8mm卵泡（SY）和F6卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均檢測(cè)到免疫陽性信號(hào)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）結(jié)果顯示GnRH1、MMP11/13基因及血管發(fā)育相關(guān)基因在海蘭褐和濟(jì)寧百日雞卵巢卵泡中的表達(dá)模式存在差異。GnRH1 mRNA在海蘭褐F1卵泡中的表達(dá)顯著高于濟(jì)寧百日雞（P<0.05）,在卵巢基質(zhì)中的表達(dá)顯著低于濟(jì)寧百日雞（P<0.01）。MMP11 m RNA在濟(jì)寧百日雞卵巢基質(zhì)中的表達(dá)顯著高于海蘭褐（P<0.001）。MMP13 mRNA在濟(jì)寧百日雞卵巢基質(zhì)、F5和F1卵泡中的表達(dá)顯著高于海蘭褐（P<0.05）。VEGFA m RNA在海蘭褐SW卵泡中的表達(dá)顯著低于濟(jì)寧百日雞（P<0.01）。VEGFC mRNA在海蘭褐F3和F1卵泡中的表達(dá)顯著高于濟(jì)寧百日雞（P<0.001）。VEGFD mRNA在海蘭褐F5卵泡中的表達(dá)顯著低于濟(jì)寧百日雞（P<0.05）,在F1卵泡中的表達(dá)顯著高于濟(jì)寧百日雞（P<0.05）。FLT1 mRNA在海蘭褐F1卵泡中的表達(dá)顯著低于濟(jì)寧百日雞（P<0.01）。KDR和FLT4 mRNA在海蘭褐SY卵泡中的表達(dá)顯著低于濟(jì)寧百日雞（P<0.05）。二、GnRH1、MMP11/13及血管發(fā)育相關(guān)基因在雞卵泡細(xì)胞中的表達(dá)分析qPCR結(jié)果顯示:GnRH1,VEGFC/D和FLT1 mRNA在等級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中高表達(dá)（P<0.05）。FOXP1和VEGFA mRNA在等級(jí)卵泡的膜細(xì)胞中高表達(dá)（P<0.05）。MMP11/13 mRNA在等級(jí)卵泡的膜細(xì)胞中低表達(dá)（P<0.05）。FLT4 mRNA在等級(jí)前卵泡的顆粒細(xì)胞中高表達(dá)（P<0.05）。綜合以上結(jié)果,說明GnRH1、MMP11/13及血管發(fā)育相關(guān)基因在不同卵泡細(xì)胞中的表達(dá)模式與卵泡發(fā)育的特定階段相關(guān)。三、雞卵泡細(xì)胞中GnRH1對(duì)MMP11/13和血管發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響將構(gòu)建的GnRH1基因的過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到雞等級(jí)前后卵泡的顆粒和膜細(xì)胞后,qPCR方法檢測(cè)GnRH1、MMP11/13基因及血管發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示,在等級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中,過表達(dá)GnRH1后,FOXP1,MMP11/13和VEGFA基因的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05）,VEGFD,KDR,FLT4基因的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05）,VEGFC,FLT1,ANGPT2/L2基因的m RNA表達(dá)量均無顯著變化;在等級(jí)卵泡的膜細(xì)胞中,FOXP1基因的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.01）,MMP11/13,VEGFA/C/D,FLT1/4,KDR,ANGPT2/L2基因的mRNA表達(dá)量均無顯著變化;在等級(jí)前卵泡的顆粒細(xì)胞中,MMP11和VEGFA基因的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05）,ANGPTL2基因的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.01）,FOXP1,MMP13,VEGFC/D,FLT1/4,KDR,ANGPT2基因的mRNA表達(dá)量均無顯著變化;在等級(jí)前膜細(xì)胞中,FOXP1,MMP11/13,VEGFA/C/D,FLT1/4,KDR,ANGPT2/L2基因的mRNA表達(dá)量均無顯著變化。ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染GnRH1過表達(dá)載體后VEGFA蛋白的表達(dá)變化,在等級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中,VEGFA蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.01）,在等級(jí)前卵泡的顆粒細(xì)胞中,VEGFA蛋白表達(dá)量無顯著變化。綜合以上結(jié)果,說明GnRH1主要在卵泡顆粒細(xì)胞中調(diào)控MMP11/13及血管發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)。四、MMP11基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MMP11基因啟動(dòng)子區(qū)-1818bp至-1066bp段存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子FOXP1結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建包含F(xiàn)OXP1兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的野生型載體MMP11-WT和兩個(gè)位點(diǎn)的突變載體MMP11-MT1、MMP11-MT2,將其與FOXP1過表達(dá)載體分別在DF-1細(xì)胞系中進(jìn)行共同轉(zhuǎn)染,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP11啟動(dòng)子區(qū)-1598bp至-1602bp的FOXP1作用位點(diǎn)影響MMP11基因的啟動(dòng)活性,MMP11啟動(dòng)子區(qū)-1070bp至-1074bp的FOXP1作用位點(diǎn)不影響MMP11基因的啟動(dòng)活性。進(jìn)一步分析GnRH1和轉(zhuǎn)錄因子FOXP1對(duì)MMP11基因啟動(dòng)活性的影響,將構(gòu)建好的GnRH1和FOXP1過表達(dá)載體分別和共同與MMP11-WT啟動(dòng)子區(qū)載體轉(zhuǎn)染到雞卵泡等級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中,結(jié)果顯示,GnRH1可以上調(diào)MMP11基因啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶活性,FOXP1可以下調(diào)MMP11基因啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶活性,GnRH1和FOXP1過表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染組MMP11基因啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶活性顯著低于pcDNA3.1和PUSE共同轉(zhuǎn)染組,GnRH1和FOXP1過表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染組MMP11啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶活性顯著高于pcDNA3.1和FOXP1過表達(dá)共同轉(zhuǎn)染組。綜上結(jié)果表明雞卵泡顆粒細(xì)胞中FOXP1能下調(diào)MMP11的表達(dá)。綜上所述,我們目前的研究結(jié)果表明GnRH1、MMP11/13以及血管發(fā)育相關(guān)基因在高低產(chǎn)雞中表達(dá)模式不同,且表達(dá)模式與卵泡細(xì)胞特定的發(fā)育階段有關(guān),GnRH1主要在等級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中調(diào)控MMP11/13以及血管發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá),在雞的卵巢和卵泡發(fā)育過程中起到重要作用。
郭慶祥[2]（2021）在《粘體動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育地位與內(nèi)寄生適應(yīng)機(jī)制研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理粘體動(dòng)物（Myxozoa）是形態(tài)簡單、個(gè)體微小的專性內(nèi)寄生蟲,宿主范圍廣泛,能寄生魚類、兩棲類、爬行類、鳥類及哺乳類。當(dāng)前,關(guān)于粘體動(dòng)物的研究主要集中于分類學(xué)、生活史及起源與適應(yīng)性進(jìn)化,其中,起源與適應(yīng)性進(jìn)化是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近三十余年來,粘體動(dòng)物的階元?dú)w屬經(jīng)歷了從原生動(dòng)物到后生動(dòng)物,再到兩側(cè)對(duì)稱生物以及刺胞動(dòng)物的過程。但限于技術(shù)手段,目前無法進(jìn)一步確定粘體動(dòng)物在刺胞動(dòng)物內(nèi)部的具體歸屬和進(jìn)化地位。同時(shí),粘體動(dòng)物目前已報(bào)道超過2,600余種,分布在河流、湖泊、深海、陸地等多種生境中,是生態(tài)適應(yīng)成功的典范。但是,目前粘體動(dòng)物適應(yīng)內(nèi)寄生過程中的驅(qū)動(dòng)因素與分子機(jī)制尚不清楚。作為生命之樹中較為古老、結(jié)構(gòu)較為簡化的后生動(dòng)物寄生蟲,探討粘體動(dòng)物的起源與適應(yīng)性進(jìn)化問題,對(duì)開展后生動(dòng)物重要生命特征,進(jìn)化模式、規(guī)律與機(jī)制研究有著重要意義。隨著組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展以及各種粘體動(dòng)物和刺胞動(dòng)物組學(xué)數(shù)據(jù)的釋放,粘體動(dòng)物的起源與適應(yīng)性進(jìn)化研究擁有了更好的技術(shù)支持與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究以粘體動(dòng)物最大的一科——碘泡科（Myxobolidae）中的部分代表物種為研究對(duì)象,結(jié)合已發(fā)表粘體動(dòng)物、刺胞動(dòng)物資料,運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)、比較蛋白質(zhì)組學(xué)和比較基因組學(xué)技術(shù),對(duì)粘體動(dòng)物在后生動(dòng)物、刺胞動(dòng)物中的系統(tǒng)發(fā)育地位、分化時(shí)間、特異細(xì)胞器刺絲囊對(duì)物種適應(yīng)進(jìn)化貢獻(xiàn)、基因組進(jìn)化、適應(yīng)性進(jìn)化分子機(jī)制等方面進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下:一、粘體動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育地位通過對(duì)粘體動(dòng)物、自由生刺胞動(dòng)物和其他后生動(dòng)物的主要類群進(jìn)行廣泛采樣,本研究建立了較為全面的后生動(dòng)物和刺胞動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育矩陣。其中,后生動(dòng)物矩陣包含103個(gè)物種,232個(gè)直系同源基因（57,930個(gè)氨基酸位點(diǎn)）,數(shù)據(jù)丟失率為31.1%;刺胞動(dòng)物矩陣包含76種后生動(dòng)物和2種鞭毛蟲外群,146個(gè)直系同源基因（51,598個(gè)氨基酸位點(diǎn)）,數(shù)據(jù)丟失率為24.8%?；谏鲜鰞蓚€(gè)矩陣,使用RAx ML,IQ-TREE以及Phylo Bayes軟件,分別在后生動(dòng)物和刺胞動(dòng)物尺度下對(duì)粘體動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)生地位進(jìn)行了探討。并使用近似無偏檢驗(yàn)法對(duì)17種候選的后生動(dòng)物和刺胞動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系開展了測(cè)試。最后,對(duì)上述兩個(gè)矩陣運(yùn)用了快速進(jìn)化位點(diǎn)梯度剔除法來檢測(cè)快速位點(diǎn)是否給系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系造成了誤導(dǎo)。結(jié)果表明粘體動(dòng)物穩(wěn)定地與螅型多足蟲聚為一支,而后再與水母亞門呈姐妹群。AU檢驗(yàn)顯著地拒絕了大多數(shù)（粘體動(dòng)物+螅型多足蟲）之外的聚類方式。雖然粘體動(dòng)物+櫛水母的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未能被顯著拒絕,但其P值僅略大于0.05（0.0561）,進(jìn)化樹中的自展值也極低（0.0000）,因此作者認(rèn)為該結(jié)構(gòu)并非最優(yōu)。快速進(jìn)化位點(diǎn)剔除分析表明,在刪除50%的快速進(jìn)化位點(diǎn)之前,關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)都保持了極高的自展值。在刪除超過50%的位點(diǎn)后,關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的自展值才開始出現(xiàn)下降。（（粘體動(dòng)物+螅型多足蟲）+水母亞門）的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)得到了確定且穩(wěn)定的支持。該研究結(jié)果克服了堿基替換飽和、長枝吸引等以往分子系統(tǒng)分析中的不足的問題,所構(gòu)建的進(jìn)化樹更加穩(wěn)定和準(zhǔn)確。二、粘體動(dòng)物發(fā)生年代分析選取刺胞動(dòng)物冠部的最大分歧時(shí)間（741百萬年前）,水母亞門的最小分歧時(shí)間（570百萬年前）,六放珊瑚亞綱的最小分歧時(shí)間（540百萬年前）,水螅綱的出現(xiàn)時(shí)間（500百萬年前）作為化石校正點(diǎn),使用懲罰似然法（Penalized likelihood,PL）對(duì)粘體動(dòng)物的分化時(shí)間進(jìn)行估算。結(jié)果顯示,刺胞動(dòng)物的最后共同祖先起源于拉伸紀(jì)（736百萬年前）,水母亞門起源于埃迪卡拉紀(jì)（626.6百萬年前）,粘體動(dòng)物共同祖先發(fā)生于晚寒武紀(jì)（492.6百萬年前）。目前,最早的寄生蟲化石發(fā)現(xiàn)于寒武紀(jì),因此本結(jié)果說明粘體動(dòng)物是比較古老的后生動(dòng)物寄生蟲之一。三、粘孢子蟲刺絲囊與殼瓣分離提純方法的建立粘體動(dòng)物的刺絲囊對(duì)其生活史的完成至關(guān)重要,是研究表型對(duì)適應(yīng)性進(jìn)化貢獻(xiàn)的理想對(duì)象。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展,本研究中開發(fā)了一種快速有效的粘體動(dòng)物孢子的解剖方法,該方法可用于分離碘泡科代表物種——洪湖碘泡蟲（Myxobolus honghuensis）、吳李碘泡蟲（Myxobolus wulii）、吉陶單極蟲（Thelohanellus kitauei）的刺絲囊和殼瓣。該方法主要通過蔗糖密度梯度對(duì)粘體動(dòng)物孢子進(jìn)行純化,通過超聲破碎進(jìn)行孢子解離以及Percoll密度梯度離心分離刺絲囊/殼瓣。采用50%-70%-90%Percoll分離液對(duì)孢子破碎液進(jìn)行密度梯度離心,在50%與70%Percoll溶液層之間以及70%Percoll分離液中部可獲得純度接近100%的完整刺絲囊。采用100%的Percoll分離液對(duì)孢子破碎液進(jìn)行離心,在Percoll分離液中部可獲得純度接近100%的完整殼瓣。為進(jìn)一步了解粘體動(dòng)物刺絲囊的生物學(xué),評(píng)估了溫度、鹽度、多種化合物以及重金屬離子對(duì)洪湖碘泡蟲完整孢子和離體刺絲囊釋放情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),熱、尿素和氨處理能夠成功地觸發(fā)大多數(shù)孢子和離體刺絲囊的釋放,而Na Cl、乙酸、乙醇、碳酸氫鈉和Ca Cl2則不能。重金屬處理可顯著降低刺絲囊的釋放率。本研究為下游實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ),還為其他寄生類群孢子的解離研究提供了新視角。四、粘體動(dòng)物綜合蛋白數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建開發(fā)了“定制綜合蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫（customized comprehensive proteomic reference database,CCPRD）”流程,用以提供全面、無污染的蛋白質(zhì)組學(xué)參考數(shù)據(jù)庫。使用洪湖碘泡蟲、吳李碘泡蟲、吉陶單極蟲刺絲囊的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)估了CCPRD的有效性。具體來說,本研究將CCPRD的質(zhì)譜鑒定結(jié)果與四個(gè)對(duì)照數(shù)據(jù)庫的結(jié)果進(jìn)行了比較:（1）轉(zhuǎn)錄組的六框翻譯（trans＿6＿frame）;（2）轉(zhuǎn)錄組+基因組的六框翻譯（genome+transcriptome＿6＿frame）;（3）將人工的宿主和細(xì)菌序列添加到CCPRD（CCPRD＿contam）中而建立的污染物數(shù)據(jù)庫;（4）將通過去污染過程中剔除的序列（包括基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)）回添到CCPRD（CCPRD＿remove）。結(jié)果表明,CCPRD＿contam比CCPRD鑒定出了更多的肽段和蛋白質(zhì),這表明組學(xué)數(shù)據(jù)中確實(shí)存在污染,證明了污染剔除的必要性。對(duì)于CCPRD＿remove,回添污染去除過程中移除的序列并沒有增加鑒定肽段和蛋白質(zhì)的數(shù)量,這表明本方法沒有過度剔除。CCPRD在肽段和蛋白質(zhì)識(shí)別數(shù)量、數(shù)據(jù)庫大小和完整性方面明顯優(yōu)于其他方法。相較傳統(tǒng)數(shù)據(jù)庫,CCPRD能多鑒定出19.1%-43.8%的蛋白質(zhì),并最多可節(jié)省84.6%的數(shù)據(jù)庫容量。此外,本研究分析了各數(shù)據(jù)庫結(jié)果的疏水性指數(shù)與保留時(shí)間的擬合程度,發(fā)現(xiàn)CCPRD可以提高鑒定結(jié)果的可靠性。去冗余分析結(jié)果表明,即使去除了冗余,CCPRD特異性肽段的數(shù)量仍超過其他數(shù)據(jù)庫。這進(jìn)一步證明CCPRD確實(shí)提高了數(shù)據(jù)庫整體的性能,而并非僅僅增加了假陽性或者重復(fù)序列的數(shù)量。本研究為下游比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了技術(shù)保障,并為其他涉及非模式生物的蛋白質(zhì)組項(xiàng)目提供了借鑒和參考。五、刺絲囊對(duì)物種適應(yīng)進(jìn)化貢獻(xiàn)的定量評(píng)估通過分析目前已發(fā)表的刺絲囊蛋白質(zhì)組和111個(gè)刺絲囊轉(zhuǎn)錄組/基因組（包括7個(gè)新測(cè)序的粘體動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組和/或基因組數(shù)據(jù)集）,研究了刺絲囊在刺胞動(dòng)物適應(yīng)性成功中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),刺絲囊組成存在高度異質(zhì)性,且蛋白質(zhì)組相似度與物種親緣關(guān)系之間的不一致,支持了刺絲囊的可塑性適應(yīng)策略,暗示其在刺胞動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化中可能起著重要作用。另外,通過對(duì)刺絲囊的五種核心基因進(jìn)行同源搜索,證明了刺絲囊的自發(fā)性起源,避免了下游分析時(shí)外部共生體的干擾。進(jìn)一步研究了刺胞動(dòng)物主要類群擴(kuò)張前后核心集/非伴隨集的進(jìn)化平衡,發(fā)現(xiàn)了一種“去中心化修飾”的模式:即核心基因只經(jīng)歷了很少的進(jìn)化事件,大量活躍的進(jìn)化事件發(fā)生在非核心基因集中,可能是因?yàn)榇探z囊祖先原型的出現(xiàn)后,刺胞動(dòng)物迅速分化,導(dǎo)致始祖刺絲囊未充分進(jìn)化便擴(kuò)張為各種形式,該發(fā)現(xiàn)同樣支持刺絲囊在刺胞動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化中的關(guān)鍵作用。最后,刺絲囊蛋白（NEMs）適應(yīng)超量分析以及選擇富集分析發(fā)現(xiàn),在NEMs中,最強(qiáng)的適應(yīng)超量(BUSTED P值<10-5)可達(dá)60%(置換檢驗(yàn)P值<2.2e-16,迭代次數(shù)107),并且NEMs顯著富集了背景蛋白的選擇壓力（在0.05、0.01和0.001置信水平下,P值=0.004658、0.01117、0.007638）。綜上,本研究定量地證明了刺絲囊是包括粘體動(dòng)物在內(nèi)的刺胞動(dòng)物成功適應(yīng)性進(jìn)化的基石,并為今后評(píng)估特定表型創(chuàng)新對(duì)物種適應(yīng)性進(jìn)化的貢獻(xiàn)提供了參考。六、洪湖碘泡蟲基因組的馬賽克進(jìn)化為進(jìn)一步了解粘體動(dòng)物適應(yīng)內(nèi)寄生生活的分子機(jī)制,本研究分析了感染異育銀鯽咽部的洪湖碘泡蟲（M.honghuensis）的基因組。通過基因組survey及17-mer分析,預(yù)測(cè)洪湖碘泡蟲基因組大小為206 Mb。三代測(cè)序的基因組最終大小為161 Mb,contig N50為1.3 Mb,預(yù)測(cè)到15,433個(gè)基因模型。進(jìn)一步分析顯示,由于基因保留,內(nèi)含子增大,轉(zhuǎn)座子插入等因素,洪湖碘泡蟲擁有目前最大的粘體動(dòng)物基因組,并且相較其他粘體動(dòng)物呈現(xiàn)出了較低程度的基因組簡化和緊密。作為對(duì)內(nèi)寄生生活方式的適應(yīng),洪湖碘泡蟲基因組中與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的基因大幅丟失,并且擁有最簡單的動(dòng)物免疫基因組件。此外,為更好地適應(yīng)內(nèi)寄生生活,洪湖碘泡蟲抗逆,侵襲,能量代謝和細(xì)胞過程相關(guān)的基因發(fā)生了顯著的擴(kuò)張與正選擇。作者還發(fā)現(xiàn)洪湖碘泡蟲具有相對(duì)保守的中胚層和肌原性組件,以及相對(duì)復(fù)雜的Wnt和Hedgehog信號(hào)通路。本研究揭示了洪湖碘泡蟲基因組的馬賽克進(jìn)化模式,即不同的基因組區(qū)域表現(xiàn)出了不同程度發(fā)保守、分化、減弱和增強(qiáng)。洪湖碘泡蟲的基因組非但沒有表現(xiàn)出遺傳退化,反而表現(xiàn)出相當(dāng)數(shù)量的基因創(chuàng)新和擴(kuò)張(主要涉及到多拷貝基因家族以及相應(yīng)的調(diào)控基因。這些結(jié)果表明,粘體動(dòng)物不像以前認(rèn)為的那樣遺傳簡化。至少對(duì)于粘體動(dòng)物來說,轉(zhuǎn)變?yōu)榧纳x的進(jìn)化過程是由基因組簡化和復(fù)雜化共同驅(qū)動(dòng)的,并且這兩種進(jìn)化機(jī)制的相對(duì)貢獻(xiàn)程度因物種而異。該研究改變或擴(kuò)展了我們對(duì)粘體動(dòng)物基因組復(fù)雜性和進(jìn)化的傳統(tǒng)認(rèn)知,對(duì)于深入理解寄生蟲進(jìn)化這一進(jìn)化生物學(xué)中的基本問題具有重要意義。綜上,本研究基于系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)構(gòu)建了刺胞動(dòng)物物種樹,并分別分析和估算了粘體動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育地位與分化時(shí)間,為進(jìn)一步了解粘體動(dòng)物的起源提供了理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上,從表型（刺絲囊）和分子（洪湖碘泡蟲基因組）兩個(gè)角度闡明了粘體動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化的驅(qū)動(dòng)因素與進(jìn)化機(jī)制,發(fā)現(xiàn)刺絲囊可能是刺胞動(dòng)物（包括粘體動(dòng)物）成功適應(yīng)性進(jìn)化的關(guān)鍵表型;并通過洪湖碘泡蟲與現(xiàn)有粘體動(dòng)物、刺胞動(dòng)物的比較基因組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)粘體動(dòng)物基因組進(jìn)化反映了丟失冗余基因造成的基因組簡化和強(qiáng)化寄生能力導(dǎo)致的基因組復(fù)雜化之間的動(dòng)態(tài)權(quán)衡,從而初步解釋了粘體動(dòng)物內(nèi)寄生適應(yīng)成功的遺傳機(jī)制。
李伊寧[3]（2021）在《KLF2通過TGF-β信號(hào)抑制肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)》文中認(rèn)為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最主要的原發(fā)性肝癌類型,也是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因,嚴(yán)重威脅人類健康。轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor beta,TGF-β）是一條控制眾多生理反應(yīng)的信號(hào)通路,在肝癌致病過程中扮演復(fù)雜的角色;反饋調(diào)節(jié)在決定TGF-β信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間,及其病理生理作用（包括肝臟惡性腫瘤）中起著關(guān)鍵作用。KLF2是Krüppel-like factor（KLF）家族轉(zhuǎn)錄因子的一員,與阻礙HCC發(fā)展相關(guān)。然而,其潛在的分子機(jī)制尚不完全清楚。本論文研究發(fā)現(xiàn):TGF-β能在肝癌細(xì)胞系中刺激KLF2基因表達(dá);過量表達(dá)KLF2能夠在肝癌細(xì)胞中抑制TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而形成一個(gè)新的負(fù)反饋調(diào)控環(huán)。進(jìn)一步機(jī)制研究表明,KLF2通過抑制Smad蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性而減弱TGF-β誘導(dǎo)的靶基因表達(dá),包括上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（Epithelialmesenchymal transition,EMT）相關(guān)基因等,從而減弱TGF-β誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。因此,本論文研究表明KLF2蛋白在肝癌中通過調(diào)控TGF-β信號(hào)而發(fā)揮腫瘤抑制作用。
陳新彤[4]（2021）在《海月水母水螅體60Co-γ射線照射模型構(gòu)建及相關(guān)基因的篩選》文中研究指明一、研究背景隨著核反應(yīng)技術(shù)、醫(yī)療性放射技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及核工業(yè)的快速發(fā)展,放射性接觸導(dǎo)致的各種健康問題越來越受到關(guān)注。在受核污染的海洋中,海洋生物可以通過受污染的食物和水?dāng)z取放射性廢物,從而使它們直接暴露在體外和體內(nèi)的核輻射中,通過直接的電離作用和化學(xué)作用,以及產(chǎn)生的自由基?OH和?H的間接作用,攻擊并破壞核酸、蛋白質(zhì)以及酶等生物大分子,造成對(duì)海洋生物本身及其共生微生物的嚴(yán)重?fù)p害,甚至威脅生命。水母（Jellyfish）是多細(xì)胞海洋生物中最原始的類群之一,通過兩代交替的變態(tài)發(fā)育完成生命周期,其中浮游的水母體在海洋中自由游動(dòng),底棲的水螅體附著在海床上生長。與水母體相比,水螅體可以以無性克隆—出芽生殖的形式維持自身數(shù)量的同時(shí),誘導(dǎo)變態(tài)發(fā)育產(chǎn)生水母體;成熟的水母體可以排放精子,與卵子結(jié)合形成受精卵以有性繁殖的形式實(shí)現(xiàn)種群數(shù)量的進(jìn)一步增加,因此,水螅體在水母種群數(shù)量的維持和擴(kuò)張上發(fā)揮了更為重要的作用。水母這種強(qiáng)大的生殖可塑性賦予其對(duì)時(shí)空環(huán)境變化具有更為快速反應(yīng)和適應(yīng)的能力,從而使得水母能在數(shù)百萬其他物種滅絕、長達(dá)5～6億年的生物進(jìn)化過程中經(jīng)久不息,并成長為分布最為廣泛的海洋生物之一。缽水母綱的海月水母（Aurita sp.）是世界各大海域最為常見、分布最廣泛的代表性水母種類。不僅如此,海月水母還是最早實(shí)現(xiàn)人工飼養(yǎng)和繁殖、最早解析基因組以及研究最多也是最為深入的水母物種,從水螅體的出芽生殖到水母體的變態(tài)發(fā)育等都受到了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。可以說海月水母是一種海洋低等多細(xì)胞無脊椎動(dòng)物的代表,尤其是其水螅體正逐漸成長為研究海洋生物海洋環(huán)境適應(yīng)性的理想模式生物。當(dāng)面臨核污染如沿海核泄漏事故時(shí),由于放射性廢物沉積,核電站附近海域底棲的海月水母水螅體將比浮游的水母體受到更多的輻射污染,從而可能導(dǎo)致其變態(tài)發(fā)育過程的異常而影響水母體種群的數(shù)量與質(zhì)量。由于水母體可以自由游動(dòng),這也可能造成以水母為載體進(jìn)一步的次級(jí)海洋核輻射污染。就核輻射相關(guān)的醫(yī)學(xué)研究而言,以海月水母水螅體為海洋低等模式動(dòng)物,分析核輻射導(dǎo)致水母水螅體的損傷效應(yīng)并分析其與哺乳動(dòng)物的差異,這將會(huì)從進(jìn)化的角度對(duì)核輻射損傷的新機(jī)理闡述、新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)以及新干預(yù)策略研究提供重要參考。因此,本論文以海月水母亞種Aurelia coerulea水螅體為對(duì)象,在自主構(gòu)建的A.coerulea水螅體實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)和觀察體系的基礎(chǔ)上,采用近年來興起的大數(shù)據(jù)組學(xué)技術(shù),同步研究了60Co-γ射線對(duì)海月水母水螅體及其共附生微生物的損傷效應(yīng),這將對(duì)海洋核輻射污染對(duì)海洋低等多細(xì)胞生物的影響,以及以海洋低等多細(xì)胞生物為參照,挖掘新的核輻射損傷新機(jī)理、新靶點(diǎn)以及新干預(yù)策略具有重要意義。二、研究內(nèi)容1.A.coerulea及其水螅體的鑒定以及水螅體實(shí)驗(yàn)室微觀飼養(yǎng)體系的構(gòu)建。2.A.coerulea水螅體60Co-γ射線照射損傷模型構(gòu)建與評(píng)價(jià),基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選A.coerulea水螅體輻射損傷相關(guān)的關(guān)鍵分子與通路,A.coerulea水螅體輻射損傷相關(guān)分子對(duì)哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞輻射損傷的影響。3.60Co-γ射線對(duì)A.coerulea水螅體共生菌的影響。三、研究方法（一）A.coerulea及其水螅體的鑒定以及水螅體實(shí)驗(yàn)室微觀飼養(yǎng)體系的構(gòu)建1.A.coerulea及其水螅體的物種鑒定及分析從A.coerulea及其水螅體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選所有注釋結(jié)果為細(xì)胞色素C氧化酶亞基I的基因序列,并通過Blastn和Blastx與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),找到相似性最大的物種,即為鑒定結(jié)果。使用Bio Edit對(duì)篩選出來的兩條序列與相似度最高的核酸和蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用MEGA7構(gòu)建進(jìn)化樹。2.A.coerulea水螅體微觀飼養(yǎng)體系的建立本部分研究水螅體均使用培養(yǎng)皿和六孔板在鹽度為3%的人工海水和20℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。主要包括人工海水的準(zhǔn)備、餌料鹵蟲的準(zhǔn)備、A.coerulea水螅體的轉(zhuǎn)移、A.coerulea水螅體的附著、A.coerulea水螅體的喂食、更換新鮮人工海水、以及傳代養(yǎng)殖七個(gè)步驟。（二）60Co-γ射線對(duì)A.coerulea水螅體的損傷效應(yīng)及相關(guān)基因篩選1.A.coerulea水螅體60Co-γ射線照射損傷模型構(gòu)建與評(píng)價(jià)通過0～1000 Gy 60Co-γ射線照射構(gòu)建A.coerulea水螅體輻射損傷劑量-效應(yīng)模型。進(jìn)一步通過A.coerulea水螅體輻射損傷劑量效應(yīng)關(guān)系統(tǒng)計(jì)、水螅體的觸手伸展?fàn)顟B(tài)等生物效應(yīng)觀察、以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）等氧化還原酶系酶活力的測(cè)定、病理學(xué)檢查等對(duì)模型進(jìn)行完整的評(píng)價(jià)。2.基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析并篩選輻射損傷相關(guān)的關(guān)鍵分子與通路收集900 Gy 60Co-γ射線照射后和不照射的水螅體樣品,提取RNA后委托杭州聯(lián)川生物公司使用Illumina Hi Seq4000測(cè)序儀進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及注釋分析?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果,對(duì)照射后水螅體的差異表達(dá)基因進(jìn)行NR和Swiss-prot注釋、GO和KEGG通路富集分析并篩選潛在的關(guān)鍵差異分子。通過SWISS-MODEL、RCSB PDB和NCBI BLAST等分析網(wǎng)站及軟件,將損傷相關(guān)基因與其人類同源序列進(jìn)行比對(duì),找出其中的差異片段,核心片段等,模擬構(gòu)建這些分子的3D結(jié)構(gòu),對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,并初步了解其可能具有的生物學(xué)功能。3.A.coerulea水螅體輻射損傷相關(guān)分子對(duì)哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞輻射損傷的影響通過RT-q PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性,PCR擴(kuò)增關(guān)鍵分子全長后通過分子生物學(xué)方法構(gòu)建包含輻射損傷相關(guān)關(guān)鍵分子的過表達(dá)質(zhì)粒,菌液PCR以及Sanger測(cè)序檢查擴(kuò)增基因的正確性。經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增后,抽提目的質(zhì)粒,使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞中,使用綠色熒光標(biāo)記、PCR、Western Blot進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。對(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)蛋白的基因進(jìn)行60Co-γ輻射照射實(shí)驗(yàn),使用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力、流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡等初步探索目標(biāo)分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞輻射損傷的影響。（三）60Co-γ射線對(duì)A.coerulea水螅體共生菌的影響收集A.coerulea四部分傘蓋、觸手、口腕和胃囊以及水螅體照射前和900 Gy 60Co-γ射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)（照射后（2 h以內(nèi)）、照射后1、3、5天）的樣品（共5個(gè)組）,提取DNA,進(jìn)行16S r RNA基因測(cè)序。序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME和R包（v3.2.0）?；诟哔|(zhì)量序列的PICRUSt 2（KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫）預(yù)測(cè)微生物功能。通過以上方法比較分析A.coerulea及其水螅體的共生菌群,以及60Co-γ輻射對(duì)水螅體菌群的影響。四、研究結(jié)果（一）海月水母及其水螅體的鑒定以及水螅體實(shí)驗(yàn)室微觀飼養(yǎng)體系的構(gòu)建1.海月水母、水螅體的物種鑒定及分析我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中觀察了海月水母的變態(tài)發(fā)育過程,主要包括水螅體,橫裂體,碟狀體,和水母體四個(gè)發(fā)育階段,這與傳統(tǒng)的海月水母屬的變態(tài)發(fā)育過程一致,并且實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的成體水母的外形特征與海月水母屬一致,可初步判斷我們研究使用的動(dòng)物屬于海月水母屬。在分子層面,我們從海月水母及其水螅體的轉(zhuǎn)錄組中各自成功篩選到注釋為水母的COI保守基因TRINITY＿DN16912＿c0＿g3和TRINITY＿DN11321＿c3＿g4。將這兩條序列與在線工具Blastn和Blastx中NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示與這兩條序列最接近的COI基因均來自于物種A.coerulea,相似度分別為98.90%,98.95%和99.03%,99.21%。因此,我們通過變態(tài)發(fā)育、形態(tài)學(xué)和基因分子水平的分析最終明確了實(shí)驗(yàn)室的海月水母及其水螅體的品系為A.coerulea,為海月水母屬（Aurelia sp.）的一個(gè)亞種。2.A.coerulea水螅體微觀飼養(yǎng)體系的建立我們成功在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了A.coerulea水螅體的微觀飼養(yǎng)體系,具體包括配制鹽度為2.8～3.2%的人工海水;A.coerulea水螅體餌料準(zhǔn)備（豐年蝦卵的孵化）;將A.coerulea水螅體從波紋板轉(zhuǎn)移至六孔板（每孔5～10只）或培養(yǎng)皿（每皿20～30只）加蓋記錄種植日期后放入20℃生化培養(yǎng)箱;一周內(nèi)不喂食不換水使A.coerulea水螅體附著在板/皿底;附著后A.coerulea水螅體每2天正常喂食一次;喂食2 h后更換新鮮人工海水;以及水螅體長滿后需進(jìn)行傳代培養(yǎng)七個(gè)步驟。目前該方法申請(qǐng)一項(xiàng)國內(nèi)發(fā)明專利,正在實(shí)審階段。（二）60Co-γ射線對(duì)A.coerulea水螅體的損傷效應(yīng)及相關(guān)基因篩選1.A.coerulea水螅體具有明顯的γ射線輻射耐受性A.coerulea水螅體在0～900 Gy 60Co-γ射線照射后,其活力呈現(xiàn)出明顯的劑量-抑制效應(yīng)關(guān)系,并且在5天內(nèi)可以恢復(fù)正常;當(dāng)劑量>900 Gy后,逐漸出現(xiàn)水螅體在一周內(nèi)死亡的現(xiàn)象,并在>1,000 Gy后死亡率達(dá)到100%,海月水母水螅體表現(xiàn)出明顯的輻射耐受性。選擇900 Gy,劑量率為9 Gy/min,構(gòu)建海月水母水螅體60Co-γ輻射劑量-損傷效應(yīng)模型。HE染色結(jié)果顯示,盡管900 Gy已經(jīng)出現(xiàn)明顯癥狀和生化變化,但其主要微觀結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯改變。氧化還原酶系活力測(cè)定則發(fā)現(xiàn)60Co-γ射線照射后24 h內(nèi)水螅體的SOD,CAT,GSH-Px以及T-AOC都呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),這可能與機(jī)體早期清除輻射產(chǎn)生的ROS而被大量消耗以及后期機(jī)體反饋性增高有關(guān)。2.基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選輻射損傷相關(guān)的關(guān)鍵分子與通路通過Illumina測(cè)序共獲得52,759,915個(gè)堿基,去除接頭和低質(zhì)量序列后,共獲得42,684,781條（96.98%）clean reads。使用Trinity軟件組裝得到72,678個(gè)轉(zhuǎn)錄本。輻射組與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)2,748個(gè)基因上調(diào)以及3,361下調(diào)基因。另外,分析KEGG通路與GO注釋發(fā)現(xiàn),與哺乳動(dòng)物輻射損傷常見的TLR、NF-кB以及MAPK等信號(hào)通路不同,而內(nèi)吞作用、線粒體自噬、蛋白質(zhì)的加工與合成、氧化磷酸化等與維持正常生命活動(dòng)的重要通路在照射后的水螅體中均發(fā)生上調(diào)。核酸切除修復(fù),轉(zhuǎn)錄調(diào)控,核酸結(jié)合等與DNA、RNA合成等通路下調(diào)。進(jìn)一步從差異上調(diào)的分中篩選出46個(gè)輻射損傷相關(guān)分子,28個(gè)分子目前沒有注釋,在有注釋的分子中SQSTM1和HSPA8分子在輻射后的變化最大,表達(dá)量為2,538.01和986.18,log2FC為6.52和6.11。3.A.coerulea水螅體輻射損傷相關(guān)分子對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞輻射損傷的影響以篩選出來的46個(gè)輻射損傷相關(guān)上調(diào)表達(dá)的差異基因?yàn)閷?duì)象,首先成功構(gòu)建輻射后上調(diào)的前10個(gè)基因中的Adtrack-a1-Flag,Adtrack-SQSTM1-Flag,Adtrack-Maf A-Flag,Adtrack-a4-Flag,Adtrack-a10-Flag質(zhì)粒。經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增后,抽提質(zhì)粒,使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞中,使用綠色熒光標(biāo)記、PCR、Western Blot進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn),其中Adtrack-a1-Flag,Adtrack-Maf A-Flag,和Adtrack-a10-Flag成功表達(dá)出了目的蛋白,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Maf A,和a10可以在一定程度上減少輻射后293T細(xì)胞晚期凋亡的比例。（三）60Co-γ射線對(duì)A.coerulea水螅體共生菌的影響我們的結(jié)果表明,變形菌門（76.19±3.24%）、軟壁菌門（12.93±3.20%）和厚壁菌門（8.33±1.06%）是A.coerulea中最豐富的菌群,而變形菌門（29.49±2.29%）、厚壁菌門（46.25±5.59%）,擬桿菌門（20.16±2.65%）居水螅體的前三位。60Co-γ射線照射后5天內(nèi),A.coerulea水螅體的變形菌門從29.49±2.29%增加到59.40±3.09%,而厚壁菌門則從46.25±5.59%下降到13.58±3.74%。在科分類等級(jí)上,γ變形菌綱在輻射后5天內(nèi)持續(xù)增加,桿菌先減少,隨后部分恢復(fù),而α-變形桿菌綱和黃桿菌科幾乎不變。五、結(jié)論1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定的A.coerulea水螅體實(shí)驗(yàn)室微觀飼養(yǎng)體系。2.A.coerulea水螅體對(duì)60Co-γ射線照射具有明顯的劑量-損傷效應(yīng)關(guān)系,表現(xiàn)出較大的60Co-γ輻射耐受性。采用900 Gy,劑量率為9 Gy/min成功構(gòu)建了穩(wěn)定的A.coerulea水螅體輻射損傷劑量-損傷效應(yīng)模型。3.照射后24 h內(nèi)A.coerulea水螅體抗氧化酶系（SOD,CAT,GSH-Px和T-AOC）先下降后自我恢復(fù)的過程表明,A.coerulea水螅體γ射線耐受性可能與體內(nèi)強(qiáng)大的氧化防御系統(tǒng)有關(guān)。4.與哺乳動(dòng)物輻射損傷發(fā)揮響應(yīng)經(jīng)典的TLR、NF-k B以及MAPK等信號(hào)通路不同,輻射后A.coerulea水螅體富集上調(diào)的GO功能注釋與KEGG信號(hào)通路主要與內(nèi)吞作用、線粒體自噬、蛋白質(zhì)的加工與合成、氧化磷酸化等與維持正常生命活動(dòng)的重要通路有關(guān)。提示A.coerulea水螅體對(duì)輻射損傷的應(yīng)答反應(yīng)與哺乳動(dòng)物存在明顯的差異,為哺乳動(dòng)物輻射損傷新機(jī)理新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供新的參考。5.A.coerulea水螅體損傷相關(guān)的差異基因Maf A和a10等的過表達(dá)可以減少輻射后293T細(xì)胞晚期凋亡的比例,提示A.coerulea水螅體照射后的部分效應(yīng)分子在一定程度上具有發(fā)揮輻射防護(hù)作用的潛力。6.60Co-γ射線輻射后A.coerulea水螅體體內(nèi)共附生微生物的動(dòng)態(tài)變化與再分配過程可能是A.coerulea水螅體機(jī)體對(duì)包括輻射在內(nèi)的外界環(huán)境干擾適應(yīng)的重要機(jī)制,有助于A.coerulea水螅體等海洋低等多細(xì)胞無脊椎動(dòng)物對(duì)外界環(huán)境的耐受和適應(yīng)。
柳鑫[5]（2021）在《miR-146b巨球蛋白α2M信號(hào)軸在骨關(guān)炎病理過程的作用及機(jī)制研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理研究目的骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是老齡化人群中最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病,因?yàn)檐浌墙M織內(nèi)無神經(jīng)及血管所以病變初期極難被診斷發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)通常病變已進(jìn)入中晚期,由于缺乏有效的疾病干預(yù)手段,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形活動(dòng)受限而喪失勞動(dòng)能力,是致殘率很高的幾種疾病之一。軟骨組織的不可逆性損壞降解是OA的最主要病理特征,如何防止或者延緩軟骨組織的損傷一直是領(lǐng)域研究重點(diǎn)。正常的軟骨組織由關(guān)節(jié)軟骨和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)組成,其中細(xì)胞外基質(zhì)占干重的絕大部分,它的代謝正常對(duì)維持關(guān)節(jié)軟骨的生理功能至關(guān)重要。OA時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶廣泛分泌參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解,而廣譜蛋白酶抑制劑巨球蛋白α2M是否能對(duì)這一病理過程起到調(diào)控作用不得而知。本研究將通過臨床標(biāo)本、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型以及軟骨細(xì)胞模型,深入探討巨球蛋白α2M在OA病理過程中的具體作用及其潛在機(jī)制。研究方法通過對(duì)臨床OA患者及正常關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本進(jìn)行病理評(píng)估后檢測(cè)巨球蛋白α2M的表達(dá)情況;通過收集6M、12M、18M、24M年齡階段小鼠關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本,檢測(cè)巨球蛋白α2M在年齡相關(guān)性軟骨損傷中的表達(dá)情況;通過構(gòu)建小鼠膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)DMM-OA模型檢測(cè)巨球蛋白α2M在創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)情況;通過構(gòu)建巨球蛋白α2M慢病毒并進(jìn)行OA小鼠膝關(guān)節(jié)腔注射,觀察外源性補(bǔ)充巨球蛋白α2M對(duì)OA病理進(jìn)程的影響;通過靶基因預(yù)測(cè),篩選上游microRNA并檢測(cè)OA中其相互作用關(guān)系。研究結(jié)果人源性標(biāo)本OA患者中巨球蛋白α2M的表達(dá)下調(diào),DMM-OA模型小鼠標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)果顯示巨球蛋白α2M表達(dá)量呈波動(dòng)性變化,疾病發(fā)展初始階段表達(dá)量上調(diào),然而隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展表達(dá)量逐漸降低,不同年齡階段小鼠的軟骨組織中也得到類似結(jié)果,巨球蛋白α2M的基礎(chǔ)表達(dá)量較低,軟骨損傷初期表達(dá)量增加,到后期時(shí)表達(dá)量顯著下降。外源性巨球蛋白α2M慢病毒補(bǔ)充能有效改善DMM-OA小鼠關(guān)節(jié)軟骨磨損,預(yù)防蛋白聚糖丟失及細(xì)胞外基質(zhì)降解,有助于維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡,并降低小鼠骨關(guān)節(jié)炎OARSI評(píng)分,能夠延緩OA小鼠病理進(jìn)程。研究證明巨球蛋白α2M是miR-146b直接作用靶點(diǎn),miR-146b可以負(fù)向調(diào)控巨球蛋白α2M參與軟骨細(xì)胞增殖凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡,且這一作用是通過PBK/AKT通路實(shí)現(xiàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示miR-146b表達(dá)抑制能有效改善OA小鼠病理變化。研究結(jié)論巨球蛋白α2M在骨關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)呈波動(dòng)性變化先上升后下降,外源性補(bǔ)充巨球蛋白α2M能有效延緩小鼠骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)程,miR-146b能夠負(fù)向調(diào)控巨球蛋白α2M生物學(xué)功能,miR-146b表達(dá)抑制有助于維持軟骨細(xì)胞活性及細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡。
杜欣[6]（2021）在《牛黃及其有效成分對(duì)神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用研究》文中研究指明目的:觀察牛黃及其有效成分對(duì)體外腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用,闡明牛黃及其有效成分治療缺血性中風(fēng)的內(nèi)在生物學(xué)機(jī)制。方法:1.體外腦神經(jīng)血管單元模型的建立以及缺氧/復(fù)氧模型的建立（1）利用體外原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),提取大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞鑒定;（2）利用transwell板將三種細(xì)胞共培養(yǎng),構(gòu)建體外腦神經(jīng)血管單元的模型,利用TEER值,判定模型是否成功;（3）采用缺氧1h,復(fù)氧24h,構(gòu)建OGD/R模型,利用TEER值、熒光素鈉滲透系數(shù)判定模型是否成功。2.牛黃及其有效成分對(duì)三種細(xì)胞的毒性利用不同濃度的牛黃（Bezoar）、?；撬幔═aurine）、牛黃熊去氧膽酸（TUDCA）和熊去氧膽酸（UDCA）,作用于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,分別干預(yù)24h和48 h,利用CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力,檢測(cè)每種不同濃度的藥物對(duì)細(xì)胞的毒性。3.牛黃及其有效成分對(duì)腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用（1）通過OGD/R模型,檢測(cè)牛黃、?；撬帷UDCA和UDCA的不同劑量對(duì)細(xì)胞的作用,利用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力,確定每種藥物的最佳劑量;（2）利用藥物的最佳劑量進(jìn)行干預(yù),通過檢測(cè)血腦屏障的通透性:TEER值、熒光素鈉滲透系數(shù)和γ-GT;炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、NO、MDA以及神經(jīng)元凋亡率。（3）牛黃對(duì)腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)機(jī)制研究加入抑制劑LY294002,檢測(cè)牛黃對(duì)細(xì)胞的干預(yù)是通過PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)的;檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金屬蛋白酶MMP2、MMP9,緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、p-AKT。4.不同配伍組分對(duì)腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用（1）利用OGD/R模型,篩選牛磺酸+?；切苋パ跄懰幔═+T）,?；撬?熊去氧膽酸（T+U）的最佳劑量;（2）利用藥物的最佳劑量進(jìn)行干預(yù),通過檢測(cè)血腦屏障的通透性:TEER值、熒光素鈉滲透系數(shù)和γ-GT;炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、NO、MDA以及神經(jīng)元凋亡率。5.配伍組分?；撬岷托苋パ跄懰釋?duì)腦神經(jīng)血管單元的作用機(jī)制利用T+U的最佳劑量,進(jìn)行OGD/R的造模,檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金屬蛋白酶 MMP2、MMP9,緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 NF-κBp65,p-P65,IKBα,p-IKBα 蛋白表達(dá)。6.配伍組分牛磺酸和牛磺熊去氧膽酸對(duì)腦神經(jīng)血管單元的作用機(jī)制利用T+T的最佳劑量,進(jìn)行OGD/R的造模,檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金屬蛋白酶MMP2、MMP9,緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5,CA43、AQP4以及 P38MAPK,P-P38MAPK。結(jié)果1.獲得了純度較高的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞（1）神經(jīng)元培養(yǎng)7d后成熟,經(jīng)MAP2免疫熒光鑒定,純度大于95%;（2）星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)7d后成熟,經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定,純度大于95%;（3）內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)7d后成熟,經(jīng)Ⅷ因子免疫熒光鑒定,純度大于95%。2.利用transwell,建立了腦神經(jīng)血管單元的模型（1）該模型的電阻值在3-5天趨于平穩(wěn);（2）三細(xì)胞共培養(yǎng),三種細(xì)胞的狀態(tài)和單細(xì)胞相比,更佳。3.成功復(fù)制OGD/R模型利用缺氧1h,復(fù)氧24h,能夠成功復(fù)制OGD/R模型,和正常組相比,模型組電阻值降低,熒光素鈉滲透系數(shù)升高,能夠進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。4.篩選藥物毒性利用不用濃度的牛黃、?；撬帷⑴；切苋パ跄懰岷托苋パ跄懰岱謩e干預(yù)24h和48h,篩選藥物的毒性。5.篩選藥物的保護(hù)劑量利用無毒性的各種藥物濃度,通過OGD/R造模方法,檢測(cè)細(xì)胞活力,篩選出保護(hù)作用的最佳劑量。6.牛黃及其有效成分對(duì)體外腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用（1）牛黃及其有效成分降低LDH,升高γ-GT,提高TEER值和降低熒光素鈉滲透系數(shù);（2）牛黃及其有效成分減少炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1 β的水平;（3）牛黃及其有效成分降低NO、MDA的水平,升高SOD的水平;（3）牛黃及其有效成分抑制神經(jīng)元的凋亡;（4）牛黃降低MMP2、MMP9的蛋白表達(dá);（5）牛黃能升高緊密連接蛋白的表達(dá),提高ZO-1、Occludin、Claudin-5的蛋白表達(dá);（6）牛黃通過HIF-α/VEGF,PI3K/AKT通路,發(fā)揮保護(hù)NVU的作用,牛黃降低HIF-1α、VEGF的蛋白表達(dá)水平,升高PI3K、AKT的蛋白表達(dá)水平。7.不同配伍組分對(duì)腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用（1）篩選了配伍組分的最佳劑量,T+T的最佳劑量1mM Taurine和1μM TUDCA,T+U的最佳劑量1mM Taurine和1μM UDCA;（2）T+T、T+U有效保護(hù)血腦屏障,降低TEER值,降低熒光素鈉滲透系數(shù),升高γ-GT;（3）T+T、T+U有效減輕細(xì)胞損傷,降低LDH的水平;（4）T+T、T+U有效減輕炎癥反正,降低TNF-α、IL-6、IL-1β的值;（5）T+T、T+U有效抑制氧化反應(yīng),降低NO、MDA的水平,升高SOD的活力;（6）T+T、T+U抑制神經(jīng)元的凋亡率。8.配伍組分?；撬岷托苋パ跄懰釋?duì)腦神經(jīng)血管單元的作用機(jī)制（1）T+U抑制神經(jīng)元的凋亡率;（2）T+U 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表達(dá);（3）T+U降低MMP2、MMP9的蛋白表達(dá);（4）T+U降低Bax、Caspase-3蛋白表達(dá),升高Bcl-2蛋白表達(dá);（5）T+U降低MyD88、P-P65、P-IKB α的蛋白表達(dá),通過MyD88/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮腦保護(hù)作用。9.配伍組分?；撬岷团｜S熊去氧膽酸對(duì)腦神經(jīng)血管單元的作用機(jī)制（1）T+T抑制神經(jīng)元的凋亡率;（2）T+T 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表達(dá);（3）T+T降低MMP2、MMP9的蛋白表達(dá);（4）T+T降低Bax、Caspase-3蛋白表達(dá),升高Bcl-2蛋白表達(dá);（5）T+U降低AQP4、P38MAPK,升高CX43的蛋白表達(dá)。結(jié)論（1）牛黃、?；撬?、TUDCA和UDCA能夠減輕炎癥反應(yīng),降低氧化應(yīng)激的水平,抑制神經(jīng)元的凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用;（2）牛黃通過HIF-1α/VEGF和PI3K/AKT通路發(fā)揮腦保護(hù)作用;（3）?；撬岷团；切苋パ跄懰??；撬岷托苋パ跄懰崤湮?發(fā)揮協(xié)同作用,比單獨(dú)使用?；撬崴幮Ц?（4）?；撬岷托苋パ跄懰?000:1的配伍能夠抑制炎癥反應(yīng),降低氧化應(yīng)激的水平,保護(hù)血腦屏障,抑制神經(jīng)元的凋亡,能夠抑制通路MyD88/NF-κB通路發(fā)揮腦保護(hù)作用（5）牛磺酸和?；切苋パ跄懰?000:1的配伍能夠抑制炎癥反應(yīng),降低氧化應(yīng)激,保護(hù)血腦屏障,能夠抑制P38MAPK通路,發(fā)揮腦保護(hù)作用;
譚衛(wèi)星[7]（2021）在《外泌體Dvl3 mRNA調(diào)節(jié)Wnt通路對(duì)關(guān)節(jié)滑膜增殖、炎癥的作用及其機(jī)制》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理一、背景類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一種以對(duì)稱性、侵蝕性和破壞性關(guān)節(jié)炎為特點(diǎn)的慢性全身性自身免疫性疾病,其中RA患者關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞（Fibroblast-1ike synoviocyte,FLS）的生物學(xué)特征改變及功能異常被認(rèn)為與RA的發(fā)病密切相關(guān)。人們對(duì)導(dǎo)致RA-FLS“腫瘤樣增殖”表型的分子機(jī)制目前仍知之甚少,猜測(cè)可能是細(xì)胞暴露于體內(nèi)類風(fēng)濕炎癥環(huán)境中以某種方式的被動(dòng)應(yīng)答,而這一炎癥環(huán)境中的效應(yīng)分子包括最新研究發(fā)現(xiàn)的一些新的生物標(biāo)志物如:外泌體,后者被認(rèn)為同樣具有潛在的臨床診斷和治療作用。我們既往研究顯示在Wnt經(jīng)典及非經(jīng)典兩條信號(hào)通路中扮演著交叉點(diǎn)角色的Dvl的一個(gè)亞型即Dvl3分子在RA血清外泌體中顯著升高。推測(cè)Dvl3這一分子在RA中可能具有誘人的研究前景,因此本研究旨在探尋Dvl3在RA中的表達(dá)模式以及通過外泌體這一方式研究Dvl3 mRNA在RA中的功能及作用機(jī)制,為將來能夠更深入了解RA的發(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的可能的治療靶點(diǎn)奠下基礎(chǔ)。二、研究目的第一部分:明確Dvl3在RA患者滑膜組織和細(xì)胞以及膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型（CIA）滑膜組織中的表達(dá)情況。第二部分:明確外泌體Dvl3 mRNA在體外對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及炎性反應(yīng)的作用。第三部分:明確外泌體Dvl3 mRNA在體內(nèi)對(duì)CIA模型疾病程度、疼痛、滑膜破壞和凋亡、軟骨和骨破壞以及血清炎性因子水平的影響。第四部分:探討Dvl3 mRNA發(fā)揮上述作用的可能下游機(jī)制。三、研究方法第一部分:（1）分別收集了6例RA和創(chuàng)傷（Trauma）患者的膝關(guān)節(jié)滑膜組織,經(jīng)固定、包埋、切片機(jī)組織HE染色對(duì)兩組滑膜組織病理進(jìn)行比較;（2）分別通過免疫組化（IHC）、蛋白印跡（WB）及實(shí)時(shí)定量PCR（q PCR）比較Dvl3在兩組患者滑膜組織中的表達(dá)水平;（3）從滑膜組織中原代提取成纖維樣滑膜細(xì)胞,比較Dvl3的表達(dá)水平;（4）通過構(gòu)建膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型,比較Dvl3在疾病模型小鼠及正常小鼠膝關(guān)節(jié)中的表達(dá)水平。第二部分:（1）構(gòu)建Dvl3 mRNA過表達(dá)及干擾慢病毒,鑒定摸索慢病毒感染RA-FLS條件,獲得能夠穩(wěn)定上調(diào)或下調(diào)Dvl3 mRNA的RA-FLS;（2）進(jìn)一步摸索條件通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清超速離心獲得能夠穩(wěn)定介導(dǎo)目標(biāo)RA-FLS中Dvl3 mRNA水平改變的外泌體,并通過q PCR及WB進(jìn)行驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。（3）采用Tunel及流式檢測(cè)法測(cè)定不同來源外泌體轉(zhuǎn)染RA-FLS后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;CKK8測(cè)定RA-FLS細(xì)胞活性;（4）經(jīng)劃痕和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞遷移能力;（5）利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)水平檢測(cè)反映細(xì)胞侵襲能力;（6）提取目的細(xì)胞RNA及上清分別使用q PCR及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各細(xì)胞因子的mRNA及蛋白水平。第三部分:（1）外泌體獲取同第二部分,構(gòu)建CIA小鼠模型,對(duì)小鼠關(guān)節(jié)腔注射外泌體,每周一次;（2）第二次免疫次日起對(duì)小鼠疾病評(píng)分;（3）對(duì)小鼠足爪機(jī)械痛覺進(jìn)行一次評(píng)分;（4）頸椎脫臼法處死小鼠獲取小鼠膝關(guān)節(jié),分別行HE染色、番紅O-固綠染色及Tunel染色對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)病理、軟骨破壞及滑膜細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行評(píng)價(jià);（5）門靜脈取血并采用ELISA法檢測(cè)各細(xì)胞因子表達(dá)水平。第四部分:（1）提取不同來源外泌體處理后的RA-FLS中的RNA,q PCR檢測(cè)Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子篩選Dvl3的可能下游通路;（2）進(jìn)行WB驗(yàn)證;（3）構(gòu)建Dvl3 mRNA過表達(dá)和干擾質(zhì)粒并進(jìn)行轉(zhuǎn)染驗(yàn)證,上述質(zhì)粒同雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證Dvl3對(duì)TCf以及ROCK2啟動(dòng)子的活性。四、結(jié)果第一部分:（1）成功提取了RA和創(chuàng)傷患者關(guān)節(jié)滑膜的原代FLS進(jìn)行培養(yǎng)、鑒定及傳代。（2）RA組滑膜在滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤及毛細(xì)血管增生等方面的評(píng)分明顯更高。（3）Dvl3在RA患者滑膜中的表達(dá)水平明顯升高。（4）Dvl3在RA-FLS中的表達(dá)同樣明顯高于對(duì)照創(chuàng)傷組。（5）Dvl3在炎性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)被顯著上調(diào)。第二部分:（1）CKK8結(jié)果顯示來自過表達(dá)外泌體組的外泌體能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖活性,而干擾外泌體組外泌體可以起到抑制FLS增殖的作用。（2）凋亡結(jié)果顯示過表達(dá)外泌體組較對(duì)照組顯著下調(diào)了RA-FLS的凋亡水平。（3）遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)提示了過表達(dá)Dvl3外泌體對(duì)細(xì)胞遷移及侵襲的促進(jìn)作用,同時(shí)伴有上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平的作用,在干擾外泌體組中則觀察到幾乎相反的作用。（4）q PCR及ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子含量水平提示Dvl3 mRNA過表達(dá)外泌體能夠顯著促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-21的表達(dá),干擾外泌體組則可以觀察到IL-17和IL-21的顯著下調(diào)。第三部分:（1）成功構(gòu)建了CIA小鼠模型,小鼠疾病評(píng)分結(jié)果顯示過表達(dá)外泌體注射組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)較對(duì)照組升高更快。（2）機(jī)械痛閾值測(cè)定結(jié)果顯示干擾外泌體組小鼠疼痛閾值下降程度較對(duì)照組明顯減緩。（3）WB及q PCR驗(yàn)證了外泌體注射干預(yù)效果。（4）HE染色提示過表達(dá)外泌體組病理評(píng)分明顯高于對(duì)照組;而Sh-Dvl3 mRNA干擾外泌體注射組則有效緩解了小鼠的關(guān)節(jié)炎癥。（5）番紅O-固綠染色結(jié)果顯示過表達(dá)外泌體組評(píng)分明顯高于對(duì)照組,而干擾實(shí)驗(yàn)組則傾向表現(xiàn)出對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)性作用。（6）Tunel實(shí)驗(yàn)提示Sh-Dvl3 mRNA外泌體注射組表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促凋亡結(jié)果。（7）ELISA結(jié)果顯示Dvl3在膝關(guān)節(jié)的表達(dá)水平升高可以顯著上調(diào)血清中TNF-α、IL-17及IL-21的水平。第四部分:（1）q PCR結(jié)果顯示Dvl3 mRNA的過表達(dá)同樣伴隨著β-catenin及Rho A下游分子ROCK2的明顯升高,而在Dvl3 mRNA干擾外泌體組則觀察到β-catenin及Ro CK2較對(duì)照組的顯著下降。以上結(jié)果經(jīng)WB得到進(jìn)一步驗(yàn)證。（2）雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)來明確Dvl3在Wnt通路兩條通路中的作用,結(jié)果提示了Dvl3可以同時(shí)激活經(jīng)典及非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。五、結(jié)論本課題通過臨床及動(dòng)物組織樣本表達(dá)、原代細(xì)胞培養(yǎng)體外實(shí)驗(yàn)研究、構(gòu)建動(dòng)物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究以及具體分子機(jī)制四個(gè)部分對(duì)Dvl3的表達(dá)以及外泌體Dvl3mRNA的功能進(jìn)行了較為詳盡的研究,發(fā)現(xiàn)了Dvl3在RA患者及炎性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中的高表達(dá),以及其在細(xì)胞水平可能具有促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制凋亡,促進(jìn)遷移、侵襲及促炎性細(xì)胞因子的分泌等作用進(jìn)而參與介導(dǎo)了關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展和加重,進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示其發(fā)揮上述作用的下游途徑可能離不開對(duì)Wnt經(jīng)典及非經(jīng)典通路的激活,包括β-catenin/TCF/LEF-1及Rho A/ROCK2通路的活化,同時(shí)Dvl3 mRNA干擾外泌體組獲得的對(duì)炎癥性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)性結(jié)果為未來RA的干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)和新的潛在靶點(diǎn)。
白清麗[8]（2021）在《AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路在稽留流產(chǎn)中的作用及機(jī)制研究》文中提出目的:通過檢測(cè)病例組和對(duì)照組胚胎組織中AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路相關(guān)因子和滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力相關(guān)因子MMPs與TIMPs的基因和蛋白表達(dá)水平,研究此信號(hào)通路與稽留流產(chǎn)的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制。方法:在蘭州市婦幼保健院和平?jīng)鍪徐o寧縣婦幼保健院收集2018年05月至2019年04月期間,確診的稽留流產(chǎn)患者和同時(shí)期進(jìn)行人工流產(chǎn)終止妊娠的正常早孕者的血清及胚胎組織建立標(biāo)本庫。本研究選取12名稽留流產(chǎn)者為病例組,12名人工流產(chǎn)者為對(duì)照組,兩組研究者孕周相同、年齡相近,無其他疾病及不良嗜好。對(duì)兩組胚胎組織進(jìn)行研究分析:（1）光鏡下觀察12對(duì)研究對(duì)象絨毛組織的病理組織學(xué)的變化;（2）采用q RT-PCR檢測(cè)AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路相關(guān)因子基因的相對(duì)表達(dá)水平以及滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力相關(guān)因子基因的相對(duì)表達(dá)水平;（3）采用Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)定量分析系統(tǒng)檢測(cè)兩組絨毛組織中AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路中相關(guān)因子蛋白的表達(dá)水平以及滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力相關(guān)因子蛋白的表達(dá)水平;（4）采用免疫組織化學(xué)法觀察p-STAT3在絨毛及蛻膜組織中的分布并進(jìn)行定量分析。結(jié)果:（1）組織病理觀察:病例組絨毛組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂,滋養(yǎng)層明顯變薄變淺,絨毛管腔變細(xì)、極度狹窄甚至消失,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,絨毛間質(zhì)不清晰。（2）AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá):病例組絨毛組織中AKT、mTOR和STAT3 m RNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較均降低（P<0.05）;病例組絨毛組織中p-AKT、mTOR、p-mTOR、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較均降低（P<0.05）,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-STAT3/STAT3比值也均較對(duì)照組減?。≒<0.05）。（3）p-STAT3定位及定量:在兩組絨毛組織中的合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜組織中均有不同程度地p-STAT3的陽性表達(dá),其主要表達(dá)于細(xì)胞核中;p-STAT3蛋白在病例組的表達(dá)低于對(duì)照組（P<0.05）。（4）滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力相關(guān)因子表達(dá):病例組絨毛組織中MMP2和MMP9 m RNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比均降低（P<0.05）,TIMP2 m RNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比則升高（P<0.05）;病例組絨毛組織中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均降低（P<0.05）,TIMP2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高（P<0.05）,MMP2/TIMP2和MMP9/TIMP3比值與對(duì)照組比較均減?。≒<0.05）。結(jié)論:稽留流產(chǎn)絨毛膜組織中AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路表達(dá)下調(diào),其下游轉(zhuǎn)錄因子MMP2/TIMP2和MMP9/TIMP3失衡,可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力降低,妊娠早期胚胎植入過淺,滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常,影響胚胎的正常生長發(fā)育。AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)可能是稽留流產(chǎn)發(fā)生的重要機(jī)制之一。
黃艷[9]（2021）在《Hc-nas-33參與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮過程的功能及其分子機(jī)制初步研究》文中指出捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）是一種寄生于牛、羊、駱駝等反芻動(dòng)物皺胃中的吸血性寄生蟲,在我國呈廣泛性流行,給中國的畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失?？谷湎x藥物對(duì)于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病有良好的治療效果,但近年來耐藥株頻繁出現(xiàn),增加了該病防治的難度。線蟲生命調(diào)控關(guān)鍵基因作為新型藥物靶點(diǎn)的篩選及抗蠕蟲藥物開發(fā)是目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病防控的重要研究方向。蛻皮是線蟲生長發(fā)育過程中必經(jīng)的生命過程,當(dāng)該過程發(fā)生障礙時(shí),可影響蟲體的正常發(fā)育,降低活動(dòng)能力,甚至導(dǎo)致幼蟲死亡,因此探明蛻皮作用機(jī)制及相關(guān)基因的生物學(xué)功能,對(duì)于該病的防控至關(guān)重要。本研究從已公布的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選了 3種線蟲蝦紅素樣蛋白基因（Nematode astacin,NAS）,擴(kuò)增獲得了 Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33基因全長,并對(duì)其結(jié)構(gòu)域和分子進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析;在HEK 293T細(xì)胞、秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中觀察了 HcNASs的表達(dá)特性;利用轉(zhuǎn)錄特性分析和RNA干擾試驗(yàn)探究了Hc-nas-33在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮的功能;構(gòu)建了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酵母cDNA文庫,并篩選得到Hc-NAS-33的候選互作蛋白鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白 β 亞基-1（Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-1,GPB-1）,驗(yàn)證了兩者的互作關(guān)系;并對(duì)Hc-GPB-1在蛻皮過程中的功能進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮機(jī)制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為新藥開發(fā)提供了潛在的藥物靶點(diǎn)。1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HcNASs基因特性分析通過擴(kuò)增獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲3個(gè)蝦紅素樣蛋白基因Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33的全長DNA及mRNA序列,利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析基因結(jié)構(gòu)、蛋白功能和分子進(jìn)化關(guān)系;并構(gòu)建原核表達(dá)載體獲得重組蛋白,制備多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,3個(gè)HcNASs均有典型的鋅金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域,此外Hc-NAS-31還具有1個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域和1個(gè)SXC結(jié)構(gòu)域,Hc-NAS-33具有1個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域;Hc-NAS-5和Hc-NAS-31具有C端信號(hào)肽。利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了 HcNASs重組蛋白,通過免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得了特異性較好的多克隆抗體。本研究擴(kuò)增得到3種HcNASs基因?qū)ζ溥M(jìn)行了生物信息學(xué)分析,制備了多克隆抗體,可用于后續(xù)蛋白表達(dá)特性分析。2.HcNASs表達(dá)特性分析為了全面分析HcNASs的表達(dá)特性,本研究首先通過構(gòu)建真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,分析其在真核細(xì)胞中的定位情況;構(gòu)建異源表達(dá)質(zhì)粒,通過顯微注射獲得重組轉(zhuǎn)基因蟲株,探究在秀麗隱桿線蟲中的表達(dá)情況;利用制備的多克隆抗體,通過幼蟲間接免疫熒光（Indirect immunofluorescence,IFA）和L4及成蟲免疫組織熒光（Immunohistofluorescence,IHF）分析在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中的表達(dá)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3種HcNASs均表達(dá)于HEK 293T細(xì)胞質(zhì)中;在秀麗隱桿線蟲中,Hc-NAS-5只表達(dá)于咽部和尾部極少數(shù)細(xì)胞中,Hc-NAS-31不能表達(dá),Hc-NAS-33表達(dá)于咽部與腸道內(nèi);在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中,Hc-NAS-5和Hc-NAS-31定位于L3上皮合胞體,而在成蟲中Hc-NAS-5和Hc-NAS-31表達(dá)模式缺乏特異性,廣泛分布于多種蟲體組織,Hc-NAS-33特異性表達(dá)于腸道與肌肉接觸面、子宮膜和未成熟蟲卵外周。本研究明確了 HcNASs的表達(dá)特性,為后續(xù)的功能研究指明了方向。3.Hc-nas-33在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮發(fā)育過程中的功能研究為了探究Hc-nas-33是否參與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮過程,本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative real time PCR,qRT-PCR）分析了Hc-nas-3在不同時(shí)段內(nèi)的轉(zhuǎn)錄特性,同時(shí)也進(jìn)行了秀麗隱桿線蟲同源基因的比較性研究,其次運(yùn)用RNA干擾方法探究Hc-nas-33沉默后對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生長發(fā)育的影響。轉(zhuǎn)錄特性分析結(jié)果顯示,Hc-nas-33轉(zhuǎn)錄水平在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L1-L2蛻皮過程中呈振蕩變化,且在中后期達(dá)到峰值,Ce-nas-33基因在蛻皮過程中同樣表現(xiàn)振蕩轉(zhuǎn)錄特性;RNA干擾后,幼蟲正常生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響,蟲體出現(xiàn)發(fā)育遲緩、活動(dòng)力下降、畸形及蛻皮功能障礙等表型。上述結(jié)果證明Hc-nas-33為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮相關(guān)基因,為后續(xù)研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮機(jī)制、開發(fā)新藥物奠定了基礎(chǔ)。4.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酵母cDNA文庫構(gòu)建及Hc-nas-33互作蛋白的篩選鑒定為了進(jìn)一步探索Hc-nas-33參與蛻皮過程的分子機(jī)制,本研究構(gòu)建了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酵母cDNA文庫,并利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與Hc-NAS-33存在相互作用的候選蛋白;通過pull down、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）與真核細(xì)胞共定位驗(yàn)證Hc-NAS-33與互作蛋白之間關(guān)系。酵母文庫篩選發(fā)現(xiàn)了 6種可能與Hc-NAS-33存在相互作用的候選蛋白;利用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒系統(tǒng)成功表達(dá) GST-Hc-NAS-33 重組蛋白,通過 pull down 驗(yàn)證了 Hc-NAS-33 與 Hc-GPB-1存在相互作用,與免疫共沉淀結(jié)果相符,且Hc-NAS-33在HEK 293 T細(xì)胞中能與Hc-GPB-1共定位。本研究成功篩選得到Hc-NAS-33的互作蛋白,為后續(xù)研究其在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮過程中的功能奠定了基礎(chǔ),有助于更好的了解線蟲蛻皮分子機(jī)制。5.Hc-NAS-33與Hc-GPB-1參與蛻皮過程的機(jī)制研究本研究借助秀麗隱桿線蟲表達(dá)系統(tǒng),分析Hc-NAS-33和Hc-GPB-1在線蟲中的共定位情況,同時(shí)利用RNA干擾技術(shù)研究Hc-GPB-1在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲生長發(fā)育過程中發(fā)揮的功能。結(jié)果表明,在秀麗隱桿線蟲中異源表達(dá)的Hc-NAS-33和Hc-GPB-1存在部分共定位;Hc-gpb-1沉默后,幼蟲同樣出現(xiàn)發(fā)育遲緩、活動(dòng)性下降及蛻皮功能障礙等表型,且降低Hc-gpb-1表達(dá)水平使得蟲體新皮的厚度受到影響,表皮、皮下與肌肉之間的緊密連接出現(xiàn)縫隙,相關(guān)基因的qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)在蛻皮過程中Hc-NAS-33與Hc-GPB-1均參與了新皮的合成,這為進(jìn)一步闡明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮機(jī)制提供了重要依據(jù),同時(shí)也為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲藥物研發(fā)提供了新的候選藥物靶標(biāo)。綜上所述,本研究擴(kuò)增得到了 3種捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HcNASs基因,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,明確了其蛋白表達(dá)特性。通過轉(zhuǎn)錄特性分析和RNA干擾實(shí)驗(yàn)對(duì)Hc-nas-33進(jìn)行深入研究,發(fā)現(xiàn)該基因參與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的蛻皮過程;利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選獲得6種Hc-NAS-33的候選互作蛋白,并驗(yàn)證了與Hc-GPB-1的互作關(guān)系;通過異源表達(dá)和RNA干擾對(duì)Hc-NAS-33及其互作蛋白Hc-GPB-1在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮過程的發(fā)揮的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究。上述結(jié)果為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的防治提供了新的思路。
周?？?sup>[10]（2021）在《基于mTOR信號(hào)通路探究腸道菌群代謝產(chǎn)物丁酸鈉對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制》文中提出目的:1)通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析腸道菌群代謝產(chǎn)物丁酸鈉的藥理作用靶點(diǎn)與骨關(guān)節(jié)炎病理過程中的共有作用基因與相互作用的機(jī)制。在體外構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型并給予最佳劑量的丁酸鈉干預(yù)探究丁酸鈉對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的影響及對(duì)自噬調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白m TOR信號(hào)通路的影響;2)進(jìn)一步探究由丁酸鈉誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬在軟骨細(xì)胞及OA小鼠的關(guān)節(jié)軟骨分解代謝、炎癥反應(yīng)、凋亡、活性氧、細(xì)胞周期及m TOR信號(hào)通路的影響;3)通過體內(nèi)構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型并給予不同劑量丁酸鈉干預(yù)探究丁酸鈉對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨及軟骨下骨中細(xì)胞自噬和m TOR信號(hào)通路的影響。方法:1)分離培養(yǎng)及鑒定C57BL/6J原代軟骨細(xì)胞。通過CCK-8評(píng)估丁酸鈉對(duì)正常的和IL-1β干預(yù)的軟骨細(xì)胞活性影響。通過免疫印跡、免疫熒光和透射電鏡觀察丁酸鈉對(duì)體外OA模型中軟骨細(xì)胞自噬的影響。通過Western Blot和免疫組織化學(xué)染色評(píng)估丁酸鈉對(duì)m TOR信號(hào)通路的影響;2)通過蛋白印跡、細(xì)胞流式、免疫熒光、免疫組織化學(xué)染色探索丁酸鈉對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝、炎癥、凋亡、活性氧損傷和細(xì)胞周期阻滯的影響;3)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)立6組,即假手術(shù)組,ACLT+安慰劑組,ACLT+濃度梯度的口服丁酸鈉治療組。術(shù)后60天評(píng)估軟骨退變情況以確定最佳的用藥劑量。后續(xù)的正式試驗(yàn)中設(shè)立3組,即假手術(shù)組,造模組和丁酸鈉口服灌胃治療組。通過HE和番紅固綠染色評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨鈣化和蛋白聚糖的情況,采用小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織評(píng)分評(píng)估軟骨的退變程度。通過免疫組化分析小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝和凋亡的特征性指標(biāo)。通過免疫組織化學(xué)分析測(cè)定關(guān)節(jié)軟骨自噬特征性指標(biāo)LC3、Beclin1和p62的表達(dá);4)通過Micro-CT分析丁酸鈉對(duì)軟骨下骨微觀結(jié)構(gòu)的改變;5)通過Micro-CT血管造影分析丁酸鈉對(duì)軟骨下骨血管增生的影響。免疫組織化學(xué)染色測(cè)定血管生成相關(guān)因子的表達(dá)水平。結(jié)果:1)形態(tài)學(xué)觀察軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)出長梭形,阿力新藍(lán)染色和免疫熒光都顯示出特征性表達(dá)Collagen II,選取分離培養(yǎng)第二代后的軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CCK-8結(jié)果顯示,500μM以上濃度的丁酸鈉對(duì)軟骨細(xì)胞有毒性作用,250μM濃度的丁酸鈉對(duì)IL-1β干預(yù)的軟骨細(xì)胞的活性提升作用最顯著。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生信分析結(jié)果顯示丁酸鈉靶向基因主要與生長因子、細(xì)胞存活以及免疫或炎癥反應(yīng)有關(guān)。丁酸鈉靶向作用基因分別是AKT1、TP53、PTEN、GSK3B、MDM2、CDKN1A、CDKN1B、FOXO1、FOXO3、m TOR和CDK4。Western blotting、免疫熒光和透射電鏡顯示丁酸鈉可有效激活并促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬并恢復(fù)受阻的自噬流;丁酸鈉對(duì)軟骨細(xì)胞自噬的增強(qiáng)作用主要是通過靶向調(diào)控PI3K/AKT/m TOR和MAPK/m TOR信號(hào)通路對(duì)m TOR抑制而產(chǎn)生的;2)丁酸鈉通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞的自噬而發(fā)揮抑制分解代謝與炎癥因子（IL-6、TNF-α、IL-10、COX-2、Collagen II、aggrecan、MMP3、ADAMTS-5）和促凋亡因子（Bax、cleaved-caspase-3、Bcl-2）的表達(dá)。細(xì)胞流式分析顯示丁酸鈉可通過激活軟骨細(xì)胞自噬而抑制由IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞異?；钚匝跎珊虳NA損傷與細(xì)胞周期阻滯;3)體內(nèi)構(gòu)建OA模型探究丁酸鈉的最佳劑量為150mg/kg。正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示丁酸鈉可抑制實(shí)驗(yàn)性O(shè)A關(guān)節(jié)軟骨的退變。丁酸鈉可促進(jìn)軟骨保護(hù)指標(biāo)的表達(dá)（Collagen II）,抑制分解代謝指標(biāo)（MMP3）。同時(shí)可抑制炎癥因子的產(chǎn)生和軟骨細(xì)胞凋亡指標(biāo)的異常表達(dá)。實(shí)驗(yàn)性O(shè)A模型中,丁酸鈉治療同樣可激活并促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬恢復(fù)通暢的自噬流;4)Micro-CT檢測(cè)提示丁酸鈉可有效抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨下異常的骨吸收及骨囊腫的形成;5)Micro-CT顯微血管造影成像技術(shù)顯示丁酸鈉可有效抑制軟骨下骨異常增生的血管數(shù)量與機(jī)體。結(jié)論:1)丁酸鈉通過抑制m TOR信號(hào)通路在病理狀態(tài)下的磷酸化而激活并促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬;2)丁酸鈉可通過增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的自噬作用而抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的分解代謝、炎癥反應(yīng)和凋亡;3)丁酸鈉可通過增強(qiáng)軟骨細(xì)胞自噬減少ROS和緩解DNA損傷而引起的軟骨細(xì)胞周期阻滯;4)丁酸鈉在OA小鼠模型中可保護(hù)軟骨的完整性并促進(jìn)蛋白多糖的合成。抑制軟骨下骨的破骨細(xì)胞的異常激活,維持軟骨下骨成骨與破骨細(xì)胞正常的耦聯(lián)機(jī)制;5)丁酸鈉通過抑制血管生成因子的表達(dá)抑制軟骨下骨血管的異常增生,從延緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。
二、Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in Hydra（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in Hydra（論文提綱范文）
（1）GnRH1對(duì)雞卵泡中MMP11/13及血管發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響及MMP11的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（論文提綱范文）
| 英文縮略詞 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 家禽卵巢結(jié)構(gòu)及發(fā)育特征 |
| 1.1.1 卵巢結(jié)構(gòu)及發(fā)育特點(diǎn) |
| 1.1.2 卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞作用 |
| 1.2 卵巢內(nèi)卵泡血管的發(fā)育 |
| 1.2.1 血管發(fā)育 |
| 1.2.2 血管發(fā)育影響因素 |
| 1.3 GnRH1、MMP11/13 及血管發(fā)育相關(guān)基因在卵巢發(fā)育中的功能 |
| 1.3.1 GnRH1 基因在卵巢發(fā)育中的功能 |
| 1.3.2 MMP11/13 基因在卵巢發(fā)育中的功能 |
| 1.3.3 血管發(fā)育相關(guān)的基因在卵巢發(fā)育中的功能 |
| 1.3.4 GnRH1 基因及血管發(fā)育相關(guān)的基因的相互作用 |
| 1.4 本研究的目的及意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣本采集 |
| 2.1.2 主要儀器設(shè)備 |
| 2.1.3 主要試劑及來源 |
| 2.1.4 主要試劑的配制 |
| 2.1.5 主要分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫及軟件 |
| 2.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng) |
| 2.2.2 RNA的提取及檢測(cè) |
| 2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR |
| 2.2.4 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) |
| 2.2.5 載體的構(gòu)建 |
| 2.2.6 細(xì)胞處理 |
| 2.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè) |
| 2.2.8 ELISA |
| 2.3 統(tǒng)計(jì)與分析 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 GnRH1、MMP11/13 和血管發(fā)育相關(guān)基因在卵巢基質(zhì)和卵泡中的表達(dá) |
| 3.1.1 GnRH1、MMP11/13和VEGFA在卵巢基質(zhì)和卵泡中的免疫定位 |
| 3.1.2 總RNA的質(zhì)量檢測(cè) |
| 3.1.3 GnRH1、MMP11/13 和血管發(fā)育相關(guān)基因在不同品種雞卵巢基質(zhì)及各級(jí)卵泡中的表達(dá) |
| 3.1.4 GnRH1、MMP11/13 和血管發(fā)育相關(guān)基因在雞卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的表達(dá) |
| 3.2 過表達(dá)GnRH1 基因在雞卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的作用分析 |
| 3.2.1 GnRH1 的轉(zhuǎn)染效率 |
| 3.2.2 GnRH1 基因過表達(dá)后,轉(zhuǎn)錄因子FOXP1及MMP11/13 基因的表達(dá)變化 |
| 3.2.3 GnRH1 基因過表達(dá)后,血管發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)變化 |
| 3.2.4 GnRH1 過表達(dá)對(duì)VEGFA蛋白表達(dá)變化 |
| 3.3 MMP11 基因啟動(dòng)子區(qū)與FOXP1 的調(diào)控關(guān)系及結(jié)合位點(diǎn)的鑒定與分析 |
| 3.4 GnRH1和FOXP1對(duì)MMP11 基因啟動(dòng)子區(qū)活性的影響 |
| 4 討論 |
| 4.1 GnRH1對(duì)MMP11/13 基因表達(dá)的影響及MMP11 轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析 |
| 4.2 GnRH1 對(duì)血管發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響分析 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 碩士期間發(fā)表的論文及專利申請(qǐng)情況 |
（2）粘體動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育地位與內(nèi)寄生適應(yīng)機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 粘體動(dòng)物的起源及分類地位 |
| 1.1 粘體動(dòng)物起源 |
| 1.2 粘體動(dòng)物的分類地位 |
| 2 粘體動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究進(jìn)展 |
| 2.1 系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué) |
| 2.2 單拷貝核基因基本特征及應(yīng)用 |
| 2.3 粘體動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)展望 |
| 3 粘體動(dòng)物刺絲囊生物學(xué)研究進(jìn)展 |
| 3.1 刺絲囊形態(tài)結(jié)構(gòu) |
| 3.2 刺絲囊蛋白組成 |
| 3.3 驅(qū)動(dòng)刺絲囊釋放的能量來源 |
| 4 粘體動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化研究進(jìn)展 |
| 4.1 適應(yīng)性進(jìn)化 |
| 4.2 比較基因組學(xué)在粘體動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化研究中的應(yīng)用 |
| 4.3 碘泡科物種:粘體動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化研究的優(yōu)秀材料 |
| 5 本研究的目的和意義 |
| 第二章 基于單拷貝核基因的粘體動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育地位分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 樣品收集及處理 |
| 2.2 基因組、轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序及組裝 |
| 2.3 直系同源基因提取 |
| 2.4 單拷貝基因選擇與數(shù)據(jù)過濾 |
| 2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 |
| 2.6 分歧時(shí)間估算 |
| 3 結(jié)果和分析 |
| 3.1 后生動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 |
| 3.2 刺胞動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 |
| 3.3 可變拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)檢驗(yàn) |
| 3.4 快速進(jìn)化位點(diǎn)梯度剔除 |
| 3.5 分歧時(shí)間 |
| 4 討論 |
| 第三章 粘孢子蟲刺絲囊與殼瓣分離提純方法的建立 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 樣品收集及處理 |
| 2.2 蔗糖及Percoll密度梯度離心液配制 |
| 2.3 完整孢子的分離及純化 |
| 2.4 孢子解離 |
| 2.5 刺絲囊提取 |
| 2.6 殼瓣提取 |
| 2.7 溫度、鹽度及多種化合物對(duì)孢子及離體刺絲囊釋放的影響 |
| 2.8 重金屬離子對(duì)孢子及離體刺絲囊釋放的影響 |
| 2.9 透射電鏡 |
| 3 結(jié)果和分析 |
| 3.1 孢子分離純化及解離 |
| 3.2 刺絲囊分離及純化 |
| 3.3 刺絲囊透射電鏡 |
| 3.4 溫度、鹽度、多種化合物及重金屬離子對(duì)孢子及離體刺絲囊釋放的影響 |
| 3.5 殼瓣分離及純化 |
| 4 討論 |
| 第四章 粘體動(dòng)物綜合蛋白數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 樣品收集及處理 |
| 2.2 基因組、轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序及組裝 |
| 2.3 序列污染剔除 |
| 2.4 粘體動(dòng)物綜合蛋白數(shù)據(jù)庫及對(duì)照數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建 |
| 2.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜及蛋白組組學(xué)分析 |
| 2.6 數(shù)據(jù)庫評(píng)估 |
| 3 結(jié)果和分析 |
| 3.1 粘體動(dòng)物綜合蛋白數(shù)據(jù)庫及對(duì)照數(shù)據(jù)庫特征 |
| 3.2 基于質(zhì)譜鑒定肽段與蛋白數(shù)量的數(shù)據(jù)庫質(zhì)量評(píng)估 |
| 3.3 數(shù)據(jù)庫肽段與蛋白交集 |
| 3.4 基于完整度的數(shù)據(jù)庫質(zhì)量評(píng)估 |
| 3.5 通過線性擬合保留時(shí)間與理論疏水性指數(shù)以驗(yàn)證肽段有效性 |
| 3.6 數(shù)據(jù)庫特異性肽段結(jié)果驗(yàn)證 |
| 4 討論 |
| 第五章 刺絲囊對(duì)粘體動(dòng)物/刺胞動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化的貢獻(xiàn)評(píng)估 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 樣品收集及處理 |
| 2.2 掃描電鏡 |
| 2.3 基因組、轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序及組裝 |
| 2.4 蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 |
| 2.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜及蛋白組組學(xué)分析 |
| 2.6 比較蛋白組組學(xué)分析及毒液組學(xué)分析 |
| 2.7 系統(tǒng)發(fā)育分析 |
| 2.8 選擇壓力分析及適應(yīng)定量 |
| 3 結(jié)果和分析 |
| 3.1 比較蛋白質(zhì)組學(xué)及毒液組學(xué) |
| 3.2 刺絲囊核心基因分析 |
| 3.3 刺絲囊核心基因的主要進(jìn)化事件分析 |
| 3.4 選擇壓力分析及適應(yīng)定量 |
| 4 討論 |
| 4.1 刺絲囊異質(zhì)性及細(xì)胞器-物種進(jìn)化不一致性支持強(qiáng)烈的物種特異適應(yīng) |
| 4.2 刺絲囊的自發(fā)性起源 |
| 4.3 刺絲囊的去中心化進(jìn)化模式 |
| 4.4 刺絲囊中的高頻適應(yīng) |
| 第六章 洪湖碘泡蟲基因組適應(yīng)性進(jìn)化研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 樣品收集及處理 |
| 2.2 基因組、轉(zhuǎn)錄組二代測(cè)序及組裝 |
| 2.3 基因組大小評(píng)估 |
| 2.4 基因組測(cè)序及組裝 |
| 2.5 基因組污染剔除 |
| 2.6 基因組注釋 |
| 2.7 基因家族及系統(tǒng)發(fā)育分析 |
| 2.8 正選擇分析 |
| 2.9 基因獲得與缺失分析 |
| 2.10 4DTv分析 |
| 3 結(jié)果和分析 |
| 3.1 基因組組裝與注釋 |
| 3.2 轉(zhuǎn)座及基因組加倍分析 |
| 3.3 系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué) |
| 3.4 基因家族進(jìn)化 |
| 3.5 精簡的神經(jīng)系統(tǒng)基因 |
| 3.6 先天免疫相關(guān)基因的缺失 |
| 3.7 抗逆、侵襲、能量代謝以及細(xì)胞過程的增強(qiáng) |
| 3.8 保守的中胚層及肌肉發(fā)育元件 |
| 3.9 Wnt與 Hedgehog信號(hào)通路分析 |
| 4 討論 |
| 第七章 全文總結(jié)及不足 |
| 1 全文總結(jié) |
| 2 不足 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
（3）KLF2通過TGF-β信號(hào)抑制肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文縮略詞表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肝癌的簡介 |
| 1.2 TGF-β信號(hào)通路 |
| 1.3 KLF相關(guān)因子 |
| 1.4 KLF蛋白與TGF-β信號(hào)的研究進(jìn)展 |
| 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 主要儀器設(shè)備 |
| 2.1.2 主要試劑材料 |
| 2.1.3 主要細(xì)胞及病毒 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 主要試劑配制 |
| 2.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇 |
| 2.2.3 細(xì)胞換液 |
| 2.2.4 細(xì)胞傳代 |
| 2.2.5 細(xì)胞凍存 |
| 2.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù) |
| 2.2.7 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)定量PCR(q-PCR) |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) |
| 2.2.10 細(xì)胞遷移 |
| 2.2.11 基質(zhì)膠侵襲 |
| 2.2.12 細(xì)胞免疫熒光 |
| 2.2.13 鬼筆環(huán)肽細(xì)胞骨架染色 |
| 2.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 第三章 KLF2 蛋白抑制TGF-β信號(hào) |
| 3.1 TGF-β在肝癌細(xì)胞中誘導(dǎo)KLF2 基因表達(dá) |
| 3.2 KLF2 蛋白抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo) |
| 3.3 KLF2 拮抗Smad蛋白轉(zhuǎn)錄活性 |
| 3.4 討論 |
| 第四章 KLF2 抑制TGF-β誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng) |
| 4.1 KLF2 抑制TGF-β誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞遷移和侵襲 |
| 4.2 KLF2 抑制TGF-β誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT |
| 4.3 KLF2減弱TGF-β誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞MMP2表達(dá) |
| 4.4 討論 |
| 第五章 結(jié)論與展望 |
| 5.1 結(jié)論 |
| 5.2 進(jìn)一步工作方向 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間的研究成果 |
| 綜述 KLF2在肝病中的生物學(xué)作用 |
| 參考文獻(xiàn) |
（4）海月水母水螅體60Co-γ射線照射模型構(gòu)建及相關(guān)基因的篩選（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 前言 |
| 第一部分:海月水母及其水螅體的鑒定以及水螅體實(shí)驗(yàn)室微觀飼養(yǎng)體系的構(gòu)建 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 四、分析與討論 |
| 第二部分:~(60)Co-γ射線對(duì)A.coerulea水螅體的損傷效應(yīng)及相關(guān)基因篩選 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 四、分析與討論 |
| 第三部分:~(60)Co-γ射線對(duì)A.coerulea水螅體共生菌的影響 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 四、分析與討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 總結(jié) |
| 綜述 海月水母屬的發(fā)育、共生菌群及毒性的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 在讀期間論文發(fā)表和科研工作情況說明 |
| 致謝 |
（5）miR-146b巨球蛋白α2M信號(hào)軸在骨關(guān)炎病理過程的作用及機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨關(guān)節(jié)炎 |
| 1.2 關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能 |
| 1.2.1 關(guān)節(jié)軟骨 |
| 1.2.2 滑膜 |
| 1.2.3 滑膜液 |
| 1.2.4 軟骨下骨 |
| 1.3 骨關(guān)節(jié)炎的病理改變 |
| 1.3.1 關(guān)節(jié)軟骨退化 |
| 1.3.2 細(xì)胞凋亡 |
| 1.3.3 自噬 |
| 1.3.4 滑膜炎癥 |
| 1.4 MicroRNA的作用機(jī)制 |
| 1.4.1 MicroRNA與骨關(guān)節(jié)炎 |
| 1.4.2 MicroRNA在疾病診斷中的應(yīng)用 |
| 1.4.3 MicroRNA在疾病治療中的應(yīng)用 |
| 1.5 研究的目的和意義 |
| 第二章 巨球蛋白α2M在OA病理過程中的表達(dá)變化及作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 第三章 miR146b靶向巨球蛋白α2M調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖及分解代謝 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 博士研究生期間研究成果 |
| 致謝 |
（6）牛黃及其有效成分對(duì)神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符號(hào)說明 |
| 上篇文獻(xiàn)綜述 |
| 綜述一 缺血性中風(fēng)背景下的神經(jīng)血管單元 |
| 1. 缺血性中風(fēng)的研究現(xiàn)狀 |
| 2. 神經(jīng)血管單元的組成 |
| 3. 在正常和低氧條件下的生理學(xué) |
| 4. 缺血性腦卒中的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/td> |
| 5. 基于神經(jīng)血管單元的治療策略 |
| 6. 參考文獻(xiàn) |
| 綜述二 中藥抗缺血性腦卒中的研究進(jìn)展 |
| 一. 植物藥 |
| 1.1 人參 |
| 1.2 梔子 |
| 1.3 姜黃 |
| 1.4 丹參 |
| 1.5 黃芪 |
| 1.6 川芎 |
| 1.7 地黃 |
| 1.8 黃連 |
| 二. 動(dòng)物藥 |
| 2.1 牛黃 |
| 2.2 麝香 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 前言 |
| 下篇 實(shí)驗(yàn)研究 |
| 實(shí)驗(yàn)一 “神經(jīng)血管單元”體外模型的建立以及缺氧/復(fù)氧模型的建立 |
| 1. 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2. 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4. 討論 |
| 5. 結(jié)論 |
| 實(shí)驗(yàn)二 牛黃及其有效成分對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性 |
| 1. 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2. 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4. 討論 |
| 5. 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 實(shí)驗(yàn)三 牛黃及其有效成分對(duì)腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用 |
| 1. 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4. 討論 |
| 5. 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 實(shí)驗(yàn)四 不同配伍組分對(duì)腦神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用 |
| 1. 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2. 試驗(yàn)方法 |
| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4. 討論 |
| 5. 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 實(shí)驗(yàn)五 ?；撬岷托苋パ跄懰釋?duì)神經(jīng)血管單元的作用機(jī)制 |
| 1. 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2. 試驗(yàn)方法 |
| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4. 討論 |
| 5. 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 實(shí)驗(yàn)六 ?；撬岷团；切苋パ跄懰釋?duì)腦神經(jīng)血管單元的作用機(jī)制 |
| 1. 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2. 試驗(yàn)方法 |
| 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4. 討論 |
| 5. 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 結(jié)語 |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡歷 |
（7）外泌體Dvl3 mRNA調(diào)節(jié)Wnt通路對(duì)關(guān)節(jié)滑膜增殖、炎癥的作用及其機(jī)制（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 第一部分 Dvl3在RA患者以及小鼠CIA模型關(guān)節(jié)滑膜中的表達(dá)情況 |
| 一、前言 |
| 二、實(shí)驗(yàn)材料 |
| 三、實(shí)驗(yàn)方法 |
| 四、結(jié)果 |
| 五、討論 |
| 六、結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 外泌體Dvl3 mRNA對(duì)RA-FLS增殖、凋亡、遷移以及炎癥因子分泌的影響 |
| 一、前言 |
| 二、實(shí)驗(yàn)材料 |
| 三、實(shí)驗(yàn)方法 |
| 四、結(jié)果 |
| 五、討論 |
| 六、結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 外泌體Dvl3 mRNA對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠模型關(guān)節(jié)炎癥的影響 |
| 一、前言 |
| 二、實(shí)驗(yàn)材料 |
| 三、實(shí)驗(yàn)方法 |
| 四、結(jié)果 |
| 五、討論 |
| 六、結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第四部分 外泌體Dvl3 mRNA通過調(diào)控Wnt途徑參與影響RA-FLS生物學(xué)行為 |
| 一、前言 |
| 二、實(shí)驗(yàn)材料 |
| 三、實(shí)驗(yàn)方法 |
| 四、結(jié)果 |
| 五、討論 |
| 六、結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 復(fù)雜Wnt信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中的舞者：Dvl蛋白 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 在讀期間論文發(fā)表和參與科研工作情況 |
| 致謝 |
（8）AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路在稽留流產(chǎn)中的作用及機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 稽留流產(chǎn)概述 |
| 1.2 滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力在胚胎發(fā)育中的作用 |
| 1.3 MMPs和 TIMPs在胚胎發(fā)育中的作用 |
| 1.4 AKT/m TOR信號(hào)通路 |
| 1.5 STAT3 信號(hào)通路 |
| 1.6 MMPs和 TIMPs與 AKT/m TOR/STAT3 信號(hào)通路的關(guān)系 |
| 1.7 研究目的和意義 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) |
| 2.1.1 研究對(duì)象和分組 |
| 2.1.2 技術(shù)路線圖 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2.1 主要試劑及儀器 |
| 2.2.2 主要溶液配制 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3.1 絨毛組織HE染色病理切片制備 |
| 2.3.2 qRT-PCR檢測(cè)步驟 |
| 2.3.3 Wes~(TM)全自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)定量分析系統(tǒng)檢測(cè)步驟 |
| 2.3.4 免疫組化染色方法 |
| 2.4 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 第三章 結(jié)果 |
| 3.1 一般臨床資料分析 |
| 3.2 絨毛組織病理形態(tài)觀察 |
| 3.3 絨毛組織AKT/m TOR信號(hào)通路相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)水平 |
| 3.3.1 相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平 |
| 3.3.2 相關(guān)蛋白表達(dá)水平 |
| 3.4 絨毛組織STAT3 信號(hào)通路相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)水平 |
| 3.4.1 相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平 |
| 3.4.2 相關(guān)蛋白表達(dá)水平 |
| 3.5 兩組胚胎組織中p-STAT3 蛋白的表達(dá)定位 |
| 3.5.1 絨毛組織中表達(dá)定位 |
| 3.5.2 蛻膜組織中表達(dá)定位 |
| 3.6 絨毛組織MMPs、TIMPs基因和蛋白表達(dá)水平 |
| 3.6.1 基因m RNA表達(dá)水平 |
| 3.6.2 蛋白表達(dá)水平 |
| 第四章 討論 |
| 4.1 絨毛組織結(jié)構(gòu)病理形態(tài)改變分析 |
| 4.2 AKT/m TOR信號(hào)通路與稽留流產(chǎn)的關(guān)系 |
| 4.3 STAT3 信號(hào)通路與稽留流產(chǎn)的關(guān)系 |
| 4.4 基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑與稽留流產(chǎn)的關(guān)系 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 5.1 結(jié)論 |
| 5.2 研究不足與展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 縮略詞表 |
| 在學(xué)期間研究成果 |
| 致謝 |
（9）Hc-nas-33參與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮過程的功能及其分子機(jī)制初步研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一章 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病簡介 |
| 1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲形態(tài)與生活史 |
| 2 臨床癥狀 |
| 3 診斷 |
| 4 藥物治療與耐藥性 |
| 5 疫苗 |
| 第二章 線蟲蛻皮研究進(jìn)展 |
| 1 蛻皮的生物學(xué)意義 |
| 2 線蟲表皮層結(jié)構(gòu)特征 |
| 3 表皮、上皮及肌肉之間的連接 |
| 4 線蟲蛻皮過程 |
| 5 線蟲蛻皮機(jī)制研究進(jìn)展 |
| 第三章 線蟲蝦紅素樣蛋白 |
| 1 蝦紅素蛋白 |
| 2 線蟲蝦紅素樣蛋白 |
| 3 寄生性線蟲蝦紅素樣蛋白研究進(jìn)展 |
| 第二部分 研究內(nèi)容 |
| 第四章 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HcNASs基因特性分析、原核表達(dá)及多克隆抗體制備 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HcNASs基因的獲得與結(jié)構(gòu)分析 |
| 2.2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲HcNASs蛋白功能預(yù)測(cè)及進(jìn)化關(guān)系分析 |
| 2.3 HcNASs基因全長CDS擴(kuò)增 |
| 2.4 原核蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化 |
| 2.5 多克隆抗體特異性檢測(cè) |
| 3 討論 |
| 第五章 HcNASs表達(dá)特性分析 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 HcNASs在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)特性 |
| 2.2 啟動(dòng)子活性分析 |
| 2.3 HcNASs在秀麗隱桿線蟲中的表達(dá)模式 |
| 2.4 過表達(dá)HcNASs對(duì)秀麗隱桿線蟲的影響 |
| 2.5 L3幼蟲間接免疫熒光定位 |
| 2.6 L4及成蟲IHF分析 |
| 3 討論 |
| 第六章 Hc-nas-33在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮發(fā)育過程中的功能研究 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 Hc-nas-33基因各時(shí)期轉(zhuǎn)錄情況qRT-PCR檢測(cè) |
| 2.2 Hc-nas-33基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮過程中的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) |
| 2.3 秀麗隱桿線蟲同源基因在蛻皮過程中發(fā)揮功能的比較研究 |
| 2.4 RNA干擾實(shí)驗(yàn) |
| 3 討論 |
| 第七章 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲酵母cDNA文庫構(gòu)建及Hc-nas-33互作蛋白的篩選鑒定 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲cDNA文庫的建立 |
| 2.2 誘餌質(zhì)粒構(gòu)建 |
| 2.3 誘餌質(zhì)粒毒性與自激活檢測(cè) |
| 2.4 Hc-GBP-1與Hc-NAS-33相互作用驗(yàn)證 |
| 3 討論 |
| 第八章 Hc-NAS-33與Hc-GPB-1參與蛻皮過程的機(jī)制研究 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 pCe-gpb-1啟動(dòng)子活性分析 |
| 2.2 Hc-NAS-33與Hc-GPB-1在秀麗隱桿線蟲中的共定位分析 |
| 2.3 Hc-nas-33與Hc-gpb-1干擾后對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的影響 |
| 3 討論 |
| 全文總結(jié) |
| 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 研究展望 |
| 附錄Ⅰ 常用溶液配制 |
| 附錄Ⅱ 實(shí)驗(yàn)涉及引物序列 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀博士學(xué)位期間的主要成果 |
| 致謝 |
（10）基于mTOR信號(hào)通路探究腸道菌群代謝產(chǎn)物丁酸鈉對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 丁酸鈉對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞自噬的影響及作用機(jī)制 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第二部分 丁酸鈉通過激活軟骨細(xì)胞自噬緩解IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第三部分 丁酸鈉緩解骨關(guān)節(jié)炎軟骨及軟骨下骨異常病理改變的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 2 研究結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 mTOR信號(hào)通路在骨關(guān)節(jié)炎病理機(jī)制中的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀博士學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果 |
| 個(gè)人簡歷 |
| 導(dǎo)師評(píng)閱表 |
四、Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in Hydra（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]GnRH1對(duì)雞卵泡中MMP11/13及血管發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響及MMP11的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[D]. 陳秀萍. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2021(01)
- [2]粘體動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育地位與內(nèi)寄生適應(yīng)機(jī)制研究[D]. 郭慶祥. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2021
- [3]KLF2通過TGF-β信號(hào)抑制肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[D]. 李伊寧. 南昌大學(xué), 2021(01)
- [4]海月水母水螅體60Co-γ射線照射模型構(gòu)建及相關(guān)基因的篩選[D]. 陳新彤. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué), 2021(09)
- [5]miR-146b巨球蛋白α2M信號(hào)軸在骨關(guān)炎病理過程的作用及機(jī)制研究[D]. 柳鑫. 南方醫(yī)科大學(xué), 2021(02)
- [6]牛黃及其有效成分對(duì)神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用研究[D]. 杜欣. 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2021(02)
- [7]外泌體Dvl3 mRNA調(diào)節(jié)Wnt通路對(duì)關(guān)節(jié)滑膜增殖、炎癥的作用及其機(jī)制[D]. 譚衛(wèi)星. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué), 2021(01)
- [8]AKT/mTOR/STAT3信號(hào)通路在稽留流產(chǎn)中的作用及機(jī)制研究[D]. 白清麗. 蘭州大學(xué), 2021(09)
- [9]Hc-nas-33參與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蛻皮過程的功能及其分子機(jī)制初步研究[D]. 黃艷. 浙江大學(xué), 2021
- [10]基于mTOR信號(hào)通路探究腸道菌群代謝產(chǎn)物丁酸鈉對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用及機(jī)制[D]. 周?？? 新疆醫(yī)科大學(xué), 2021(08)
標(biāo)簽：基因合成論文; 動(dòng)物細(xì)胞論文; 輻射劑量論文; 基因結(jié)構(gòu)論文; 動(dòng)物進(jìn)化論文;