一、一種粘膜免疫佐劑——大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素研究現(xiàn)況（論文文獻(xiàn)綜述）
馮啟崢[1]（2020）在《產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌mLT突變株的構(gòu)建及其主要生物學(xué)特性研究》文中指出產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起旅行者、兒童及幼齡動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一,其引起的仔豬黃痢、仔豬白痢和斷奶仔豬腹瀉嚴(yán)重影響仔豬的健康,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于耐藥菌株的出現(xiàn)使抗生素療效明顯下降,因此,生產(chǎn)上迫切需要新型、高效的藥物或疫苗來(lái)保障仔豬哺乳期的健康。口服疫苗具有誘導(dǎo)腸道局部黏膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫的優(yōu)點(diǎn),為仔豬大腸桿菌病疫苗研究提供了新思路。ETEC產(chǎn)生的腸毒素主要有熱不穩(wěn)定腸毒素（Heat-labile enterotoxin,LT）和熱穩(wěn)定腸毒素（Heat-stable enterotoxin,ST）,是主要致病因子。LT雖具有良好的抗原性,但自身的毒性限制了其作為抗原被直接用于動(dòng)物的免疫。減毒LT突變體（Mutant heat-labile enterotoxin,mLT）的研究已有報(bào)道,但不同mLT突變菌株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究構(gòu)建了3株產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的mLT突變菌株,旨在通過對(duì)其主要生物學(xué)特性系統(tǒng)地比較研究,為仔豬大腸桿菌性腹瀉口服疫苗的研制篩選出較理想的候選菌株。本研究選擇E.coli C83903（K88、STb、LT）為初始菌株,使用CRISPR/Cas9雙質(zhì)?；蚓庉嬒到y(tǒng)敲除est B基因獲得E.coli C83903（35）est B后,對(duì)編碼LT的基因elt定點(diǎn)突變,分別構(gòu)建了E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、和E.coli mLT-R192G。經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè),3株突變菌在連續(xù)50次傳代后基因突變位點(diǎn)遺傳穩(wěn)定;細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、菌毛的生長(zhǎng)、對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的黏附等生物學(xué)特性與初始菌比較無(wú)明顯差異;耐藥性無(wú)改變;對(duì)p H>2.5的胃液環(huán)境和0.3%的膽汁環(huán)境有良好的耐受性。為檢測(cè)LT和mLT,本研究構(gòu)建了E.coli p ET-32a-S1-BL21、E.coli p ET-32a-S2-BL21重組菌,表達(dá)純化了重組蛋白LTA-S1、LTA-S2,免疫家兔并制備了兔抗LTA-S1和兔抗LTA-S2血清,其中兔抗LTA-S1血清效價(jià)較高,用于后續(xù)LT和mLT的檢測(cè)。兔腸袢結(jié)扎試驗(yàn)和兔腸組織切片觀察結(jié)果顯示,3種不同mLT均有一定的腸毒性,其中E.coli mLT-S63K產(chǎn)生的mLT腸毒性最弱,且對(duì)腸組織造成的損傷最輕。Y1細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示,E.coli mLT-S63K產(chǎn)生的mLT對(duì)Y1細(xì)胞的毒性最弱,毒力效價(jià)為103.48 TCID50/0.1m L,是初始菌E.coli C83903產(chǎn)生的LT毒性的1/10 000(107.61 TCID50/0.1m L)。將5周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組（A、B、C、D、E、F）,每組25只,連續(xù)3天分別灌胃0.3 m L無(wú)菌PBS,3×1010CFU的E.coli C83903（35）est B（35）eltⅠ、E.coli C83903（35）est B、E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、E.coli mLT-R192G,間隔2 w共免疫3次。檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較表明,突變菌對(duì)小鼠采食量、體重?zé)o影響,對(duì)回腸組織無(wú)損傷,安全性良好;用間接ELISA檢測(cè)各組小鼠血清、腸黏液中特異性Ig G和s Ig A水平,結(jié)果顯示,在初次免疫后的第14 d,從實(shí)驗(yàn)組小鼠血清和腸黏液檢測(cè)到針對(duì)LTA-S1蛋白的特異性Ig G和s Ig A,抗體水平顯著高于對(duì)照組（p<0.05）,其中E.coli mLT-R192G組在第35 d檢測(cè)到的Ig G水平顯著高于其他組（p<0.05）,而E.coli mLT-S63K組在第42 d檢測(cè)到的s Ig A水平顯著高于其他組（p<0.05）,在三免后的2周內(nèi)仍能維持較高水平。針對(duì)K88菌毛蛋白和E.coli C83903全菌的特異性Ig G和s Ig A抗體水平檢測(cè)結(jié)果表明,在首免后的第7 d可在部分免疫組的腸黏液中檢出特異性s Ig A,其中E.coli mLT-A72R組產(chǎn)生s Ig A的速度最快,抗體水平在第21 d便顯著高于其他組并能持續(xù)保持較高水平;E.coli mLT-S63K組的K88特異性Ig G自第21 d一直處于較高水平,第42 d時(shí)仍顯著高于其他組（p<0.05）。針對(duì)E.coli C83903全菌所產(chǎn)生的特異性抗體,在第35 d E.coli mLT-S63K組的Ig G水平顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（p<0.05）,同時(shí)該組與E.coli mLT-R192G組腸黏液中的s Ig A水平顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組（p<0.05）,并能在第42d仍維持較高水平。免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示,免疫后第35 d,E.coli mLT-S63K組和E.coli mLT-R192G組小鼠Peyer’s淋巴結(jié)組織切片可見大量Ig A陽(yáng)性細(xì)胞,數(shù)量明顯多于其他組。小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,IFN-γ和IL-4陽(yáng)性脾淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組,IFN-γ/IL-4的比值小于1;血清IFN-γ、IL-4和IL-17細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明,口服活菌均可有效刺激小鼠產(chǎn)生Th1、Th2以及Th17型細(xì)胞免疫反應(yīng),血清中IL-4的表達(dá)水平更高。結(jié)合淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果表明口服突變菌株誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫以Th2型細(xì)胞為主。抗體中和試驗(yàn)結(jié)果表明,免疫組血清和腸黏液中的Ig G和s Ig A具有中和LT活性,三組突變株的血清中和抗體效價(jià)均為1:89.1,腸黏液的中和抗體效價(jià)均為1:44.7,但分別高于E.coli C83903（35）est B組的1:53.7與1:26.9。綜上所述,本研究構(gòu)建的三株mLT突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性,基因編輯操作對(duì)其主要生物學(xué)特性無(wú)顯著影響。突變株的生物學(xué)特性符合口服疫苗候選菌株基本條件,口服免疫小鼠后能誘導(dǎo)產(chǎn)生局部黏膜免疫、體液免疫以及細(xì)胞免疫應(yīng)答。其中E.coli mLT-S63K株毒性最小、免疫效果最好,可作為ETEC口服疫苗候選菌株進(jìn)行后續(xù)研究。本研究為仔豬大腸桿菌性腹瀉的新型疫苗研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和候選菌株。
胡佳[2]（2020）在《FanC-FaeG共展示的ETEC菌株構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌ETEC作為細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌,具有傳播范圍廣、致病性強(qiáng)等特點(diǎn),給畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大損失。ETEC的危害性源自于自身菌毛黏附素的定植功能以及腸毒素的毒害作用,本研究以致病菌ETEC本身作為菌株構(gòu)建的宿主,利用Lpp’Omp A表面展示系統(tǒng),將另一種類的黏附素展示到ETEC細(xì)胞表面,實(shí)現(xiàn)雙黏附素共展示表達(dá),并對(duì)其生物學(xué)特性及黏附保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)估,以期構(gòu)建一種雙重黏附能力的腸毒性大腸桿菌,為相應(yīng)的ETEC疫苗或相關(guān)黏附抗原提供菌株基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容及相關(guān)結(jié)果如下:本試驗(yàn)構(gòu)建了pQE-30-GFP報(bào)告質(zhì)粒,通過對(duì)不同重組菌相對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)定及顯色所需時(shí)間的對(duì)比,篩選得到了含有Fan C黏附素的良好表達(dá)宿主菌BE311。為了增加宿主菌的黏附素黏附表達(dá)活性,本試驗(yàn)擴(kuò)增了來(lái)自于E.coli K88黏附素基因fae G,利用over-lap PCR方法構(gòu)建表面展示質(zhì)粒p QE-30-Lpp’Omp A-Fae G-TC,將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BE311中,通過陽(yáng)性克隆的篩選及四半胱氨酸（TC）-雙砷系統(tǒng)對(duì)特異性標(biāo)記的Fae G-TC表達(dá)產(chǎn)物的鑒定,證實(shí)外源的K88黏附素被成功展示在BE311菌體表面;對(duì)重組菌進(jìn)行生長(zhǎng)特性測(cè)定和誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果表明,外源蛋白的表達(dá)未給菌株帶來(lái)生長(zhǎng)壓力,fae G在經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,能夠穩(wěn)定表達(dá)。在疏水性實(shí)驗(yàn)及IPEC-J2細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中,重組菌B311-fae G分別表現(xiàn)出了更好的體外疏水性和對(duì)上皮細(xì)胞的特異性黏附能力。為了進(jìn)一步探討重組菌的在動(dòng)物腸道中對(duì)病原性大腸桿菌的競(jìng)爭(zhēng)拮抗能力,本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室原有的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了兩種特異性熒光標(biāo)記的ETEC菌株,分別是紅色熒光的E.coli K99-m Cherry與綠色熒光的E.coli K88ab-GFP,通過這兩種標(biāo)記的復(fù)合病原菌的聯(lián)合攻毒,發(fā)現(xiàn)在攻毒后第5天,能夠顯著地增加大鼠炎性因子相關(guān)基因和蛋白的上調(diào)表達(dá)。以該攻毒模型為基礎(chǔ),本試驗(yàn)特異性比較了單黏附素Fan C（源自于野生菌株BE311）與雙黏附素FanC-FaeG（來(lái)源于重組菌株BE311-Fae G）對(duì)攻毒大鼠的病原菌拮抗作用,即發(fā)酵制備并誘導(dǎo)表達(dá)得到相應(yīng)的大腸桿菌菌體,調(diào)整菌懸液濃度為109 CFU/m L,采用輻照的方式處死后,分別添加到大鼠飲水中預(yù)飼5天,然后利用109 CFU的復(fù)合標(biāo)記菌株進(jìn)行灌胃攻毒,分別測(cè)定不同處理下的大鼠生長(zhǎng)性能及胃腸道分段和糞便中的標(biāo)記的E coli數(shù)量。結(jié)果表明,FanC-FaeG組與陰性對(duì)照組的大鼠在生長(zhǎng)性能方面無(wú)顯著性差異（P>0.05）;攻毒后的12 h,在十二指腸、空腸及回腸中E coli數(shù)量:FanC-FaeG組<Fan C組<陽(yáng)性對(duì)照;攻毒24 h時(shí),糞便中FanC-FaeG組<Fan C組<陽(yáng)性對(duì)照。因此,相較于單黏附素組,重組菌的雙黏附特性能夠更為顯著地減少病原菌標(biāo)記菌株在小腸內(nèi)的特異性黏附,有效緩解攻毒后大鼠受到的病原菌侵襲,起到健康保護(hù)效果。綜上所述,本研究構(gòu)建了一株FanC-FaeG雙黏附素共展示表達(dá)ETEC菌株,該菌株能夠穩(wěn)定高效表達(dá)外源K88黏附素,并具有強(qiáng)于單黏附素野生菌的黏附能力,在大鼠小腸內(nèi)能夠優(yōu)先占據(jù)特異性結(jié)合位點(diǎn),從而抑制病原菌的黏附,起到腸道保護(hù)作用,為疫苗開發(fā)或腸道保護(hù)制劑的研究提供了多抗原菌株基礎(chǔ)。
陳東強(qiáng)[3]（2009）在《豬瘟疫苗經(jīng)粘膜途徑接種動(dòng)物免疫效果分析》文中指出豬瘟病毒是通過粘膜—消化道和呼吸道途徑感染動(dòng)物體,因此如果通過局部粘膜接種疫苗,則可利用抗原與粘膜受體結(jié)合的占位作用,有效阻斷野毒經(jīng)粘膜途徑感染,達(dá)到事半功倍的免疫預(yù)防效果。本研究以現(xiàn)有豬瘟疫苗為基礎(chǔ),通過與粘膜佐劑配合,探討豬瘟疫苗經(jīng)粘膜途徑免疫接種的可行性。本研究通過重組菌株發(fā)酵,獲得了大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體蛋白LTKG、 LTRG.利用親和層析法純化重組蛋白,經(jīng)BCA方法定量,蛋白濃度分別為：750μg/ml和660μg/ml。豬瘟脾淋巴苗分別與LTKG、LTRG蛋白佐劑混合,采用滴鼻、灌胃/口服、肌注三種途徑免疫小鼠,間隔10-15天進(jìn)行二免、三免。每次免疫后,采血,收集鼻洗液和糞便。經(jīng)間接ELISA檢測(cè)血清抗體IgG及局部粘膜抗體IgA。結(jié)果顯示,三免前滴鼻組和灌胃組之間IgG水平相當(dāng),無(wú)顯著差異（P>0.05）,但都低于肌注組；三免后,LTRG滴鼻免疫組和灌胃免疫組小鼠血清抗體IgG高于其它組,且高于疫苗肌肉注射組,LTRG滴鼻免疫組與疫苗滴鼻免疫組差異顯著（0.01<P<0.05）。局部粘膜抗體IgA檢測(cè)結(jié)果顯示,三免后灌胃途徑免疫的小鼠各組IgA均高于其他各組,且疫苗+LTRG灌胃、疫苗+LTKG灌胃小鼠IgA顯著高于滴鼻免疫組小鼠（P<0.01）,同時(shí)顯著高于肌注疫苗組（P<0.01）,即疫苗與佐劑LTRG、LTKG共免疫組獲得了最佳局部粘膜免疫效果。豬瘟脾淋巴苗分別與LTKG、LTRG蛋白佐劑混合,通過滴鼻、灌胃/口服、肌注三種途徑免疫仔豬,間隔10-15天二免、三免。采血,收集鼻洗液和糞便。經(jīng)間接ELISA檢測(cè)血清抗體IgG及局部粘膜抗體IgA。整個(gè)免疫過程中,血清IgG一直保持較高的抗體水平。三免后14天,口服疫苗+LTKG的豬血清抗體IgG顯著高于疫苗經(jīng)肌注和滴鼻免疫的豬（0.01<P<0.05）；三免后28天,口服疫苗+LTKG組IgG水平最高。三免后局部粘膜抗體IgA水平,用疫苗+LTRG.疫苗+LTKG經(jīng)滴鼻、口服免疫組顯著高于肌注疫苗組（0.01<P<0.05）,其中滴鼻疫苗+LTKG組IgA水平最高,與疫苗滴鼻免疫組顯著差異（0.01<P<0.05）。采用MTT法分析豬外周血T淋巴細(xì)胞增殖情況,各試驗(yàn)組均檢測(cè)到一定程度的淋巴細(xì)胞增殖活化,其中疫苗+LTKG滴鼻免疫組T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)強(qiáng)于疫苗滴鼻組；疫苗+LTKG口服組強(qiáng)于疫苗口服組,且對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用滴鼻免疫途徑較口服免疫途徑好。上述試驗(yàn)結(jié)果表明,豬瘟脾淋巴苗分別與LTRG和LTKG粘膜佐劑經(jīng)粘膜免疫途徑共免疫小鼠、豬,均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),以及局部粘膜免疫反應(yīng)。尤其是粘膜分泌型抗體的產(chǎn)生,為在局部中和野毒感染提供了保護(hù)屏障,能更有效發(fā)揮機(jī)體免疫預(yù)防機(jī)能。
張秀香[4]（2009）在《表達(dá)LTB-MOMP融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻的建立及免疫試驗(yàn)》文中提出為了研制一種廉價(jià)、方便的鸚鵡熱衣原體口服疫苗,本研究以其主要保護(hù)性抗原基因momp基因和大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞單位ltb基因?yàn)檠芯繉?duì)象,分別構(gòu)建了表達(dá)MOMP蛋白和LTB-MOMP融合蛋白的原核表達(dá)載體,使其在大腸桿菌中都高效表達(dá)。通過小鼠的免疫試驗(yàn),確定了LTB-MOMP融合蛋白的免疫效果要優(yōu)于MOMP蛋白單獨(dú)免疫效果。所以本實(shí)驗(yàn)通過前期試驗(yàn)結(jié)果,利用分子克隆、農(nóng)桿菌介導(dǎo)和分子生物學(xué)常規(guī)檢測(cè)技術(shù)等方法,構(gòu)建了表達(dá)LTB-MOMP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻植株,試圖探索出一種利用水稻作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)鸚鵡熱衣原體口服疫苗的免疫途徑和作用模式。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將ltb-momp融合基因?qū)胨局仓曛?通過抗性篩選及整合性鑒定,證明獲得了表達(dá)LTB-MOMP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻植株。用間接ELISA的方法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因水稻葉片中融合蛋白的平均含量可占植物總可溶性蛋白的0.0055%,而在種子中的平均含量為0.0069%。實(shí)驗(yàn)中以BALB/c小鼠為哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,用獲得的表達(dá)LTB-MOMP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻植株種子在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了口服免疫實(shí)驗(yàn)研究,通過對(duì)體液、細(xì)胞及粘膜免疫等相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè),結(jié)果表明:口服轉(zhuǎn)基因水稻種子能夠誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生體液、細(xì)胞及粘膜免疫反應(yīng),但以細(xì)胞和粘膜免疫應(yīng)答為主。同時(shí),還證明了LTB在轉(zhuǎn)基因水稻口服免疫實(shí)驗(yàn)中具有良好的粘膜佐劑效應(yīng)。通過本實(shí)驗(yàn)研究,將為下一步應(yīng)用表達(dá)LTB-MOMP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻在禽源動(dòng)物體內(nèi)口服免疫實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ),也為禽類鸚鵡熱衣原體病的預(yù)防提供新思路。
羅耀玲[5]（2008）在《用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LTB口服活疫苗及其粘膜免疫佐劑功能研究》文中提出在世界范圍內(nèi),產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）感染是引起腹瀉最重要的因素之一。它是發(fā)展中國(guó)家腹瀉發(fā)病和嬰兒死亡的主要原因,也是旅行者腹瀉與國(guó)家士兵腹瀉的最常見病原菌。因此,一個(gè)安全有效的抵抗ETEC腹瀉的疫苗對(duì)公眾健康是非常重要的。ETEC是非侵襲性的,是依靠定居因子（CFA）粘附小腸粘膜上的,進(jìn)而分泌腸毒素LT和ST。CFAs是細(xì)菌細(xì)胞表面的鞭毛,可以促進(jìn)對(duì)小腸上皮細(xì)胞的粘附,主要有CFA/I、CFA/II和CFA/1V家族菌毛抗原。最普遍的CFAs是CFA/I。ST是由estA基因編碼的19個(gè)氨基酸組成的單體多肽,免疫原性很差。LT是由eltAB編碼,結(jié)構(gòu)與霍亂毒素（CT）相似。它由兩個(gè)亞單位組成即有毒性的A單位（LTA）和五聚體的B單位（LTB）組成。CT和LT有很強(qiáng)的免疫原性和粘膜佐劑活性。LTB也和CTB一樣有很強(qiáng)的免疫原性和佐劑活性。本研究中選用LTB作為免疫原和粘膜免疫佐劑。ETEC疫苗要求能夠中和大多數(shù)ETEC菌株的毒力因子抗原,目前普遍認(rèn)為一個(gè)合理的大腸桿菌疫苗應(yīng)該包括三個(gè)主要的菌毛抗原即CFA/I,CFA/II,和CFA/IV以及具有免疫原性的不耐熱腸毒素LT。因此在研究LTB免疫活性時(shí)選用CFA/I為參照。目前ETEC疫苗研究熱點(diǎn)集中在三個(gè)方向:1.免疫方式由傳統(tǒng)的肌肉、皮下等轉(zhuǎn)為粘膜免疫;2.免疫途徑上尋求粘膜佐劑,常用CT和LT;3.表達(dá)載體由傳統(tǒng)的有毒轉(zhuǎn)向減毒或無(wú)毒載體。根據(jù)以上三點(diǎn),我們采用無(wú)毒的雙歧桿菌為表達(dá)載體,通過粘膜免疫SD大鼠,檢LTB的免疫原性,并與重組的雙歧桿菌-CFA/I疫苗共免疫以檢測(cè)其粘膜佐劑活性。雙歧桿菌是人類腸道的自然宿主且可以粘附于腸道上皮細(xì)胞。因此,本研究的目的是將雙歧桿菌發(fā)展成一個(gè)表達(dá)LTB蛋白的口服活疫苗的抗原表達(dá)系統(tǒng)。目的:構(gòu)建攜帶ETEC LTB的雙歧桿菌重組疫苗,然后將此載體疫苗免疫SD大鼠,檢測(cè)其在大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液和粘膜免疫應(yīng)答,并與雙歧桿菌重組的pBES-CFA/I疫苗共免疫,檢測(cè)其粘膜免疫佐劑的效應(yīng)。方法:（1）以pBV220為基礎(chǔ),構(gòu)建穿梭表達(dá)載體pBES-LTB。將其電轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌,SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白的表達(dá),并通過家兔腸袢實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表達(dá)蛋白的安全性。（2）用雙歧桿菌重組載體疫苗免疫SD大鼠:隨機(jī)分四組分別為PBS、pBES-LTB、pBES-CFA/I和pBES-LTB+PBES-CFA/I組,每組12只,免疫三次（0,10,17天）,并于0,7,10,14,17,22和27天采血和糞便樣本,ELISA檢測(cè)其特異抗體水平。（3）在第27天,每組一半大鼠腹腔感染致死劑量ETEC毒株H10407,連續(xù)觀察20天,計(jì)算其存活力。另一半鼻飼ETEC H10407,觀察其肺部感染情況。結(jié)果:（1）LTB蛋白在雙歧桿菌中成功表達(dá),其表達(dá)蛋白經(jīng)家兔腸袢實(shí)驗(yàn)證實(shí)是微毒的。（2）ELISA結(jié)果表明:pBES-LTB與pBES-CFA/I疫苗聯(lián)合免疫組的大鼠比其它單獨(dú)免疫組產(chǎn)生了更強(qiáng)烈的血清IgG和糞便IgA抗體（P<0.05）。LTB免疫組和CFA/I免疫組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（3）腹腔攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí), pBES-LTB + pBES-CFA/I免疫組的SD大鼠保護(hù)性比單獨(dú)免疫組的好,單獨(dú)口服天然雙歧桿菌和PBS的免疫組無(wú)保護(hù)性。（4）ETEC鼻飼實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:pBES-LTB +pBES-CFA/I免疫組及pBES-CFA/I單獨(dú)免疫的SD大鼠肺部均無(wú)病理變化, pBES-LTB免疫組有一定的炎癥反應(yīng),未免疫組肺部有嚴(yán)重的病理變化。結(jié)論:（1）雙歧桿菌可以作為ETEC重組口服活疫苗的表達(dá)載體系統(tǒng),該口服疫苗表達(dá)系統(tǒng)開辟了ETEC疫苗研究的新方向;（2）雙歧桿菌表達(dá)的LTB單獨(dú)接種對(duì)ETEC的粘附無(wú)免疫保護(hù)性,但腸袢試驗(yàn)證明它對(duì)LT具有免疫性;（3）pBES-LTB與pBES-CFA/I聯(lián)合免疫,可明顯提高CFA/I的抗體滴度,并使動(dòng)物獲得更好的保護(hù)力,即具備口服疫苗免疫佐劑的基本特性。
黃雪萍[6]（2008）在《用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌定居因子I重組載體疫苗研究》文中認(rèn)為大腸桿菌感染是引起腹瀉最重要的因素之一。在許多發(fā)展中國(guó)家,腸毒素大腸桿菌ETEC是導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉致嚴(yán)重脫水的第二大病原菌（僅位于輪狀病毒之后）,ETEC也是旅行者腹瀉的最常見病原菌。因此,一個(gè)安全有效的抵抗ETEC腹瀉的疫苗對(duì)公眾健康是非常重要的。現(xiàn)已知ETEC的兩種抗原—定居因子抗原（colonization factor antigens,CFAs）和腸毒素（enterotoxins）參與了腹瀉過程。ETEC菌體表面的菌毛（又稱定居因子抗原）是重要的致病因子,ETEC感染宿主后,正是靠定居因子粘附干宿主小腸上皮細(xì)胞,經(jīng)定居、繁殖產(chǎn)生腸毒素而致病。迄今為止,了解得比較清楚的菌毛抗原包括定居因子抗原I （CFA/I）、定居因子抗原II （CFA/ II）和定居因子抗原IV （CFA/ IV） [1]。其中CFA/I是一種優(yōu)勢(shì)血清型定居因子,其相應(yīng)抗體在阻止病原體在宿主小腸定居而引起腹瀉方面起重要怍用,在許多地方流行腹瀉區(qū),它是許多疫苗的一個(gè)重要組成成分。腸毒素是ETEC產(chǎn)生的毒性分泌蛋白,有不耐熱腸毒素（heat—labile entemtoxin,LT）和耐熱腸毒素（heat—stable entemtoxin,sT）兩種。CT和LT有很強(qiáng)的免疫原性和佐劑活性。LTB為無(wú)毒性的LT的B亞單位,也和CTB一樣有很強(qiáng)的免疫原性和佐劑活性。本研究中選用LTB作為粘膜免疫佐劑。ETEC疫苗要求能夠中和大多數(shù)ETEC菌株的毒力因子抗原,目前普遍認(rèn)為一個(gè)合理的大腸桿菌疫苗應(yīng)該包括三個(gè)主要的菌毛抗原即CFA/I,CFA/II,和CFA/IV以及具有免疫原性的不耐熱腸毒素LT。目前ETEC研究熱點(diǎn)集中在三個(gè)方向:1.免疫方式由傳統(tǒng)的肌肉、皮下等轉(zhuǎn)為粘膜免疫;2.尋求粘膜佐劑,常用CT和LT;3.表達(dá)載體由傳統(tǒng)的有毒轉(zhuǎn)向減毒或無(wú)毒載體。雙歧桿菌是人類腸道的自然宿主且可以粘附于腸道上皮細(xì)胞。因此,本研究的目的是將雙歧桿菌發(fā)展成一個(gè)表達(dá)CFA/I的口服活疫苗的抗原表達(dá)系統(tǒng)。目的:構(gòu)建攜帶ETEC CFA/I的雙歧桿菌重組疫苗（即pBEX-CFA/I）,然后將此載體疫苗免疫SD大鼠,檢測(cè)其在大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液和粘膜免疫應(yīng)答,并與雙歧桿菌重組LTB（即pBES-LTB）共免疫,檢測(cè)其粘膜免疫佐劑的效應(yīng)。方法:（1）以pGEX-5x-1為基礎(chǔ),構(gòu)建穿梭表達(dá)載體pBEX-CFA/I。將其電轉(zhuǎn)化嬰兒雙歧桿菌,SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白的表達(dá)。通過家兔腸袢實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表達(dá)蛋白的安全性。（2）用雙歧桿菌重組載體疫苗免疫SD大鼠:隨機(jī)分四組分別為PBS、pBES-LTB、pBEX-CFA/I和pBES-LTB+pBEX-CFA/I組,每組12只,免疫三次（0,10,17天）,并于0,7,10,14,17,22和27天采血和糞便樣本,ELISA檢測(cè)其特異抗體水平。（3）在第27天,每組一半大鼠腹腔感染致死劑量ETEC毒株H10407,連續(xù)觀察20天,計(jì)算其存活力。另一半鼻飼ETECH10407,觀察其肺部感染情況。結(jié)果:（1）CFA/I蛋白在雙歧桿菌中成功表達(dá),其表達(dá)蛋白經(jīng)家兔腸袢實(shí)驗(yàn)證實(shí)是無(wú)毒的。（2）ELISA結(jié)果表明:pBEX-CFA/I與pBES- LTB疫苗聯(lián)合免疫組的大鼠比其它單獨(dú)免疫組產(chǎn)生了更強(qiáng)烈的血清IgG和糞便IgA抗體（P<0.05）。CFA/I免疫組和LTB免疫組間無(wú)顯著性差別（P>0.05）。（3）腹腔攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí), pBEX-CFA/I + pBES-LTB免疫組的SD大鼠保護(hù)性比單獨(dú)免疫組的好,單獨(dú)口服天然雙歧桿菌和PBS的未免疫組無(wú)保護(hù)性。（4）ETEC鼻飼實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:pBEX-CFA/I+pBES-LTB免疫組及pBEX-CFA/I單獨(dú)免疫的SD大鼠肺部均無(wú)病理變化。結(jié)論:（1）雙歧桿菌可以作為ETEC重組口服活疫苗的表達(dá)載體系統(tǒng),該口服疫苗表達(dá)系統(tǒng)開辟了ETEC疫苗研究的新方向;（2）重組雙歧桿菌表達(dá)-CFA/I單獨(dú)接種對(duì)ETEC的粘附和感染有免疫保護(hù)作用;（3）雙歧桿菌-CFA/I和雙歧桿菌-LTB聯(lián)合免疫,可明顯提高CFA/I的抗體滴度,并使動(dòng)物獲得更好的保護(hù)力。
張國(guó)廣[7]（2007）在《禽流感病毒M2重組多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究》文中提出禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）能感染幾乎所有的野生及飼養(yǎng)禽類，引起禽類尤其是飼養(yǎng)禽類的死亡，AIV的流行給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。1997年在香港發(fā)現(xiàn)H5N1亞型禽流感病毒突破生物屏障直接感染人，使人們認(rèn)識(shí)到AIV對(duì)于人類公共衛(wèi)生的重要性。疫苗接種是預(yù)防和控制AIV流行的主要措施之一，但AIV突變頻率高、亞型多，給疫苗的研制帶來(lái)困難。AIV的M2蛋白是病毒囊膜上的蛋白之一，具有亞型間高度的保守性，是理想的交叉保護(hù)性疫苗的候選抗原。AIV主要是經(jīng)過動(dòng)物呼吸道等粘膜系統(tǒng)傳染，具有誘導(dǎo)機(jī)體粘膜和系統(tǒng)應(yīng)答能力的疫苗對(duì)于禽流感的防治具有重要的意義。大腸桿菌不耐熱腸毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）是目前研究較多的粘膜佐劑之一，尤其是其B亞單位不具有LT的腸毒素毒性，但仍然保持較好的粘膜佐劑活性。本研究基于M2基因及其M2e表位與大分子載體HBcAg（Heptitis B core antigen，HBcAg）構(gòu)建融合基因，利用融合基因制備多肽和DNA疫苗，并對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行了研究，同時(shí)研究了LTB亞基對(duì)多肽和DNA疫苗的佐劑效應(yīng)。主要結(jié)果如下：1)利用RT-PCR從一株福建分離的AIV H5N1病毒株中克隆了其M基因，序列比對(duì)結(jié)果表明與人源分離株遺傳距離較遠(yuǎn)，從M基因上擴(kuò)增得到完整的M2基因，利用OE-PCR（Overlap extension PCR）得到缺失跨膜區(qū)的△M2，將△M2進(jìn)行原核表達(dá)。利用OE-PCR分別將M2e表位融合到大分子載體HBcAg的N端和主要免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)（Maior immunodominant region，MIR），構(gòu)建融合基因M2eHBc和M2eHBc+，進(jìn)行了原核表達(dá)。上述原核表達(dá)蛋白具有抗原性、亞型間交叉識(shí)別能力、M2eHBc和M2eHBc+還具有體外自主包裝成VLP（Virus-like particles，VLP）顆粒的能力，肌肉注射免疫小鼠后均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生M2特異性抗體，其中M2eHBc+蛋白免疫效果顯著優(yōu)于其它免疫組；2)從大腸桿菌195毒株中克隆出LT基因，并對(duì)其B亞基進(jìn)行了原核表達(dá)，表達(dá)的重組LTB蛋白具有抗原性和體外GM1結(jié)合活性。將LTB基因與M2eHBc+融合進(jìn)行了原核表達(dá)，表達(dá)出的LBM2eHBc+蛋白能與M2蛋白抗體發(fā)生免疫識(shí)別，能自主包裝成VLP顆粒，具有體外GM1結(jié)合活性；3)動(dòng)物免疫試驗(yàn)表明，與陰性對(duì)照比M2eHBc+蛋白通過粘膜途徑免疫小鼠能誘導(dǎo)一定的系統(tǒng)和粘膜應(yīng)答，表達(dá)的LTB蛋白與M2eHBc+蛋白混合通過粘膜途徑免疫小鼠能顯著增強(qiáng)機(jī)體的血清IgG應(yīng)答，誘導(dǎo)較強(qiáng)的粘膜IgA應(yīng)答，表明所表達(dá)的LTB蛋白具有很強(qiáng)的粘膜佐劑活性。表達(dá)的LBM2eHBc+融合蛋白通過粘膜途徑免疫小鼠引起的機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)答水平與M2eHBc+混合LTB免疫組相似，且對(duì)粘膜IgA的誘導(dǎo)能力優(yōu)于混合組；4)將M2eHBc+與pCDNA3載體連接構(gòu)建pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，能表達(dá)出抗原蛋白且該蛋白具有抗原性，DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原特異性抗體和T細(xì)胞增殖應(yīng)答；5)LTB質(zhì)粒與pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗等量混合，或LTB基因與pCDNA3-M2eHBc+融合構(gòu)建的DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，與單獨(dú)pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗肌肉注射組比，能顯著增強(qiáng)DNA疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)體液IgG應(yīng)答的佐劑效應(yīng)不明顯；通過滴鼻途徑免疫時(shí)能顯著刺激機(jī)體粘膜IgA分泌；6)研究了DNA疫苗和蛋白疫苗的初免／加強(qiáng)策略，結(jié)果表明在DNA疫苗兩次免疫后用一次相同抗原的蛋白疫苗加強(qiáng)免疫，可以顯著增強(qiáng)機(jī)體系統(tǒng)IgG應(yīng)答，且對(duì)DNA疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答影響不顯著；7)將LBM2eHBc+融合基因構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPIC9K-LBM2eHBc+，轉(zhuǎn)化GS115表達(dá)菌，篩選出能分泌表達(dá)LBM2eHBc+蛋白的轉(zhuǎn)基因酵母株，WesternBlotting分析該蛋白具有抗原性。
羅維[8]（2007）在《大腸桿菌F18菌毛FedF蛋白及LTB-FedF融合蛋白的表達(dá)及免疫原性研究》文中研究指明1、產(chǎn)腸毒素性E．coliLT全基因的克隆與序列分析根據(jù)GenBank中收錄的LT基因序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，以豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌臨床分離株ECOH1的DNA為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出約1.3kb的片段。將此PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMDTLT，測(cè)序結(jié)果表明所克隆的LT基因序列全長(zhǎng)為1334bp，與GenBank收錄的序列的核苷酸同源性在97.6％-98.8％之間。2、E．coli野生株F18菌毛FedF基因的克隆表達(dá)及免疫原性研究根據(jù)Z26520中fedF序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，從發(fā)病仔豬的腹瀉糞便分離獲得的大腸桿菌中擴(kuò)增得到fedF基因，經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化，將其克隆到pMD18-T中，所克隆fedF基因序列與GenBank中收錄的其他fedF基因序列的同源性在97.8％～99.2％。另設(shè)計(jì)1對(duì)引物，利用基因工程方法將所克隆的fedF的編碼序列亞克隆到表達(dá)載體pBV220中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）LysS獲得表達(dá)重組菌。SDS-PAGE電泳及Western-blotting分析表明重組菌在誘導(dǎo)后可以表達(dá)特異性的FedF蛋白，該重組蛋白分子量約為30kDa。該重組蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白量的11.17％。將純化的重組FedF蛋白免疫小鼠，攻毒試驗(yàn)表明免疫小鼠可完全抵抗致死性的E．coli的感染。3、大腸桿菌LTB-FedF融合蛋白的表達(dá)及免疫原性研究經(jīng)PCR、酶切、連接和轉(zhuǎn)化將LTB成熟肽基因按預(yù)定的閱讀框架插入到表達(dá)質(zhì)粒pET28a（+）中，獲得重組質(zhì)粒pETLTB，用同樣的方法將fedF成熟肽基因片段插入到重組質(zhì)粒pPLTB中LTB基因的3’末端，獲得LTB-fedF融合基因的質(zhì)粒pETLTBFedF。SDS-PAGE與Western-blotting分析表明轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒的重組大腸桿菌在IPTG誘導(dǎo)下可以高效表達(dá)融合蛋白LTB-FedF，該重組蛋白分子量約40kDa。該融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白量的23.17％。融合蛋白經(jīng)純化后免疫小鼠，攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明免疫小鼠只得到部分保護(hù)。結(jié)果說明在此融合蛋白中LTB起到了免疫抑制作用，其原因有待進(jìn)一步的研究。
王曉乾,萬(wàn)春云,姬茜茜[9]（2007）在《大腸桿菌熱敏性腸毒素綜述》文中認(rèn)為大腸桿菌腸毒素是引起腹瀉的主要致病因子,可以分為熱敏性腸毒素和耐熱性腸毒素兩類[1]。本文就熱敏性腸毒素的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能、免疫原性、免疫佐劑作用以及國(guó)內(nèi)外對(duì)其免疫原性與佐劑效應(yīng)的應(yīng)用研究進(jìn)行了綜述。
張金波[10]（2007）在《產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在煙草中的表達(dá)》文中認(rèn)為ETEC腸毒素分為不耐熱性腸毒素（heat-labile,LT）和耐熱性腸毒素（heat-stable,ST）兩種,LT是由A、B兩種亞單位組成的AB5型結(jié)構(gòu)的六聚體蛋白,是目前人們發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)有力的黏膜免疫原和黏膜免疫佐劑之一。其中A亞單位具有ADP核糖基化酶活性, A亞單位通過其A2片段插入B亞單位五聚體“戒孔”中央,組成一個(gè)完整的LT分子。LT-B可與小腸黏膜上皮細(xì)胞GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合,導(dǎo)致有毒性的A亞單位內(nèi)在化和吸收,從而誘發(fā)全身和局部抗體反應(yīng)。融合保護(hù)性抗原的LT類全毒素具有傳輸抗原載體和免疫佐劑兩重功效。本研究利用基因工程技術(shù),首先克隆熱穩(wěn)定性腸毒素STII的抗原決定簇（CEHYRQIAKESCKKGF）與K88ac蛋白融合基因,并利用套疊PCR技術(shù)定點(diǎn)突變K88ac-STII內(nèi)部EcoR I、Sac I酶切位點(diǎn)。將LT的A亞基的LTA1部分用以已克隆的抗原基因K88ac-STII替換,并將煙草病程相關(guān)蛋白PR1a基因的信號(hào)肽分別與K88ac-STII-LTA2、LTB連接,構(gòu)建到pCAMBIA2300植物高效表達(dá)載體上,即構(gòu)建了帶有信號(hào)肽的PR1as-K88ac-STII-LTA2 /Ubquitin-PR1as-LTB雙價(jià)植物表達(dá)載體。構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR檢測(cè)、酶切分析及核苷酸序列分析,結(jié)果表明,插入的融合基因核苷酸序列與預(yù)期的一致,且閱讀框正確。重組質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化模式植物煙草。轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)PCR和RT-PCR初步檢測(cè),證明外源基因已經(jīng)整合到受體植物基因組中,同時(shí)表明融合基因在轉(zhuǎn)錄水平上有表達(dá)。提取轉(zhuǎn)基因煙草植株總蛋白質(zhì), Western-dot免疫檢測(cè)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)的重組抗原有免疫原性。本研究結(jié)果表明,K88-STII-LTA2/LTB融合基因能夠在煙草中正確表達(dá)并證實(shí)該基因具有一定的免疫原性,轉(zhuǎn)基因煙草的獲得為下一步把LT類全毒素轉(zhuǎn)入苜蓿等飼料作物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗腹瀉植物口服疫苗的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
二、一種粘膜免疫佐劑——大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素研究現(xiàn)況（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁(yè)面大小,采用多級(jí)分層頁(yè)表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁(yè)表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來(lái)發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來(lái)獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來(lái)分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來(lái)間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、一種粘膜免疫佐劑——大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素研究現(xiàn)況（論文提綱范文）
（1）產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌mLT突變株的構(gòu)建及其主要生物學(xué)特性研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 仔豬大腸桿菌性腹瀉簡(jiǎn)介 |
| 1.2 ETEC主要毒力因子 |
| 1.2.1 熱穩(wěn)定腸毒素 |
| 1.2.2 熱不穩(wěn)定腸毒素 |
| 1.2.3 K88菌毛 |
| 1.2.4 其他黏附素 |
| 1.3 ETEC疫苗研究進(jìn)展 |
| 1.4 黏膜免疫 |
| 1.5 口服疫苗 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 簡(jiǎn)述 |
| 1.7 研究目的與意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 菌種和質(zhì)粒 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要試劑和抗體 |
| 2.1.5 主要儀器設(shè)備 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 E.coli C83903△estB的構(gòu)建 |
| 2.2.2 E.coli mLT-S63K/mLT-A72R/mLT-R192G的構(gòu)建 |
| 2.2.3 突變菌株的部分生物學(xué)特性檢測(cè) |
| 2.2.4 mLT體內(nèi)外毒性的測(cè)定 |
| 2.2.5 小鼠口服突變菌株的免疫效果評(píng)價(jià) |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 E.coli C83903△estB的構(gòu)建 |
| 3.1.1 pTarget-T△estB質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 |
| 3.1.2 estB基因敲除菌株的鑒定結(jié)果 |
| 3.2 E.coli mLT-S63K/mLT-A72R/mLT-R192G的構(gòu)建 |
| 3.2.1 pTarget-T-N425 質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化結(jié)果 |
| 3.2.2 pTarget-T-S63K/A72R/R192G質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化結(jié)果 |
| 3.2.3 基因編輯質(zhì)粒的消除結(jié)果 |
| 3.3 突變菌株的部分生物學(xué)特性 |
| 3.3.1 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.2 菌毛生長(zhǎng)能力的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.3.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.3.4 胃腸道環(huán)境耐受性的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.3.5 耐藥性的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.3.6 黏附能力的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.4 mLT體內(nèi)外毒性的測(cè)定 |
| 3.4.1 LTA-S1、LTA-S2 蛋白的表達(dá)及多抗的制備結(jié)果 |
| 3.4.2 mLT體內(nèi)外毒性的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.5 小鼠口服突變菌株的免疫效果評(píng)價(jià) |
| 3.5.1 突變菌株定植能力測(cè)定結(jié)果 |
| 3.5.2 突變菌株安全性檢驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.5.3 特異性抗體的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.5.4 Peyer’s集合淋巴結(jié)免疫組化結(jié)果 |
| 3.5.5 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.5.6 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.5.7 血清中細(xì)胞因子水平的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.5.8 抗體中和活性的測(cè)定結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 4.1 mLT突變菌株的構(gòu)建策略 |
| 4.2 mLT突變菌株的毒力分析 |
| 4.3 E.coli m LT-S63K的應(yīng)用前景 |
| 4.4 本研究的局限性和后續(xù)研究的建議 |
| 5 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（2）FanC-FaeG共展示的ETEC菌株構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的危害 |
| 1.2 ETEC的毒力因子及致病機(jī)制 |
| 1.2.1 致病機(jī)制 |
| 1.2.2 黏附素 |
| 1.2.3 腸毒素 |
| 1.3 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的防治 |
| 1.4 大腸桿菌表面展示的研究進(jìn)展 |
| 1.4.1 基于外膜蛋白的展示系統(tǒng) |
| 1.4.2 基于細(xì)菌表面附屬物的展示系統(tǒng) |
| 1.4.3 基于自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的展示系統(tǒng) |
| 1.5 研究?jī)?nèi)容及意義 |
| 第二章 ETEC表達(dá)宿主的篩選及黏附素雙展示菌株的構(gòu)建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2.1 菌株和載體 |
| 2.2.2 試劑、工具酶及培養(yǎng)基 |
| 2.2.3 儀器 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3.1 ETEC表達(dá)宿主的篩選 |
| 2.3.1.1 基于GFP的原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.3.1.2 GFP轉(zhuǎn)入不同大腸桿菌宿主 |
| 2.3.1.3 最佳表達(dá)宿主的菌株背景鑒定 |
| 2.3.2 應(yīng)用表面展示技術(shù)構(gòu)建雙黏附素共表達(dá)ETEC菌株 |
| 2.3.2.1 重組質(zhì)粒p QE-30-Lpp’Omp A-Fae G的構(gòu)建 |
| 2.3.2.2 雙黏附素重組大腸桿菌的建立 |
| 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 2.4.1 綠色熒光蛋白GFP的 PCR擴(kuò)增結(jié)果 |
| 2.4.2 p QE-30-GFP的陽(yáng)性克隆鑒定結(jié)果 |
| 2.4.3 重組質(zhì)粒在ETEC及工程菌中的表達(dá) |
| 2.4.4 不同宿主菌表達(dá)GFP的相對(duì)熒光值測(cè)定 |
| 2.4.5 BE311的菌株種屬鑒定結(jié)果 |
| 2.4.6 BE311毒力因子的檢測(cè) |
| 2.4.7 表面展示體系相關(guān)基因的PCR的擴(kuò)增結(jié)果 |
| 2.4.8 重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證結(jié)果 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第三章 重組菌株的黏附素表達(dá)及黏附特性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2.1 菌株及細(xì)胞 |
| 3.2.2 試劑及培養(yǎng)基 |
| 3.2.3 儀器 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3.1 雙砷-四半胱氨酸系統(tǒng)特異性檢測(cè) |
| 3.3.2 重組菌株生長(zhǎng)特性研究 |
| 3.3.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 3.3.4 重組菌表面疏水性測(cè)定 |
| 3.3.5 重組菌對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2的黏附研究 |
| 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 3.4.1 重組菌BE311-Fae G-TC的熒光顯微鏡觀察 |
| 3.4.2 重組菌BE311-Fae G與野生菌BE311 的生長(zhǎng)曲線比較 |
| 3.4.3 重組菌BE311-Fae G的黏附素誘導(dǎo)表達(dá) |
| 3.4.4 重組菌BE311-Fae G與野生株的疏水性比較 |
| 3.4.5 重組菌BE311-Fae G對(duì) IPEC-J2 細(xì)胞的黏附 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第四章 重組菌株對(duì)ETEC體內(nèi)拮抗模型的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.2.1 菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 4.2.2 試劑及培養(yǎng)基 |
| 4.2.3 儀器 |
| 4.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.3.1 E.coli K99-m Cherry-CRISPR/Cas的改造 |
| 4.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) |
| 4.3.3 腸道的取樣處理方法 |
| 4.3.4 ETEC標(biāo)記菌株的檢測(cè)方法 |
| 4.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 |
| 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 4.4.1 E.coli K99-m Cherry-p QE30 的抗性檢測(cè) |
| 4.4.2 E.coli K99-m Cherry-p QE30與E.coli K99-m Cherry-CRISPR/Cas的比較 |
| 4.4.3 E.coli K99-m Cherry-p QE30 的穩(wěn)定性檢測(cè) |
| 4.4.4 熒光體系下E.coli K99-m Cherry-p QE30 活菌濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 |
| 4.4.5 大鼠腸道內(nèi)回收標(biāo)記菌株的可視化區(qū)分 |
| 4.4.6 大鼠腸道內(nèi)標(biāo)記菌株的回收統(tǒng)計(jì)結(jié)果 |
| 4.4.7 ETEC攻毒后大鼠腸道內(nèi)炎癥因子的基因表達(dá)水平測(cè)定 |
| 4.4.8 ETEC攻毒后大鼠腸道內(nèi)炎癥因子的蛋白濃度測(cè)定結(jié)果 |
| 4.5 小結(jié) |
| 第五章 FanC-FaeG雙展示重組ETEC菌株在大鼠體內(nèi)對(duì)攻毒菌株侵染的保護(hù)性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 5.2.1 菌株和動(dòng)物 |
| 5.2.2 試劑及培養(yǎng)基 |
| 5.2.3 儀器 |
| 5.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 5.3.1 菌株準(zhǔn)備 |
| 5.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 |
| 5.3.3 腸道和糞便的取樣處理方法 |
| 5.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 |
| 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 |
| 5.4.1 攻毒后對(duì)大鼠生長(zhǎng)性能的影響 |
| 5.4.2 攻毒后大鼠的脾臟、肝臟變化 |
| 5.4.3 攻毒后大鼠糞便中標(biāo)記菌株的回收統(tǒng)計(jì) |
| 5.4.4 攻毒后大鼠各腸段中標(biāo)記菌株的回收統(tǒng)計(jì) |
| 5.5 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
（3）豬瘟疫苗經(jīng)粘膜途徑接種動(dòng)物免疫效果分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符號(hào)說明 |
| 上篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一章 豬瘟疫苗的研究進(jìn)展 |
| 1 豬瘟病毒的概述 |
| 2 豬瘟疫苗 |
| 3 豬瘟新型疫苗制劑研發(fā)的必要性 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二章 大腸桿菌熱敏性腸毒素作為粘膜佐劑的研究進(jìn)展 |
| 1 LT的佐劑功能 |
| 2 LT突變體的研究 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 下篇 試驗(yàn)研究 |
| 第三章 大腸桿菌熱敏性腸毒素突變體發(fā)酵表達(dá)及純化 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 英文摘要 |
| 第四章 豬瘟疫苗與LT突變體免疫小鼠試驗(yàn) |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 英文摘要 |
| 第五章 豬瘟疫苗與LT突變體免疫豬試驗(yàn) |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 英文摘要 |
| 全文總結(jié) |
| 附錄 |
| 致謝 |
（4）表達(dá)LTB-MOMP融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻的建立及免疫試驗(yàn)（論文提綱范文）
| 內(nèi)容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 第1章 植物基因工程疫苗的研究進(jìn)展 |
| 1.1 植物疫苗的表達(dá)系統(tǒng) |
| 1.2 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的優(yōu)點(diǎn) |
| 1.3 可食性植物疫苗的作用機(jī)理 |
| 1.4 幾種主要轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究現(xiàn)狀 |
| 1.5 轉(zhuǎn)基因植物疫苗存在的問題及未來(lái)研究的展望 |
| 第2章 衣原體和鸚鵡熱衣原體疾病的研究概況 |
| 2.1 衣原體 |
| 2.2 禽衣原體 |
| 第3章 粘膜免疫及其佐劑的研究進(jìn)展 |
| 3.1 參與粘膜免疫誘導(dǎo)的抗原遞呈細(xì)胞 |
| 3.2 粘膜免疫效應(yīng) |
| 3.3 粘膜免疫佐劑 |
| 第二篇 研究?jī)?nèi)容 |
| 第1章 MOMP/LTB-MOMP 融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá) |
| 1.1 材料與方法 |
| 1.2 結(jié)果 |
| 1.3 討論 |
| 1.4 小結(jié) |
| 第2章 MOMP/LTB-MOMP 融合基因原核表達(dá)的小鼠免疫試驗(yàn)研究 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.3 討論 |
| 2.4 小結(jié) |
| 第3章 表達(dá)LTB-MOMP 融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建及鑒定 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.3 討論 |
| 3.4 小結(jié) |
| 第4章 表達(dá)LTB-MOMP 融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻的小鼠試驗(yàn)免疫 |
| 4.1 材料與方法 |
| 4.2 結(jié)果 |
| 4.3 討論 |
| 4.4 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 導(dǎo)師簡(jiǎn)介 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
（5）用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LTB口服活疫苗及其粘膜免疫佐劑功能研究（論文提綱范文）
| 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 論文正文：用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌 LTB 口服活疫苗及其粘膜免疫佐劑功能研究 |
| 前言 |
| 第一部分：大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素 B 亞單位在嬰兒雙歧桿菌中的表達(dá) |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 小結(jié) |
| 第二部分：雙歧桿菌-LTB 重組載體疫苗免疫力及佐劑活性檢測(cè) |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述：不同粘膜免疫途徑的免疫效果 |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間的論文 |
（6）用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌定居因子I重組載體疫苗研究（論文提綱范文）
| 符號(hào)說明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 論文正文：用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌定居因子Ⅰ重組載體疫苗研究 |
| 前言 |
| 第一部分 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌定居因子Ⅰ在嬰兒雙歧桿菌中的表達(dá) |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 第二部分 雙歧桿菌重組載體疫苗免疫力檢測(cè) |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文 |
（7）禽流感病毒M2重組多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 禽流感病毒研究進(jìn)展 |
| 1.1 禽流感病毒的分類、命名 |
| 1.2 禽流感的發(fā)生及危害 |
| 1.3 禽流感病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其理化特性 |
| 1.4 禽流感病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展 |
| 1.4.1 禽流感病毒的基因組 |
| 1.4.2 禽流感病毒的蛋白結(jié)構(gòu) |
| 1.5 禽流感病毒的復(fù)制 |
| 1.5.1 病毒粒子的吸附、侵入與脫殼 |
| 1.5.2 基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制 |
| 1.5.3 AIV基因表達(dá)的調(diào)控 |
| 1.5.4 AIV的裝配與釋放 |
| 1.6 禽流感與人禽流感 |
| 1.7 禽流感的防治 |
| 1.7.1 綜合防治 |
| 1.7.2 疫苗接種 |
| 1.7.3 疫區(qū)的控制 |
| 1.8 禽流感疫苗研究進(jìn)展 |
| 1.8.1 滅活全病毒疫苗 |
| 1.8.2 純化組分疫苗 |
| 1.8.3 減毒活疫苗 |
| 1.8.4 重組亞單位疫苗 |
| 1.8.5 重組活載體疫苗 |
| 1.8.6 合成多肽疫苗 |
| 1.8.7 核酸疫苗 |
| 1.8.8 RNAi疫苗 |
| 2 粘膜免疫研究進(jìn)展 |
| 2.1 粘膜免疫系統(tǒng)基本組成 |
| 2.2 粘膜免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)與效應(yīng)細(xì)胞 |
| 2.3 分泌型IgA作用 |
| 2.4 粘膜免疫的優(yōu)點(diǎn) |
| 2.5 粘膜疫苗佐劑 |
| 第二章 禽流感病毒M2蛋白及其膜外序列的多肽疫苗研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 基于M2蛋白及其M2e表位的疫苗研究進(jìn)展 |
| 1.2 本研究的目的和內(nèi)容 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料、載體、菌株、工具酶 |
| 2.2 主要試劑及溶液的配制 |
| 2.2.1 質(zhì)粒抽提相關(guān)溶液 |
| 2.2.2 SDS-PAGE相關(guān)溶液 |
| 2.2.3 Western blotting相關(guān)溶液 |
| 2.2.4 ELISA所用試劑 |
| 2.2.5 蛋白純化相關(guān)試劑 |
| 2.2.6 其它相關(guān)溶液 |
| 2.3 引物設(shè)計(jì)和序列分析 |
| 2.4 M基因的克隆 |
| 2.4.1 PCR引物 |
| 2.4.2 病毒RNA提取 |
| 2.4.3 RT-PCR |
| 2.4.4 M基因的TA克隆 |
| 2.4.5 序列測(cè)定及分析 |
| 2.4.6 M2基因及缺失跨膜區(qū)的M2基因的克隆 |
| 2.5 基于M2基因膜外序列的融合基因構(gòu)建 |
| 2.5.1 M2e比對(duì)及密碼子優(yōu)化 |
| 2.5.2 PCR引物 |
| 2.5.3 M2eHBc和M2eHBc+融合基因片段的獲得 |
| 2.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.6.1 pET32a-△M2原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.6.2 pMALc2x-M2eHBc和 pMALc2x-M2eHBc+原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.7 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.7.1 缺失跨膜區(qū)的M2蛋白表達(dá) |
| 2.7.2 M2eHBc和M2eHBc+融合蛋白表達(dá) |
| 2.7.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) |
| 2.8 原核表達(dá)重組蛋白純化及濃度測(cè)定 |
| 2.9 表達(dá)產(chǎn)物的抗原性分析 |
| 2.10 純化表達(dá)蛋白的交叉抗原性檢測(cè) |
| 2.11 電鏡觀察原核表達(dá)的融合蛋白 |
| 2.12 免疫小鼠 |
| 2.13 抗體效價(jià)檢測(cè) |
| 2.13.1 血清收集方法 |
| 2.13.2 HBcAg抗體檢測(cè) |
| 2.13.3 M2特異性抗體效價(jià)檢測(cè) |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 M基因RT-PCR擴(kuò)增和重組載體pMD18T-M鑒定 |
| 3.2 M基因序列比對(duì)及分子進(jìn)化分析 |
| 3.3 缺失跨膜區(qū)的M2基因擴(kuò)增及pET32a-△M2鑒定 |
| 3.4 M2e與HBcAg融合基因的擴(kuò)增及原核表達(dá)載體鑒定 |
| 3.5 融合蛋白的表達(dá)及蛋白表達(dá)形式分析 |
| 3.5.1 pET32a-OM2表達(dá)分析 |
| 3.5.2 pMALc2x-M2eHBc和pMALc2x-M2eHBc+表達(dá)分析 |
| 3.6 原核表達(dá)的融合蛋白抗原性分析 |
| 3.7 融合蛋白的交叉反應(yīng)性檢測(cè) |
| 3.8 電鏡觀察結(jié)果 |
| 3.9 抗體效價(jià)檢測(cè) |
| 3.9.1 抗血清中HBcAg抗體 |
| 3.9.2 抗血清中M2抗體效價(jià) |
| 4 討論 |
| 4.1 M基因的克隆與序列分析 |
| 4.2 融合基因的構(gòu)建 |
| 4.3 外源基因的原核表達(dá) |
| 4.4 病毒樣顆粒 |
| 4.5 融合蛋白交叉抗原性及抗體效價(jià) |
| 第三章 LTB的克隆與表達(dá)及其與M2eHBc+蛋白的粘膜免疫研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 LT與CT的結(jié)構(gòu)與功能 |
| 1.2 LT和CT的粘膜免疫佐劑研究 |
| 1.3 LT與CT B亞單位的免疫佐劑研究 |
| 1.4 本研究的目的和內(nèi)容 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料、載體、菌株、工具酶 |
| 2.2 LT基因的克隆 |
| 2.2.1 PCR模板制備、引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 |
| 2.2.2 LT基因的TA克隆 |
| 2.3 LTB的原核表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 2.3.1 LTB PCR引物合成、PCR擴(kuò)增 |
| 2.3.2 pET32a-LTB原核表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 2.4 LTB亞單位與M2eHBc+的融合表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 2.5 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.6 表達(dá)產(chǎn)物抗原性分析 |
| 2.7 體外GM1-ELISA檢測(cè) |
| 2.8 電鏡觀察原核表達(dá)的融合蛋白LBM2eHBc+ |
| 2.9 小鼠免疫接種 |
| 2.10 抗體效價(jià)檢測(cè) |
| 2.10.1 免疫血清及腸分泌液制備 |
| 2.10.2 血清抗原特異性IgG效價(jià)檢測(cè) |
| 2.10.3 腸分泌液中抗原特異性IgA檢測(cè) |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 LT全長(zhǎng)基因的克隆及序列分析 |
| 3.2 pET32a-LTB原核表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 3.3 pMALc2x-LBM2eHBc+原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.4 融合蛋白的表達(dá)及蛋白表達(dá)形式 |
| 3.4.1 pET32a-LTB的表達(dá) |
| 3.4.2 pMALc2x-LBM2eHBc+的原核表達(dá) |
| 3.5 重組蛋白的抗原性分析 |
| 3.6 重組蛋白的GM1-ELISA |
| 3.7 電鏡觀察結(jié)果 |
| 3.8 抗體效價(jià)檢測(cè) |
| 3.8.1 血清M2特異性IgG檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.8.2 腸沖洗液M2特異性IgA檢測(cè)結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 4.1 原核表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的可溶性表達(dá) |
| 4.2 LTB對(duì)共免疫原的粘膜佐劑活性 |
| 第四章 M2eHBc+融合基因的DNA疫苗免疫研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 DNA疫苗 |
| 1.1.1 DNA疫苗的發(fā)展及其優(yōu)點(diǎn) |
| 1.1.2 DNA疫苗誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的機(jī)制 |
| 1.1.3 加強(qiáng)DNA免疫效應(yīng)的策略 |
| 1.1.4 DNA疫苗與其它疫苗的二次免疫(初免-加強(qiáng))策略 |
| 1.2 DNA疫苗與粘膜免疫 |
| 1.3 禽流感病毒DNA疫苗的研究 |
| 1.4 本研究的目的與內(nèi)容 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2 主要試劑及溶液的配制 |
| 2.2.1 質(zhì)粒大量抽提所需試劑配制 |
| 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑配制 |
| 2.2.3 T細(xì)胞增殖試驗(yàn)相關(guān)試劑配制 |
| 2.3 pcDNA3-LTB、 pcDNA3-M2eHBc+及pcDNA3-LBM2eHBc+構(gòu)建 |
| 2.4 轉(zhuǎn)染及免疫用質(zhì)粒的制備及濃度純度測(cè)定 |
| 2.4.1 轉(zhuǎn)染及免疫用質(zhì)粒的制備 |
| 2.4.2 質(zhì)粒濃度及質(zhì)粒純度測(cè)定 |
| 2.5 體外轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞 |
| 2.6 免疫小鼠 |
| 2.7 IgG和IgA抗體效價(jià)檢測(cè) |
| 2.8 T細(xì)胞增殖試驗(yàn) |
| 2.8.1 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離 |
| 2.8.2 T細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT法) |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 DNA疫苗相關(guān)載體的構(gòu)建 |
| 3.2 體外轉(zhuǎn)染W(wǎng)estern blotting分析 |
| 3.3 DNA疫苗抗體檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.1 血清IgG-M2檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.3.2 腸洗液IgA-M2檢測(cè)結(jié)果 |
| 3.4 T細(xì)胞增殖的試驗(yàn)結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 第五章 畢氏酵母表達(dá)的LBM2eHBc+重組基因多肽疫苗及其抗原性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 畢氏酵母表達(dá)所用各種試劑與溶劑的配制 |
| 2.3 LBM2eHBc+融合基因畢氏酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.4 LBM2eHBc+融合基因轉(zhuǎn)化畢氏酵母GS115 |
| 2.4.1 GS115感受態(tài)的制備 |
| 2.4.2 重組表達(dá)載體pPIC9K-LBM2eHBc+線性化 |
| 2.4.3 表達(dá)載體pPIC9K-LBM2eHBc+轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞 |
| 2.5 LBM2eHBc+融合基因在畢氏酵母GS115中的表達(dá) |
| 2.5.1 轉(zhuǎn)化子的PCR快速鑒定 |
| 2.5.2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的Dot-ELISA鑒定 |
| 2.5.3 酵母整合的PCR分析 |
| 2.5.4 融合基因在酵母中的表達(dá) |
| 2.6 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析及Western-blotting分析 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.2 轉(zhuǎn)化GS115陽(yáng)性克隆的PCR鑒定及Dot-ELISA鑒定 |
| 3.3 PCR分析外源基因在酵母中的整合 |
| 3.4 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 3.5 表達(dá)蛋白的Western blotting分析 |
| 4 討論 |
| 結(jié)論與展望 |
| 其它研究工作 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 縮略詞 |
| 致謝 |
（8）大腸桿菌F18菌毛FedF蛋白及LTB-FedF融合蛋白的表達(dá)及免疫原性研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一 大腸桿菌不耐熱腸毒素LT研究進(jìn)展 |
| 二 致病性大腸桿菌F18菌毛的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第一章 產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌LT全基因的克隆與序列分析 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二章 E.coli野生株F18菌毛蛋白粘附亞單位基因的克隆、表達(dá)及免疫原性研究 |
| 材料和方法 |
| 結(jié)果 |
| 小結(jié)和討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三章 大腸桿菌LTB-F18融合蛋白的表達(dá)及免疫原性研究 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果與分析 |
| 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 結(jié)論 |
| 符號(hào)說明 |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)歷 |
（10）產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在煙草中的表達(dá)（論文提綱范文）
| 英文縮寫詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 抗腹瀉植物疫苗的研究進(jìn)展 |
| 實(shí)驗(yàn)研究 |
| 實(shí)驗(yàn)一 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌 K88-STII-LTA2//LTB 融合基因雙價(jià)植物表達(dá)載體的構(gòu)建及根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 實(shí)驗(yàn)二 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因煙草的分子生物學(xué)鑒定 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 主要結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn) |
| 主要結(jié)論 |
| 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 致謝 |
| 作者簡(jiǎn)介 |
| 附錄 |
| 附錄 1 主要技術(shù)路線 |
| 附錄 2 載體構(gòu)建流程 |
| 附錄3 主要培養(yǎng)基、溶液配制 |
| 導(dǎo)師評(píng)閱表 |
四、一種粘膜免疫佐劑——大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素研究現(xiàn)況（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌mLT突變株的構(gòu)建及其主要生物學(xué)特性研究[D]. 馮啟崢. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020(04)
- [2]FanC-FaeG共展示的ETEC菌株構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究[D]. 胡佳. 中南民族大學(xué), 2020(08)
- [3]豬瘟疫苗經(jīng)粘膜途徑接種動(dòng)物免疫效果分析[D]. 陳東強(qiáng). 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009(06)
- [4]表達(dá)LTB-MOMP融合蛋白轉(zhuǎn)基因水稻的建立及免疫試驗(yàn)[D]. 張秀香. 吉林大學(xué), 2009(09)
- [5]用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LTB口服活疫苗及其粘膜免疫佐劑功能研究[D]. 羅耀玲. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2008(01)
- [6]用雙歧桿菌構(gòu)建產(chǎn)腸毒素大腸桿菌定居因子I重組載體疫苗研究[D]. 黃雪萍. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2008(01)
- [7]禽流感病毒M2重組多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究[D]. 張國(guó)廣. 廈門大學(xué), 2007(11)
- [8]大腸桿菌F18菌毛FedF蛋白及LTB-FedF融合蛋白的表達(dá)及免疫原性研究[D]. 羅維. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007(02)
- [9]大腸桿菌熱敏性腸毒素綜述[J]. 王曉乾,萬(wàn)春云,姬茜茜. 養(yǎng)殖與飼料, 2007(06)
- [10]產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在煙草中的表達(dá)[D]. 張金波. 石河子大學(xué), 2007(06)
標(biāo)簽：雙歧桿菌論文; 免疫佐劑論文; 抗原抗體反應(yīng)論文; 重組蛋白論文; 抗原決定簇論文;