一、阿爾茨海默病核酸疫苗的構(gòu)建及誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的初步研究（論文文獻(xiàn)綜述）
張洪亮[1]（2021）在《偽狂犬病病毒的基因工程疫苗構(gòu)建及其感染PK-15細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析》文中研究說明偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）,是一種可感染豬、牛、羊等家畜,犬貓等寵物,家兔、狐、貉、水貂等毛皮動物和野生動物,以引起發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎等主要臨床癥狀的皰疹病毒。該病毒可感染各年齡段的豬群,主要造成種豬繁殖障礙、仔豬發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸道癥狀。自2011年P(guān)RV變異株出現(xiàn)以來,導(dǎo)致Bartha-K61等傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)力有所降低,我國多個地區(qū)已免疫PRV疫苗的豬場發(fā)生偽狂犬病疫情,嚴(yán)重威脅了我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此,本研究開展了PRV變異株的病原學(xué)、快速鑒別診斷技術(shù)、新型基因工程疫苗、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,為該病有效防控奠定技術(shù)和理論基礎(chǔ)。取得的主要研究成果有:1.本研究對山東某Bartha-K61疫苗免疫豬場感染的PRV野毒株進(jìn)行了分離鑒定,成功分離鑒定到PRV SD-2017株,并完成了生物學(xué)特性分析。基于g E、TK和g B等毒力基因的遺傳進(jìn)化分析,確定該毒株為我國當(dāng)前流行的PRV變異毒株。透射電鏡觀察病毒粒子直徑大約在140～180 nm,有厚囊膜,囊膜表面有放射狀纖突,粒子核心致密,呈現(xiàn)出皰疹病毒典型的病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)。該毒株在PK-15細(xì)胞上的病毒滴度可達(dá)到109.0TCID50/m L,對家兔的半數(shù)致死量(LD50)為3.2×102.0TCID50/m L。2.針對PRV疫苗株與野毒株的鑒別診斷,篩選到特異性引物和探針,成功建立了PRV g B和g E基因的酶促重組等溫?cái)U(kuò)增（ERA）熒光檢測方法。g B和g E基因的ERA檢測方法的敏感性分別為10copies/μL、103copies/μL,與熒光定量PCR方法比對,g B和g E基因檢測結(jié)果符合率分別為100%和92.31%。該方法在38℃恒溫反應(yīng)25 min,能夠?qū)崿F(xiàn)對PRV g B和g E基因的特異性鑒別檢測,將反應(yīng)體系進(jìn)行預(yù)凍干后,可組裝成檢測試劑盒進(jìn)行現(xiàn)場應(yīng)用,可有效應(yīng)用于PRV野毒和疫苗毒的臨床快速診斷。3.以PRV變異毒株SD-2017株作為親本毒株,利用同源重組技術(shù)對g E/g I/TK毒力基因進(jìn)行了缺失,分別構(gòu)建了PRV SD-2017Δg E/g I株和SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株,并分析了其一步生長曲線、致病性等生物學(xué)特性,基因缺失株的病毒含量在PK-15細(xì)胞上仍能達(dá)到108.0TCID50/m L,SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株對家兔的LD50>1.0×106.0TCID50/m L,為針對PRV變異株開發(fā)基因缺失滅活疫苗和減毒活疫苗提供了理想的候選疫苗種毒。4.將樹突狀細(xì)胞靶向誘導(dǎo)肽DCpep作為分子內(nèi)佐劑,腦膜炎奈瑟氏球菌Por B蛋白作為疫苗佐劑,分別構(gòu)建了含有蛋白分泌信號肽gp67的重組桿狀病毒Ac-g B-DCpep和Ac-Por B,利用昆蟲細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了PRV g B-DCpep蛋白融合表達(dá)和Por B蛋白真核表達(dá),基于前期研究構(gòu)建的PRV毒力基因缺失株,分別制備了PRV SD2017株Δg E/g I/TK三基因缺失活疫苗和Δg E/g I雙基因缺失滅活疫苗,與g B-DCpep基因工程亞單位疫苗、Bartha K61活疫苗一同在家兔上進(jìn)行了對PRV變異株感染的免疫保護(hù)效果評價。構(gòu)建的SD2017Δg E/g I/TK減毒活疫苗、PRV-g B+Por B亞單位疫苗和SD2017Δg E/g I+Por B滅活疫苗,在家兔上顯示了對變異株SD-2017良好的免疫保護(hù)作用。結(jié)果說明DCpep可作為潛在的分子佐劑,Por B蛋白可以作為新型疫苗佐劑,對體液免疫和細(xì)胞免疫均具有顯著的誘導(dǎo)刺激作用,后續(xù)可應(yīng)用于新型基因工程疫苗的制備,為PRV新型疫苗開發(fā)提供了新的策略。5.基于Illumina轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異進(jìn)行了全面分析,發(fā)現(xiàn)差異上調(diào)的基因多集中在細(xì)胞周期、m TOR信號通路、自噬-動物、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞衰老、癌癥的途徑、胞吞作用、HTLV-I感染、ap1信號通路、MAPK等信號通路。差異下調(diào)的基因多集中在有氧化磷酸化、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、碳代謝、HTLV-I感染、人乳頭瘤病毒感染和MAPK等信號通路。差異表達(dá)下調(diào)的基因富集最多的通路是核糖體、氧化磷酸化RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、m RNA監(jiān)測途徑、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、丙酸酯代謝、基因復(fù)制、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、生熱等信號通路。相關(guān)基因的其生物學(xué)意義需要進(jìn)一步研究揭示。6.利用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)差異進(jìn)行了全面分析,解析了差異蛋白參與不同毒力PRV感染細(xì)胞中的生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞定位。差異蛋白涉及的主要信號通路有抗原處理和展示、初級膽汁酸合成、醚脂質(zhì)代謝、礦物質(zhì)吸收、過氧化物酶體、HTLV-I感染、催產(chǎn)素信號通路、單純皰疹感染、卡波濟(jì)氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、細(xì)胞衰老、趨化因子信號通路、Notch信號通路等。PRV病毒-宿主細(xì)胞相互作用的機(jī)制值得進(jìn)一步研究,尤其是蛋白質(zhì)組差異中涉及的關(guān)鍵基因如何調(diào)節(jié)PRV感染方面,將有助于更好地了解PRV的特定感染機(jī)制。另外,本研究通過PRV感染PK15細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組GO功能富集關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn),兩者在細(xì)胞部分、細(xì)胞、細(xì)胞器部分大分子復(fù)合物、催化活性、結(jié)合、細(xì)胞過程、代謝過程等方面的顯著差異相關(guān)聯(lián),為后續(xù)深入研究不同PRV毒株的致病機(jī)理提供了有利條件。
張霞[2]（2020）在《基于酵母的皰疹病毒疫苗的設(shè)計(jì)和制備》文中研究表明阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種神經(jīng)退行性疾病,它的發(fā)生、發(fā)展過程與遺傳、表觀修飾、環(huán)境等因素有關(guān),關(guān)于阿爾茨海默病的學(xué)說有很多種,主要包括“膽堿功能障礙假說”、“淀粉樣蛋白級聯(lián)假說”、“tau蛋白假說”、“病毒感染假說”等。一直以來,對于AD藥物的研發(fā)重點(diǎn)都放在消除Aβ的沉積,以期望改善患者的認(rèn)知功能障礙,但有關(guān)藥物研發(fā)的相繼失敗證明此途徑行不通。近兩年提出的“病毒感染假說”是指AD是由1型單純皰疹病毒（Herpes simplex virus 1,HSV-1）感染引起的,而這一假說的提出使得HSV重新進(jìn)入人們的視野中。單純皰疹病毒可以引起Aβ的沉積和tau蛋白的過度磷酸化,而這兩者是AD的主要神經(jīng)病理學(xué)特征。一直以來,人們普遍認(rèn)為Aβ沉積所形成的老年斑是AD的罪魁禍?zhǔn)?因此Aβ一度成為眾矢之的,但是Aβ也是抗菌肽,具有抗細(xì)菌、抗真菌以及抗病毒的作用。研究表明Aβ可以包裹皰疹病毒,以保護(hù)神經(jīng)元不受損傷。目前,對于HSV-1的治療是使用一些抗病毒藥物,如阿昔洛韋等,但這些抗病毒藥物也只是緩解患者的疼痛程度及降低發(fā)生頻率,并不能達(dá)到治愈的目的。所以對于HSV-1的感染,最有效的方法就是預(yù)防,也就是接種疫苗。實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明,蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfide isomerase,PDI）可以增加外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)量,所以本研究采用過表達(dá)PDI的畢赤酵母X-33-PDI作為外源蛋白的表達(dá)菌株,以增加外源蛋白的表達(dá)量。從疫苗的角度出發(fā),考慮到目前疫苗主要是注射型疫苗,而這種疫苗研發(fā)過程中需要蛋白純化,成本高,而且運(yùn)輸過程中必須保證全程冷鏈,使用時也需要專業(yè)的醫(yī)護(hù)人員才可以操作,所以我們采用酵母表面展示技術(shù)構(gòu)建酵母口服疫苗,酵母展示體系包含三部分:M細(xì)胞特異性配體,起到靶向性作用;HSV-1包膜糖蛋白D,病原體蛋白,即抗原;α凝集素,錨定蛋白。酵母表面展示菌株構(gòu)建成功后,我們利用熒光顯微鏡觀察了目的蛋白在酵母表面的定位情況,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組菌株的表面可以觀察到綠色熒光,而對照組菌株無綠色熒光,證明目的蛋白已經(jīng)被成功誘導(dǎo)表達(dá),且被展示在酵母表面上;同時利用免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了目的蛋白的表達(dá)情況,提取酵母細(xì)胞壁蛋白做western blot實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞壁中檢測到目的蛋白,而胞外產(chǎn)物中不含有目的蛋白,這再次驗(yàn)證了目的蛋白已被表達(dá)且定位在酵母細(xì)胞壁上,并未出現(xiàn)泄漏的情況,同時對照組的細(xì)胞壁蛋白及胞外產(chǎn)物中均未檢測到目的蛋白。以上驗(yàn)證成功的菌株經(jīng)過目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)后,給BALB/c鼠口服飼喂使用,飼喂時間分別為第1、3、5、7、9、11周,每周飼喂5天,然后定期收集小鼠血液樣本及糞便樣本,血樣樣本經(jīng)離心后獲得血清,糞便樣本處理成勻漿后離心獲得上清,采用ELISA的方法驗(yàn)證特異性抗體濃度,結(jié)果表明,血液樣本中的特異性抗體IgG,糞便樣本中的特異性抗體IgA隨著時間的延長逐漸增多,與對照組小鼠相比,實(shí)驗(yàn)組小鼠具有顯著性差異,證明可以有效引起體液免疫應(yīng)答及粘膜免疫應(yīng)答,這為HSV-1的疫苗研發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),有望用于單純皰疹病毒感染的預(yù)防,同時也可能為AD的干預(yù)打開一扇新的大門。
趙冠宇[3]（2019）在《表達(dá)高致病性豬藍(lán)耳病GP3、GP5基因DNA疫苗構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究》文中研究指明豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）引起豬繁殖與呼吸綜合征,其特征是易感豬生殖健康狀況變差,死亡率升高,特別是在幼齡動物和呼吸系統(tǒng)疾病中。它是世界范圍內(nèi)豬肉生產(chǎn)國的重要疾病,導(dǎo)致母豬繁殖失敗和仔豬呼吸道疾病,這會導(dǎo)致區(qū)域性疾病的發(fā)生和慢性經(jīng)濟(jì)損失。GP5蛋白分子量約為25kDa,含有中和抗原表位,通常認(rèn)為中和抗體的產(chǎn)生與它密切相關(guān)。GP3是分子量約為28kDa的高度糖基化結(jié)構(gòu)蛋白,通常認(rèn)為它對可能影響蛋白的中和活性。該病毒具有已知最高的RNA病毒突變率之一,是開發(fā)保護(hù)性疫苗的主要障礙,DNA疫苗在疫苗生產(chǎn)中顯示了較好的應(yīng)用前景,可引起宿主產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫的免疫應(yīng)答反應(yīng),以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。本試驗(yàn)以美洲型高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒GD株GP3、GP5基因?yàn)檠芯繉ο?以pVAX1為載體,構(gòu)建重組核酸疫苗質(zhì)粒pVAX-N35HP,并對構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將鑒定正確的核酸疫苗質(zhì)粒pVAX-N35HP與佐劑A1、A2、A3、A4、A8聯(lián)合使用,免疫分組為pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2、pVAX-N35HP+A3、pVAX-N35HP+A4和pVAX-N35HP+A8,對小鼠及健康仔豬的免疫效果進(jìn)行評價。實(shí)驗(yàn)期間小鼠每周采血分離血清,檢測中和性抗體、GP3和GP5抗體、IL-4及IFN-γ水平;處死后分離脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的檢測。結(jié)果表明,pVAX-N35HP+A3組中和性抗體滴度最高,達(dá)到1:16,與商品化滅活疫苗抗體滴度相同;pVAX-N35HP+A3組IL-4水平達(dá)到165.74 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組;IFN-γ水平達(dá)到342.67 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組;淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果顯示,pVAX-N35HP+A1組具有最高CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù),為24.37%,略低于商品化滅活疫苗組;pVAX-N35HP組具有最高CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù),達(dá)到45.21%,高于商品化滅活疫苗組T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。表明pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3可引起小鼠較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫,具有良好的免疫效果。選擇小鼠免疫效果較好的pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3免疫仔豬,進(jìn)行豬體免疫效果評價。免疫后仔豬每周前腔靜脈采血,分離血清進(jìn)行中和性抗體和細(xì)胞因子等檢測,35天時無菌分離外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞亞類鑒定,同時準(zhǔn)備攻毒保護(hù)試驗(yàn),攻毒毒株為PRRSV GD株,攻毒劑量2×105TCID50。攻毒后每天檢測仔豬直腸體溫,觀察仔豬健康狀態(tài),14天后剖殺豬只,采集心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)進(jìn)行病毒載量檢測,制作肺部組織病理切片。結(jié)果顯示,pVAX-N35HP+A1組和pVAX-N35HP+A3組具有最高的中和抗體滴度,達(dá)到1:18,低于商品化滅活疫苗組,但統(tǒng)計(jì)差異不顯著（p>0.05）;pVAX-N35HP+A1具有最高的IFN-γ水平,達(dá)到227.37 pg/μl,是pVAX-N35HP組1.22倍,但統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著（p>0.05）,高于商品化滅活疫苗組,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（p<0.05）;pVAX-N35HP+A3組IL-4水平最高,為136.77 pg/μl,高于商品化滅活疫苗組,且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著（p<0.01）;pVAX-N35HP+A1組CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為36.16%與商品化滅活疫苗組統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異（p>0.05）;pVAX-N35HP+A3組CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)達(dá)到62.37%,略高于商品化滅活疫苗組,統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異（p>0.05）;攻毒后每日觀察仔豬狀態(tài),各免疫組體溫及健康狀態(tài)均好于陰性對照組;攻毒后14天,檢測組織內(nèi)病毒載量,肺部檢測結(jié)果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為2.14×103 copies/g,低于商品化滅活疫苗組,pVAX-N35HP組、pVAX-N35HP+A2組和pVAX-N35HP+A3組高于商品化滅活疫苗組但處于相同數(shù)量級。頜下淋巴結(jié)檢測結(jié)果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為7.25×103 copies/g,低于商品化滅活疫苗組。腹股溝淋巴結(jié)檢測結(jié)果顯示pVAX-N35HP+A1組最低,為8.70×103 copies/g,低于商品化滅活疫苗組。肺部病理切片結(jié)果顯示各免疫組肺部結(jié)構(gòu)均好于陰性對照組。pVAX-N35HP+A3可顯著提高仔豬體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫水平,強(qiáng)毒攻擊時顯示良好的保護(hù)效果,可作為預(yù)防和保護(hù)仔豬免受高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的候選疫苗,為未來的疫苗研制提供參考。
李高[4]（2019）在《N端截短與修飾的β-淀粉樣蛋白的疫苗及抑制劑研究》文中研究表明β-淀粉樣蛋白（Aβ蛋白）在患者大腦內(nèi)的異常聚集和沉積被認(rèn)為是導(dǎo)致阿爾茨海默?。ˋD）的重要原因之一。淀粉樣沉積級聯(lián)假說認(rèn)為:Aβ蛋白聚集過程中形成的寡聚體和纖維等對神經(jīng)元有很強(qiáng)的毒性,會導(dǎo)致神經(jīng)元死亡,從而出現(xiàn)記憶力衰退等癥狀。在AD患者大腦內(nèi)存在各種不同長度、不同修飾類型的Aβ蛋白,而目前研究得比較廣泛和深入的是Aβ1-40和Aβ1-42,即全長無修飾的Aβ蛋白。研究者們針對這類Aβ開發(fā)了多種策略,希望能通過降低Aβ蛋白的含量或者抑制Aβ蛋白的聚集來實(shí)現(xiàn)對AD病理過程的緩解。遺憾的是,雖然上述策略在AD模型小鼠上取得了一定的效果,但目前這些策略在臨床上尚無正面有效的結(jié)果。一方面可能是Aβ蛋白對神經(jīng)元細(xì)胞的損傷已經(jīng)不可逆轉(zhuǎn),這提示我們需要開發(fā)預(yù)防性的策略。另一方面有研究表明患者大腦內(nèi)存在的N端截短或修飾的Aβ蛋白聚集更快、毒性更大,而之前的策略可能沒有靶向這些形式的Aβ蛋白。研究表明,3位焦谷氨酸化的Aβ蛋白(p EAβ3-X)可以誘導(dǎo)無修飾的Aβ蛋白形成毒性寡聚體,而針對無修飾Aβ蛋白N端的抗體無法結(jié)合p EAβ3-X。基于此,本論文設(shè)計(jì)合成了針對焦谷氨酸Aβ的疫苗,經(jīng)過對B表位和輔助T輔助細(xì)胞表位的篩選,得到了能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高抗體滴度的多肽疫苗p EAβ3-15-P2。對AD模型小鼠的預(yù)防性免疫結(jié)果表明,該疫苗可以很好緩解小鼠的認(rèn)知障礙癥狀并降低小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊沉積。目前除了抗體之外,尚無其他分子可以特異性的識別/區(qū)分N端截短與修飾的Aβ,這阻礙了對它們的功能研究。本論文通過等溫滴定量熱法、質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn),證明了葫蘆[7]脲和葫蘆[8]脲對N端截短的Aβ4-X有更強(qiáng)的結(jié)合(相比Aβ1-X)。進(jìn)一步的Th T聚集動力學(xué)、透射電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,葫蘆[7]脲和葫蘆[8]脲能更好的抑制Aβ4-40的聚集和毒性(相比Aβ1-40)。本論文利用化學(xué)動力學(xué)模擬研究了色氨酸-糖綴合物與中藥提取物分子的抑制機(jī)理,并通過聯(lián)合應(yīng)用這兩者實(shí)現(xiàn)了對Aβ蛋白聚集更強(qiáng)的抑制。這些結(jié)果為開發(fā)AD的治療策略提供了新的思路。
彭顏梅[5]（2018）在《基于藥用酶的自聚化Aβ表位疫苗制備及免疫藥理學(xué)研究》文中認(rèn)為疫苗是預(yù)防與治療人類重大疾病的重要策略,也是現(xiàn)代生物技術(shù)藥物的主要組成。抗原純度高、針對性強(qiáng)、副反應(yīng)少、制備簡單的表位疫苗已成為現(xiàn)代疫苗發(fā)展的主流方向。然而,表位分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、應(yīng)答機(jī)制單一的生物學(xué)性質(zhì)極大程度地限制了其免疫原性,并影響了該類疫苗的臨床開發(fā)與應(yīng)用。阿爾茨海默氏癥（Alzheimer disease,AD）是一種致死的神經(jīng)退行性疾病,其病理機(jī)制復(fù)雜,尚無法有效防治。近來,以β淀粉樣蛋白（Amyloid β,Aβ）為靶標(biāo)的免疫策略為AD的有效防治帶來了希望,基于A β功能B細(xì)胞表位（Aβ1-15）開發(fā)的表位疫苗和抗體藥物分布于臨床前和臨床研究的各個階段。研究揭示;如何在保證免疫安全性的基礎(chǔ)上有效提高表位多肽的免疫原性和保護(hù)功能仍是Aβ表位疫苗研發(fā)中急需解決的關(guān)鍵問題,也是表位疫苗開發(fā)的普遍需求。為此,本論文基于課題組前期工作基礎(chǔ),對以大腸桿菌左旋門冬酰胺酶Ⅱ（L-asparaginase B,AnsB）及通用型輔助 T 細(xì)胞表位（pan HLA-DR reactive epitope,PADRE）融合蛋白為載體設(shè)計(jì)和開發(fā)的新型Aβ表位疫苗進(jìn)行了表達(dá)制備和初步免疫藥理學(xué)研究。首先,論文對課題組前期設(shè)計(jì)并構(gòu)建的新型表位疫苗抗原蛋白AnsB-PADRE-A β 1-15（簡稱APA）重組表達(dá)工程菌進(jìn)行了復(fù)蘇、培養(yǎng)和表達(dá)載體鑒定;進(jìn)而,添加IPTG誘導(dǎo)抗原蛋白高效可溶性表達(dá),并通過生物酶消化、超聲波破碎、鹽析沉淀、親和柱層析和凝膠過濾等蛋白質(zhì)工程技術(shù)手段對抗原蛋白進(jìn)行了提取與分離純化制備;再次,采用SDS-PAGE電泳分離、BCA法、凝膠柱層析、酶聯(lián)免疫吸附檢測（Enzyme-linked immunosorhent assay,ELISA）和 Western-Blot 等技術(shù)方法對抗原蛋白的相對分子量、蛋白純度、含量、同源自聚形式、抗原性以及表位可及性進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定;在此基礎(chǔ)上,以野生型C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對象,通過對抗血清中A β特異性抗體水平、抗體親合力和IgG亞型等進(jìn)行測定評價,進(jìn)而比較性研究抗原蛋白與乳化佐劑（如弗氏佐劑）、顆粒性佐劑（如氫氧化鋁佐劑）和核酸佐劑（如CpG寡核苷酸佐劑）等不同佐劑形式的組合效能,并從中甄選出最適疫苗組合方式。最后,以B6/J-Tg（APPswe,PSENdE9）/Nju（簡稱APP/PSN）轉(zhuǎn)基因小鼠為AD病理模型,采用動物免疫、體液免疫檢測以及基于水迷宮（Morris water maze,MWM）的學(xué)習(xí)記憶評價,對新型疫苗的免疫藥理學(xué)效應(yīng)進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明:通過工程菌的培養(yǎng)與誘導(dǎo),論文實(shí)現(xiàn)了抗原蛋白在原核系統(tǒng)中的高效表達(dá),并且主要以可溶性形式表達(dá)于細(xì)菌胞質(zhì)中,利于抗原蛋白的正確折疊和純化制備;經(jīng)論文建立并優(yōu)化的蛋白質(zhì)純化工藝,獲得了純度大于95%的目的抗原蛋白,證實(shí)了抗原蛋白單亞基相對分子量約為42 kDa,表觀分子量約為164 kDa,并維持了融合表位A β 1-15的可及性和抗原性,揭示了抗原蛋白通過AnsB的自聚化過程形成了能夠四價呈現(xiàn)A β1-15表位的同源四聚體分子;進(jìn)一步基于野生型C57BL/6小鼠的體內(nèi)研究顯示制備獲得的抗原蛋白與不同類型佐劑配伍時表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答強(qiáng)度和機(jī)制,其中與弗氏佐劑的組合在免疫原性和體液免疫偏向性等方面具有顯著優(yōu)勢,能夠誘導(dǎo)具有Aβ神經(jīng)毒性中和作用和Aβ淀粉樣斑塊靶向識別的特異性體液免疫;在此基礎(chǔ)上,本論文將抗原蛋白與弗氏佐劑的優(yōu)化組合接種AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠APP/PSN,發(fā)現(xiàn)新型抗原在能夠內(nèi)源性表達(dá)Aβ的病理模型中表現(xiàn)出相對的免疫耐受,而具有神經(jīng)保護(hù)作用的中藥提取物TCME-1701能夠克服耐受,在病理模型中誘導(dǎo)更為強(qiáng)烈的Th2型抗A β體液免疫,減輕病理小鼠的腦內(nèi)淀粉樣沉積,并在一定程度上改善模型小鼠的認(rèn)知、學(xué)習(xí)及記憶能力?？傊?本論文在課題組前期工作基礎(chǔ)上,成功制備了以自聚化藥用酶AnsB和通用型輔助T細(xì)胞表位PADRE融合蛋白為載體的新型四價Aβ表位疫苗抗原蛋白,證明了該抗原蛋白能夠在野生型小鼠和AD轉(zhuǎn)基因模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生更為安全有效的Th2型抗Aβ特異性免疫應(yīng)答,體現(xiàn)出有效防治AD的潛力,并揭示了自聚化藥用酶AnsB和通用型輔助T細(xì)胞表位PADRE融合蛋白載體作為Th2型表位疫苗載體的可行性和實(shí)用性,為提升表位疫苗的免疫原性提供了一種新型的載體補(bǔ)充和技術(shù)方案,為AD的有效安全防治提供了一個候選抗原,并為基于相同免疫機(jī)制設(shè)計(jì)和開發(fā)的Aβ疫苗提供了一種潛在的輔助強(qiáng)化策略。
王文斌[6]（2011）在《阿爾茨海默病重組B細(xì)胞表位Aβ1-15融合抗原疫苗研究》文中研究說明阿爾茨海默病是一種神經(jīng)退行性疾病,其主要特征是記憶減退、認(rèn)知障礙。主要的病理表現(xiàn)包括細(xì)胞外淀粉樣蛋白的堆積形成老年斑,細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白的磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié),并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的失營養(yǎng)壞死。淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認(rèn)為,患者大腦內(nèi)堆積過多的Aβ42/Aβ40是導(dǎo)致阿爾茨海默病產(chǎn)生的主要原因。因此,以Aβ作為靶標(biāo)治療老年癡呆癥的各種主動免疫和被動免疫治療方法不斷涌現(xiàn)。本研究針對免疫治療阿爾茨海默病過程中出現(xiàn)的免疫原性和安全性問題,提出優(yōu)化的策略設(shè)計(jì)新型疫苗。采用人源Aβ42的B細(xì)胞表位Aβ1-15多拷貝串聯(lián)重復(fù)后,融合含有13aa的輔助T細(xì)胞表位PADRE構(gòu)建了重組融合基因Aβ（1-15）6-T,加入A型肉毒毒素Hc片段后構(gòu)建重組基因Aβ（1-15）6-T-AHc及Aβ（1-15）6-T-AHc-C。將以上基因分別克隆入原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體中,表達(dá)重組蛋白及構(gòu)建DNA表位疫苗。同時研究白細(xì)胞介素4及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF等細(xì)胞因子作為分子佐劑對于阿爾茨海默病DNA疫苗的免疫調(diào)節(jié)作用和免疫效果的影響。將重組融合基因克隆入原核表達(dá)載體pTIG-Trx中,優(yōu)化表達(dá)條件后實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的可溶性表達(dá),His親和純化后得到可用于下一步免疫實(shí)驗(yàn)的重組蛋白。其中,重組蛋白6Aβ及6Aβ-T經(jīng)過分子量測定和肽譜分析表明具有特殊的二聚體結(jié)構(gòu),其功能結(jié)構(gòu)尚需進(jìn)一步研究確定。將四種重組蛋白6Aβ,6Aβ-T,6Aβ-T-AHc-C及AHc-5Aβ-T聯(lián)合Al（OH）3佐劑免疫Balb/C小鼠,四次免疫后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了較高的抗Aβ42抗體,最高抗體滴度可以達(dá)到1:25000左右。添加了輔助T細(xì)胞表位和載體分子的重組蛋白免疫組抗體水平明顯提高。抗體亞型分析結(jié)果顯示,重組蛋白免疫后主要產(chǎn)生IgG1及IgG2b亞型抗體,表明免疫反應(yīng)主要是Th2型。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明重組蛋白免疫組未引起明顯的Th1型免疫炎癥反應(yīng)。免疫組脾細(xì)胞經(jīng)PADRE刺激后產(chǎn)生了大量IL-4細(xì)胞因子,表明疫苗主要引起了Th2型免疫應(yīng)答。研究表明,可溶性寡聚體的Aβ是大腦內(nèi)毒性Aβ的主要形式,Dot-blot結(jié)果顯示重組蛋白免疫后血清抗體特異性強(qiáng)結(jié)合Aβ寡聚體,弱結(jié)合單體,少或無結(jié)合纖維化狀態(tài)的Aβ,提示我們重組蛋白免疫后產(chǎn)生的抗體可能能夠特異性的清除或中和體內(nèi)的Aβ42寡聚體,在AD免疫治療中具有重大意義。重組蛋白6Aβ-T及6Aβ-T-AHc-C對轉(zhuǎn)基因PDAPP小鼠進(jìn)行免疫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,免疫組產(chǎn)生了針對Aβ42較高的抗體水平?？贵w亞型分析結(jié)果說明其主要引起的Th2型免疫反應(yīng)。細(xì)胞免疫水平測定結(jié)果與普通Balb/C小鼠相似,沒有引起明顯的針對Aβ42的淋巴細(xì)胞增殖。通過自發(fā)行為實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí),相比對照組,免疫組小鼠一定程度上提高了自主活動和空間學(xué)習(xí)記憶能力。免疫組化結(jié)果表明,重組蛋白免疫組小鼠大腦內(nèi)海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)的淀粉樣斑塊數(shù)量明顯減少,斑塊面積比例明顯降低。重組融合基因?qū)胝婧吮磉_(dá)載體pVAX1中,構(gòu)建DNA表位疫苗。DNA質(zhì)粒免疫Balb/C小鼠后產(chǎn)生了明顯的抗體反應(yīng),融合了全長AHc片段的DNA表位疫苗pVAX1-S-Aβ（1-15）6-T-AHc產(chǎn)生的抗體水平最高,可以達(dá)到1:6400左右?？贵w亞型分析其主要產(chǎn)生的是IgG1及IgG2b亞型抗體,表明免疫反應(yīng)以Th2型為主。Dot-blot結(jié)果說明,DNA疫苗免疫后的血清抗體主要與寡聚體Aβ結(jié)合,與單體結(jié)合較弱,很少結(jié)合纖維狀A(yù)β,提示這可能與我們設(shè)計(jì)的B細(xì)胞表位串聯(lián)重復(fù)基因有關(guān)。將IL-4及GM-CSF基因克隆入含有信號肽序列的真核表達(dá)載體pVAX1-S中,構(gòu)建分子佐劑載體pVAX1-S-IL-4和pVAX1-S-GM-CSF。與DNA表位疫苗共同免疫Balb/C小鼠。結(jié)果顯示,兩種分子佐劑對DNA疫苗免疫后的抗體水平都有一定提高作用,GM-CSF的作用效果更好,抗體滴度可以提高4倍左右?？贵w亞型結(jié)果分析也表明,聯(lián)合免疫組主要產(chǎn)生的是IgG1型抗體,說明分子佐劑的加入并未改變DNA疫苗的免疫應(yīng)答途徑。GM-CSF分子佐劑對于提高重組阿爾茨海默病DNA表位疫苗的效果具有一定作用,能夠提高DNA表位疫苗的免疫原性?？偨Y(jié)以上結(jié)果,我們設(shè)計(jì)了Aβ1-15重組融合基因,獲得四種重組融合蛋白,其中兩種融合了輔助T細(xì)胞表位和載體分子的重組蛋白免疫Balb/C小鼠和PDAPP小鼠后證明其具有良好的免疫原性。免疫反應(yīng)偏向于Th2型,沒有出現(xiàn)明顯的針對Aβ的Th1型免疫應(yīng)答。重組蛋白6Aβ-T和6Aβ-T-AHc-C能夠明顯減少轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)的淀粉樣斑塊含量以及改善自主活動和空間記憶能力,表明其可用于AD的免疫預(yù)防研究,具有十分重要的研究意義和應(yīng)用前景。另外,我們設(shè)計(jì)的DNA疫苗具有良好的免疫原性,細(xì)胞因子類分子佐劑可以提高AD DNA表位疫苗的免疫效果。
陳鰲[7]（2011）在《破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位疫苗研究》文中認(rèn)為阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）作為一種中樞退行性疾病,是老年癡呆的最主要形式。依據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,世界上大約有2700萬人口受到該病的影響。目前,淀粉樣蛋白級聯(lián)假說（Amyloid Cascade Hypothesis）是一種主流的關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的推測。該假說認(rèn)為患者腦內(nèi)堆積過多的p淀粉樣多肽是造成AD的最根本原因。1999年,Schenk等首先開展了以Aβ為靶點(diǎn)的AD主動免疫治療研究,將人纖維化的Aβ1-42（簡稱Aβ42）多肽聯(lián)合弗氏佐劑免疫APP轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2576后,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對Aβ42的抗體,減少了大腦內(nèi)的淀粉樣斑塊,改善了認(rèn)知能力。隨后,動物模型上的其他相關(guān)研究表明AD的主動免疫治療策略是有效的,但之后的AN-1792臨床試驗(yàn)結(jié)果表明Aβ42中存在的2個T細(xì)胞表位（17-21,29-42）誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞免疫反應(yīng)使得受試者出現(xiàn)了急性腦膜炎癥狀。目前關(guān)于AD主動免疫的研究更傾向于使用Aβ42的B細(xì)胞表位（1-15）并去除有害的T細(xì)胞表位,既讓疫苗達(dá)到促進(jìn)抗體生成的目的,又從根本上避免之前臨床試驗(yàn)所產(chǎn)生的不良反應(yīng)。因此,我們在此理論基礎(chǔ)上進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位重組亞單位疫苗和核酸疫苗的研究工作。首先進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位重組亞單位疫苗的研究,設(shè)計(jì)了3種融合多個Aβ1-15（簡稱Aβ15）串聯(lián)基因、PADRE基因和破傷風(fēng)毒素重鏈C端（簡稱TTC）基因的重組蛋白原核表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)了重組融合蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)并成功地純化得到了電泳級純度的重組蛋白。然后將純化獲得的重組蛋白免疫普通Balb/C小鼠,測定的抗Aβ特異性抗體水平結(jié)果顯示重組蛋白免疫動物后能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的Aβ特異性抗體,并且通過血清抗體的亞型分析和脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明產(chǎn)生的抗Aβ抗體傾向于與Aβ寡聚體結(jié)合,與纖維狀A(yù)β結(jié)合能力較弱。進(jìn)一步將其中一種重組蛋白免疫APP轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白在模型小鼠中仍然具有良好的免疫原性,免疫特性與普通Balb/C小鼠相似。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評價結(jié)果顯示免疫后小鼠認(rèn)知能力得到了一定改善。小鼠大腦組織免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫組小鼠Aβ斑塊明顯減少。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示重組蛋白作為預(yù)防或治療AD的候選亞單位疫苗具有良好的應(yīng)用前景。在重組蛋白亞單位疫苗研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位核酸疫苗的研究。設(shè)計(jì)了2種融合6個Aβ1-15串聯(lián)基因、PADRE基因和破傷風(fēng)毒素重鏈C端基因的DNA真核表達(dá)載體作為DNA疫苗。經(jīng)IFA檢測表明得到的2種真核表達(dá)載體均能使Aβ15和TTC基因在真核細(xì)胞中得到有效地表達(dá)。DNA疫苗免疫普通小鼠誘導(dǎo)生成了較高水平的抗Aβ抗體,并且免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然提示設(shè)計(jì)的DNA疫苗產(chǎn)生的抗體傾向與Aβ可溶性寡聚體結(jié)合。DNA疫苗免疫APP轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠后,也產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng),并且免疫組小鼠大腦組織內(nèi)的Aβ斑塊明顯少于未免疫組小鼠,提示該DNA疫苗可能擁有較好的免疫預(yù)防效果,可作為AD疫苗的一種新發(fā)展方向。綜上,本研究設(shè)計(jì)和制備了3種重組蛋白亞單位疫苗和2種重組核酸疫苗,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各疫苗在普通Balb/C小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的針對Aβ42的特異性抗體,并且有效地避免了Th1型免疫反應(yīng),免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)表明產(chǎn)生的抗體傾向于與Aβ寡聚體結(jié)合,提示抗體可能針對毒性較大的Aβ寡聚體擁有更好的清除或中和能力,這一免疫特性對疫苗的下一步深入研究具有重要意義。疫苗免疫AD轉(zhuǎn)基因小鼠以后,產(chǎn)生了同普通Balb/C小鼠的相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч?并且小鼠認(rèn)知能力得到了改善,腦組織內(nèi)的Aβ斑塊明顯少于未免疫組轉(zhuǎn)基因小鼠。本研究首次證實(shí)了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)阿爾茨海默病B細(xì)胞表位疫苗能夠提高其免疫原性反應(yīng)的可行性。以上結(jié)果表明本研究設(shè)計(jì)和制備的這種新型重組Aβ15表位疫苗擁有良好的免疫效果,具備了新型AD疫苗的發(fā)展方向,具有良好的應(yīng)用前景。
趙臣勇[8]（2011）在《核酸疫苗預(yù)防接種對急性帕金森病小鼠黑質(zhì)炎癥反應(yīng)的影響》文中研究表明目的1.探討小鼠在遭受急性神經(jīng)毒素?fù)p害時,預(yù)防接種優(yōu)化hα-syn核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B對小鼠中腦黑質(zhì)部多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用。2.觀察小鼠在遭受急性神經(jīng)毒素?fù)p害時,預(yù)防接種優(yōu)化hα-syn核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B對多巴胺能神經(jīng)元COX-2和iNOS表達(dá)的影響。方法用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒大量抽提質(zhì)粒和空載體,制備hα-syn核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B質(zhì)粒、pVAX1空載體。在C57BL小鼠雙側(cè)后肢脛骨前肌同一部位、同一深度地分別預(yù)防注射pVAX1-IL-4/SYN-B質(zhì)粒（優(yōu)化核酸疫苗組）、pVAX1空載體（空載體組）或PBS（PBS組）各50μl,共3次。末次注射2周后,各組小鼠均經(jīng)腹腔注射MPTP（20mg/kg）,間隔2h注射1次,共4次。在免疫接種與模型制備過程中,觀察小鼠行為學(xué)變化,評價模型是否制備成功。于末次MPTP注射后1、3、7d處死小鼠（n=6）。采用HE染色法和DAB免疫組織化學(xué)法觀察黑質(zhì)部多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)的改變和COX-2、CD11b、iNOS陽性神經(jīng)元數(shù)目的表達(dá)情況;采用RT-PCR法檢測不同時間點(diǎn)小鼠中腦黑質(zhì)COX-2和iNOS的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果1.行為學(xué)觀察結(jié)果:在免疫接種過程中,各組小鼠于預(yù)防注射pVAX1-IL-4/SYN-B質(zhì)粒、pVAX1空載體和PBS前后其行為學(xué)均無明顯變化。在模型制備過程中,優(yōu)化核酸疫苗組第1次注射MPTP 1030 min后,小鼠均出現(xiàn)震顫抖動、少動、豎毛、蜷縮、分泌物明顯增多、煩躁等癥狀。第2次注射后,癥狀加重,并且易激惹。第3次注射后癥狀進(jìn)一步加重。第4次注射10min后,出現(xiàn)尾巴成弓形隆起、僵硬、細(xì)顫、活動變慢、前后肢運(yùn)動協(xié)調(diào)性差等類PD樣癥狀。空載體組和PBS組于每次注射MPTP后也出現(xiàn)上述類似癥狀,各組行為學(xué)表現(xiàn)均符合急性PD小鼠模型標(biāo)準(zhǔn)。2.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果:HE染色法染色后,優(yōu)化核酸疫苗組與空載體組和PBS組相比,黑質(zhì)部殘存神經(jīng)元數(shù)目較多,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活較輕。3. SP免疫組化法結(jié)果顯示:與空載體組和PBS組相比,優(yōu)化核酸疫苗組小鼠中腦黑質(zhì)部TH陽性神經(jīng)元平均積分光密度值MOD較大（0.39±0.10）TH陽性細(xì)胞染色較深,有顯著差異性（p<0.05）;CD11b、COX-2和iNOS陽性神經(jīng)元數(shù)目相對較少,平均積分光密度值MOD較小,陽性細(xì)胞染色較淺,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。后兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。4. RT-PCR結(jié)果顯示:在MPTP末次注射后1、3、7d,COX-2在各組均有表達(dá),1d表達(dá)量微弱,3d表達(dá)量達(dá)高峰,7d各組表達(dá)均降低。同一時間點(diǎn),優(yōu)化核酸疫苗組與空載體組和PBS組相比顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）,;iNOS在各組也均有表達(dá),且在1d時表達(dá)最高,隨著時間的推移,表達(dá)量依次降低。同一時間點(diǎn),優(yōu)化核酸疫苗組與空載體組和PBS組相比有所降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。后兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論1.優(yōu)化核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B具有較好的免疫原性,誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能對抗MPTP神經(jīng)毒素的腦損害;在預(yù)防接種小鼠后產(chǎn)生的免疫效果對多巴胺能神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用。2.優(yōu)化核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B具有較好的對抗炎癥因子表達(dá)作用,能夠在一定程度上保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免于炎癥反應(yīng)對其所造成的損害。
王法祥[9]（2009）在《優(yōu)化人α-突觸核蛋白核酸疫苗免疫M(jìn)PTP帕金森病小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究》文中研究表明研究背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是第二個最常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病, 65歲以上人口中的患病率超過1%以上。關(guān)注占全國人口10%的60歲以上老年人的健康是個不容忽視的問題。帕金森病的主要病理性標(biāo)志物是黑質(zhì)區(qū)出現(xiàn)異常聚集的α-突觸核蛋白（alpha-synuclein,α-syn）為主要成分的Lewy小體。α-syn異常聚集參與了PD多巴胺能神經(jīng)元的變性過程。在家族性和散發(fā)性PD的發(fā)病機(jī)制中,α-syn的異常聚集起到了重要的作用。帕金森病目前尚無根本治療方法,針對α-syn的疫苗是治療PD的新方法。近年來,核酸疫苗在退行性病變的防治中顯示出誘人的前景。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了人α-syn（hα-syn）核酸疫苗,并在哺乳動物體內(nèi)表達(dá),觀察到hα-syn核酸疫苗治療MPTP慢性帕金森病模型小鼠取得了較好的療效。為了提高核酸疫苗的免疫效果,并對核酸疫苗的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行探討,我們欲對該疫苗作進(jìn)一步的優(yōu)化,以期為帕金森病的臨床防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。α-syn由大量無序的異構(gòu)體組成,呈現(xiàn)為非緊密的混合體。自然狀態(tài)下,α-syn是一種富含疏水區(qū)域的天然伸展的蛋白質(zhì)。其氨基端（160）包含四個不完全重復(fù)序列,易形成兩性螺旋。NAC區(qū)（6195）為中心區(qū),是α-syn序列中疏水性最強(qiáng)的一段。羧基端（96140）富含酸性氨基酸,如脯氨酸,帶有大量負(fù)電荷,與正常狀態(tài)下α-syn保持無規(guī)則卷曲狀態(tài)有關(guān)。a-syn蛋白中的這三種結(jié)構(gòu)域是否具有不同的免疫效價?對疫苗的神經(jīng)免疫防護(hù)效果是否有不同的影響?因此對α-syn蛋白結(jié)構(gòu)和功能的了解,會對核酸疫苗的優(yōu)化構(gòu)建,以及疫苗的免疫效果造成重要的影響。我們初期研究中,盡管發(fā)現(xiàn)核酸疫苗免疫治療MPTP慢性帕金森病模型小鼠取得了一定的效果。但是,由于α-syn分子量僅14kD,只有140個氨基酸殘基組成的小分子蛋白質(zhì)。因α-syn分子量小,免疫活性弱,需要較大劑量才能誘導(dǎo)足夠的免疫效應(yīng)。Ig Kappa鏈信號肽（Ig ksp）可使細(xì)胞內(nèi)hα-syn向細(xì)胞外移動,增加hα-syn的分泌能力,必將會有助于抗體效價的提高,促使更多的異常聚集的α-syn蛋白被降解和清除。因此,在hα-syn基礎(chǔ)之上增加小鼠Ig ksp基因序列,構(gòu)建高效分泌型hα-syn真核表達(dá)載體,增強(qiáng)免疫治療效果,提升疫苗的安全性,成為了我們深入研究的重點(diǎn)內(nèi)容。異常聚集的α-syn可以通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)和溶酶體途徑降解和清除。在PD發(fā)病中,α-syn的降解通路受損可引起α-syn的異常聚集,形成Lewy小體。若使用蛋白酶體抑制劑抑制酶的活性,可產(chǎn)生劑量依賴性選擇性多巴胺（Dopamine,DA）神經(jīng)元死亡。在清除α-syn的積聚和降解過程中,溶酶體也發(fā)揮了重要作用。對于α-syn寡聚體介導(dǎo)的毒性,溶酶體降解通路是一個重要的保護(hù)機(jī)制。Masliah等發(fā)現(xiàn),使用重組hα-syn接種hα-syn轉(zhuǎn)基因小鼠,產(chǎn)生的抗體可通過溶酶體途徑清除α-syn,減少α-syn在DA能神經(jīng)元胞體和突觸的聚集。優(yōu)化構(gòu)建的hα-syn核酸疫苗是否也可通過增加異常聚集的α-syn降解清除來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用?抗原與抗體結(jié)合后,是否必定要通過溶酶體或/和蛋白酶體途徑代謝分解?它們的分解代謝特點(diǎn)是什么?需要作進(jìn)一步的研究。免疫炎癥反應(yīng)與PD的發(fā)病機(jī)理有著密切的關(guān)系,帕金森病可以說是一個動態(tài)的炎癥變化過程。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia,MI）被激活,大量增殖是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病炎癥反應(yīng)的一個最重要表現(xiàn)。黑質(zhì)內(nèi)MI被激活,特別是吞噬了異常聚集的α-syn之后可被持續(xù)激活,引起DA能神經(jīng)元變性,導(dǎo)致帕金森病發(fā)生。MI被激活、增殖,可產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子,如α-腫瘤壞死因子、活性氧簇、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6等。炎癥細(xì)胞因子反過來又可加劇MI的激活,共同參與腦局部炎癥過程。因此在PD的病理生理過程中,炎癥發(fā)揮了重要作用。優(yōu)化核酸疫苗對神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用,那么核酸疫苗對PD病理過程中的炎癥反應(yīng)會產(chǎn)生哪些影響?在優(yōu)化核酸疫苗免疫治療過程中,對MI活性和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)情況如何?對這些問題的深入了解,將有助于我們對核酸疫苗的治療作用和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的理解。研究目的根據(jù)α-syn結(jié)構(gòu)中折疊的特點(diǎn),構(gòu)建三種高分泌表達(dá)型hα-syn蛋白的優(yōu)化核酸疫苗;通過接種MPTP慢性PD模型小鼠,觀察核酸疫苗的防治效果和神經(jīng)保護(hù)作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容包括:①將擴(kuò)增出的人α-syn（1-140）基因、α-syn（84-140）基因、α-syn（34-140）基因與Ig ksp基因克隆到質(zhì)粒pVAX1上,優(yōu)化構(gòu)建成三種重組質(zhì)粒。在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)并鑒定其生物學(xué)活性;②觀察三組疫苗誘導(dǎo)體液免疫的效果、不同特點(diǎn)和免疫特異性;③大量制備三種優(yōu)化核酸疫苗接種PD小鼠模型,觀察三種疫苗的神經(jīng)保護(hù)作用以及對溶酶體功能的影響,炎癥反應(yīng)的影響和調(diào)控等;④將微量溶酶體抑制劑與蛋白酶體抑制劑,通過腦立體定向技術(shù)注射中腦黑質(zhì)區(qū)以阻斷α-syn的降解通路,觀察溶酶體抑制劑不同劑量、不同時間段對DA神經(jīng)元功能的影響和小鼠行為學(xué)改變特點(diǎn);⑤溶酶體和蛋白酶體通路阻滯對核酸疫苗免疫保護(hù)作用的影響,運(yùn)用免疫組化等技術(shù),了解hα-syn核酸疫苗誘導(dǎo)特異性神經(jīng)保護(hù)性免疫所產(chǎn)生的抗體,降解清除過表達(dá)α-syn,阻抑PD的病理進(jìn)程的機(jī)制。方法1.三種重組質(zhì)粒的優(yōu)化構(gòu)建和表達(dá)從重組質(zhì)粒中擴(kuò)增人α-syn1-140、84-140、34-140基因,根據(jù)已知序列合成Ig ksp基因;將上述融合基因序列克隆到質(zhì)粒pVAX1上,構(gòu)建成三組重組質(zhì)粒:A組（pVAX1-Igk-hαS1-140）重組質(zhì)粒;B組pVAX1-Igk-hαS84-140)重組質(zhì)粒;C組pVAX1-Igk-hαS34-140)重組質(zhì)粒。進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA測序鑒定。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,抽提質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,用Western Blot法檢測其生物學(xué)活性。2.重組質(zhì)粒對體液免疫的誘導(dǎo)分別用A、B、C三種優(yōu)化核酸疫苗、空質(zhì)粒pVAX1免疫正常的C57/BL小鼠。采用股四頭肌肉注射,100μg/只/次,每三周加強(qiáng)免疫一次,共免疫5次。在每次免疫后二周各采血一次,分離血清用于抗體測定。并用免疫后的小鼠血清和能表達(dá)α-syn的小鼠腦組織行免疫組化反應(yīng)及中和反應(yīng),觀察免疫血清抗體的特異性。3.觀察優(yōu)化核酸疫苗免疫防治的神經(jīng)保護(hù)作用正常C57/BL小鼠注射MPTP 25mg/kg·d,每周2次,共10次,建立MPTP慢性PD小鼠動物模型。建模成功后分別接種三種優(yōu)化核酸疫苗。觀察免疫治療小鼠模型行為學(xué)改變特點(diǎn),DA細(xì)胞酪氨酸羥化酶（TH）和α-syn蛋白表達(dá)水平;并且檢測免疫保護(hù)作用后的炎性反應(yīng),以及了解對溶酶體組織蛋白酶D （Cathepsin D,Cath D）活性的影響。4.觀察溶酶體和蛋白酶體抑制劑對正常小鼠DA神經(jīng)元作用特點(diǎn)于小鼠右側(cè)中腦黑質(zhì)（SN）區(qū),分別立體定向微量注射不同劑量溶酶體抑制劑磷酸氯喹溶劑,或者蛋白酶體抑制劑。觀察阿樸嗎啡（apomorphine,APO）誘導(dǎo)的小鼠旋轉(zhuǎn)行為改變以及行為學(xué)變化;于溶酶體抑制劑注射后不同時間段,檢測小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)、α-syn和Cath D表達(dá)水平。5.探討溶酶體和蛋白酶體通道阻滯后,核酸疫苗對α-syn降解和清除的影響同上方法建立慢性模型成功后接種優(yōu)化核酸疫苗pVAX1-Igk-hαS1-140,共3次。于第三次接種的前三天,小鼠右側(cè)SN區(qū),分別立體定向微量注射溶酶體抑制劑或蛋白酶體抑制劑。檢測通道阻滯后,小鼠SN區(qū)TH和細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化,了解對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果1.重組質(zhì)粒pVAX1-Igk-hαS1-140、pVAX1-Igk-hαS84-140、pVAX1-Igk-hαS34-140的成功優(yōu)化構(gòu)建和表達(dá)成功擴(kuò)增了hα-syn1-140、84-140、34-140基因,并合成了Ig ksp基因。分別將兩者的融合基因克隆到表達(dá)載體pVAX1上,經(jīng)酶切分析和DNA測序證明三組重組質(zhì)粒的大小、方向和序列完全正確,成功構(gòu)建了三種重組質(zhì)粒。經(jīng)Western blot檢測具有較好的生物學(xué)活性。2.重組質(zhì)粒誘導(dǎo)的體液免疫大量制備A、B、C三種重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pVAX1。重組質(zhì)粒免疫動物后產(chǎn)生了較高的抗體滴度,pVAX1-Igk-hαS1-140為（3.76±0.33）×103、pVAX1-Igk-hαS84-140為（3.87±0.12）×103、pVAX1-Igk-hαS34-140為（3.79±.022）×103,三組之間差異沒有顯著性意義（p>0.05）,與空質(zhì)粒pVAX1（0.09±0.01）×103組相比,差異有顯著意義（p<0.05）。重組質(zhì)粒免疫小鼠的血清能與α-syn過表達(dá)小鼠的腦組織發(fā)生特異性免疫組化反應(yīng),被α-syn蛋白中和的血清則不發(fā)生反應(yīng)。3.核酸疫苗免疫保護(hù)作用的觀察與空質(zhì)粒pVAX1組比較,三種優(yōu)化核酸疫苗均可以提高小鼠的爬桿能力,提高TH細(xì)胞數(shù)目達(dá)60-65%,減少α-syn表達(dá)量44-47%,增加Cath D表達(dá)量46-50%,差異均有顯著性（P<0.05）,但三組疫苗之間上述檢測指標(biāo)差異沒有顯著性（P>0.O5）。三組核酸疫苗與PBS對照組相比,TNF-α表達(dá)量減少27-55%（P<0.05）。B組、C組與A組相比,差異亦有有顯著性（p<0.05）,顯示B組、C組安全性更高。4.溶酶體和蛋白酶體抑制劑對正常小鼠多巴胺神經(jīng)元的作用特點(diǎn)①溶酶體抑制劑只有在400μmol/L濃度時才可出現(xiàn)較明顯的由藥物誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為,7-8次/分。而蛋白酶體抑制劑組小鼠清醒后即出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)行為,甚至不需要藥物就可自發(fā)出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)癥狀;②毀損側(cè)與黑質(zhì)區(qū)內(nèi)TH陽性細(xì)胞數(shù)目正常相比有明顯的不同程度減少。腦立體定向注射后的第三周內(nèi)可以觀察到,隨著溶酶體劑量25μmol/L400μmol/L增加,DA神經(jīng)元的損害程度呈正比例上升。從溶酶體100μmol/L立體定向注射一周到四周可以觀察到,多巴胺的數(shù)量隨時間逐漸恢復(fù)。③毀損側(cè)與正常黑質(zhì)區(qū)比較,Cath D陽性細(xì)胞數(shù)目存在不同程度的明顯減少。注射溶酶體25μmol/L400μmol/L的第三周內(nèi),Cath D陽性數(shù)量隨劑量的增加而明顯減少,同時TH損害程度也增加。而且Cath D陽性細(xì)胞數(shù)與TH陽性細(xì)胞數(shù)成正比,Cath D陽性表達(dá)量與TH損害程度呈正比例關(guān)系。5.α-syn降解通道阻滯后,核酸疫苗的作用特點(diǎn)當(dāng)α-syn降解通道阻滯后,與未注射側(cè)相比,溶酶體抑制劑損害較輕,蛋白酶體抑制劑損害略重,溶酶體加蛋白酶體抑制劑相對損害較重,但是在注射局部仍然有TH陽性數(shù)目的表達(dá)。TH與Hoechst熒光染色顯示,抑制劑組小鼠腦黑質(zhì)部位有大量陽性細(xì)胞核固縮呈不規(guī)則形,核碎裂,部分裂解為多個凋亡小體。各組小鼠中腦黑質(zhì)核形態(tài)中可以看出,與未注射側(cè)的核形態(tài),PBS組與它沒有明顯區(qū)別。與未注射側(cè)相比,溶酶體抑制劑損害較輕,蛋白酶體抑制劑損害略重,溶酶體加蛋白酶體抑制劑相對損害較重。結(jié)論1.成功優(yōu)化構(gòu)建了三組真核表達(dá)質(zhì)粒并具有較好的生物學(xué)活性。2.三組核酸疫苗免疫小鼠均產(chǎn)生了較高的抗體滴度,并且具有抗α-syn特異性。3.三組核酸疫苗免疫均可減少慢性PD小鼠模型腦內(nèi)異常聚積的α-syn表達(dá),改善溶酶體的功能,阻擾MI激活所致前炎癥因子的釋放,從而減輕神經(jīng)毒素對神經(jīng)細(xì)胞的損害作用。并且pVAX1-Igk-hαS84-140與pVAX1-Igk-hαS34-140核酸疫苗可能具有更安全的免疫效果。4.溶酶體和蛋白酶體抑制劑對正常小鼠DA神經(jīng)元有損害作用,但兩種抑制劑的損害具有不同的作用特點(diǎn)。溶酶體抑制劑對DA神經(jīng)元的損害具有劑量和時間依賴性。DA神經(jīng)元損害程度與Cath D的活性呈正相關(guān)。單側(cè)溶酶體抑制劑損傷小鼠,注射APO可以誘導(dǎo)出旋轉(zhuǎn)行為,但是沒有蛋白酶體明顯。5.核酸疫苗可能通過其它的降解清除途徑,具有一定的拮抗溶酶抑制劑和蛋白酶體抑制劑對多巴胺神經(jīng)元損害的作用,可減少細(xì)胞凋亡,對神經(jīng)元起到保護(hù)作用。
何穎[10]（2008）在《核酸疫苗免疫機(jī)制的研究》文中研究指明DNA疫苗又稱核酸疫苗、基因疫苗,是近年來隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型疫苗。由于DNA疫苗本身既有類似減毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn),又有滅活疫苗或亞單位疫苗的安全性,不僅具有預(yù)防疾病的作用,同時還具有治療疾病的作用。所以治療性核酸疫苗成為近些年研究的重點(diǎn),并迅速地從治療傳染性疾病的研究擴(kuò)展到非傳染性疾病的研究。感染疾病預(yù)防性和腫瘤治療性DNA疫苗的研究發(fā)展很快,而且有相當(dāng)數(shù)量的臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行。盡管DNA疫苗得到了快速而廣泛的發(fā)展,但其總的免疫效果還不盡如人意。有的DNA疫苗在小動物實(shí)驗(yàn)中免疫效果很好,在大動物實(shí)驗(yàn)中效果欠佳;有的DNA疫苗在動物實(shí)驗(yàn)中能起到很好的免疫保護(hù)作用,但在臨床試驗(yàn)中卻不能保護(hù)受試者抵抗病原體的攻擊。為了能解決DNA疫苗應(yīng)用中的這些問題,新的用于增強(qiáng)DNA疫苗的研究策略層出不窮,但任何策略都是建立在對疫苗作用機(jī)制深刻認(rèn)識的基礎(chǔ)上,而關(guān)于DNA疫苗的免疫機(jī)制目前尚不十分清楚。為了深入研究DNA疫苗的免疫機(jī)制,我們選擇了兩種疾病展開研究,一種是阿爾茨海默氏?。ˋD）,另一種是乙肝病毒（HBV）相關(guān)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）。阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease,AD）是一種神經(jīng)元退行性變疾病,是引起老年期癡呆最主要的原因。眾所周知β淀粉樣蛋白（Aβ）在腦內(nèi)沉積形成的老年斑（senile plaque,SP）是引起AD發(fā)病最主要的因素,減少Aβ淀粉樣蛋白沉積的形成,是預(yù)防和治療AD的一種新措施。繼Schenk等人成功的用Aβ疫苗對PDAPP小鼠進(jìn)行免疫治療之后,一些動物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)該疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生有效治療濃度的抗Aβ抗體,使Aβ沉淀減少,并改善動物的認(rèn)知行為學(xué)表現(xiàn)。但在臨床Ⅱ期試驗(yàn)中出現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和卒中,這些不良反應(yīng)促使人們對Aβ疫苗的應(yīng)用和機(jī)制更深入地去研究。也使我們研制具有Aβ免疫原性而又不具有其毒副作用的AβDNA疫苗勢在必行。我們前期工作中采用Aβ表位疫苗和Aβ全長DNA疫苗免疫小鼠,不與任何佐劑聯(lián)用時,Aβ全長DNA疫苗與其中一組Aβ表位疫苗能誘發(fā)有效的體液免疫,但抗體滴度不理想。考慮到DNA疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度與基因表達(dá)效率（即每個被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)抗原基因的表達(dá)量）呈正相關(guān),可以嘗試通過改變胞內(nèi)定位,使之分泌到胞外來改變目的蛋白的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)選用了TPA信號肽序列與Aβ42融合表達(dá),體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,含有TPA信號肽序列與Aβ42融合基因的DNA疫苗組所誘發(fā)的特異性抗Aβ抗體滴度高于僅含Aβ42全長基因DNA疫苗組。在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Aβ/GFP和TPA-Aβ/GFP融合蛋白,發(fā)現(xiàn)TPA-Aβ在細(xì)胞質(zhì)和胞核中均勻表達(dá)并于72h少量集中分布于細(xì)胞膜上,提示我們目的蛋白正處于分泌表達(dá)狀態(tài)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在融合基因TPA-Aβ/GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)存在目的蛋白。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們,利用TPA信號肽成功地將Aβ引導(dǎo)穿過細(xì)胞膜,達(dá)到分泌表達(dá),從而增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞的攝取,提高機(jī)體免疫系統(tǒng)免疫活性,產(chǎn)生較高滴度的抗體水平。為我們下一步改造Aβ表位疫苗,使之具有更強(qiáng)的免疫原性,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫,進(jìn)一步探討利用DNA疫苗主動免疫清除老年斑的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染和原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）相關(guān)率高達(dá)80%,HBV感染者發(fā)生HCC的危險性是無感染者的200余倍。HBV是HCC的重要誘因這一結(jié)論已被科學(xué)界廣泛接受,但其具體機(jī)制尚不明確。近年來,隨著對HBx生物學(xué)功能研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)HBx在此過程中發(fā)揮了重要作用。X基因是HBV基因組最小的開放讀碼框,它編碼的X蛋白含154個氨基酸,分子量約為16.5 kD。HBx是一種多功能的病毒調(diào)節(jié)因子,大量研究資料顯示HBx參與基因轉(zhuǎn)錄,DNA修復(fù),活化多種信號傳導(dǎo)通路。這些效應(yīng)以及它們在細(xì)胞凋亡和增殖中綜合作用的結(jié)果,可以初步解釋HBV導(dǎo)致HCC的機(jī)制。但HBx促癌變的確切機(jī)制至今尚未闡明,可能通過多種途徑起作用,十分復(fù)雜,一些研究結(jié)果又互相矛盾,因此,有必要對其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究,在此基礎(chǔ)上才有可能構(gòu)建相應(yīng)的治療性DNA疫苗防治這種與病毒相關(guān)的腫瘤。X蛋白不能同雙鏈DNA直接結(jié)合,而是通過細(xì)胞內(nèi)蛋白間的相互作用啟動一系列磷酸化和去磷酸化過程,從而上調(diào)眾多基因的表達(dá)。為了尋找并鑒定X蛋白直接或間接作用的蛋白,進(jìn)一步闡明其機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)以成人肝癌細(xì)胞HepG2為研究對象,將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-X瞬時轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中,利用蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)尋找并鑒定了實(shí)驗(yàn)組和對照組的8個差異表達(dá)蛋白。其中,上調(diào)表達(dá)的蛋白STRAP、nm23-H1和下調(diào)表達(dá)蛋白PIMT與PI3K信號通路相關(guān)。通過我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBx下調(diào)PIMT表達(dá)是通過上調(diào)STRAP、nm23-H1激活PI3K信號通路實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果為我們進(jìn)一步了解受HBx影響的紛繁復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)提供一定的幫助,而HBx介導(dǎo)的PIMT低水平表達(dá)將為闡明HCC發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制提供線索,并為進(jìn)一步治療HCC提供靶點(diǎn)。
二、阿爾茨海默病核酸疫苗的構(gòu)建及誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的初步研究（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會科學(xué)用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、阿爾茨海默病核酸疫苗的構(gòu)建及誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的初步研究（論文提綱范文）
（1）偽狂犬病病毒的基因工程疫苗構(gòu)建及其感染PK-15細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 縮略語表 |
| 1 引言 |
| 1.1 偽狂犬病病毒概述 |
| 1.2 病原學(xué)研究 |
| 1.2.1 分子結(jié)構(gòu) |
| 1.2.2 基因組特征 |
| 1.2.3 主要蛋白功能 |
| 1.2.4 遺傳變異分析 |
| 1.3 診斷技術(shù)研究 |
| 1.3.1 病原學(xué)診斷 |
| 1.3.2 血清學(xué)診斷 |
| 1.4 新型疫苗研究 |
| 1.4.1 基因缺失疫苗 |
| 1.4.2 重組載體疫苗 |
| 1.4.3 亞單位疫苗 |
| 1.4.4 核酸疫苗 |
| 1.5 生物信息學(xué)研究 |
| 1.6 本研究的目的意義 |
| 1.7 技術(shù)路線 |
| 2 豬源PRV SD-2017 株的分離鑒定及其遺傳變異分析 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.1.2 試驗(yàn)儀器 |
| 2.1.3 試驗(yàn)方法 |
| 2.1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) |
| 2.1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.1.3.3 基因組DNA提取及目的基因擴(kuò)增 |
| 2.1.3.4 病毒分離培養(yǎng) |
| 2.1.3.5 病毒傳代純化 |
| 2.1.3.6 病毒形態(tài)觀察 |
| 2.1.3.7 病毒滴度測定 |
| 2.1.3.8 動物感染試驗(yàn)(LD50 測定) |
| 2.1.3.9 主要毒力基因遺傳變異分析 |
| 2.2 結(jié)果與分析 |
| 2.2.1 目的基因的擴(kuò)增和克隆 |
| 2.2.2 病毒的分離培養(yǎng)及純化 |
| 2.2.3 病毒的形態(tài)觀察 |
| 2.2.4 PRV SD-2017 株病毒滴度的測定 |
| 2.2.5 PRV SD-2017 株家兔感染試驗(yàn) |
| 2.2.6 PRV SD-2017 株遺傳變異分析 |
| 2.2.6.1 gE基因的序列分析 |
| 2.2.6.2 gB基因的序列分析 |
| 2.2.6.3 gC基因的序列分析 |
| 2.2.6.4 gD基因的序列分析 |
| 2.2.6.5 TK基因的序列分析 |
| 2.2.6.6 gI基因的序列分析 |
| 2.2.6.7 gM基因的序列分析 |
| 2.3 討論 |
| 2.4 小結(jié) |
| 3 PRV gB和 gE基因酶促重組等溫?cái)U(kuò)增(ERA)檢測方法的建立及應(yīng)用 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 3.1.2 試驗(yàn)儀器 |
| 3.1.3 試驗(yàn)方法 |
| 3.1.3.1 核酸提取 |
| 3.1.3.2 引物和探針設(shè)計(jì) |
| 3.1.3.3 PRV gB和 gE基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建及其鑒定 |
| 3.1.3.4 ERA反應(yīng)體系的優(yōu)化 |
| 3.1.3.5 特異性試驗(yàn) |
| 3.1.3.6 敏感性試驗(yàn) |
| 3.1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 3.1.3.8 臨床樣本檢測 |
| 3.2 結(jié)果與分析 |
| 3.2.1 PRV gB和 gE基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 3.2.2 ERA反應(yīng)體系的建立 |
| 3.2.3 特異性試驗(yàn) |
| 3.2.4 敏感性試驗(yàn) |
| 3.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 3.2.6 臨床樣品的檢測 |
| 3.3 討論 |
| 3.4 小結(jié) |
| 4 PRV SD-2017 基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析 |
| 4.1 材料與方法 |
| 4.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 4.1.2 試驗(yàn)儀器 |
| 4.1.3 試驗(yàn)方法 |
| 4.1.3.1 引物和質(zhì)粒 |
| 4.1.3.2 gE/gI和 TK轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 |
| 4.1.3.3 PRV2017 基因缺失株的構(gòu)建和純化 |
| 4.1.3.4 PRV一步生長曲線和噬斑大小測定 |
| 4.1.3.5 動物接種試驗(yàn)(LD50 測定) |
| 4.2 結(jié)果與分析 |
| 4.2.1 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP的構(gòu)建與純化 |
| 4.2.2 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP報告基因的敲除 |
| 4.2.3 rPRV SD-2017ΔgE/gI/TK-EGFP的構(gòu)建和純化 |
| 4.2.4 rPRV一步生長曲線和噬斑大小測定 |
| 4.2.5 動物接種試驗(yàn)(LD50 測定) |
| 4.2.6 病理組織學(xué)觀察 |
| 4.3 討論 |
| 4.4 小結(jié) |
| 5 基于PRV SD-2017 株三種基因工程新型疫苗的構(gòu)建及其免疫原性研究 |
| 5.1 材料與方法 |
| 5.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 5.1.2 試驗(yàn)儀器 |
| 5.1.3 試驗(yàn)方法 |
| 5.1.3.1 重組蛋白序列的優(yōu)化與合成 |
| 5.1.3.2 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 |
| 5.1.3.3 重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)純化 |
| 5.1.3.4 家兔的疫苗接種和攻毒保護(hù)試驗(yàn) |
| 5.1.3.5 血清PRV特異性抗體測定 |
| 5.1.3.6 血清PRV中和抗體測定 |
| 5.1.3.7 外周血淋巴細(xì)胞增殖測定 |
| 5.1.3.8 外周血細(xì)胞因子檢測 |
| 5.1.3.9 剖檢和病理病變觀察 |
| 5.1.3.10 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 5.2 結(jié)果與分析 |
| 5.2.1 重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 |
| 5.2.2 重組蛋白PRV gB-DCpep和 PorB的表達(dá)和純化 |
| 5.2.3 PRV疫苗體液免疫反應(yīng)的測定 |
| 5.2.4 PRV疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)的測定 |
| 5.2.5 PRV疫苗血清中和抗體滴度的測定 |
| 5.2.6 PRV疫苗的攻毒保護(hù)試驗(yàn) |
| 5.3 討論 |
| 5.3.1 PRV變異株基因缺失疫苗的構(gòu)建 |
| 5.3.2 PRV變異株基因工程亞單位疫苗的構(gòu)建 |
| 5.4 小結(jié) |
| 6 PRV感染引起PK-15 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化及差異表達(dá)基因分析 |
| 6.1 材料與方法 |
| 6.1.1 細(xì)胞及毒株 |
| 6.1.2 試劑與耗材 |
| 6.1.3 儀器設(shè)備 |
| 6.1.4 主要數(shù)據(jù)庫、網(wǎng)站和軟件 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 PRV感染PK-15 細(xì)胞 |
| 6.2.2 細(xì)胞總RNA的提取 |
| 6.2.3 RNA樣本測序 |
| 6.2.3.1 樣本檢測 |
| 6.2.3.2 文庫構(gòu)建與質(zhì)檢 |
| 6.2.3.3 上機(jī)測序 |
| 6.2.4 RNA-Seq數(shù)據(jù)處理及分析 |
| 6.2.4.1 數(shù)據(jù)輸出與質(zhì)控 |
| 6.2.4.2 序列比對到參考基因組 |
| 6.2.4.3 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測 |
| 6.2.4.4 基因表達(dá)水平定量 |
| 6.2.4.5 基因表達(dá)差異分析 |
| 6.2.4.6 差異基因的GO功能富集及KEGG信號通路分析 |
| 6.3 結(jié)果與分析 |
| 6.3.1 PRV毒株感染PK-15 細(xì)胞的時間與劑量效應(yīng) |
| 6.3.2 RNA-seq測序樣本檢測結(jié)果 |
| 6.3.3 RNA-seq測序數(shù)據(jù)評估及質(zhì)控 |
| 6.3.4 PRV感染PK-15 細(xì)胞差異表達(dá)基因分析 |
| 6.3.4.1 差異基因統(tǒng)計(jì) |
| 6.3.4.2 差異表達(dá)基因可視化分析 |
| 6.3.4.3 差異表達(dá)基因疊加關(guān)系分析 |
| 6.3.4.4 差異表達(dá)基因聚類分析 |
| 6.3.5 PRV毒株感染PK-15 細(xì)胞差異表達(dá)基因富集分析 |
| 6.3.5.1 GO功能富集分析 |
| 6.3.5.2 KEGG通路富集分析 |
| 6.4 討論 |
| 6.5 小結(jié) |
| 7 偽狂犬病病毒感染引起PK-15 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)變化分析 |
| 7.1 材料與方法 |
| 7.1.1 試劑與耗材 |
| 7.1.2 儀器設(shè)備 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 PRV感染PK-15 細(xì)胞 |
| 7.2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析的細(xì)胞樣品制備 |
| 7.2.3 細(xì)胞總蛋白的提取 |
| 7.2.4 蛋白質(zhì)檢 |
| 7.2.5 TMT標(biāo)記 |
| 7.2.6 餾分分離 |
| 7.2.7 液質(zhì)檢測 |
| 7.2.8 生物信息學(xué)分析 |
| 7.2.9 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組的關(guān)聯(lián)性分析 |
| 7.3 結(jié)果 |
| 7.3.1 提取蛋白質(zhì)檢結(jié)果 |
| 7.3.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控與蛋白鑒定結(jié)果 |
| 7.3.2.1 鑒定到的蛋白總體情況 |
| 7.3.2.2 肽段長度分布 |
| 7.3.2.3 母離子質(zhì)量容差分布 |
| 7.3.2.4 Unique肽段數(shù)分布 |
| 7.3.2.5 蛋白覆蓋度分布 |
| 7.3.2.6 蛋白分子量分布 |
| 7.3.2.7 蛋白重復(fù)性分析 |
| 7.3.3 蛋白差異分析結(jié)果 |
| 7.3.3.1 差異蛋白統(tǒng)計(jì) |
| 7.3.3.2 差異蛋白可視化分析 |
| 7.3.4 差異蛋白GO功能注釋分析 |
| 7.3.5 差異蛋白KEGG分析 |
| 7.3.6 差異蛋白亞細(xì)胞定位分析 |
| 7.3.7 轉(zhuǎn)錄組和蛋白組表達(dá)調(diào)控關(guān)聯(lián)分析 |
| 7.3.8 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組表達(dá)量關(guān)聯(lián)分析 |
| 7.3.9 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組GO功能富集關(guān)聯(lián)分析 |
| 7.4 討論 |
| 7.5 小結(jié) |
| 8 結(jié)論 |
| 9 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 10 展望 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡介 |
（2）基于酵母的皰疹病毒疫苗的設(shè)計(jì)和制備（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 0.1 阿爾茨海默病 |
| 0.2 單純皰疹病毒與AD |
| 0.3 病毒疫苗 |
| 0.4 粘膜免疫 |
| 0.5 酵母表面展示技術(shù) |
| 0.6 研究目的及意義 |
| 第一章 構(gòu)建畢赤酵母表面展示重組菌株 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1.1 質(zhì)粒、引物及菌株 |
| 1.1.2 化學(xué)藥品、試劑及儀器 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.2.1 試劑的配置 |
| 1.2.2 構(gòu)建過表達(dá)PDI的畢赤酵母重組菌株 |
| 1.2.3 構(gòu)建HSV-1酵母表面展示菌株 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1.3.1 構(gòu)建過表達(dá)PDI的重組菌株的酵母直接PCR結(jié)果 |
| 1.3.2 構(gòu)建過表達(dá)PDI的重組菌株的酵母基因組PCR結(jié)果 |
| 1.3.3 構(gòu)建表面展示重組菌株的酵母直接PCR結(jié)果 |
| 1.3.4 構(gòu)建表面展示重組菌株的酵母基因組PCR結(jié)果 |
| 1.3.5 空白對照菌株的酵母直接PCR結(jié)果 |
| 1.4 本章小結(jié) |
| 第二章 誘導(dǎo)并驗(yàn)證酵母表面展示菌株中的蛋白 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑的配置 |
| 2.2.2 誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá) |
| 2.2.3 熒光顯微鏡觀察蛋白表達(dá)情況 |
| 2.2.4 提取酵母細(xì)胞壁蛋白 |
| 2.2.5 western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)情況 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.1 熒光顯微鏡觀察蛋白表達(dá)結(jié)果 |
| 2.3.2 western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)情況 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 動物實(shí)驗(yàn)并評估小鼠免疫應(yīng)答反應(yīng) |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 |
| 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 口服免疫小鼠 |
| 3.2.2 ELISA檢測體液免疫應(yīng)答及粘膜免疫應(yīng)答 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.1 體液免疫應(yīng)答結(jié)果 |
| 3.3.2 粘膜免疫應(yīng)答結(jié)果 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第四章 結(jié)論與展望 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及參加科研情況 |
（3）表達(dá)高致病性豬藍(lán)耳病GP3、GP5基因DNA疫苗構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 第1章 豬繁殖與呼吸綜合征概況 |
| 1.1 PRRSV結(jié)構(gòu) |
| 1.2 PRRSV流行譜系 |
| 1.3 PRRSV與抗體 |
| 第2章 PRRSV DNA疫苗研究進(jìn)展 |
| 2.1 減毒(MLV)疫苗 |
| 2.2 滅活的PRRSV疫苗 |
| 2.3 DNA疫苗及亞單位疫苗 |
| 2.4 疫苗與中和抗體 |
| 第3章 DNA疫苗佐劑的研究進(jìn)展 |
| 3.1 脂質(zhì)體佐劑 |
| 3.2 DNA疫苗的分子佐劑 |
| 3.2.1 基于PRR激動劑的分子佐劑 |
| 3.2.2 基因趨化因子佐劑 |
| 3.2.3 共刺激分子的遺傳佐劑 |
| 3.2.4 基于免疫信號分子的佐劑 |
| 第二篇 研究內(nèi)容 |
| 第1章 高致病性豬藍(lán)耳病核酸疫苗構(gòu)建及鑒定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第2章 高致病性豬藍(lán)耳病DNA疫苗小鼠免疫及佐劑效果評價 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第3章 高致病性豬藍(lán)耳病DNA疫苗豬體免疫效果及佐劑效果評價 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果 |
| 致謝 |
（4）N端截短與修飾的β-淀粉樣蛋白的疫苗及抑制劑研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符號對照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 阿爾茨海默病概述 |
| 1.2 淀粉樣沉積級聯(lián)假說 |
| 1.3 Aβ的產(chǎn)生、聚集、清除與毒性 |
| 1.3.1 Aβ的產(chǎn)生與聚集 |
| 1.3.2 Aβ的清除 |
| 1.3.3 Aβ的毒性 |
| 1.4 靶向Aβ的各類治療策略 |
| 1.4.1 抑制Aβ的產(chǎn)生 |
| 1.4.2 清除已有的Aβ |
| 1.4.3 抑制Aβ蛋白聚集 |
| 1.5 大腦內(nèi)多種形式的Aβ蛋白 |
| 1.6 本論文研究內(nèi)容 |
| 第2章 針對焦谷氨酸Aβ的疫苗研究 |
| 2.1 本章引言 |
| 2.2 疫苗的設(shè)計(jì)、合成與表征 |
| 2.2.1 疫苗的初步設(shè)計(jì) |
| 2.2.2 疫苗的合成 |
| 2.3 疫苗的初步評價與篩選 |
| 2.3.1 篩選輔助T細(xì)胞表位 |
| 2.3.2 篩選B細(xì)胞表位 |
| 2.3.3 抗體分型的測定 |
| 2.4 疫苗對AD模型小鼠的作用評價 |
| 2.4.1 免疫AD模型小鼠 |
| 2.4.2 使用Morris水迷宮評價小鼠認(rèn)知能力 |
| 2.4.3 測定小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊沉積的含量 |
| 2.5 實(shí)驗(yàn)部分 |
| 2.5.1 試劑、儀器與小鼠 |
| 2.5.2 多肽合成與表征數(shù)據(jù) |
| 2.5.3 BSA偶聯(lián)的疫苗合成 |
| 2.5.4 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.6 本章小結(jié) |
| 第3章 針對Aβ_(4-X)的抑制劑研究 |
| 3.1 本章引言 |
| 3.2 探究葫蘆脲與Aβ_(1-X)和 Aβ_(4-X)的結(jié)合能力 |
| 3.2.1 使用等溫滴定量熱法測定葫蘆脲與Aβ的結(jié)合模式 |
| 3.2.2 使用質(zhì)譜驗(yàn)證葫蘆脲與Aβ的結(jié)合模式 |
| 3.3 探究葫蘆脲對Aβ_(1-40)和Aβ_(4-40)聚集的調(diào)控能力 |
| 3.3.1 使用ThT聚集動力學(xué)評價葫蘆脲對Aβ聚集的影響 |
| 3.3.2 使用透射電子顯微鏡驗(yàn)證葫蘆脲對Aβ聚集的影響 |
| 3.4 探究葫蘆脲對Aβ_(1-40)和Aβ_(4-40)毒性的影響 |
| 3.5 探究葫蘆脲抑制Aβ_(1-40)和Aβ_(4-40)聚集的機(jī)理 |
| 3.5.1 構(gòu)建Aβ聚集的動力學(xué)模型 |
| 3.5.2 葫蘆脲抑制Aβ聚集的動力學(xué)模型 |
| 3.6 實(shí)驗(yàn)部分 |
| 3.6.1 試劑與儀器 |
| 3.6.2 多肽合成與表征數(shù)據(jù) |
| 3.6.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.7 本章小結(jié) |
| 第4章 抑制劑聯(lián)用的研究 |
| 4.1 本章引言 |
| 4.2 糖-色基酸綴合物對Aβ聚集的抑制 |
| 4.3 聯(lián)合應(yīng)用糖-色氨酸綴合物與中藥提取物分子 |
| 4.4 透射電子顯微鏡驗(yàn)證抑制劑聯(lián)用的效果 |
| 4.5 實(shí)驗(yàn)部分 |
| 4.5.1 試劑與儀器 |
| 4.5.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.6 本章小結(jié) |
| 第5章 結(jié)論 |
| 5.1 研究總結(jié) |
| 5.2 展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果 |
（5）基于藥用酶的自聚化Aβ表位疫苗制備及免疫藥理學(xué)研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疫苗的研究進(jìn)展 |
| 1.1.1 傳統(tǒng)疫苗的簡介 |
| 1.1.1.1 減毒疫苗 |
| 1.1.1.2 滅活疫苗 |
| 1.1.2 新型疫苗的簡介 |
| 1.1.2.1 亞單位疫苗 |
| 1.1.2.2 活載體疫苗 |
| 1.1.2.3 表位疫苗 |
| 1.2 提高表位疫苗免疫原性的策略 |
| 1.2.1 表位與載體偶聯(lián) |
| 1.2.2 表位與佐劑聯(lián)合 |
| 1.3 以Aβ為靶點(diǎn)防治阿爾茨海默氏癥 |
| 1.3.1 A β與阿爾茨海默氏癥的發(fā)生 |
| 1.3.2 以Aβ為靶點(diǎn)的治療藥物 |
| 1.3.3 疫苗在AD中存在的問題 |
| 1.4 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及意義 |
| 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 工程化細(xì)菌 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 2.1.4 主要儀器 |
| 2.1.5 主要溶液配方 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 多肽、CpG的合成 |
| 2.2.2 工程化細(xì)菌的復(fù)蘇 |
| 2.2.3 工程化細(xì)菌的鑒定 |
| 2.2.3.1 工程菌基因準(zhǔn)確性的鑒定 |
| 2.2.4 抗原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.2.5 抗原蛋白的提取和分離純化 |
| 2.2.5.1 細(xì)菌破碎與抗原蛋白的提取 |
| 2.2.5.2 抗原蛋白的硫酸銨分級沉淀 |
| 2.2.5.3 抗原蛋白的親和柱層析分離 |
| 2.2.5.4 抗原蛋白的脫鹽、凍干與保存 |
| 2.2.6 抗原蛋白的性質(zhì)鑒定 |
| 2.2.6.1 蛋白質(zhì)含量的測定 |
| 2.2.6.2 分子量的檢測 |
| 2.2.6.3 抗原蛋白聚集形式的鑒定 |
| 2.2.6.4 免疫印跡的檢測 |
| 2.2.6.5 抗原蛋白組件完整性的檢測 |
| 2.2.6.6 抗原表位的表面呈現(xiàn)性鑒定 |
| 2.2.7 免疫佐劑與抗原蛋白的配伍和篩選 |
| 2.2.7.1 實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)與分組 |
| 2.2.7.2 動物免疫 |
| 2.2.7.3 血清的采集與保存 |
| 2.2.7.4 抗Aβ_(42)特異性抗體的濃度檢測 |
| 2.2.7.5 抗Aβ_(42)特異性抗體的親合力檢測 |
| 2.2.7.6 抗Aβ_(42)特異性抗體的抗體亞型檢測 |
| 2.2.7.7 PC12細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.7.8 抗血清中的抗體對Aβ斑塊的特異性靶向研究 |
| 2.2.8 新型疫苗的免疫藥理學(xué)研究 |
| 2.2.8.1 模式動物的分子鑒定 |
| 2.2.8.2 實(shí)驗(yàn)動物的飼養(yǎng)與分組 |
| 2.2.8.3 模式動物的免疫 |
| 2.2.8.4 新型疫苗的免疫效應(yīng)研究 |
| 2.2.8.4.1 抗Aβ_(42)特異性抗體的濃度檢測 |
| 2.2.8.4.2 抗Aβ_(42)特異性抗體的親合力檢測 |
| 2.2.8.4.3 抗Aβ_(42)特異性抗體的抗體亞型檢測 |
| 2.2.8.5 新型疫苗的藥理效應(yīng)研究 |
| 2.2.8.5.1 模型動物空間認(rèn)知和記憶能力的研究與評價 |
| 2.2.8.5.2 模型動物腦內(nèi)病理性淀粉樣斑塊的檢測與評價 |
| 2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 |
| 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.1 工程化細(xì)菌能夠可溶性高效表達(dá)目的抗原蛋白 |
| 3.1.1 重組質(zhì)粒序列正確性的鑒定 |
| 3.1.2 抗原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 3.1.3 抗原蛋白的提取和分離純化 |
| 3.1.3.1 抗原蛋白能夠被可溶性表達(dá) |
| 3.1.3.2 抗原蛋白的硫酸銨分級沉淀 |
| 3.1.3.3 抗原蛋白的親和柱層析分離 |
| 3.1.3.4 抗原蛋白的脫鹽 |
| 3.1.4 抗原蛋白的性質(zhì)鑒定 |
| 3.1.4.1 分子量檢測 |
| 3.1.4.2 抗原蛋白聚集形式的鑒定 |
| 3.1.4.3 抗原蛋白組分完整性的鑒定 |
| 3.1.4.4 抗原蛋白含有Aβ_(1-15)表位 |
| 3.1.4.5 Aβ表位疫苗能夠有效呈現(xiàn)于四聚化抗原分子的表面 |
| 3.2 抗原蛋白與乳化佐劑配伍的新型疫苗能夠激發(fā)有效的抗Aβ體液免疫 |
| 3.2.1 乳化佐劑能夠有效提高抗Aβ_(42)特異性抗體的濃度 |
| 3.2.2 鋁佐劑能夠提高Aβ_(42)特異性抗體的親和力 |
| 3.2.3 乳化佐劑能夠促進(jìn)免疫反應(yīng)偏向Th2 |
| 3.2.4 抗血清能夠靶向性結(jié)合Aβ病理性斑塊 |
| 3.2.5 抗血清能夠中和Aβ_(42)低聚物對PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性 |
| 3.3 轉(zhuǎn)基因動物能夠模擬Aβ導(dǎo)致的AD病理改變 |
| 3.4 新型疫苗能夠激發(fā)病理模型產(chǎn)生針對Aβ_(42)的特異性免疫應(yīng)答 |
| 3.4.1 新型疫苗能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高濃度的抗Aβ_(42)特異性抗體 |
| 3.4.2 抗原蛋白APA與乳化佐劑組合能夠提高抗Aβ_(42)特異性抗體的親合力 |
| 3.5 新型疫苗能夠激發(fā)病理模型產(chǎn)生以Th2為主的體液免疫反應(yīng) |
| 3.6 新型疫苗能夠降低病理模型腦內(nèi)的淀粉樣斑塊 |
| 3.7 新型疫苗能夠改善病理模型的空間認(rèn)知能力 |
| 3.7.1 潛伏期檢測 |
| 3.7.2 超越平臺次數(shù)測定 |
| 3.7.3 首次超越平臺耗時測定 |
| 3.7.4 水迷宮運(yùn)動軌跡分析 |
| 第四章 討論與總結(jié) |
| 第五章 結(jié)果與展望 |
| 附錄1: 縮略語 |
| 附錄2: Aβ_(1-42)合成報告 |
| 附錄3: 硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表(0℃) |
| 附錄4: APA正向測序結(jié)果 |
| 附錄5: APA反向測序結(jié)果 |
| 附錄6: 以oIMR1597及oIMR1598為引物鑒定APP/PSN轉(zhuǎn)基因小鼠基因型結(jié)果 |
| 附錄7: 以PS1-F2及PS1-R1為引物鑒定APP/PSN轉(zhuǎn)基因小鼠基因型結(jié)果 |
| 附錄8: 以42及43為引物鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)參基因的結(jié)果 |
| 附錄9: APP/PSN轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定參考匯總 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 發(fā)表論文及科研情況說明 |
| 致謝 |
（6）阿爾茨海默病重組B細(xì)胞表位Aβ1-15融合抗原疫苗研究（論文提綱范文）
| 縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第一部分 阿爾茨海默病重組B細(xì)胞表位Aβ1-15融合蛋白疫苗研究 |
| 1 阿爾茨海默病重組B細(xì)胞表位Aβ1-15融合蛋白疫苗在Balb |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 2 阿爾茨海默病重組B 細(xì)胞表位Aβ1-15 融合蛋白疫苗在PDAPP 小鼠免疫原性研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 阿爾茨海默病重組B 細(xì)胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗研究 |
| 1 阿爾茨海默病重組B 細(xì)胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗在Balb |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 2 分子佐劑對重組B 細(xì)胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗免疫原性影響 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1.4 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 研究總結(jié) |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 個人簡歷 |
| 致謝 |
（7）破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位疫苗研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 阿爾茨海默病及其免疫治療機(jī)制簡述 |
| 1.2 阿爾茨海默病主動免疫治療現(xiàn)狀 |
| 1.3 本研究AD疫苗研究策略及主要研究內(nèi)容 |
| 2 破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病重組Aβ1-15嵌合疫苗研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、質(zhì)粒 |
| 2.1.2 培養(yǎng)基 |
| 2.1.3 引物的設(shè)計(jì) |
| 2.1.4 試劑 |
| 2.1.5 抗體、蛋白、多肽 |
| 2.1.6 動物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.2.2 重組蛋白的表達(dá)和純化 |
| 2.2.3 SDS-PAGE電泳 |
| 2.2.4 Western Blot免疫印跡試驗(yàn) |
| 2.2.5 蛋白質(zhì)的定量分析 |
| 2.2.6 動物免疫實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.7 血清抗體測定 |
| 2.2.8 細(xì)胞免疫水平檢測 |
| 2.2.9 斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)(Dot-blot) |
| 2.2.10 APP轉(zhuǎn)基因AD模型動物免疫實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.11 血清抗體測定(轉(zhuǎn)基因小鼠部分) |
| 2.2.12 小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.13 免疫組化檢測小鼠大腦組織Aβ斑塊 |
| 2.2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.3.1 3種原核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 2.3.2 重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá),純化及鑒定 |
| 2.3.3 免疫小鼠血清特異性抗體水平 |
| 2.3.4 T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng) |
| 2.3.5 斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.6 ELISA法測定各免疫階段抗Aβ的抗體水平(轉(zhuǎn)基因小鼠部分) |
| 2.3.7 免疫后小鼠血清抗體滴度以及抗體亞型分析(轉(zhuǎn)基因小鼠部分) |
| 2.3.8 免疫后小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn) |
| 2.3.9 免疫組化檢測小鼠腦組織(海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū))Aβ斑塊含量 |
| 2.4 討論 |
| 2.4.1 重組蛋白具有良好的免疫原性,免疫反應(yīng)偏向于Th2型 |
| 2.4.2 產(chǎn)生的Aβ特異性抗體更傾向與Aβ寡聚體結(jié)合 |
| 2.4.3 重組蛋白的二價疫苗潛力 |
| 2.4.4 使用AD模型小鼠評價重組蛋白的免疫預(yù)防效果 |
| 2.5 本章小結(jié) |
| 3 破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病Aβ1-15表位核酸疫苗研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、質(zhì)粒 |
| 3.1.2 培養(yǎng)基 |
| 3.1.3 引物的設(shè)計(jì) |
| 3.1.4 試劑 |
| 3.1.5 抗體 |
| 3.1.6 動物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.2.2 質(zhì)粒的大量提取 |
| 3.2.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 |
| 3.2.4 間接免疫熒光鑒定蛋白的表達(dá) |
| 3.2.5 動物免疫實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.6 血清抗體測定 |
| 3.2.7 細(xì)胞免疫水平檢測 |
| 3.2.8 斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.9 AD轉(zhuǎn)基因動物免疫實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.10 血清抗體測定(轉(zhuǎn)基因小鼠部分) |
| 3.2.11 細(xì)胞免疫水平檢測(轉(zhuǎn)基因小鼠部分) |
| 3.2.12 小鼠大腦組織的免疫組化 |
| 3.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 2種真核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.3.2 真核表達(dá)載體在BHK21細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定 |
| 3.3.3 免疫小鼠血清特異性抗體水平 |
| 3.3.4 T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng) |
| 3.3.5 斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn) |
| 3.3.6 ELISA法測定各免疫階段抗Aβ的抗體水平(轉(zhuǎn)基因小鼠部分) |
| 3.3.7 免疫后小鼠血清抗體滴度以及抗體亞型分析(轉(zhuǎn)基因小鼠部分) |
| 3.3.8 T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)(轉(zhuǎn)基因小鼠部分) |
| 3.3.9 免疫組化檢測小鼠腦組織Aβ斑塊 |
| 3.4 討論 |
| 3.4.1 重組Aβ表位DNA疫苗具有良好的免疫原性 |
| 3.4.2 DNA疫苗同重組亞單位疫苗之間的比較 |
| 3.5 本章小結(jié) |
| 4 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 附A. 英文縮略詞表 |
| 附B. 綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（8）核酸疫苗預(yù)防接種對急性帕金森病小鼠黑質(zhì)炎癥反應(yīng)的影響（論文提綱范文）
| 英漢縮略語名詞對照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第一部分 優(yōu)化核酸疫苗 pVAX1-IL-4/SYN-B 預(yù)防接種帕金森病小鼠的免疫效果 |
| 1 材料與方法 |
| 2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 第二部分 優(yōu)化核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B 預(yù)防接種對帕金森病小鼠黑質(zhì)免疫炎癥反應(yīng)的影響 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附圖 |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（9）優(yōu)化人α-突觸核蛋白核酸疫苗免疫M(jìn)PTP帕金森病小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 英漢縮略語名詞對照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 論文正文：優(yōu)化人α-突觸核蛋白核酸疫苗免疫 MPTP 帕金森病小鼠神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究 |
| 前言 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第一部分 三種防治帕金森病核酸疫苗的優(yōu)化構(gòu)建與鑒定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 三種優(yōu)化核酸疫苗的體液免疫效果 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附圖 |
| 第三部分 優(yōu)化核酸疫苗治療 MPTP 帕金森病小鼠神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附圖 |
| 第四部分 溶酶體和蛋白酶體抑制劑對正常小鼠多巴胺神經(jīng)元的影響 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附圖 |
| 第五部分 溶酶體和蛋白酶體阻滯劑影響核酸疫苗免疫作用的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附圖 |
| 全文總結(jié) |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 在讀期間發(fā)表的文章和學(xué)術(shù)活動 |
（10）核酸疫苗免疫機(jī)制的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 縮略詞表 |
| 第一部分 阿爾茨海默氏病治療性核酸疫苗免疫機(jī)制的研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、參考文獻(xiàn) |
| 六、小結(jié) |
| 第二部分 乙型肝炎病毒X基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制研究 |
| 第一章 乙型肝炎病毒X基因轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞比較蛋白組學(xué) |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、參考文獻(xiàn) |
| 六、小結(jié) |
| 第二章 乙型肝炎病毒X基因通過上調(diào)STRAP,nm23-H1激活PI3K信號通路調(diào)控PIMT蛋白表達(dá) |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、參考文獻(xiàn) |
| 六、小結(jié) |
| 附錄 |
| 文獻(xiàn)綜述(一) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述(二) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 在讀期間撰寫、發(fā)表的論文 |
| 致謝 |
四、阿爾茨海默病核酸疫苗的構(gòu)建及誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的初步研究（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]偽狂犬病病毒的基因工程疫苗構(gòu)建及其感染PK-15細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D]. 張洪亮. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2021
- [2]基于酵母的皰疹病毒疫苗的設(shè)計(jì)和制備[D]. 張霞. 遼寧大學(xué), 2020(01)
- [3]表達(dá)高致病性豬藍(lán)耳病GP3、GP5基因DNA疫苗構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究[D]. 趙冠宇. 吉林大學(xué), 2019(11)
- [4]N端截短與修飾的β-淀粉樣蛋白的疫苗及抑制劑研究[D]. 李高. 清華大學(xué), 2019(02)
- [5]基于藥用酶的自聚化Aβ表位疫苗制備及免疫藥理學(xué)研究[D]. 彭顏梅. 云南大學(xué), 2018(04)
- [6]阿爾茨海默病重組B細(xì)胞表位Aβ1-15融合抗原疫苗研究[D]. 王文斌. 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2011(07)
- [7]破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位疫苗研究[D]. 陳鰲. 河南大學(xué), 2011(08)
- [8]核酸疫苗預(yù)防接種對急性帕金森病小鼠黑質(zhì)炎癥反應(yīng)的影響[D]. 趙臣勇. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2011(11)
- [9]優(yōu)化人α-突觸核蛋白核酸疫苗免疫M(jìn)PTP帕金森病小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D]. 王法祥. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2009(04)
- [10]核酸疫苗免疫機(jī)制的研究[D]. 何穎. 第二軍醫(yī)大學(xué), 2008(02)
標(biāo)簽：抗體論文; 重組蛋白論文; 細(xì)胞免疫論文; 基因合成論文; 免疫策略論文;