一、雙重實(shí)時(shí)PCR快速同時(shí)檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌（論文文獻(xiàn)綜述）
鐘宜科[1]（2020）在《基于HAND系統(tǒng)15種食源性致病菌多重實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理近年來,食源性疾病的發(fā)病率居高不下,在全世界范圍內(nèi)都是一個(gè)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）統(tǒng)計(jì)顯示由病原微生物引起的食源性疾病比例達(dá)50%以上,因此急需建立一種有效的食源性致病菌檢測方法。傳統(tǒng)的食源性病原體檢測和鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不足以滿足食品快速檢測的要求。為阻止疾病的傳播、監(jiān)控食品的衛(wèi)生安全,保障人民的安全,急需建立一種快速、簡單和有效的檢測技術(shù)。本文將腸粘附性大腸桿菌、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、結(jié)腸彎曲菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、腸炎沙門氏菌、類志賀鄰單胞菌、嗜水氣單胞菌和福氏志賀氏菌為模式菌株,建立一種快速檢測15種食源性致病菌的多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)。主要研究結(jié)果如下:（1）通過HAND系統(tǒng)建立了一種能夠同時(shí)檢測15種食源性致病菌多重實(shí)時(shí)PCR方法,具有特異性高、靈敏度好、重復(fù)性和穩(wěn)定性高等特點(diǎn),并且適用于復(fù)雜樣本的檢測;（2）通過玻璃化技術(shù),將多重實(shí)時(shí)PCR中熱不穩(wěn)定成分（Taq酶、dNTP、染料和引物）玻璃化到PCR管蓋上。實(shí)驗(yàn)表明,試劑的活性不受玻璃化的影響實(shí)驗(yàn),并且被玻璃化成分高度穩(wěn)定,能夠在室溫（25℃）下保存12年,從而克服了冷鏈運(yùn)輸和低溫儲存的局限性;（3）針對復(fù)雜樣本的快速提取,研制了一種以Chelex-100和TritonX-100為主要裂解成分的核酸提取液,評價(jià)其對15種食源性致病菌核酸提取的效果,結(jié)果顯示只需要在90℃裂解10 min,即可適用于熒光定量PCR檢測技術(shù),具有操作簡便、裂解效果好、不影響后續(xù)反應(yīng)的特點(diǎn),且不受糞便和食品等復(fù)雜樣本的影響。綜上所述,本研究通過HAND系統(tǒng)與玻璃化技術(shù)相結(jié)合建立了一種能夠同時(shí)檢測15種食源性致病菌快速檢測方法,具有良好的特異性與敏感性,解決了樣本核酸提取和加樣繁瑣、復(fù)雜以及試劑在非低溫環(huán)境下易失活的問題。
凌嬌[2]（2018）在《副溶血弧菌qPCR檢測及T6SS-1效應(yīng)因子的篩選和功能研究》文中研究指明副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）和霍亂弧菌（Vibrio cholerae,Vc）均屬于革蘭氏陰性菌,是引起食源性胃腸炎或敗血癥的重要病原體。它們廣泛分布于河口、沿海水域及沉積物,隨著海產(chǎn)品消售量日益增加,建立一種能同時(shí)檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的快速準(zhǔn)確的檢測方法至關(guān)重要。致病性副溶血弧菌公認(rèn)的毒力因子為耐熱穩(wěn)定性直接溶血素（TDH）與TDH相關(guān)溶血素（TRH）。近幾年發(fā)現(xiàn)的VⅥ型分泌系統(tǒng)（T6SS）廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中,在細(xì)菌的生存及致病性上起著非常重要的作用。由T6SS遞送的多種蛋白質(zhì),被稱為“效應(yīng)因子”,現(xiàn)在已被鑒定并在靶細(xì)胞中呈現(xiàn)各種毒性活性。本研究首次建立一種基于TaqMan探針法同步定量檢測副溶血弧菌（toxR）和霍亂弧菌（ompW）的雙重?zé)晒舛縋CR方法,是同時(shí)快速檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的有效手段。采用超濾管濃縮法、Label-free蛋白組學(xué)分析及Western-blot技術(shù),從野生株SH112和雙缺失株△vipA1-hcp1中成功篩選并鑒定分泌蛋白VP0837和VP0285均屬于副溶血弧菌T6SS-1的效應(yīng)因子。此外,通過對效應(yīng)蛋白VP0837基因缺失株生物學(xué)特性和致病性分析,表明T6SS-1在副溶血弧菌的致病過程中扮演著重要的角色。試驗(yàn)Ⅰ 副溶血弧菌與霍亂弧菌雙重?zé)晒舛縋CR快速檢測方法的建立及應(yīng)用建立一種基于TaqMan探針法同步定量檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的雙重?zé)晒舛縋CR方法。根據(jù)副溶血弧菌toxR基因和霍亂弧菌ompW基因設(shè)計(jì)特異性引物與探針。結(jié)果表明:此方法對這兩種菌的最低檢測限均達(dá)到10CFU/mL,靈敏度高;特異性試驗(yàn)表明這兩種細(xì)菌與其他病原菌（如:大腸桿菌0157、沙門氏菌、擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌）均無交叉反應(yīng);重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明變異系數(shù)均小于1.5%,說明重復(fù)性好。采用人工染菌蝦肉樣品并及時(shí)檢測,副溶血弧菌和霍亂弧菌的最低檢測限分別為100 CFU/mL和50 CFU/mL,人工染菌貝類樣品的最低檢測限分別為50 CFU/mL和50 CFU/mL。兩種細(xì)菌在蝦肉中富集2h后的最低檢出限均為1 CFU/mL。結(jié)論:本研究所建立的雙重?zé)晒釶CR檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),包括DNA提取的整個(gè)檢測過程可在1～3 h內(nèi)完成,是同時(shí)快速檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的有效方法。試驗(yàn)Ⅱ 副溶血弧菌T6SS-1效應(yīng)蛋白的篩選與鑒定為初步篩選、鑒定副溶血弧菌T6SS-1效應(yīng)蛋白。基于本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果,采用超濾管濃縮法分別提取副溶血弧菌野生株SH112和△vipA1-hcp1雙缺失株的分泌蛋白。蛋白酶解后用于LC-MS/MS檢測,將所篩選的蛋白進(jìn)行基因本體注釋（GO）分析和LFQ（Label Free Quantitation）分析。另外,選取兩種分泌蛋白VP0837和VP0285進(jìn)行原核表達(dá),制備多克隆抗體,并采用Western-blot方法對提取的分泌蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示:利用LC-MS/MS方法成功鑒定了 52個(gè)差異蛋白質(zhì),其中在△vipA1-hcp1中下調(diào)的蛋白有36個(gè),上調(diào)的有16個(gè);GO結(jié)果表明所鑒定的蛋白主要參與代謝作用、生物學(xué)定位、信號分子、氧化還原、生物學(xué)結(jié)合等過程。Western-blot表明,鼠抗VP0837和VP0285的血清均能特異性識別副溶血弧菌野生株SH112的上清蛋白,而未能識別雙缺失株△vipA1-hcp1的上清蛋白;表明分泌蛋白VP0837和VP0285均屬于副溶血弧菌T6SS-1的效應(yīng)蛋白,并且對T6SS-1的分泌功能起著重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究VP0837和VP0285蛋白功能及副溶血弧菌快速檢測方法奠定了基礎(chǔ)。試驗(yàn)Ⅲ 副溶血弧菌T6SS-1效應(yīng)蛋白VP0837基因缺失株的構(gòu)建及致病性分析本試驗(yàn)旨在研究T6SS-1在副溶血孤菌生物學(xué)特性和致病性中發(fā)揮的作用,以T6SS-1分泌蛋白VP0837為研究對象,構(gòu)建副溶血弧菌SH112株vp0837基因缺失株和互補(bǔ)株。通過分析各菌株的生長特性、運(yùn)動性、生物被膜形成能力的差異;比較缺失株對細(xì)胞黏附入侵與毒性、細(xì)胞炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的差異以及對小鼠致死率的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示:與野生株相比,缺失株△vp0837與互補(bǔ)株C△vp0837的生長速度和生物被膜形成能力均差異不顯著;△vp0837對Caco-2細(xì)胞的毒性、黏附與入侵作用明顯降低,而使Caco-2細(xì)胞炎性因子IL-1β和IL-6表達(dá)顯著上調(diào);對ICR小鼠的致死率顯著下降。上述結(jié)果提示副溶血弧菌T6SS-1中分泌蛋白vp0837基因不僅參與了對宿主的細(xì)胞毒力和致炎性等致病過程,而且對鼠死亡率也發(fā)揮著明顯的作用,充分說明vp0837基因在副溶血弧菌的感染致病過程中扮演重要的角色。
王義濤[3]（2018）在《威海地區(qū)食源性細(xì)菌的分布及病原性海洋弧菌多重降落PCR方法的建立》文中研究指明背景與目的:海洋性弧菌廣泛分布于內(nèi)灣、沿岸、外洋水域、海洋生物體和沉積物中,能夠感染魚類或哺乳動物,并可在人群中引起食物中毒。不少弧菌會導(dǎo)致人或其他動物發(fā)病,以霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌致病力最強(qiáng)。隨著海產(chǎn)品消費(fèi)的不斷增多,因海產(chǎn)品傳播的細(xì)菌性疾病發(fā)生范圍和頻率也逐漸增大。常規(guī)的海洋弧菌檢測方法即培養(yǎng)法不能滿足快速診斷的需要,且某些海洋性弧菌培養(yǎng)困難,因此建立病原性海洋弧菌的快速檢測技術(shù),對病原性海洋性弧菌感染的診斷、治療和維護(hù)公共健康具有重要意義。本研究旨在了解威海地區(qū)食源性疾病中致病菌的分布情況,建立一種可以同時(shí)檢測臨床標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌及副溶血性弧菌的多重降落PCR方法,為臨床快速診斷創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌感染提供一種有效手段。方法:收集2017年3月10月威海市立醫(yī)院食源性疾病就診患者的糞便標(biāo)本357例,采用常規(guī)培養(yǎng)法結(jié)合質(zhì)譜分析對標(biāo)本中病原菌進(jìn)行鑒定。設(shè)計(jì)針對創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）細(xì)胞溶解素編碼基因vvh A和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）膠原蛋白酶編碼基因col的特異性引物,建立單一降落PCR和多重降落PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行優(yōu)化,檢測各種標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株評價(jià)單一降落和多重降落PCR的特異性和敏感性。應(yīng)用多重降落PCR檢測103例糞便標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌,并與細(xì)菌培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行比較,評價(jià)多重降落PCR在臨床標(biāo)本檢測中的可行性。結(jié)果:（1）共檢出致病微生物98株,5種疾控要求監(jiān)測病原微生物致瀉大腸埃希菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、諾如病毒和志賀氏菌的比率依次為26.53%、21.43%、20.41%、10.20%和7.14%;另外還檢出其它致病性海洋弧菌14株（14.28%）,包括創(chuàng)傷弧菌6株（6.12%）、哈氏弧菌3株（3.06%）、溶藻弧菌3株（3.06）和燦爛弧菌2株（2.04%）,海洋性弧菌的總檢出比率為35.71%。（2）單一降落PCR只分別對創(chuàng)傷弧菌或副溶血弧菌檢測到特異擴(kuò)增條帶,對其它種類弧菌和非弧菌未出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶;對創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的最低檢測限分別為104 CFU/ml和103CFU/ml。（3）多重降落PCR可在目標(biāo)測試菌中同時(shí)檢測到創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的特異性擴(kuò)增條帶,對其它種類弧菌和非弧菌未出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶;對創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的最低檢測限亦分別為104 CFU/ml和103 CFU/ml。（4）與細(xì)菌培養(yǎng)法比較,多重降落PCR檢測103份糞便標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌的靈敏度和特異性分別為l00%和97.94%,副溶血性弧菌的靈敏度與特異性分別為100%和95.12%。結(jié)論:（1）威海地區(qū)食源性疾病中海洋性弧菌檢出率高,需要對其進(jìn)行監(jiān)測。（2）成功建立快速檢測創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的多重降落PCR方法,靈敏度高,特異性強(qiáng),可直接用于臨床標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的快速檢測。
魏霜,馬新華,汪天杰,龍陽,紀(jì)強(qiáng),任嬌,吳希陽[4]（2016）在《雙重DPO-PCR檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌》文中指出根據(jù)副溶血弧菌collagenase基因和霍亂弧菌omp W基因,分別設(shè)計(jì)特異性DPO（dual priming oligonucleotide）引物,建立一種快速檢測這兩種弧菌的多重DPO-PCR方法,并對其特異性和靈敏度進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果顯示,設(shè)計(jì)的DPO引物特異性較強(qiáng),副溶血弧菌和霍亂弧菌DNA可分別擴(kuò)增出307 bp與463 bp的特異性條帶,檢測靈敏度均達(dá)0.1 ng/μL。該檢測方法對退火溫度不敏感。利用該方法對69株疑似弧菌菌株進(jìn)行鑒定,結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高,適合于對食品、水產(chǎn)品等中副溶血弧菌和霍亂弧菌的進(jìn)行快速篩檢。
韓輝,畢玉國,祁軍,胡群,譚緒良,吳海磊,王靜,徐寶梁[5]（2015）在《霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重?zé)晒釶CR檢測方法的建立》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的建立霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測方法。方法根據(jù)霍亂弧菌外膜蛋白W基因（out membrane protein W,omp W）和擬態(tài)弧菌溶血素基因（Vibrio mimicus hemolysin gene,vmh）的保守序列設(shè)計(jì)引物和Taq Man探針,建立快速檢測并區(qū)分霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的雙重?zé)晒釶CR方法,并對所建立的方法進(jìn)行靈敏度和特異度評價(jià)。結(jié)果建立了霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重?zé)晒釶CR快速檢測方法。優(yōu)化的反應(yīng)體系中,omp W引物和探針的濃度分別為100 nmol/L和200 nmol/L;vmh引物和探針的濃度均為100 nmol/L。對兩種質(zhì)粒模板的檢測下限均為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率分別為100.9%和99.7%。靈敏度和特異度均為100.0%。結(jié)論基于Taq Man探針的omp W和vmh雙重?zé)晒釶CR檢測方法,具有好的靈敏度和特異度。并且能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測兩種毒力基因,為繁瑣費(fèi)時(shí)的傳統(tǒng)檢測方法提供了一種快速可靠的替代選擇。
周冬根,孫大為,倪敏君,王燕,張升,翟敏[6]（2012）在《多重實(shí)時(shí)熒光PCR法快速檢測水體中致病性弧菌的研究》文中指出致病性弧菌檢測方法主要是生化鑒定法,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且對于生化反應(yīng)不典型或生化反應(yīng)極為相似的弧菌屬無法準(zhǔn)確鑒別,傳統(tǒng)的生化鑒定法在大規(guī)模的病害調(diào)查過程和生產(chǎn)實(shí)踐中無法做到快速準(zhǔn)確方便。多重?zé)晒釶CR方法是在DNA分子水平進(jìn)行微生物檢測的一種新方法,根據(jù)樣本中各種微生物的特異性基因?qū)δ繕?biāo)菌進(jìn)行鑒定,可以穩(wěn)定準(zhǔn)確地在種屬和菌株水平上鑒別微生物,彌補(bǔ)傳統(tǒng)生化鑒定方法的缺陷。本研究通過優(yōu)化多重?zé)晒釶CR方法體系,建立了水體中致病性弧菌的兩個(gè)多重?zé)晒釶CR檢測方法,該方法通過富集水體細(xì)菌,
韓輝,李海山,胡群,姚李四,譚緒良,賈琳[7]（2011）在《霍亂毒素基因（ctx）和耐熱直接溶血素基因（tdh）雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立》文中認(rèn)為[目的]建立霍亂毒素和耐熱直接溶血素基因雙重TaqMan實(shí)時(shí)-PCR實(shí)驗(yàn)室檢測方法。[方法]根據(jù)霍亂毒素基因（Cholera toxin gene,ctx）和耐熱直接溶血素基因（thermostable direct hemolysin,tdh）的保守序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針,建立檢測霍亂毒素和耐熱直接溶血素兩種毒力基因的雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR方法。對所建立的霍亂毒素基因和耐熱直接溶血素基因雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法進(jìn)行靈敏度和特異度評價(jià)。[結(jié)果]建立了霍亂毒素基因和耐熱直接溶血素基因雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR的實(shí)驗(yàn)室檢測方法。優(yōu)化的tdh和ct雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中,ct引物和探針的濃度分別為200nmol/L和100nmol/L;tdh引物和探針的濃度分別為200nmol/L和100nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對兩種質(zhì)粒模板的檢測下限均為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率分別為94%和97.7%。[結(jié)論]本研究建立了基于TaqMan探針的tdh和ct雙重實(shí)時(shí)PCR檢測方法,具有令人滿意的靈敏度和特異度。檢測下限能達(dá)到1.0×102拷貝/μl,高于普通PCR100倍。并且雙重實(shí)時(shí)PCR能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測兩種毒力基因,這為費(fèi)時(shí)又繁瑣的傳統(tǒng)檢測方法提供了一種可靠又快速的替代選擇。
覃倚瑩[8]（2010）在《沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌同時(shí)檢測方法的研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理本文建立了沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌的同時(shí)檢測方法,包括共增培養(yǎng)基及其三重?zé)晒釶CR檢測方法,使水產(chǎn)品中主要致病菌的檢測能夠通過一步增殖培養(yǎng)和一步檢測完成,大大縮短檢測時(shí)間,簡化檢測步驟,提高檢測效率。以BPW作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,選擇對目標(biāo)菌具有促進(jìn)作用或者對非目標(biāo)菌具有抑制作用的添加劑進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),研制了共增培養(yǎng)基SVV,其最佳配為：緩沖蛋白胨水20.1g/L、NaCl20g/L、亞碲酸鉀1mg/L、3號膽鹽2.5g/L、檸檬酸鈉5g/L葡萄糖1.25g/L、甘露醇1.25g/L、亞硫酸鈉1.25g/L以及丙酮酸納0.05g/L。結(jié)果顯示,SVV培養(yǎng)基能有效抑制競爭菌群,經(jīng)過一步增殖即可有效富集單個(gè)目標(biāo)菌或者混合目標(biāo)菌生長至105-108cfu/mL。同時(shí),SVV共增培養(yǎng)基具有良好的適用性,與PCR檢測技術(shù)聯(lián)用時(shí)與傳統(tǒng)檢測法的符合率達(dá)100%,能有效監(jiān)測目標(biāo)菌。以沙門氏菌的invA基因、副溶血弧菌的toxR基因和霍亂弧菌的hlyA基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物探針,對設(shè)計(jì)的多對引物探針組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選優(yōu)化,獲得最佳引物探針組合。向反應(yīng)體系中添加抗干擾物質(zhì)BSA 0.04%（w/v）和甲酰胺0.01%（w/v）提高PCR反應(yīng)體系的抗干擾能力。通過優(yōu)化反應(yīng)組分濃度和反應(yīng)條件,建立了抗干擾三重?zé)晒釶CR檢測方法。25μL反應(yīng)體系包含：1×Buffer, MgCl2 3.75mmol/L, dNTP mixture 1mmol/L,沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌的上下游引物濃度分別為0.5mmol/L、0.4 mmol/L、0.46mmol/L,探針濃度分別為0.18μmol/L、0.2μmol/L、0.22μmol/L, Taq DNA聚合酶2.5U,模板2μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4min,94℃10s、60℃45s,40個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示,該法的檢測特異性達(dá)到100%,對目標(biāo)菌的檢測靈敏度分別為沙門氏菌1300cfu/mL、副溶血弧菌6400cfu/mL、霍亂弧菌2100cfu/mL。用本法與SVV共增培養(yǎng)基聯(lián)用檢測52份實(shí)際樣品,準(zhǔn)確率達(dá)100%,并能有效克服傳統(tǒng)方法對副溶血弧菌的漏檢。共增培養(yǎng)SVV突破了傳統(tǒng)培養(yǎng)法中需要針對單一細(xì)菌進(jìn)行兩步培養(yǎng),使三種目標(biāo)菌通過一步培養(yǎng)即達(dá)到檢測限以上。本文的三重?zé)晒釶CR能與簡單的DNA提取方法聯(lián)用,進(jìn)一步簡化了檢測過程,并能保證PCR反應(yīng)順利進(jìn)行。本文建立的SVV共增培養(yǎng)聯(lián)合三重?zé)晒釶CR檢測方法能快速、準(zhǔn)確地監(jiān)測沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌,可以應(yīng)用于進(jìn)出口水產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫和其它食品的日常監(jiān)測。
王海波[9]（2009）在《重要致病性弧菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立》文中研究指明【目的】建立重要致病性弧菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法,具體包括:（1）霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法（2）O1群和O139群霍亂弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法（3）霍亂毒素基因（ctx）TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法（4）副溶血弧菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法（5）耐熱直接溶血素基因（tdh）和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素基因（trh）雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法（6）創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法（7）霍亂毒素基因和耐熱直接溶血素基因雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法（8）嗜水氣單胞菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法。[方法]對“目的”中涉及的前7個(gè)實(shí)時(shí)PCR檢測方法,本研究采取如下實(shí)驗(yàn)方案:（1）查閱文獻(xiàn)確定待檢測的目的基因,通過序列比對確定待檢基因的保守序列,然后借助引物探針設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)單重和（或）雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR引物和探針。（2）引物擴(kuò)增待測基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與T載體連接制備擴(kuò)增產(chǎn)物克隆子,挑選陽性克隆子提取質(zhì)粒,測序確認(rèn)。用EasyDilution將上述質(zhì)粒依次稀釋成1.0×1010拷貝/μl—1.0×100拷貝/μl。（3）分別在100—1000 nmol/L 10個(gè)濃度梯度和100—500 nmol/L 5個(gè)濃度梯度內(nèi),借助方差分析優(yōu)化引物和探針的濃度。（4）單重實(shí)時(shí)PCR靈敏度和特異度的評價(jià)。（5）以1.0×108拷貝/μl—1.0×100拷貝/μl 9個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒為模板,每個(gè)濃度梯度做8個(gè)平行樣,在伯樂公司的CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,確定單重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系的檢測下限以及擴(kuò)增效率。（6）將優(yōu)化了的單重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系組合成雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系,并對雙重實(shí)時(shí)PCR的檢測下限進(jìn)行評價(jià)。對嗜水氣單胞菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法,檢測下限的評價(jià)包括菌液的檢測下限和DNA的檢測下限。將一系列稀釋度的嗜水氣單胞菌菌液人工污染健康人的糞便,評價(jià)該檢測方法從未經(jīng)增菌處理的糞便中以及增菌3小時(shí)、8小時(shí)和16小時(shí)的糞便中檢測出嗜水氣單胞菌的能力?！窘Y(jié)果】建立了重要致病性弧菌的TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法。具體結(jié)果為:（1）霍亂弧菌外膜蛋白W基因（out membrane protein w,ompW）和擬態(tài)弧菌的溶血素基因（Vibrio mimicus hemolysin,vmh）作為霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的待檢基因。優(yōu)化的反應(yīng)體系中,霍亂弧菌引物和探針的濃度分別為100 nmol/L和200 nmol/L;擬態(tài)弧菌引物和探針的濃度分別為100 nmol/L和100 nmol/L。該反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對兩種質(zhì)粒模板的檢測下限均為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率分別為:100.9%和99.7%。（2）O1和O139的O抗原合成基因rfb基因作為O1群和O139群霍亂弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的待檢基因。優(yōu)化的反應(yīng)體系中,O1的引物和探針的濃度均為200 nmol/L;O139的引物和探針的濃度均為200 nmol/L。該反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對兩種質(zhì)粒模板的檢測下限均為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率分別為:101.4%和99.9%。（3）優(yōu)化的霍亂毒素基因?qū)崟r(shí)PCR反應(yīng)體系中,ctx引物和探針的濃度均為200 nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對ctx質(zhì)粒模板的檢測下限為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率為99.8%。（4）副溶血弧菌的toxR基因被選作副溶血弧菌的特異性基因。優(yōu)化的toxR引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L;反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。該反應(yīng)體系對toxR質(zhì)粒模板的檢測下限為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率為100.1%。（5）優(yōu)化的tdh和trh雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中,tdh引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L;trh引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L。該反應(yīng)體系對兩種質(zhì)粒模板的檢測下限均為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率分別為:97.3%和100.1%。（6）創(chuàng)傷弧菌的溶血素基因（Vibrio vulnificus hemolysin,vvh）和溶藻弧菌的膠原酶基因（Vibrio alginolyticus collagenase,col）被選作為創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的待檢基因。優(yōu)化的反應(yīng)體系中,創(chuàng)傷弧菌引物和探針的濃度均為200 nmol/L;溶藻弧菌引物和探針的濃度均為200 nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對兩種質(zhì)粒模板的檢測下限均為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率分別為:100.5%和101.5%。（7）優(yōu)化的tdh和ct雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中,ct引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L;tdh引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。優(yōu)化的反應(yīng)體系對兩種質(zhì)粒模板的檢測下限均為1.0×102拷貝/μl,擴(kuò)增效率分別為:94%和97.7%。（8）嗜水氣單胞菌的主要粘附素基因（Aeromonas hydrophila major adhesiongene,aha）被選為嗜水氣單胞菌的特異性基因。優(yōu)化的引物和探針的濃度分別為200 nmol/L和100 nmol/L。反應(yīng)體系的靈敏度和特異度均為100%。該反應(yīng)體系對純培養(yǎng)物DNA的檢測下限為1 pg/μl,對菌液的檢測下限為80 CFU/ml。對未經(jīng)增菌的人工污染糞便標(biāo)本的檢測下限為8×103 CFU/ml,增菌3小時(shí)對檢測下限沒有影響,增菌8小時(shí)和16小時(shí)后,檢測下限能達(dá)到8 CFU/ml。【結(jié)論】本研究建立了基于TaqMan探針的重要致病性弧菌的實(shí)時(shí)PCR檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明它們具有令人滿意的靈敏度和特異度。檢測下限能達(dá)到1.0×102拷貝/μl,高于普通PCR 10-1000倍。并且雙重實(shí)時(shí)PCR能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測兩種菌或者兩個(gè)致病基因,大大減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和對試劑的消耗。因此,上述檢測方法可用于重要致病性弧菌的快速檢測及篩查,尤其是當(dāng)樣本量很大或者爆發(fā)疫情時(shí)。
王海波,王多春,闞飆,畢振強(qiáng)[10]（2009）在《副溶血弧菌TaqMan雙重實(shí)時(shí)-聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法的建立》文中研究指明目的建立副溶血弧菌TaqMan實(shí)時(shí)-PCR和毒力基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)-PCR篩檢的實(shí)驗(yàn)室檢測方法。方法根據(jù)副溶血弧菌toxR基因的保守序列設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針,建立檢測副溶血弧菌的實(shí)時(shí)-PCR方法;根據(jù)副溶血弧菌耐熱直接溶血素（thermostable direct hemolysin,tdh）和耐熱相關(guān)溶血素（thermostable relatedhemolysin,trh）基因的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針,建立檢測致病性副溶血弧菌毒力基因的雙重TaqMan實(shí)時(shí)-PCR方法。對所建立的副溶血弧菌實(shí)時(shí)-PCR檢測方法進(jìn)行靈敏度和特異度評價(jià)。結(jié)果副溶血弧菌的檢測下限為102拷貝/μl,tdh和trh雙重實(shí)時(shí)PCR的檢測下限為102拷貝/μl。針對toxR基因建立的副溶血弧菌實(shí)時(shí)-PCR方法對11種其他弧菌和腸道細(xì)菌的染色體無擴(kuò)增。結(jié)論建立的方法能夠特異和敏感地檢測副溶血弧菌,并能確定致病性副溶血弧菌的毒力基因,能作為副溶血弧菌的靈敏和快速檢測方法。
二、雙重實(shí)時(shí)PCR快速同時(shí)檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會科學(xué)用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、雙重實(shí)時(shí)PCR快速同時(shí)檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌（論文提綱范文）
（1）基于HAND系統(tǒng)15種食源性致病菌多重實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 第1章 緒論 |
| 1.1 食源性致病菌 |
| 1.2 病原微生物常用鑒別方法 |
| 1.2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法 |
| 1.2.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)法的優(yōu)化 |
| 1.2.3 免疫學(xué)檢測 |
| 1.2.4 核酸檢測 |
| 1.3 研究目的及意義 |
| 1.4 技術(shù)路線 |
| 第2章 基于HAND系統(tǒng)食源性致病菌實(shí)時(shí)PCR檢測技術(shù)的建立 |
| 2.1 材料與設(shè)備 |
| 2.1.1 菌株及來源 |
| 2.1.2 培養(yǎng)基和試劑 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 菌株的培養(yǎng)和模板DNA的制備 |
| 2.2.2 靶序列與引物 |
| 2.2.3 單重?zé)晒舛縋CR體系的建立 |
| 2.2.4 單重實(shí)時(shí)PCR的特異性 |
| 2.2.5 單重實(shí)時(shí)PCR的敏感性 |
| 2.2.6 單重實(shí)時(shí)PCR的重復(fù)性和穩(wěn)定性 |
| 2.2.7 多重實(shí)時(shí)PCR體系的建立 |
| 2.2.8 多重時(shí)候PCR的特異性 |
| 2.2.9 多重實(shí)時(shí)PCR的敏感性 |
| 2.2.10 多重實(shí)時(shí)PCR的重復(fù)性和穩(wěn)定性 |
| 2.3 結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 單重?zé)晒舛縋CR體系的建立 |
| 2.3.2 單重?zé)晒舛縋CR特異性結(jié)果 |
| 2.3.3 單重實(shí)時(shí)PCR敏感性結(jié)果 |
| 2.3.4 單重實(shí)時(shí)PCR重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果 |
| 2.3.5 多重實(shí)時(shí)PCR體系的建立 |
| 2.3.6 多重?zé)晒舛縋CR特異性結(jié)果 |
| 2.3.7 多重?zé)晒舛縋CR敏感性結(jié)果 |
| 2.3.8 多重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第3章 多重實(shí)時(shí)PCR體系的玻璃化 |
| 3.1 材料與設(shè)備 |
| 3.1.1 菌株及來源 |
| 3.1.2 培養(yǎng)基和試劑 |
| 3.1.3 主要儀器 |
| 3.2 試驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 菌株的培養(yǎng)和模板DNA的制備 |
| 3.2.2 反應(yīng)體系的玻璃化 |
| 3.2.3 玻璃化試劑穩(wěn)定性 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 反應(yīng)體系的玻璃化 |
| 3.3.2 玻璃化試劑穩(wěn)定性 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第4章 復(fù)雜樣本的快速提取 |
| 4.1 材料與方法 |
| 4.1.1 菌株及來源 |
| 4.1.2 培養(yǎng)基與試劑 |
| 4.1.3 主要儀器 |
| 4.2 復(fù)雜樣本快速提取方法 |
| 4.2.1 食品模擬樣本 |
| 4.2.2 糞便模擬標(biāo)本 |
| 4.3 結(jié)果 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 展望 |
| 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡介 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文和科研成果 |
（2）副溶血弧菌qPCR檢測及T6SS-1效應(yīng)因子的篩選和功能研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符號與縮略語 |
| 前言 |
| 第一篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一章 副溶血弧菌相關(guān)毒力因子及其致病機(jī)理 |
| 1 副溶血弧菌的致病力及流行 |
| 2 副溶血弧菌的檢測方法 |
| 2.1 常規(guī)分離鑒定 |
| 2.2 免疫學(xué)檢測方法 |
| 2.3 分子生物學(xué)檢測方法 |
| 3 副溶血弧菌的主要毒力因子 |
| 3.1 溶血素 |
| 3.2 黏附相關(guān)因子 |
| 3.3 Ⅲ型分泌系統(tǒng) |
| 3.4 Ⅵ型分泌系統(tǒng) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二篇 試驗(yàn)研究 |
| 第二章 副溶血弧菌與霍亂弧菌雙重?zé)晒舛縋CR快速檢測方法的建立及應(yīng)用 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 菌株與引物設(shè)計(jì) |
| 1.2 試劑與儀器 |
| 1.3 雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立 |
| 1.4 敏感性試驗(yàn) |
| 1.5 特異性試驗(yàn) |
| 1.6 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 1.7 人工染菌蝦和貝類樣品的檢測 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增 |
| 2.2 敏感性試驗(yàn) |
| 2.3 特異性試驗(yàn) |
| 2.4 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 2.5 人工染菌樣品的檢測 |
| 3 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三章 副溶血弧菌T6SS-1效應(yīng)蛋白的篩選與鑒定 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 菌株、質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞 |
| 1.2 試驗(yàn)動物 |
| 1.3 試驗(yàn)試劑與儀器 |
| 1.4 副溶血弧菌T6SS-1分泌蛋白的提取 |
| 1.5 上清蛋白SDS-PAGE分析 |
| 1.6 Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析 |
| 1.7 原核表達(dá)引物設(shè)計(jì)與合成 |
| 1.8 vp0837和vp0285基因的PCR擴(kuò)增 |
| 1.9 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 |
| 1.10 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 1.11 重組蛋白的純化 |
| 1.12 重組蛋白VP0837和VP0285多克隆抗體的制備 |
| 1.13 ELISA測定表達(dá)產(chǎn)物免疫效價(jià) |
| 1.14 Western-blot鑒定效應(yīng)蛋白VP0837和VP0285 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 副溶血弧菌T6SS-1分泌蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.2 Label-free鑒定和定量結(jié)果評估 |
| 2.3 vp0837和vp0285基因的PCR擴(kuò)增 |
| 2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 |
| 2.5 原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及可溶性分析 |
| 2.6 重組蛋白的純化 |
| 2.7 ELISA測定表達(dá)產(chǎn)物免疫效價(jià) |
| 2.8 Western-blot鑒定效應(yīng)蛋白VP0837和VP0285 |
| 3 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第四章 副溶血弧菌T6SS-1效應(yīng)蛋白vp0837基因缺失株的構(gòu)建及致病性分析 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 菌株與引物設(shè)計(jì) |
| 1.2 細(xì)胞及試驗(yàn)動物 |
| 1.3 試劑與儀器 |
| 1.4 vp0837基因缺失株的構(gòu)建 |
| 1.5 vp0837基因互補(bǔ)株的構(gòu)建 |
| 1.6 熒光定量PCR檢測基因轉(zhuǎn)錄水平 |
| 1.7 遺傳穩(wěn)定性分析 |
| 1.8 生長曲線的測定 |
| 1.9 細(xì)菌運(yùn)動性檢測 |
| 1.10 透射電鏡下的鞭毛結(jié)構(gòu)觀察 |
| 1.11 不同菌株生物被膜形成能力測定 |
| 1.12 細(xì)胞黏附與入侵能力測定 |
| 1.13 細(xì)胞毒性測定 |
| 1.14 細(xì)胞因子測定 |
| 1.15 半數(shù)致死量(LD_(50))的測定 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 vp0837基因缺失株的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 |
| 2.2 C△vp0837互補(bǔ)株的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 |
| 2.3 熒光定量PCR檢測結(jié)果 |
| 2.4 遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果 |
| 2.5 生長曲線的測定結(jié)果 |
| 2.6 細(xì)菌運(yùn)動性檢測結(jié)果 |
| 2.7 透射電鏡下的鞭毛結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果 |
| 2.8 生物被膜形成能力測定結(jié)果 |
| 2.9 細(xì)胞黏附與入侵能力測定結(jié)果 |
| 2.10 細(xì)胞毒性測定結(jié)果 |
| 2.11 細(xì)胞因子測定結(jié)果 |
| 2.12 半數(shù)致死量(LD_(50))的測定結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 全文總結(jié) |
| 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文 |
（3）威海地區(qū)食源性細(xì)菌的分布及病原性海洋弧菌多重降落PCR方法的建立（論文提綱范文）
| 摘要 abstract 引言 材料與方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及臨床菌株 |
| 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 1.3 主要實(shí)驗(yàn)溶液配制 |
| 1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 |
| 2 臨床標(biāo)本采集與處理 |
| 3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感實(shí)驗(yàn) |
| 3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的培養(yǎng)和鑒定 |
| 3.2 臨床標(biāo)本中細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定 |
| 3.3 細(xì)菌質(zhì)譜鑒定 |
| 3.4 藥物敏感試驗(yàn) |
| 4 細(xì)菌基因組DNA的提取 |
| 5 PCR引物設(shè)計(jì) |
| 6 單一降落PCR |
| 6.1 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 |
| 6.2 單一降落PCR特異性檢測 |
| 6.3 單一降落PCR敏感性檢測 |
| 7 多重降落PCR |
| 7.1 PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 |
| 7.2 多重降落PCR特異性檢測 |
| 7.3 多重降落PCR敏感性檢測 |
| 8 多重降落PCR檢測臨床標(biāo)本 結(jié)果 |
| 1 威海地區(qū)食源性疾病致病菌的鑒定及分布 |
| 1.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 |
| 1.2 威海地區(qū)食源性疾病致病菌的分布 |
| 1.3 抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2 單一降落PCR檢測結(jié)果 |
| 2.1 單一降落PCR特異性檢測結(jié)果 |
| 2.2 單一降落PCR敏感性檢測結(jié)果 |
| 3 多重降落PCR檢測結(jié)果 |
| 3.1 多重降落PCR特異性檢測結(jié)果 |
| 3.2 多重降落PCR敏感性檢測結(jié)果 |
| 4 臨床標(biāo)本驗(yàn)證結(jié)果 討論 結(jié)論 參考文獻(xiàn) 綜述 |
| 綜述參考文獻(xiàn) 攻讀學(xué)位期間的研究成果 致謝 |
（4）雙重DPO-PCR檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌（論文提綱范文）
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料與儀器 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.2.1 基因組DNA的提取 |
| 1.2.2 引物設(shè)計(jì) |
| 1.2.3 雙重DPO-PCR體系 |
| 1.2.4 雙重DPO-PCR體系退火溫度敏感性實(shí)驗(yàn) |
| 1.2.5 雙重DPO-PCR體系的特異性評價(jià) |
| 1.2.6 雙重DPO-PCR體系的靈敏度評價(jià) |
| 1.2.7 雙重DPO-PCR體系檢測實(shí)際樣品 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 兩種弧菌的雙重DPO-PCR檢測方法建立 |
| 2.2 雙重DPO-PCR退火溫度敏感性實(shí)驗(yàn) |
| 2.3 雙重DPO-PCR體系的特異性評價(jià) |
| 2.4 雙重DPO-PCR體系的靈敏度評價(jià) |
| 2.5 雙重DPO-PCR體系對實(shí)際樣品的檢測 |
| 3 結(jié)論 |
（5）霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重?zé)晒釶CR檢測方法的建立（論文提綱范文）
| 1材料與方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 2結(jié)果 |
| 3討論 |
（7）霍亂毒素基因（ctx）和耐熱直接溶血素基因（tdh）雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立（論文提綱范文）
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 |
| 1.1.2 ctx和tdh雙重引物和探針的設(shè)計(jì) |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.2.1 細(xì)菌染色體DNA的提取 |
| 1.2.2 質(zhì)粒的制備 |
| 1.2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 |
| 1.2.3. 1 引物濃度的優(yōu)化 |
| 1.2.3. 2 探針濃度的優(yōu)化 |
| 1.2.4 實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)條件 |
| 1.2.4. 1 ctx和tdh基因單重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件 |
| 1.2.4. 2 ctx和tdh基因雙重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件 |
| 1.2.5 靈敏度的檢測 |
| 1.2.6 特異度檢測 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 |
| 2.1.1 引物濃度的優(yōu)化 |
| 2.1.2 探針濃度的優(yōu)化 |
| 2.2 靈敏度的檢測 |
| 2.2.1 ctx和tdh基因單重實(shí)時(shí)PCR靈敏度 |
| 2.2.2 ctx和tdh雙重實(shí)時(shí)PCR靈敏度 |
| 2.3 特異度檢測 |
| 2.4 擴(kuò)增效率 |
| 3 討論 |
（8）沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌同時(shí)檢測方法的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 立題依據(jù) |
| 1.1.1 沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌是水產(chǎn)品中的主要致病菌 |
| 1.1.2 致病菌的檢測現(xiàn)狀 |
| 1.1.3 沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌的共性 |
| 1.2 課題的研究意義和研究內(nèi)容 |
| 1.2.1 研究意義 |
| 1.2.2 擬解決的關(guān)鍵問題 |
| 1.2.3 主要研究內(nèi)容 |
| 第二章 沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌共增培養(yǎng)基SVV的研制 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.2 儀器與試劑 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2 結(jié)果與討論 |
| 2.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇 |
| 2.2.2 抑制劑的選擇 |
| 2.2.3 促進(jìn)劑的選擇 |
| 2.2.4 抑制劑單因素實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.5 促進(jìn)劑單因素實(shí)驗(yàn) |
| 2.2.6 響應(yīng)面分析優(yōu)化 |
| 2.3 本章小結(jié) |
| 第三章 沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌共增培養(yǎng)基SVV增菌效果的研究 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.2 儀器與試劑 |
| 3.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2 結(jié)果與討論 |
| 3.2.1 SVV的單獨(dú)增菌效果研究 |
| 3.2.2 SVV的復(fù)合增菌效果研究 |
| 3.2.3 SVV的選擇性研究 |
| 3.2.4 競爭菌群對SVV共增效果影響研究 |
| 3.2.5 SVV應(yīng)用于人工接種樣品 |
| 3.2.6 SVV應(yīng)用于實(shí)際樣品 |
| 3.3 本章小結(jié) |
| 第四章 沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌三重?zé)晒釶CR檢測方法的建立 |
| 4.1 材料與方法 |
| 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.1.2 主要儀器與試劑 |
| 4.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.2 結(jié)果與討論 |
| 4.2.1 DNA模板的制備 |
| 4.2.2 PCR反應(yīng)促進(jìn)物質(zhì)的選擇 |
| 4.2.3 引物探針組合篩選 |
| 4.2.4 反應(yīng)體系優(yōu)化 |
| 4.2.5 目標(biāo)菌單重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果 |
| 4.2.6 目標(biāo)菌雙重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果 |
| 4.2.7 目標(biāo)菌三重?zé)晒釶CR擴(kuò)增結(jié)果 |
| 4.2.8 三重?zé)晒釶CR檢測特異性 |
| 4.2.9 三重?zé)晒釶CR靈敏度實(shí)驗(yàn) |
| 4.2.10 三重?zé)晒釶CR檢測技術(shù)適用性結(jié)果 |
| 4.3 本章小結(jié) |
| 結(jié)論與展望 |
| 一、結(jié)論 |
| 二、課題創(chuàng)新性闡述 |
| 三、展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
| 評定意見 |
（9）重要致病性弧菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測體系的建立 |
| 前言 |
| 一、霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和結(jié)果 |
| 3.討論 |
| 4.參考文獻(xiàn) |
| 二、O1和O139雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和結(jié)果 |
| 3.討論 |
| 4.參考文獻(xiàn) |
| 三、霍亂毒素基因(ctx)TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和結(jié)果 |
| 3.討論 |
| 4.參考文獻(xiàn) |
| 四、小結(jié) |
| 第二部分 副溶血弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測體系的建立 |
| 前言 |
| 一、副溶血弧菌toxR基因?qū)崟r(shí)PCR檢測方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和結(jié)果 |
| 3.討論 |
| 二、tdh和trh雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和結(jié)果 |
| 3.tdh和trh雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的應(yīng)用 |
| 4.討論 |
| 三、小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測體系的建立 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法和結(jié)果 |
| 3.討論 |
| 4.參考文獻(xiàn) |
| 第四部分 ctx和tdh雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測體系的建立 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法和結(jié)果 |
| 3.討論 |
| 4.參考文獻(xiàn) |
| 第五部分 嗜水氣單胞菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測體系的建立 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法和結(jié)果 |
| 3.討論 |
| 4.參考文獻(xiàn) |
| 研究總結(jié) |
| 附錄 |
| 致謝 |
| 碩士期間發(fā)表論文情況 |
| 學(xué)位論文評閱及答辯情況表 |
（10）副溶血弧菌TaqMan雙重實(shí)時(shí)-聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法的建立（論文提綱范文）
| 1 材料與方法 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 |
| 1.2 引物和探針的設(shè)計(jì) |
| 1.3 細(xì)菌染色體DNA的提取 |
| 1.4 質(zhì)粒的制備 |
| 1.5 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化 |
| 1.5.1 引物濃度的優(yōu)化 |
| 1.5.2 探針濃度的優(yōu)化 |
| 1.6 實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)條件 |
| 1.6.1 toxR、tdh和trh |
| 1.6.2 檢測tdh和trh基因的雙重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件 |
| 1.7 靈敏度的檢測 |
| 1.7.1 單重實(shí)時(shí)PCR靈敏度的檢測 |
| 1.7.2 tdh和trh雙重實(shí)時(shí)PCR靈敏度的檢測 |
| 1.8 toxR檢測副溶血弧菌特異度檢測 |
| 1.9 tdh和trh雙重實(shí)時(shí)PCR的應(yīng)用 |
| 2 結(jié)果 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化 |
| 2.1.1 引物濃度的優(yōu)化 |
| 2.1.2 探針濃度的優(yōu)化 |
| 2.2 靈敏度的檢測 |
| 2.3 toxR檢測副溶血弧菌特異度檢測 |
| 2.4 tdh和trh雙重實(shí)時(shí)PCR的應(yīng)用 |
| 3 討論 |
四、雙重實(shí)時(shí)PCR快速同時(shí)檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]基于HAND系統(tǒng)15種食源性致病菌多重實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立[D]. 鐘宜科. 河北工程大學(xué), 2020(02)
- [2]副溶血弧菌qPCR檢測及T6SS-1效應(yīng)因子的篩選和功能研究[D]. 凌嬌. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018(07)
- [3]威海地區(qū)食源性細(xì)菌的分布及病原性海洋弧菌多重降落PCR方法的建立[D]. 王義濤. 青島大學(xué), 2018(01)
- [4]雙重DPO-PCR檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌[J]. 魏霜,馬新華,汪天杰,龍陽,紀(jì)強(qiáng),任嬌,吳希陽. 食品工業(yè)科技, 2016(22)
- [5]霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重?zé)晒釶CR檢測方法的建立[J]. 韓輝,畢玉國,祁軍,胡群,譚緒良,吳海磊,王靜,徐寶梁. 中國國境衛(wèi)生檢疫雜志, 2015(03)
- [6]多重實(shí)時(shí)熒光PCR法快速檢測水體中致病性弧菌的研究[J]. 周冬根,孫大為,倪敏君,王燕,張升,翟敏. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2012(04)
- [7]霍亂毒素基因（ctx）和耐熱直接溶血素基因（tdh）雙重TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立[J]. 韓輝,李海山,胡群,姚李四,譚緒良,賈琳. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2011(18)
- [8]沙門氏菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌同時(shí)檢測方法的研究[D]. 覃倚瑩. 華南理工大學(xué), 2010(04)
- [9]重要致病性弧菌TaqMan實(shí)時(shí)PCR檢測方法的建立[D]. 王海波. 山東大學(xué), 2009(06)
- [10]副溶血弧菌TaqMan雙重實(shí)時(shí)-聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法的建立[J]. 王海波,王多春,闞飆,畢振強(qiáng). 疾病監(jiān)測, 2009(04)
標(biāo)簽：霍亂弧菌論文; pcr論文; 副溶血性弧菌論文; 溶血反應(yīng)論文; 引物設(shè)計(jì)論文;