一、按大腸桿菌高表達(dá)序列設(shè)計(jì)的人干擾素α-2b基因的化學(xué)合成和克?。ㄕ撐奈墨I(xiàn)綜述）
楊瑞[1]（2020）在《表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞系的建立及免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)》文中研究指明豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus Type 2,PCV2）被認(rèn)為是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒orcine Circovirus Associated Disease,PCVAD）的主要傳播病原體之一,每年給我國(guó)乃至全球仔豬養(yǎng)殖和育種業(yè)的發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,疫苗接種是控制和預(yù)防PCVAD的主要措施。研究表明,衣殼蛋白（Cap）是PCV2的最具免疫原性的蛋白,與PCV2的感染和免疫力密切相關(guān)。因此,Cap蛋白是開發(fā)PCV2疫苗的潛在靶蛋白。為了獲得高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,本研究首先以熒光素酶（Luciferase,Luc）為報(bào)告基因,篩選不同的啟動(dòng)子和信號(hào)肽對(duì)其在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)的影響,在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建可表達(dá)PCV2 Cap蛋白的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后篩選得到穩(wěn)定表達(dá)Cap蛋白的細(xì)胞株。另外,為了提高Cap蛋白的免疫原性,本研究也探討了腦膜炎球菌外膜蛋白PorB對(duì)其免疫原性的增強(qiáng)作用。將CMV和CAG 2種啟動(dòng)子和5種不同來源的信號(hào)肽（人血清白蛋白、氮雜環(huán)蛋白前體蛋白、小鼠信號(hào)肽Ig Gκ、人干擾素-α2、人白細(xì)胞介素-2）分別與Luc報(bào)告基因進(jìn)行融合構(gòu)建重組真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞后通過化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)Luc蛋白的表達(dá)量,最終篩選出CAG啟動(dòng)子及人干擾素-α2信號(hào)肽（命名為SP4）可顯著增加Luc蛋白的表達(dá),結(jié)果證明了CHO細(xì)胞高效表達(dá)體系的成功建立。最后,將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的Cap基因構(gòu)建到p CDNA3.1-CAG-SP4-Luc真核表達(dá)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒p CDNA3.1-CAG-SP4-Cap,通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞,G418篩選獲得單克隆,經(jīng)有限稀釋法擴(kuò)大培養(yǎng)后得到能夠高效表達(dá)Cap蛋白的細(xì)胞株SP4-1,并分離純化該細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后的蛋白,得到的重組Cap蛋白進(jìn)行Western bloting鑒定。結(jié)果表明,Cap蛋白能夠在CHO-K1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。將收集的重組Cap蛋白通過鎳柱進(jìn)行純化,使用BCA法測(cè)定蛋白濃度為637±0.165mg/L。最后,以原核表達(dá)系統(tǒng)制備的重組腦膜炎球菌外膜蛋白PorB為免疫增強(qiáng)劑免疫動(dòng)物,結(jié)果證明,經(jīng)CHO-K1細(xì)胞表達(dá)的Cap蛋白具備良好的免疫原性,且原核表達(dá)的重組PorB蛋白具有顯著的免疫增強(qiáng)作用。本研究為開發(fā)新型有效防治豬圓環(huán)病毒的疫苗及相關(guān)佐劑奠定基礎(chǔ)。
梁濤[2]（2020）在《人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-Ts的原核表達(dá)及體外合成O-糖基化修飾的白介素-2》文中提出O-GalNAc糖基化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式,不僅在蛋白質(zhì)加工、細(xì)胞增殖分化、免疫炎癥等過程中具有重要功能,還在重組蛋白類藥物修飾中具有重要意義,如缺乏糖基化修飾會(huì)縮短重組蛋白藥物的體內(nèi)半衰期或降低藥效。多肽:N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶（polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase,ppGalNAc-T,EC:2.4.1.41）是催化蛋白質(zhì)O-GalNAc糖基化修飾的起始糖基轉(zhuǎn)移酶,是調(diào)控人體蛋白質(zhì)發(fā)生O-糖基化修飾及其糖蛋白生物功能的關(guān)鍵酶。體外高產(chǎn)量獲得人源ppGalNAc-T酶對(duì)于重組治療性O(shè)-糖蛋白藥物的合成,疫苗生產(chǎn)及工具酶的開發(fā)都具有重要意義。由于ppGalNAc-T從進(jìn)化上只存在于真核后生動(dòng)物中,在細(xì)菌和酵母中不存在可以取代的同功酶。長(zhǎng)期以來人們只能通過化學(xué)合成多肽的方式來取得O-GalNAc修飾糖肽,但對(duì)于大分子蛋白藥物的O-糖鏈合成仍存在局限。利用昆蟲細(xì)胞或人源HEK 293T細(xì)胞表達(dá)ppGalNAc-T酶存在表達(dá)量低、培養(yǎng)成本高等問題,無(wú)法適應(yīng)日益增長(zhǎng)的多肽蛋白類藥物生產(chǎn)的需求。而過往在利用原核系統(tǒng)表達(dá)人源ppGalNAc-T酶時(shí)存在需要多個(gè)分子伴侶共表達(dá)幫助該酶折疊而導(dǎo)致表達(dá)效率低等問題。因此,本研究我們開發(fā)了一種可以獲得產(chǎn)量達(dá)12 mg/L以上并具有穩(wěn)定酶活的ppGalNAc-T酶的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。本研究使用了Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS作為表達(dá)菌株,通過在該菌株胞內(nèi)共表達(dá)人源蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfide-isomerase,PDI,EC:5.3.4.1）,成功從大腸桿菌中表達(dá)純化了高酶活的ppGalNAc-T酶。本論文主要內(nèi)容和研究結(jié)果如下:（1）建立了一種操作簡(jiǎn)便、表達(dá)量高以及酶活強(qiáng)的大腸桿菌表達(dá)ppGalNAc-T酶的方法。研究發(fā)現(xiàn)在Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS菌株胞內(nèi)共表達(dá)人源重組PDI和ppGalNAc-T酶,可以幫助ppGalNAc-T酶二硫鍵形成并且正確折疊。以ppGalNAc-T2酶為例,經(jīng)過表達(dá)條件優(yōu)化后可以從1 L培養(yǎng)基中獲得超過12 mg的有活性的ppGalNAc-T2酶。（2）利用基于HPLC的酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、圓二色譜實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn),我們系統(tǒng)性比較了E.coli和HEK 293T細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的ppGalNAc-T2酶之間的差異。發(fā)現(xiàn)E.coli-T2和293T-T2針對(duì)受體底物EA2多肽和供體底物UDP-GalNAc具有相似的Vmax,但是E.coli-T2相比293T-T2對(duì)EA2和UDP-GalNAc的親和力更強(qiáng)。圓二色譜結(jié)果表明,E.coli-T2具有和293T-T2相似的熱穩(wěn)定性,但是二者的α螺旋結(jié)構(gòu)存在輕微差異。（3）利用體外酶法合成及點(diǎn)突變技術(shù),我們證實(shí)大腸桿菌表達(dá)的ppGalNAc-T2酶可以選擇性的在白介素-2（Interleukin-2,IL-2）蛋白T23位點(diǎn)上進(jìn)行O-GalNAc糖基化修飾。該結(jié)果一方面驗(yàn)證了大腸桿菌表達(dá)的ppGalNAc-T酶的活性,同時(shí)為理解ppGalNAc-T酶精密調(diào)控底物蛋白糖基化的機(jī)制提供實(shí)例。綜上所述,本研究中我們通過PDI共表達(dá)等方法構(gòu)建了一種新型的ppGalNAc-T酶的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便,可以生產(chǎn)大量有活性的ppGalNAc-T酶。以IL-2為例,我們證實(shí)這種大腸桿菌表達(dá)的ppGalNAc-T酶能夠用于體外催化蛋白上O-GalNAc糖鏈合成。本研究為體外合成均一化的O-糖蛋白藥物提供了新的技術(shù)支持,同時(shí)相似的策略可以用來嘗試表達(dá)其他的糖基轉(zhuǎn)移酶。
于榮榮[3]（2019）在《改造和優(yōu)化人干擾素α-2b基因序列并在大腸桿菌中做表達(dá)驗(yàn)證》文中研究表明提高外源基因的表達(dá)水平一直是生物技術(shù)探討的熱點(diǎn)問題。在理論上,探討更有效的基因序列改造和優(yōu)化方案,對(duì)于提高外源基因的表達(dá)水平具有重要意義和實(shí)用價(jià)值。本研究提出了針對(duì)人干擾素α-2b基因的改造和優(yōu)化方案,期望在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)。研究?jī)蓚€(gè)部分,第一部分在理論上將人干擾素α-2b基因（IFNα-2b）編碼序列（CDS）改造成大腸桿菌高表達(dá)基因的偏好模式,然后配置選定的啟動(dòng)子區(qū)和終止子區(qū)序列以便構(gòu)成完整基因。第二部分是為了檢驗(yàn)我們的理論方法的可靠性,將改造和優(yōu)化的人IFNα-2b基因在大腸桿菌中表達(dá)。（一）人干擾素α-2b基因改造和優(yōu)化方案。對(duì)編碼序列改造分為兩步,首先將編碼序列中的密碼子置換成大腸桿菌高表達(dá)基因的最適同義密碼子。其次將編碼序列中緊鄰密碼子第三位點(diǎn)的堿基關(guān)聯(lián)置換成大腸桿菌高表達(dá)基因的強(qiáng)關(guān)聯(lián)模式。在此過程中,在強(qiáng)關(guān)聯(lián)模式和最適或次最適同義密碼子的置換上做出最佳選擇。以大腸桿菌中高表達(dá)基因lpp的啟動(dòng)區(qū)和終止區(qū)序列作為改造基因的啟動(dòng)區(qū)和終止區(qū)序列。以lpp啟動(dòng)區(qū)中的SD序列作為高表達(dá)啟動(dòng)區(qū)的SD序列,將低表達(dá)基因的SD序列替換lpp啟動(dòng)區(qū)中的SD序列作為對(duì)照序列。構(gòu)造三條完整的人干擾素α-2b基因,它們是“高表達(dá)SD+改造前CDS”基因（GWGB）,“高表達(dá)SD+改造后CDS”基因（GGB）和“低表達(dá)SD+改造后CDS”基因（DGB）。（二）GWGB基因和GGB基因作為第一對(duì)照組,檢驗(yàn)編碼序列改造前和改造后的表達(dá)差異。GGB基因和DGB基因作為第二對(duì)照組,檢驗(yàn)的是高表達(dá)SD序列和低表達(dá)SD序列對(duì)基因表達(dá)水平的影響。在大腸桿菌中做表達(dá)對(duì)比實(shí)驗(yàn),我們采用了兩種方式完成表達(dá)實(shí)驗(yàn),（1）由于我們?cè)O(shè)計(jì)的序列是一條完整的基因序列,將重組克隆載體p GM-T-IFNα-2b轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。（2）將重組表達(dá)載體p ET-28a（+）-IFNα-2b轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)（表達(dá)載體中的T7啟動(dòng)子被抑制）。（3）最后通過ELISA檢測(cè)兩個(gè)載體中人干擾素α-2b基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示:在克隆載體中,編碼序列改造后的基因（GGB基因）的表達(dá)量顯著高于編碼序列改造前的基因（GWGB基因）的表達(dá)量,表達(dá)量提高了55.1%;高表達(dá)SD基因的表達(dá)量顯著高于低表達(dá)SD基因的表達(dá)量,表達(dá)量提高了52.8%。在表達(dá)載體中,編碼序列改造后的基因的表達(dá)量顯著高于編碼序列改造前的基因的表達(dá)量,表達(dá)量提高了9.1%;高表達(dá)SD基因的表達(dá)量顯著高于低表達(dá)SD基因的表達(dá)量,表達(dá)量提高了18.2%。結(jié)果表明,基因改造和優(yōu)化的理論方案得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。我們的理論方案對(duì)于提高外源基因的表達(dá)效率具有重要的參考價(jià)值。
姚凌云[4]（2018）在《犬干擾素α2的克隆表達(dá)與抗病毒活性分析》文中研究表明干擾素是由多種細(xì)胞分泌的蛋白家族成員之一,具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。根據(jù)干擾素的核苷酸序列和染色體定位,及其與特定受體的相互作用方式、結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)等,干擾素可以分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3大類。干擾素α屬Ⅰ型干擾素家族,是由白細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種糖蛋白,具有較高的抗病毒活性,在試驗(yàn)研究和抗病毒治療中具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。干擾素也存在半衰期短、給藥頻繁等缺陷,限制了它的臨床應(yīng)用。血清白蛋白是天然存在于動(dòng)物體內(nèi)的一類大分子蛋白質(zhì),具有性質(zhì)穩(wěn)定和半衰期長(zhǎng)的特點(diǎn),在維持膠體滲透壓、運(yùn)輸物質(zhì)和清除自由基等方面有著重要的生理作用,適合用來與干擾素融合表達(dá)以延長(zhǎng)干擾素的半衰期。本試驗(yàn)通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)犬干擾素α2,并鑒定其抗病毒活性;再在昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)犬血清白蛋白與犬干擾素α2的融合干擾素,并進(jìn)一步檢測(cè)其抗病毒活性,為犬干擾素的研究與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)1、犬干擾素α2在大腸桿菌的表達(dá)與抗病毒活性分析根據(jù)Genbank公布的犬干擾素α2序列（M28625.1）,設(shè)計(jì)并合成編碼犬干擾素α2（CaIFN-α2）的成熟蛋白基因,同時(shí)引入EcoRI和HindⅢ酶切位點(diǎn)。將合成的CaIFN-α2基因插入表達(dá)載體pET-28a（+）,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2。將鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western bolt分析可見分子量約為23 kDa的目的蛋白,主要以包涵體的形式存在,表達(dá)量約占菌體總蛋白的52.5%。蛋白包涵體經(jīng)變性、復(fù)性和純化后,獲得的重組CaIFN-α2純度為92%。用犬腎細(xì)胞（MDCK）/水皰性口炎病毒（VSV）系統(tǒng)檢測(cè)重組CaIFN-α2的抗病毒活性為3.16×106U/ml。本試驗(yàn)成功構(gòu)建pET-28a-CaIFN-α2表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)的重組CaIFN-α2具有較好的抗病毒活性,為進(jìn)一步研究新型犬用干擾素制品提供了依據(jù)。試驗(yàn)2、犬干擾素α2在昆蟲細(xì)胞的表達(dá)與抗病毒活性測(cè)定本試驗(yàn)將合成的編碼CaIFN-α2成熟蛋白基因插入pFastBacHTA載體,轉(zhuǎn)化DH1OBac細(xì)胞。經(jīng)過3次篩選純化,獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-CaIFN-α2,并轉(zhuǎn)染Sf 9細(xì)胞后收獲重組桿狀病毒rBac-CaIFN-α2。rBac-CaIFN-α2傳至第3代后,用P3代rBac-CaIFN-α2感染Sf 9昆蟲細(xì)胞3 d,收獲昆蟲細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE、IFA和Western blot分析CaIFN-α2的表達(dá)。IFA結(jié)果表明,CaIFN-α2可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá),SDS-PAGE和Western blot均檢測(cè)到25和28 kDa的表達(dá)產(chǎn)物。利用MDCK/VSV系統(tǒng)檢測(cè)重組CaIFN-α2的抗病毒活性,表達(dá)的重組CaIFN-α2能夠有效抑制VSV對(duì)MDCK細(xì)胞的攻擊,細(xì)胞裂解物的抗病毒活性為5.58×105 U/mL。試驗(yàn)3、犬融合干擾素α2在昆蟲細(xì)胞的表達(dá)將編碼犬血清白蛋白（Alb）基因與CaIFN-α2成熟蛋白基因用柔性肽（GGGGS）連接,并在犬血清白蛋白基因N端接入蜂素信號(hào)肽基因（HBM）。將合成的融合基因HBM-Alb-CaIFN-α2插入pFastBacI載體,轉(zhuǎn)化DH1OBac細(xì)胞。經(jīng)過3次篩選純化,獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-α2,并轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后獲得重組桿狀病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2。重組桿狀病毒傳至第3代后,用P3代感染Sf 9昆蟲細(xì)胞3 d,收獲昆蟲細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE、IFA和Western blot分析重組犬融合干擾素α2的表達(dá)。IFA結(jié)果表明,重組犬融合干擾素α2可在昆蟲細(xì)胞表達(dá);SDS-PAGE和Western blot均檢測(cè)到上清培養(yǎng)物存在90 kDa的表達(dá)產(chǎn)物,表明獲得分泌性表達(dá),符合預(yù)期結(jié)果。用MDCK/VSV系統(tǒng)檢測(cè)重組犬融合干擾素a2的抗病毒活性,表達(dá)的重組犬融合干擾素α2對(duì)MDCK細(xì)胞遭受VSV的攻擊具有抑制作用,細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗病毒活性為 1.78×104U/mL。
張德芳[5]（2017）在《重組干擾素α-2b合成研究進(jìn)展》文中研究表明干擾素α-2b具有抗病毒、抗腫瘤、影響細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等活性,臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。本文就干擾素α-2b的重組基因合成、發(fā)酵、蛋白表達(dá)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,同時(shí)探討干擾素α-2b的長(zhǎng)效化研究,展望干擾素α-2b的研究和應(yīng)用方向。
馬芳[6]（2013）在《盧氏雞IFN-γ成熟蛋白基因的克隆與原核表達(dá)產(chǎn)物處理方法研究》文中認(rèn)為干擾素具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等功能，可作為一種天然治療劑和佐劑，鑒于目前尚未見到關(guān)于地方優(yōu)良品種盧氏雞IFN-γ的相關(guān)研究報(bào)道，本文對(duì)盧氏雞IFN-γ成熟基因序列進(jìn)行了克隆、基因遺傳變異分析及原核表達(dá)，并通過超聲波破碎法、超聲波和溶菌酶聯(lián)合使用法、高壓勻漿法、高壓勻漿和溶菌酶聯(lián)合使用法等四種方法對(duì)盧氏雞IFN-γ重組蛋白進(jìn)行了提取，進(jìn)而對(duì)不同方法的提取效果進(jìn)行了研究，旨在為盧氏雞IFN-γ今后的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)的主要內(nèi)容包括：1.盧氏雞IFN-γ成熟基因序列克隆、鑒定及表達(dá)結(jié)果分析應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出盧氏雞IFN-γ的完整序列，利用在線生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)其信號(hào)肽所在位置，從而設(shè)計(jì)盧氏雞IFN-γ成熟蛋白基因序列引物。采用PCR技術(shù)進(jìn)行盧氏雞IFN-γ成熟蛋白基因序列的擴(kuò)增，并將其克隆到PET-28a載體上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒（PET28a-IFN-γ），并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，通過酶切、PCR、測(cè)序、SDS-PAGE進(jìn)行結(jié)果鑒定。結(jié)果顯示，雞IFN-γ成熟蛋白基因片段克隆成功，約438bp；并在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)，約22KDa。2.盧氏雞IFN-γ與其他禽類IFN-γ的同源性分析將盧氏雞IFN-γ成熟基因與其它禽類的IFN-γ基因進(jìn)行了同源性分析，并繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，盧氏雞IFN-γ與白萊航雞、印度原雞、原雞的核苷酸序列同源性均為99.5%，與火雞、雉雞、鵪鶉的核苷酸序列的同源性分別為96.6%、95.2%、95.0%，與吐綬雞的同源性為92.5%，與大雁、白色吐綬雞、青銅吐綬雞、珍珠雞的同源性均為70.8%，與野鴿的同源性為31.5%。3.盧氏雞IFN-γ四種提取方法獲得的重組蛋白熱原質(zhì)、內(nèi)毒素的測(cè)定結(jié)果分析通過動(dòng)物發(fā)熱試驗(yàn)結(jié)果可知，四種提取方法獲得的雞IFN-γ重組蛋白所含熱原的限度均符合規(guī)定，超聲波與溶菌酶聯(lián)合作用組與其它方法組相比，試驗(yàn)動(dòng)物的體溫變化最小，說明該方法獲得的重組蛋白所含熱原質(zhì)的量最低。通過凝膠法對(duì)內(nèi)毒素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示四種方法獲得的雞IFN-γ重組蛋白內(nèi)毒素含量均不超過規(guī)定限值（10EU/mL），符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定。4.雞IFN-γ四種提取方法獲得的重組蛋白對(duì)家禽生長(zhǎng)和免疫器官指數(shù)的影響口服組和注射組中的五個(gè)試驗(yàn)組法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)在免疫后0d21d之間不存在顯著性差異；各試驗(yàn)組的胸腺指數(shù)的平均值在721d均高于對(duì)照組，并在21d時(shí)，超聲波與溶菌酶聯(lián)合作用組顯著高于對(duì)照組，通過結(jié)果分析，可得知使雞IFN-γ對(duì)法氏囊、脾臟的生長(zhǎng)無(wú)影響，對(duì)胸腺的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。同時(shí)通過觀察試驗(yàn)動(dòng)物的生長(zhǎng)情況，口服組、注射組的試驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲食情況、糞便、剖檢、體重情況等與對(duì)照組沒有明顯的區(qū)別。5.雞IFN-γ四種提取方法獲得的重組蛋白對(duì)NDVⅣ系弱毒苗抗體水平影響的測(cè)定結(jié)果分析四種提取方法獲得的重組蛋白分別采取口服和注射方式和NDVⅥ系弱毒苗聯(lián)合使用，結(jié)果表明：口服組、注射組在免疫后7d各組之間的抗體滴度均高于對(duì)照組。說明雞IFN-γ以包涵體的形式可以提高NDVⅥ系弱毒苗的免疫水平。
樊興冬[7]（2013）在《犬α-干擾素基因的克隆、原核表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定》文中研究說明隨著一些人畜共患病的發(fā)生，尤其是一些具有高致死性病毒性疾病的發(fā)生以及病原新毒株、變異株的不斷出現(xiàn)，使得人們?cè)絹碓街匾暭倚蟮募膊》乐巍Ｗ?957年，Isaacs和Lindanmann發(fā)現(xiàn)干擾素（Interferon, IFN）以來，干擾素的分子結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)和生物學(xué)活性一直被人們所關(guān)注。干擾素是一族具有抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和調(diào)節(jié)免疫功能等活性的蛋白質(zhì)。干擾素作為生物體內(nèi)的第一病毒防御系統(tǒng)，一直是各種生物體內(nèi)重要的細(xì)胞因子之一。大量研究表明，犬干擾素具有廣譜抗病毒活性，抗增生和免疫調(diào)節(jié)功能。犬α-干擾素對(duì)犬的許多病毒性疾病都有治療效果。生產(chǎn)實(shí)踐之中，將犬干擾素作為疫苗佐劑，可以研制出免疫效果很好的新型疫苗，這將對(duì)犬病防治產(chǎn)生積極的作用。利用基因重組干擾素來防治家畜的病毒性疾病，是一種非常有效的手段。通過對(duì)犬α-干擾素成熟蛋白基因（以下簡(jiǎn)稱犬α-干擾素基因）天然序列的分析，并參照天然犬干擾素基因-α，利用各種在線軟件和免費(fèi)軟件分析，將犬α-干擾素基因去掉信號(hào)肽后設(shè)計(jì)并合成引物，引入兩個(gè)酶切位點(diǎn)，利用PCR技術(shù)從犬肝臟基因組DNΑ中擴(kuò)增犬α-干擾素基因，克隆至表達(dá)載體pBV220，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)行重組表達(dá)載體的構(gòu)建。實(shí)現(xiàn)了犬α-干擾素在大腸桿菌DH-5α中的高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)過SDS-PAGE分析后，在約18.0kDa處出現(xiàn)了條帶，其大小和理論值相符合。表達(dá)產(chǎn)物約占菌體總蛋白的32%。變性的包涵體經(jīng)過Sephacryl S-200初步純化后，經(jīng)過優(yōu)化的氧化還原體系，在4℃條件下，將變性的樣品稀釋到終濃度為100～200μg/mL的復(fù)性緩沖液之中復(fù)性。此種方法極大的提高了復(fù)性的收率和效率。復(fù)性之后的蛋白質(zhì)經(jīng)過DEAE-FF進(jìn)一步純化，得到了純度為95%的純化蛋白。純化之后的蛋白，經(jīng)過MDCK-VSV系統(tǒng)以細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)其活性，活性結(jié)果為5.56×106U/mg。
張海濤[8]（2012）在《重組人干擾素-α2b與內(nèi)皮抑素肽融合蛋白抗腫瘤研究》文中提出人干擾素（Interferon）α2b是重要的腫瘤免疫治療藥物，在許多醫(yī)院中作為一線的腫瘤治療藥物被廣泛使用。己獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于多種病毒性疾病和惡性腫瘤的治療。然而，IFNα2b在臨床治療中需要大劑量長(zhǎng)期給藥，因此常常引發(fā)如急性和慢性毒性、神經(jīng)系統(tǒng)損害和血液系統(tǒng)損害等明顯的毒副作用，嚴(yán)重制約了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。人血管內(nèi)皮抑素（Endostatin）是血管生成的抑制劑，在抑制腫瘤血管生成類藥物中表現(xiàn)優(yōu)秀，2009年被SFDA批準(zhǔn)用于治療腫瘤。經(jīng)過大量的研究證實(shí)，人血管內(nèi)皮抑素N末端的27個(gè)氨基酸是其核心功能區(qū)域。在內(nèi)皮抑素N末端的27個(gè)氨基酸基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸的替換和增補(bǔ)，引入串聯(lián)的RGD（Arg-Gly-Asp）序列，形成內(nèi)皮抑素多肽（29amino acid, EP29），在保持內(nèi)皮抑素抑制腫瘤血管生成活性的同時(shí)，RGD序列賦予內(nèi)皮抑素27肽靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)其抗腫瘤活性的效果。實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，EP29體外抗腫瘤活性明顯高于天然內(nèi)皮抑素，體內(nèi)抗腫瘤活性也略高于天然內(nèi)皮抑素，病理切片研究顯示腫瘤組織大面積壞死，腫瘤萎縮。因此，有望成為新一代抗腫瘤小分子藥物。在本研究中，我們采用基因工程技術(shù)，將EP29融合在IFNα2b的C末端形成IFNα2b-內(nèi)皮抑素29個(gè)氨基酸多肽（IEP29）融合蛋白，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。期望該融合蛋白通過EP29的RGD序列與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的整合素αvβ3/αvβ5特異結(jié)合，使IEP29在腫瘤組織的新生血管處富集，既能針對(duì)性地發(fā)揮EP29抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤作用，又可以抑制整合素介導(dǎo)的新生血管形成，從而降低IFNα2b臨床用藥量，提高量效比。通過一系列的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)，IEP29蛋白具有較高的生物活性，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管生成，同時(shí)具有良好的腫瘤靶向性。因此，符合最初的設(shè)計(jì)，具有較高的臨床應(yīng)用開發(fā)價(jià)值，有望成為新一代抗腫瘤藥物。研究具體內(nèi)容如下：1. IEP29融合蛋白上游研究本實(shí)驗(yàn)采用DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建含IEP29融合基因的原核表達(dá)載體pET3a-IEP29，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BL21工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后以包涵體形式表達(dá)重組蛋白，表達(dá)量占菌體總蛋白的10%左右，重組蛋白條帶能夠和抗IFNα2b單克隆抗體特異性結(jié)合。重組工程菌使用5L的NBS發(fā)酵罐培養(yǎng)，收集菌體經(jīng)裂解、包涵體洗滌、溶解變性和透析復(fù)性，最后經(jīng)親和層析和離子交換柱純化獲得純度大于95%的重組蛋白，內(nèi)毒素檢測(cè)完全符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。為適應(yīng)臨床前試驗(yàn)研究的需要，我們優(yōu)化了發(fā)酵和純化工藝，并將發(fā)酵和純化工藝放大至中試規(guī)模。采用NBS5L發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)三批工程菌，每批次收獲濕菌體約150g，IEP29蛋白表達(dá)量約占總蛋白量的10%。純化三批次IEP29蛋白，純度均達(dá)到95%以上，蛋白產(chǎn)量為每批3050mg，生產(chǎn)規(guī)?；具_(dá)到中試要求。按照基因工程藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求對(duì)IEP29融合蛋白的理化性質(zhì)、純度、生物活性、內(nèi)毒素含量和雜質(zhì)殘留等進(jìn)行檢測(cè)和控制。2. IEP29融合蛋白活性研究為了驗(yàn)證融合蛋白是否同時(shí)具有IFNα2b和EP29的生物活性，我們通過腫瘤細(xì)胞侵襲和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證融合蛋白體外活性。通過內(nèi)皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證融合蛋白在體外與腫瘤特異的內(nèi)皮細(xì)胞親和能力。結(jié)果說明，在體外IEP29融合蛋白有效抑制腫瘤細(xì)胞繁殖和遷移，其能力明顯高于IFNα2b和EP29，同時(shí)特異粘附于內(nèi)皮細(xì)胞。3. IEP29融合蛋白抗腫瘤研究通過小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)、藥物體內(nèi)分布研究、腫瘤病理組織切片研究、雞胚尿囊膜試驗(yàn)等，一方面研究和探討IEP29融合蛋白在小鼠體內(nèi)的抑瘤效果和間接證明藥物的腫瘤靶向性。另一方面初步探討融合蛋白抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)理。結(jié)果顯示IEP29的抗腫瘤效果比IFNα2b和EP29更加顯著，有效抑制腫瘤血管生成，具有腫瘤靶向性。為了進(jìn)一步研究IEP29是否保持著IFNα2b和EP29的生物學(xué)功能，我們進(jìn)行了一系列的抗腫瘤研究，有助于揭示靶向性藥物的作用途徑，同時(shí)對(duì)融合蛋白藥物的開發(fā)也具有指導(dǎo)意義。在抑瘤實(shí)驗(yàn)中，IEP29融合蛋白能明顯減輕S180、H22和Lewis腫瘤細(xì)胞荷瘤裸鼠的瘤重，和對(duì)照組比具有顯著性差別，并且具有明顯的量效關(guān)系。IEP29融合蛋白組抑瘤率均明顯高于同劑量的EP29組，且和同劑量IFNα2b組比較有顯著性差別。體內(nèi)分布試驗(yàn)顯示，給藥30min后IEP29在腫瘤組織的濃度是IFNα2b的5倍，給藥1h后IEP29在腫瘤組織的濃度是IFNα2b的1.8倍，表明IEP29可以在小鼠腫瘤組織中有效聚集。在雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)中，EP29、IFNα2b和IEP29蛋白在不影響原有血管的前提下，均有一定程度的抑制新生血管的生長(zhǎng)。EP29和IEP29抑制新生血管的能力明顯強(qiáng)于IFNα2b。從結(jié)果可以看出對(duì)照組血管生長(zhǎng)良好，毛細(xì)血管清晰可見，主血管粗壯，分支適中。IFNα2b組有部分毛細(xì)血管減少，但不明顯。EP29組毛細(xì)血管數(shù)量部分減少，局部血管變模糊。而IEP29組的血管抑制較明顯，許多毛細(xì)血管開始消失，大部分血管變模糊。綜上所述，我們獲得了IEP29蛋白，經(jīng)過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)IEP29融合蛋白與IFNα2b和EP29相比，是一種高效抗腫瘤新生血管形成和抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物，本研究結(jié)果為IEP29重組蛋白將來的工業(yè)化生產(chǎn)和臨床研究奠定了基礎(chǔ)。此外，建立了比較穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝流程，確定了優(yōu)化的融合蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
王中安[9]（2012）在《利用大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重組人干擾素-α2b N端的起始甲硫氨酸》文中認(rèn)為摘要目的獲取大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶（reMAP）基因，構(gòu)建重組大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶的原核高表達(dá)載體pACYCDuet-1-MAP，利用大腸桿菌BL21作為宿主菌進(jìn)行原核表達(dá)，并利用表達(dá)的reMAP切除重組人干擾素-α2b（rhIFN-α2b）N末端的初始甲硫氨酸。方法提取大腸桿菌BL21基因組作為模板，用PCR方法擴(kuò)增得到大腸桿菌MAP基因，并克隆到載體質(zhì)粒pGEM-7zf（-）中，將重組質(zhì)粒pGEM-7zf（-）-MAP轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，藍(lán)-白斑篩選及測(cè)序驗(yàn)證正確后，將reMAP基因克隆至表達(dá)載體質(zhì)粒pACYCDuet-1，Nco I/BamH I雙酶切及PCR驗(yàn)證正確后，將重組表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-1-MAP轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21中，篩選得到陽(yáng)性克隆通過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行可溶性表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析及活性檢測(cè)后，通過兩種方法作用rhIFN-α2b：①將純化后reMAP和rhIFN-α2b在體外適當(dāng)?shù)木彌_液中作用；②構(gòu)建reMAP和rhIFN-α2b的共表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)對(duì)rhIFN-α2b進(jìn)行作用，并對(duì)兩種作用方式的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果Nco I/BamH I雙酶切、PCR驗(yàn)證及測(cè)序結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒pACYCDuet-1-MAP構(gòu)建成功；SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果表明reMAP和rhIFN-α2b均得到正確表達(dá)；酶活性檢測(cè)結(jié)果表明reMAP具有水解N端甲硫氨酸的活性，切除MET的活性>30pmol/μg/min；兩種方法作用后的rhIFN-α2b經(jīng)氨基酸序列測(cè)定后顯示N端起始甲硫氨酸均被切除，其中體內(nèi)作用切除率＞94%、體外作用切除率＞96%。結(jié)論reMAP可以用于rhIFN-α2b N末端的初始甲硫氨酸的切除。
王中安,鄒文藝,劉磊,范清林,宋禮華[10]（2012）在《利用大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重組人干擾素-α2b N端的起始甲硫氨酸》文中認(rèn)為目的構(gòu)建重組大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶（re-MAP）的原核表達(dá)體系,并利用表達(dá)的reMAP切除重組人干擾素-α2b（rhIFN-α2b）N末端的初始甲硫氨酸。方法將PCR擴(kuò)增得到的大腸桿菌MAP基因克隆到表達(dá)載體質(zhì)粒pACYCDuet-1中,并在宿主菌E.coli BL21中通過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行可溶性表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析及活性檢測(cè)后,通過兩種方法作用rhIFN-α2b:①將純化后reMAP和rhIFN-α2b在體外適當(dāng)?shù)木彌_液中作用;②構(gòu)建reMAP和rhIFN-α2b的共表達(dá)體系,實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)對(duì)rhIFN-α2b進(jìn)行作用,并對(duì)兩種作用方式的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 reMAP和rhIFN-α2b均得到正確表達(dá),酶活性檢測(cè)結(jié)果表明reMAP具有水解N端甲硫氨酸的活性,兩種方法作用后的rhIFN-α2b經(jīng)氨基酸序列測(cè)定后顯示N端起始甲硫氨酸均被切除,其中體內(nèi)作用切除率>94%、體外作用切除率>96%。結(jié)論 reMAP可以用于rhIFN-α2b N末端的初始甲硫氨酸的切除。
二、按大腸桿菌高表達(dá)序列設(shè)計(jì)的人干擾素α-2b基因的化學(xué)合成和克隆（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁(yè)面大小,采用多級(jí)分層頁(yè)表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁(yè)表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、按大腸桿菌高表達(dá)序列設(shè)計(jì)的人干擾素α-2b基因的化學(xué)合成和克?。ㄕ撐奶峋V范文）
（1）表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞系的建立及免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略語(yǔ) |
| 第一章 緒論 |
| 1 PCV2的研究進(jìn)展 |
| 1.1 PCV2的基因組結(jié)構(gòu) |
| 1.2 PCV2疫苗研究現(xiàn)狀 |
| 1.2.1 減毒疫苗和滅活疫苗 |
| 1.2.2 亞單位疫苗 |
| 1.2.2.1 DNA疫苗 |
| 1.2.2.2 嵌合PCV1-2疫苗 |
| 1.3 PCV2作用機(jī)制 |
| 2 CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介 |
| 3 腦膜炎球菌外膜蛋白PorB免疫增強(qiáng)作用 |
| 3.1 腦膜炎球菌外膜蛋白PorB的結(jié)構(gòu) |
| 3.2 外膜蛋白PorB免疫增強(qiáng)作用 |
| 第二章 研究方案設(shè)計(jì) |
| 1 研究目的及意義 |
| 2 研究?jī)?nèi)容 |
| 3 技術(shù)路線 |
| 第三章 CHO細(xì)胞高效表達(dá)體系的建立 |
| 1 引言 |
| 2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑耗材與相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的制備 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2 試劑耗材 |
| 2.3 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的制備 |
| 3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.1 CMV和 CAG啟動(dòng)子的篩選 |
| 3.1.1 pcDNA3.1-Luc、pcDNA3.1-CAG-Luc重組載體的構(gòu)建 |
| 3.1.1.1 目的基因的擴(kuò)增 |
| 3.1.1.2 目的基因的酶切與連接 |
| 3.1.1.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 3.1.1.4 重組質(zhì)粒的鑒定 |
| 3.1.1.5 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定 |
| 3.1.2 CHO-K1細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存 |
| 3.1.3 重組質(zhì)粒的提取和轉(zhuǎn)染 |
| 3.1.3.1 無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒的提取 |
| 3.1.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞 |
| 3.1.4 蛋白表達(dá)的鑒定 |
| 3.2 信號(hào)肽的篩選 |
| 3.2.1 含有5 種不同信號(hào)肽的pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc重組載體的構(gòu)建 |
| 3.2.1.1 基因序列及相關(guān)引物設(shè)計(jì)與合成 |
| 3.2.1.2 目的基因的酶切與連接 |
| 3.2.1.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 3.2.1.4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定 |
| 3.2.1.5 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定 |
| 3.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞 |
| 3.2.2.1 無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒的提取 |
| 3.2.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞 |
| 3.2.3 鑒定Luc蛋白表達(dá)的情況 |
| 4 結(jié)果分析 |
| 4.1 含CMV和 CAG啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體的鑒定 |
| 4.1.1 pcDNA3.1-Luc、pcDNA3.1-CAG-Luc重組表達(dá)載體的鑒定 |
| 4.1.2 檢測(cè)Luc蛋白的表達(dá) |
| 4.2 含有5 種不同信號(hào)肽重組表達(dá)載體pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc的相關(guān)鑒定 |
| 4.2.1 5 種不同信號(hào)肽pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc重組表達(dá)載體的鑒定 |
| 4.2.2 檢測(cè)Luc蛋白的表達(dá) |
| 5 討論 |
| 第四章 穩(wěn)定表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白CHO細(xì)胞的建立 |
| 1 引言 |
| 2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑耗材與相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的制備 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2 試劑耗材與相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的制備 |
| 3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.1 pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap真核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 3.1.1 基因序列及相關(guān)引物設(shè)計(jì)與合成 |
| 3.1.2 目的基因的酶切與連接 |
| 3.1.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 3.1.4 重組質(zhì)粒的鑒定 |
| 3.1.5 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定 |
| 3.2 無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒的提取 |
| 3.3 篩選穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株 |
| 3.3.1 用G418方法篩選細(xì)胞株 |
| 3.3.1.1 確定CHO-K1細(xì)胞中G418最佳篩選濃度 |
| 3.3.1.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞 |
| 3.3.1.3 單克隆細(xì)胞株篩選 |
| 3.3.2 Western bloting檢測(cè)Cap蛋白表達(dá) |
| 3.3.3 CHO-K1 細(xì)胞的總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 |
| 3.3.3.1 從細(xì)胞提取總RNA |
| 3.3.3.2 RT-PCR |
| 3.3.4 MTT檢測(cè)單克隆細(xì)胞株的活力 |
| 4 結(jié)果分析 |
| 4.1 pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap重組表達(dá)載體的相關(guān)鑒定 |
| 4.1.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 |
| 4.1.2 重組質(zhì)粒的相關(guān)鑒定 |
| 4.2 Cap蛋白表達(dá)的鑒定及分析 |
| 4.2.1 CHO-K1細(xì)胞G418最佳篩選濃度確定 |
| 4.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1 細(xì)胞后Cap蛋白的表達(dá)鑒定 |
| 4.2.3 CHO-K1 細(xì)胞總RNA提取及PCR鑒定 |
| 4.3 篩選高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株 |
| 4.3.1 篩選單克隆細(xì)胞株 |
| 4.3.2 篩選后陽(yáng)性細(xì)胞增殖檢測(cè) |
| 4.3.3 重組Cap蛋白的純化 |
| 5 討論 |
| 第五章 腦膜炎球菌外膜蛋白PorB免疫增強(qiáng)作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑耗材與相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的制備 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.2 試劑耗材 |
| 2.1.3 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的制備 |
| 2.2 基因序列及相關(guān)引物設(shè)計(jì)與合成 |
| 3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.1 PorB重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 3.1.1 目的基因的擴(kuò)增 |
| 3.1.2 目的基因的酶切與連接 |
| 3.1.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 3.1.4 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 |
| 3.1.5 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定 |
| 3.2 PorB蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 |
| 3.3 PorB蛋白表達(dá)的鑒定 |
| 3.4 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)分析 |
| 3.4.1 BALB/c小鼠的免疫 |
| 3.4.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) |
| 3.4.3 特異性抗體檢測(cè) |
| 4 結(jié)果分析 |
| 4.1 重組表達(dá)載體的鑒定 |
| 4.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 |
| 4.3 不同劑量PorB蛋白在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)Cap蛋白的免疫效應(yīng) |
| 4.3.1 特異性抗體的檢測(cè) |
| 4.3.2 淋巴細(xì)胞增殖水平檢測(cè) |
| 4.4 PorB蛋白在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)Mhp的免疫作用 |
| 4.4.1 特異性抗體的檢測(cè) |
| 4.4.2 淋巴細(xì)胞增殖水平檢測(cè) |
| 5 討論 |
| 第六章 PCV2 Cap蛋白免疫原性分析 |
| 1 引言 |
| 2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑耗材與相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的制備 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2 試劑耗材 |
| 2.3 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑的制備 |
| 3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.1 免疫樣品的制備 |
| 3.2 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)分析 |
| 3.2.1 BALB/c小鼠的分組和免疫 |
| 3.2.2 免疫小鼠的血清滴度檢測(cè) |
| 3.2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) |
| 4 結(jié)果分析 |
| 4.1 特異性抗體的檢測(cè) |
| 4.2 淋巴細(xì)胞增殖水平檢測(cè) |
| 5 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 碩士期間學(xué)術(shù)成果 |
| 致謝 |
（2）人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-Ts的原核表達(dá)及體外合成O-糖基化修飾的白介素-2（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 縮寫詞 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 蛋白質(zhì)糖基化修飾對(duì)重組蛋白藥物的影響 |
| 1.2 蛋白質(zhì)O-GalNAc糖基化修飾及ppGalNAc-T酶 |
| 1.3 重組治療性蛋白藥物表達(dá)系統(tǒng)綜述 |
| 1.3.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) |
| 1.3.2 酵母表達(dá)系統(tǒng) |
| 1.3.3 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) |
| 1.3.4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) |
| 1.3.5 總結(jié) |
| 1.4 本課題的研究?jī)?nèi)容以及研究意義 |
| 第二章 人源多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-T的大腸桿菌表達(dá)方法構(gòu)建及條件優(yōu)化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法 |
| 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.1 ppGalNAc-T酶家族序列結(jié)構(gòu)、二硫鍵及糖基化修飾分析 |
| 2.3.2 在Rosetta大腸桿菌中表達(dá)ppGalNAc-T2酶 |
| 2.3.3 四種ppGalNAc-T2 酶表達(dá)方法篩選 |
| 2.3.4 PDI對(duì)大腸桿菌中ppGalNAc-T2 酶表達(dá)的影響 |
| 2.3.5 大腸桿菌表達(dá)ppGalNAc-T2 酶的條件優(yōu)化 |
| 2.4 本章小結(jié)與討論 |
| 第三章 大腸桿菌和HEK293T細(xì)胞表達(dá)的ppGalNAc-T酶結(jié)構(gòu)及功能比較 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法 |
| 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.1 E.coli-T2和293T-T2 酶活及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 |
| 3.3.2 E.coli-T2和293T-T2 二級(jí)結(jié)構(gòu)比較 |
| 3.3.3 E.coli-T2和293T-T2 底物選擇性比較 |
| 3.3.4 O-糖基化修飾對(duì)ppGalNAc-T2 酶活及二級(jí)結(jié)構(gòu)影響 |
| 3.3.5 在大腸桿菌中表達(dá)ppGalNAc-T1和ppGalNAc-T13 |
| 3.3.6 E. coli-T1和E. coli-T13 二級(jí)結(jié)構(gòu)檢測(cè) |
| 3.4 本章小結(jié)與討論 |
| 第四章 體外酶法合成O-糖基化修飾的白介素-2 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法 |
| 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.3.1 白介素-2 結(jié)構(gòu)及ppGalNAc-T酶對(duì)白介素-2 糖基化偏好性分析 |
| 4.3.2 在大腸桿菌中表達(dá)白介素-2 |
| 4.3.3 使用E.coli-T2/T1 體外酶法合成O-GalNAc修飾的白介素-2 |
| 4.4 本章小結(jié)與討論 |
| 第五章 全文總結(jié)與展望 |
| 5.1 全文總結(jié) |
| 5.2 本論文的創(chuàng)新點(diǎn) |
| 5.3 研究展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果 |
（3）改造和優(yōu)化人干擾素α-2b基因序列并在大腸桿菌中做表達(dá)驗(yàn)證（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 干擾素簡(jiǎn)介 |
| 1.2 基因工程菌-大腸桿菌 |
| 1.3 影響外源基因表達(dá)的因素 |
| 1.4 SD序列對(duì)基因表達(dá)的影響 |
| 1.5 研究的目的與意義 |
| 第二章 人干擾素α-2b基因的改造和優(yōu)化 |
| 2.1 大腸桿菌編碼序列與基因表達(dá)的關(guān)系 |
| 2.2 基因序列設(shè)計(jì) |
| 2.2.1 人干擾素α-2b蛋白的氨基酸序列 |
| 2.2.2 編碼序列的改造方法 |
| 2.2.3 SD序列的選取 |
| 2.3 完整基因序列的構(gòu)建 |
| 第三章 材料與方法 |
| 3.1 常用儀器與設(shè)備 |
| 3.2 質(zhì)粒與菌株 |
| 3.2.1 克隆載體pGM-T |
| 3.2.2 表達(dá)載體pET-28a(+) |
| 3.2.3 大腸桿菌菌株 |
| 3.3 其它試劑及工具酶 |
| 3.4 引物設(shè)計(jì) |
| 3.5 常用溶液 |
| 3.6 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.6.1 微生物學(xué)技術(shù) |
| 3.6.2 分子生物學(xué)方法 |
| 3.6.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 |
| 第四章 基因克隆 |
| 4.1 目的序列與克隆載體的連接 |
| 4.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 4.3 人干擾素α-2b在克隆載體中的表達(dá)及檢測(cè) |
| 4.4 ELISA法測(cè)人干擾素α-2b表達(dá)量 |
| 4.5 表達(dá)量的顯著性檢驗(yàn) |
| 第五章 基因表達(dá) |
| 5.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 5.1.1 目的DNA片段的回收 |
| 5.1.2 表達(dá)載體pET-28a(+)的酶切及回收 |
| 5.1.3 目的DNA片段和表達(dá)載體的連接 |
| 5.2 人干擾素α-2b在表達(dá)載體中的表達(dá)及鑒定 |
| 5.3 表達(dá)檢測(cè) |
| 第六章 總結(jié)與展望 |
| 6.1 總結(jié) |
| 6.2 展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
（4）犬干擾素α2的克隆表達(dá)與抗病毒活性分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符號(hào)及縮略語(yǔ) |
| 緒論 |
| 第一部分 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一章 干擾素的研究進(jìn)展與應(yīng)用 |
| 1 干擾素的起源與生物進(jìn)化 |
| 2 干擾素的分類與分布 |
| 3 干擾素的誘導(dǎo)產(chǎn)生及機(jī)理 |
| 3.1 干擾素誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)產(chǎn)生 |
| 3.2 干擾素的產(chǎn)生機(jī)理 |
| 4 干擾素作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 |
| 5 犬干擾素研究進(jìn)展 |
| 5.1 犬干擾素分類與特點(diǎn) |
| 5.2 重組犬干擾素研究現(xiàn)狀 |
| 6 干擾素在犬病治療中的應(yīng)用 |
| 6.1 干擾素的抗腫瘤作用 |
| 6.2 干擾素的抗病毒作用 |
| 6.3 干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 試驗(yàn)研究 |
| 第二章 犬干擾素α2在大腸桿菌的表達(dá)與抗病毒活性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要儀器設(shè)備 |
| 1.2 菌株、載體、病毒及細(xì)胞 |
| 1.3 主要試劑及試劑盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 成熟CaIFN-α2基因的設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.2 成熟CaIFN-α2基因的擴(kuò)增 |
| 2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-CaIFN-α2的構(gòu)建 |
| 2.4 重組CaIFN-α2的表達(dá)與鑒定 |
| 2.5 重組CaIFN-α2表達(dá)條件的優(yōu)化 |
| 2.6 重組CaIFN-α2包涵體的變性、復(fù)性及純化 |
| 2.7 重組CaIFN-α2的抗病毒活性測(cè)定 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 成熟CaIFN-α2的擴(kuò)增 |
| 3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒(pET-28a-CaIFN-α2)的鑒定 |
| 3.3 重組CaIFN-α2的表達(dá)分析 |
| 3.4 重組CaIFN-α2的可溶性分析 |
| 3.5 重組CaIFN-α2的Western blot檢測(cè) |
| 3.6 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 |
| 3.7 重組CaIFN-α2的純化 |
| 3.8 重組CaIFN-α2的抗病毒活性分析 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三章 犬干擾素α2在昆蟲細(xì)胞的表達(dá)與抗病毒活性測(cè)定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要儀器設(shè)備 |
| 1.2 菌株、載體、病毒及細(xì)胞 |
| 1.3 主要試劑及試劑盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 成熟CaIFN-α2基因的獲得 |
| 2.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacHTA-CaIFN-α2的構(gòu)建 |
| 2.3 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacHTA-CaIFN-α2的篩選與鑒定 |
| 2.4 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-CaIFN-α2的構(gòu)建與鑒定 |
| 2.5 重組桿狀病毒rBac-CaIFN-α2的構(gòu)建與鑒定 |
| 2.6 重組CaIFN-α2在Sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與檢測(cè) |
| 2.7 重組CaIFN-α2的抗病毒活性測(cè)定 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA-CaIFN-α2的構(gòu)建 |
| 3.2 重組穿梭載體Bacmid-CaIFN-α2的構(gòu)建 |
| 3.3 轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后的病變情況 |
| 3.4 重組桿狀病毒rBac-CaIFN-α2的獲得與鑒定 |
| 3.5 重組CaIFN-α2在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的SDS-PAGE分析 |
| 3.6 重組CaIFN-α2的Western blot鑒定 |
| 3.7 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)重組CaIFN-α2的表達(dá) |
| 3.8 重組CaIFN-a2的抗病毒活性測(cè)定 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第四章 犬融合干擾素α2在昆蟲細(xì)胞的表達(dá) |
| 1 材料 |
| 1.1 主要儀器設(shè)備 |
| 1.2 菌株、載體、病毒及細(xì)胞 |
| 1.3 主要試劑及試劑盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 融合基因HBM-Alb-CaIFN-α2的設(shè)計(jì)與獲得 |
| 2.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacI-HBM-Alb-CaIFN-a2的篩選與鑒定 |
| 2.3 重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-a2的構(gòu)建與鑒定 |
| 2.4 重組桿狀病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-a2的構(gòu)建與鑒定 |
| 2.5 重組HBM-Alb-CaIFN-α2在Sf9昆蟲細(xì)胞的表達(dá)與檢測(cè) |
| 2.6 重組HBM-Alb-CaIFN-α2的抗病毒活性測(cè)定 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 轉(zhuǎn)移載體pFastBacI-HBM-Alb-CaIFN-α2的鑒定 |
| 3.2 重組穿梭載體Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-α2的構(gòu)建 |
| 3.3 轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后的病變情況 |
| 3.4 重組桿狀病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2的獲得與鑒定 |
| 3.5 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)重組融合CaIFN-α2的表達(dá) |
| 3.6 SDS-PAGE分析 |
| 3.7 重組融合CaIFN-α2的Western blot鑒定 |
| 3.8 重組融合CaIFN-α2的抗病毒活性測(cè)定 |
| 4 討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 全文結(jié)論 |
| 附錄: 常用試劑的配制 |
| 致謝 |
（5）重組干擾素α-2b合成研究進(jìn)展（論文提綱范文）
| 1 以大腸桿菌為宿主菌表達(dá)干擾素α-2b進(jìn)展 |
| 2 以酵母菌為宿主菌表達(dá)干擾素α-2b進(jìn)展 |
| 3 干擾素α-2b長(zhǎng)效化進(jìn)展 |
| 4 展望 |
（6）盧氏雞IFN-γ成熟蛋白基因的克隆與原核表達(dá)產(chǎn)物處理方法研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 干擾素 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 干擾素的生物學(xué)功能 |
| 1.2 雞 IFN-γ的研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 雞 IFN-γ的理化性質(zhì)及來源 |
| 1.2.2 雞 IFN-γ的基因結(jié)構(gòu) |
| 1.2.3 雞 IFN-γ的功能 |
| 1.2.4 雞 IFN-γ基因的研究進(jìn)展 |
| 1.3 基因工程 IFN 的研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 關(guān)于干擾素基因序列的改造 |
| 1.3.2 關(guān)于干擾素基因表達(dá)產(chǎn)物提取方法的研究 |
| 1.3.3 關(guān)于原核表達(dá)條件的篩選 |
| 1.3.4 關(guān)于原核表達(dá)產(chǎn)物制備方法的研究 |
| 1.3.5 關(guān)于規(guī)模生產(chǎn)工藝的研究 |
| 1.4 目的與意義 |
| 第2章 盧氏雞 IFN-γ成熟蛋白基因的克隆、鑒定及表達(dá) |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、載體、雞胚及疫苗 |
| 2.1.2 試驗(yàn)試劑、酶、儀器和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.1.3 試驗(yàn)相關(guān)試劑的配制 |
| 2.1.4 主要的儀器設(shè)備 |
| 2.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 引物設(shè)計(jì) |
| 2.2.2 大腸桿菌 BL21、JM109 感受態(tài)的制備（CaCl2法） |
| 2.2.3 盧氏雞 IFN-γ基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄 |
| 2.2.4 總 RNA 的提取 |
| 2.2.5 RT-PCR 及 PCR |
| 2.2.6 PCR 產(chǎn)物的回收與純化 |
| 2.2.7 IFN-γ全基因與 pMD18-T 載體連接、轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.8 質(zhì)粒的提取 |
| 2.2.9 重組質(zhì)粒（pMD18T-IFN-γ）的 PCR 鑒定 |
| 2.2.10 PCR 產(chǎn)物與 PET28a 載體的酶切及其產(chǎn)物的回收 |
| 2.2.11 PCR 產(chǎn)物與 PET28a 載體的連接與轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.12 重組質(zhì)粒（PET28a-IFN-γ）的 PCR 鑒定及酶切鑒定 |
| 2.2.13 重組質(zhì)粒的測(cè)序 |
| 2.2.14 IFN-γ成熟蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.2.15 同源性分析 |
| 2.3 結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 |
| 2.3.2 重組 pMD18T-IFN-γ質(zhì)粒的鑒定 |
| 2.3.3 盧氏雞 IFN-γ去信號(hào)肽序列的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 |
| 2.3.4 重組質(zhì)粒(PET28a-IFN-γ)的 PCR 及酶切鑒定結(jié)果 |
| 2.3.5 測(cè)序結(jié)果與分析 |
| 2.3.6 SDS-PAGE 電泳鑒定結(jié)果 |
| 2.3.7 盧氏雞 IFN-γ基因與其他禽類核苷酸序列的比較 |
| 2.3.8 IFN-γ基因遺傳進(jìn)化分析 |
| 2.4 討論 |
| 第3章 雞 IFN-γ重組蛋白不同提取方法的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 試驗(yàn)所用的主要試劑 |
| 3.1.2 相關(guān)試劑的配制 |
| 3.1.3 主要儀器 |
| 3.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 雞 IFN-γ重組蛋白的四種不同提取方法 |
| 3.2.2 四種提取方法獲得的重組蛋白含量的測(cè)定 |
| 3.2.3 四種提取方法獲得的重組蛋白熱原質(zhì)、內(nèi)毒素的測(cè)定 |
| 3.2.4 四種提取方法獲得的重組蛋白對(duì)免疫器官指數(shù)的影響 |
| 3.2.5 四種提取方法獲得的重組蛋白對(duì) NDVⅣ系弱毒苗免疫后抗體水平的測(cè)定 |
| 3.3 結(jié)果與分析 |
| 3.3.1 四種提取方法提取的蛋白含量的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.3.2 四種提取方法獲得的重組蛋白熱原質(zhì)、內(nèi)毒素的測(cè)定結(jié)果 |
| 3.3.3 四種提取方法獲得的重組蛋白對(duì)家禽生長(zhǎng)和免疫器官指數(shù)的影響 |
| 3.3.4 四種提取方法獲得的重組蛋白對(duì) NDVⅣ系弱毒苗免疫后抗體水平測(cè)定結(jié)果 |
| 3.3.5 四種提取方法在工業(yè)化生產(chǎn)中的可操作性 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 展望 |
| 第4章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果 |
（7）犬α-干擾素基因的克隆、原核表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1、緒論 |
| 1.1 干擾素分類及干擾素系統(tǒng)生物進(jìn)化 |
| 1.1.1 干擾素分類 |
| 1.1.2 干擾素系統(tǒng)生物進(jìn)化及其功能 |
| 1.2 干擾素的產(chǎn)生條件 |
| 1.3 犬干擾素分子生物學(xué)特性 |
| 1.3.1 干擾素的理化特性 |
| 1.3.2 犬α-干擾素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) |
| 1.3.3 犬干擾素受體 |
| 1.3.4 犬干擾素的信號(hào)傳遞信息途徑 |
| 1.4 干擾素生物學(xué)功能及其作用機(jī)制 |
| 1.4.1 抗病毒功能 |
| 1.4.2. 干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用 |
| 1.4.3 干擾素的抗腫瘤作用 |
| 1.4.4 干擾素其他作用 |
| 1.5 基因工程干擾素的研究進(jìn)展 |
| 1.5.1 對(duì)干擾素表達(dá)系統(tǒng)的改造 |
| 1.5.2 對(duì)干擾素基因序列的改變 |
| 1.5.3 對(duì)干擾素生產(chǎn)工藝的改進(jìn) |
| 1.5.4 為了提高干擾素的效用而進(jìn)行的研究 |
| 1.6 重組犬干擾素的研究現(xiàn)狀 |
| 1.7 研究目的與意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 質(zhì)粒、宿主菌和病毒 |
| 2.1.2 試劑盒和生化試劑 |
| 2.1.3 軟件和網(wǎng)站 |
| 2.1.4 主要儀器和設(shè)備 |
| 2.1.5 主要試劑的配制 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 引物設(shè)計(jì) |
| 2.2.2 犬肝臟組織基因組的提取 |
| 2.2.3 擴(kuò)增犬肝臟細(xì)胞基因組的 DNA |
| 2.2.4 犬α-干擾素基因的克隆及鑒定 |
| 2.2.5 犬α-干擾素基因的序列分析 |
| 2.2.6 重組表達(dá)載體 pBV220-CaIFN-α的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.7 犬α-干擾素蛋白原核表達(dá)和表達(dá)條件優(yōu)化 |
| 2.2.8 包涵體的提取及蛋白質(zhì)變性 |
| 2.2.9 蛋白的復(fù)性和純化 |
| 2.2.10 生物學(xué)活性的鑒定 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 犬α-干擾素基因的擴(kuò)增結(jié)果 |
| 3.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 |
| 3.3 IFN-α基因序列比較及進(jìn)化分析 |
| 3.4 犬α-干擾素的表達(dá)及條件優(yōu)化 |
| 3.4.1 誘導(dǎo)時(shí)間的條件優(yōu)化 |
| 3.4.2 宿主菌的優(yōu)化結(jié)果 |
| 3.4.3 陽(yáng)性工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 |
| 3.4.4 包涵體的提取結(jié)果 |
| 3.5 蛋白的初步純化和復(fù)性 |
| 3.5.1 蛋白質(zhì)的初步純化 |
| 3.5.2 蛋白的復(fù)性 |
| 3.6 重組犬α-干擾素的活性測(cè)定結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 4.1 犬α-干擾素的研究 |
| 4.2 干擾素-α基因的表達(dá)及條件優(yōu)化 |
| 4.3 包涵體的提取和蛋白質(zhì)的變性 |
| 4.4 蛋白的復(fù)性 |
| 4.4.1 氧化還原體系的選擇 |
| 4.4.2 復(fù)性溫度和蛋白濃度的選擇 |
| 4.5 蛋白質(zhì)的純化 |
| 4.6 復(fù)性后蛋白活性測(cè)定 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況 |
| 致謝 |
（8）重組人干擾素-α2b與內(nèi)皮抑素肽融合蛋白抗腫瘤研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 腫瘤及其治療方法研究進(jìn)展 |
| 1.1.1 腫瘤 |
| 1.1.2 腫瘤研究現(xiàn)狀 |
| 1.1.3 腫瘤的治療 |
| 1.2 腫瘤免疫治療 |
| 1.2.1 干擾素腫瘤免疫治療 |
| 1.2.2 干擾素 alpha 的理化性質(zhì) |
| 1.2.3 IFN 作用的受體及信號(hào)通路 |
| 1.2.4 IFN 抗腫瘤作用機(jī)理 |
| 1.2.5 IFN 抗腫瘤的臨床應(yīng)用 |
| 1.2.6 新型 IFN 的研究 |
| 1.2.7 問題與展望 |
| 1.3 抑制腫瘤血管生成 |
| 1.3.1 血管生成與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展 |
| 1.3.2 腫瘤血管生成和調(diào)控 |
| 1.3.3 抑制腫瘤血管生成藥物 |
| 1.3.4 腫瘤血管生成抑制療法的優(yōu)勢(shì) |
| 1.3.5 抗腫瘤血管生成治療面臨的問題與展望 |
| 1.4 內(nèi)皮抑素 |
| 1.4.1 內(nèi)皮抑素及其結(jié)構(gòu)特性 |
| 1.4.2 血管內(nèi)皮抑素的作用機(jī)制 |
| 1.4.3 內(nèi)皮抑素抑制腫瘤研究 |
| 1.4.4 內(nèi)皮抑素 27 肽 |
| 1.4.5 內(nèi)皮抑素的問題與展望 |
| 1.5 RGD、整合素與腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移 |
| 1.5.1 RGD、整合素家族概述 |
| 1.5.2 腫瘤血管生成與整合素 |
| 1.5.3 整合素與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移 |
| 1.5.4 RGD 肽在腫瘤治療中的應(yīng)用 |
| 1.6 內(nèi)皮抑素 29 個(gè)氨基酸多肽 |
| 1.7 IEP29 融合蛋白 |
| 1.8 研究的目的和意義 |
| 1.9 研究的技術(shù)路線 |
| 第二章 IEP29 融合蛋白載體構(gòu)建與表達(dá) |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1.1 IEP29 融合蛋白基因的克隆 |
| 2.1.2 表達(dá)載體的提取、酶切和純化 |
| 2.1.3 感受態(tài)菌的制備 |
| 2.1.4 目的基因與載體的連接和轉(zhuǎn)化 |
| 2.1.5 重組蛋白的表達(dá) |
| 2.1.6 鑒定表達(dá)產(chǎn)物 |
| 2.1.7 目的蛋白的純化和鑒定 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.2.1 重組質(zhì)粒 pET3a-IEP29 的構(gòu)建 |
| 2.2.2 融合蛋白的表達(dá)和鑒定 |
| 2.2.3 融合蛋白的初步純化 |
| 2.2.4 等電點(diǎn)分析 |
| 2.2.5 融合蛋白肽圖 HPLC 分析 |
| 2.2.6 菌種穩(wěn)定性的鑒定 |
| 2.3 討論 |
| 第三章 IEP29 蛋白抗腫瘤活性研究 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.1.1 細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 3.1.2 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) |
| 3.1.3 MTT 比色實(shí)驗(yàn) |
| 3.1.4 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) |
| 3.1.5 內(nèi)皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)(Endothelial Attachment Assay) |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.2.1 腫瘤細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.2 內(nèi)皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn) |
| 3.2.3 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) |
| 3.3 討論 |
| 第四章 IEP29 蛋白抗腫瘤機(jī)理研究 |
| 4.1 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.1.1 雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)(Chickchorioallantoicmembrane, CAM) |
| 4.1.2 小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn) |
| 4.1.3 藥物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn) |
| 4.1.4 腫瘤病理組織切片研究 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.2.1 雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn) |
| 4.2.2 腫瘤抑制實(shí)驗(yàn) |
| 4.2.3 融合蛋白組織分布特點(diǎn) |
| 4.2.4 腫瘤組織切片研究 |
| 4.3 討論 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀博士期間發(fā)表論文及成果 |
| 致謝 |
（9）利用大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重組人干擾素-α2b N端的起始甲硫氨酸（論文提綱范文）
| 縮略詞 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
| 綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
四、按大腸桿菌高表達(dá)序列設(shè)計(jì)的人干擾素α-2b基因的化學(xué)合成和克?。ㄕ撐膮⒖嘉墨I(xiàn)）
- [1]表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白穩(wěn)轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞系的建立及免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)[D]. 楊瑞. 浙江理工大學(xué), 2020
- [2]人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-Ts的原核表達(dá)及體外合成O-糖基化修飾的白介素-2[D]. 梁濤. 上海交通大學(xué), 2020(01)
- [3]改造和優(yōu)化人干擾素α-2b基因序列并在大腸桿菌中做表達(dá)驗(yàn)證[D]. 于榮榮. 內(nèi)蒙古大學(xué), 2019(09)
- [4]犬干擾素α2的克隆表達(dá)與抗病毒活性分析[D]. 姚凌云. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018(07)
- [5]重組干擾素α-2b合成研究進(jìn)展[J]. 張德芳. 海峽藥學(xué), 2017(07)
- [6]盧氏雞IFN-γ成熟蛋白基因的克隆與原核表達(dá)產(chǎn)物處理方法研究[D]. 馬芳. 河南科技大學(xué), 2013(06)
- [7]犬α-干擾素基因的克隆、原核表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定[D]. 樊興冬. 齊齊哈爾大學(xué), 2013(01)
- [8]重組人干擾素-α2b與內(nèi)皮抑素肽融合蛋白抗腫瘤研究[D]. 張海濤. 哈爾濱師范大學(xué), 2012(09)
- [9]利用大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重組人干擾素-α2b N端的起始甲硫氨酸[D]. 王中安. 安徽醫(yī)科大學(xué), 2012(01)
- [10]利用大腸桿菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重組人干擾素-α2b N端的起始甲硫氨酸[J]. 王中安,鄒文藝,劉磊,范清林,宋禮華. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012(03)
標(biāo)簽：干擾素論文; 重組人干擾素α-2b凝膠論文; 重組蛋白論文; 大腸桿菌論文; 基因合成論文;