一、里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表達載體的構建（論文文獻綜述）
劉琴[1]（2021）在《β-甘露聚糖酶在里氏木霉中的高效表達》文中研究指明甘露聚糖是植物細胞壁的主要成分之一,廣泛存在于多種植物組織中。β-甘露聚糖酶是主要的甘露聚糖降解酶,已經在動物飼料、食品、生物精煉、紡織、洗滌以及造紙等多種行業(yè)得到了應用。因此,提高β-甘露聚糖酶產量,降低β-甘露聚糖酶生產成本具有重大應用價值和現(xiàn)實意義。里氏木霉等絲狀真菌具有高效合成分泌纖維素酶和半纖維素酶的能力,在β-甘露聚糖酶的生產中具有較好的應用前景。高效啟動子是異源蛋白表達的關鍵元件。篩選、改造高效啟動子是實現(xiàn)目標蛋白高效表達的重要策略。在本論文中,我們選擇來源于草酸青霉的β-甘露聚糖酶Man5A,對其在里氏木霉中的高效表達策略進行了研究:（1）使用組成型啟動子Pcdna1實現(xiàn)了 Man5A在葡萄糖培養(yǎng)基中的表達。構建了Pcdna1啟動的man5A表達盒,隨機插入到里氏木霉菌株QP4基因組中,獲得的Qman菌株可產生純度較高的Man5A。對所得到的Man5A的性質進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)其在pH2.5-5.5的范圍內均能保持較高的活性。Man5A最適反應溫度在80℃,差示掃描量熱法測得的熔解溫度為80℃。對影響Pcdna1啟動效率的關鍵序列進行了鑒定,在Pcdna1序列由原本的1159 bp縮短至831bp時,啟動效率降為原來的81%,縮短至505 bp時啟動效率明顯降低,僅為原來的10%。此外,探究了含有Man5A的里氏木霉纖維素酶粗酶液與草酸青霉生產的富含α-半乳糖苷酶的纖維素酶粗酶液復配時在豆粕降解中的應用效果,發(fā)現(xiàn)當兩者比例相當時,豆粕降解產生的還原糖水平最高。（2）使用誘導型啟動子Pcbh1實現(xiàn)了 Man5A在纖維素培養(yǎng)基中的高效表達,并通過啟動子序列改造和轉錄激活因子改造進一步提高了其表達水平。通過序列截短以及替換、刪除Pcbh1序列中轉錄因子結合位點,構建了 3種不同的Pcbh1突變體。通過測定Man5A的表達水平,發(fā)現(xiàn)對Pcbh1中轉錄因子XYR1結合位點進行替換得到的突變體Pcbh1-IR的啟動效率提高至原來的2.5倍。在獲得了 β-甘露聚糖酶多拷貝表達菌株的基礎上,通過過表達XYR1A824V持續(xù)激活突變體基因,獲得了在葡萄糖培養(yǎng)條件和纖維素誘導條件下β-甘露聚糖酶均能夠高表達的菌株。
劉杜娟[2]（2020）在《低纖維素酶背景里氏木霉表達宿主菌的構建》文中研究指明絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）是重要的纖維素酶工業(yè)生產菌株。由于它卓越的產酶性能,近年來越來越多的研究將其作為異源基因的表達宿主。里氏木霉產生的內源纖維素酶數(shù)量較多,它們主要包括纖維二糖水解酶（外切葡聚糖酶）和內切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表達外源基因時,它們會形成較高的纖維素酶背景,而且其表達還可能會導致對細胞轉錄、翻譯和分泌等相關資源的占用。本實驗應用CRISPR/Cas9技術并結合RNAi干擾技術,敲除和干擾里氏木霉中的主要的纖維素酶基因,構建里氏木霉低纖維素酶表達菌株。實驗還發(fā)現(xiàn),以低纖維素酶背景菌株作為表達宿主,可以明顯提高部分異源基因的表達水平。本研究進行了如下工作:1.應用CRISPR/Cas9技術敲除里氏木霉中主要的纖維二糖水解酶cbh1基因,同時結合RNAi干擾技術沉默內切葡聚糖酶eg2基因在里氏木霉中的表達應用CRISPR/Cas9技術,在體外組裝Cas9/gRNA復合物并轉化里氏木霉以定點敲除主要的纖維二糖水解酶cbh1基因,同時結合RNAi干擾技術來沉默主要的內切葡聚糖酶eg2基因,以期一步構建里氏木霉低纖維素酶背景的表達系統(tǒng)。使用這種方法獲得了一株纖維素酶表達顯著下降的11號轉化子SUS6。該轉化子中,cbh1的表達完全消失,而eg2基因的轉錄水平較出發(fā)菌株SUS5降低了98%。2.在SUS6菌株中表達外源基因NfBgl3A以SUS6為宿主表達外源基因NfBgl3A,兩個代表性轉化子的beta-葡萄糖苷酶酶活最高分別為172.4和79.3 U/mL,遠高于以出發(fā)菌株（高纖維素酶背景）為宿主表達beta-葡萄糖苷酶酶活（兩個代表轉化子分別為11.6和31.9 U/mL）。然而,表達黑曲霉來源的甘露聚糖酶時酶活并沒有明顯的提高。因此,構建低纖維素酶背景的菌株作為表達宿主,還可選擇性的顯著提高某些異源基因的表達水平。3.在SUS6菌株的基礎上應用CRISPR/Cas9技術敲除主要分泌蛋白木糖苷酶xyl3A和纖維素酶cbh2、eg1基因本實驗在SUS6菌株的基礎上,首先通過5-FOA反向選擇,將木霉菌種的pyr4篩選標記去除,而后通過胞內表達Cas9核酸酶并結合gRNA的表達,敲除xyl3A基因,在48個轉化子中篩選到一株xyl3A基因被敲除的菌株SUS7。再以SUS7菌株作為宿主菌,敲除pyr4篩選標記,后應用CRISPR/Cas9技術,在體外組裝Cas9/gRNA復合物并結合同源重組臂,共同轉化里氏木霉以分別定點敲除主要的纖維二糖水解酶cbh2基因以及內切葡聚糖酶eg1基因,進一步構建里氏木霉低纖維素酶背景的表達體系。4.里氏木霉中基于CRISPR/Cas9的新型編輯方法的探索CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第三代基因組編輯技術,具有高效的基因編輯能力,但是當我們在里氏木霉中應用時,發(fā)現(xiàn)其效率仍然很低。針對這一問題,我們對CRISPR/Cas9系統(tǒng)從各個角度嘗試進行改進,如對驅動gRNA的啟動子的改造、對Cas9蛋白進行突變、加入非同源DNA、加入小分子物質、使用熱脅迫條件等,以期提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在里氏木霉中的基因編輯效率。綜上所述,本研究綜合應用各種方法,構建了里氏木霉低纖維素酶背景的表達菌株;以構建過程中的菌株作為表達宿主,能明顯提高某些異源基因的表達水平。此外我們還對一些新型的編輯方法進行了有益的探索。
易拾[3]（2019）在《木質纖維素酶的生產優(yōu)化、定向進化和生物乙醇應用研究》文中研究表明本研究以農業(yè)廢棄物著手,本著變廢為寶和保護環(huán)境的宗旨,優(yōu)化木質纖維素酶的固態(tài)共發(fā)酵工藝,改造木質纖維素酶的最適溫度,志在解決二代生物乙醇的生產瓶頸。本研究為木質纖維素酶的高水平表達和二代生物乙醇高水平生產提供技術支撐,為木質纖維素酶最適溫度的分子改造提供科學依據(jù)。具體研究內容和結果如下:1)以農業(yè)廢棄物稻草和麩皮為原料,基于草酸青霉16（Po16）和里氏木霉Rut-C30的各自產酶優(yōu)勢,首次利用它們固態(tài)共發(fā)酵體系生產木質纖維素酶,采用單因素和響應曲面法優(yōu)化生產工藝,使濾紙酶、木聚糖酶、淀粉酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶（BGL）分別達到38.0IU/gds、352.9IU/gds、713.2IU/gds、15.7IU/gds、188.6IU/gds,與優(yōu)化前相比,分別提高了4.2倍、2.9倍、2.03倍、1.08倍和1.96倍。2)利用上述1)獲得的木質纖維素酶水解未處理麩皮（WB）、預處理稻草（pre-RS）,以及未處理麩皮和預處理稻草的混合物（WB+pre-RS）,利用不等溫半同步糖化發(fā)酵方法生產二代生物乙醇。具體為,以20IU/gds（FPase/克干物質）和10%固體載物量的投放量于pH5、45℃和150rpm條件下進行48h糖化,WB的糖化效率達到94.26%,pre-RS達到42.04%,WB+pre-RS達到93.23%;糖化后加入釀酒酵母UV-20于35℃靜置發(fā)酵48h,WB的乙醇轉化效率高達98.41%,pre-RS達到67%,WB+pre-RS達到90.8%,WB乙醇轉化效率明顯高于pre-RS轉化效率。3)BGL是木質纖維素水解的關鍵限速酶。Po16BGL能耐受任何濃度的木質素衍生物和呋喃衍生物,對乙醇、無機鹽和有機酸鹽也具有較好的耐受性,這表明它在生物乙醇生產中具有潛在的應用價值。抑制劑對Po16BGL的抑制程度為:水楊苷-有機酸>有機酸>水楊苷-有機酸鈉鹽>有機酸鈉鹽>水楊苷>水楊苷-KCl>水楊苷-NaCl>水楊苷-乙醇=乙醇。4)為縮短BGL最適溫度與釀酒酵母最適發(fā)酵溫度的差距,以Po16BGL為研究對象,采用易錯PCR方法,構建pGAPZαA-bgl載體并整合到畢赤酵母GS115,根據(jù)96孔板的高通量篩選方法,以便獲得最適溫度降低且活性高的突變酶。與初始酶相比較,Y-1-B1突變酶的比活提高至1.8倍,最適溫度從70℃降低為50℃,Kcat/Km達76.521 mL/mg.min,催化效率是初始酶的1.53倍。
羅長財[4]（2018）在《一種耐高溫β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中高效表達及其耐高溫機理分析》文中指出β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）能通過催化β-1,4-甘露糖苷鍵,將甘露聚糖水解為甘露糖和甘露低聚糖。作為一種重要的工業(yè)用酶制劑,β-甘露聚糖酶被廣泛應用于動物飼料、食品加工、生物漂白、紡織、可再生能源等領域。由于一些應用領域在加工過程中需要進行高溫處理,如飼料制粒、可再生能源生產等,這就要求所開發(fā)的β-甘露聚糖酶具有良好的耐高溫性能。目前,市面上存在的β-甘露聚糖酶在耐高溫性能方面往往達不到要求,因此,開發(fā)一種具有優(yōu)良耐高溫能力的β-甘露聚糖酶就顯得非常迫切,具有良好的應用前景。在本研究中,我們從熱泉中（水溫高于68℃）分離、篩選出一株產β-甘露聚糖酶的嗜熱枯草芽孢桿菌（TBS2）。以TBS2為出發(fā)菌株,經過基因克隆,在畢赤酵母X33中進行表達,獲得了一種重組耐高溫β-甘露聚糖酶（ReTMan26）。采用純化后的ReTMan26,完成了該酶的相關酶學性質檢測并對其耐高溫機理進行了相應分析。在此基礎上,通過密碼子優(yōu)化,大幅提高了ReTMan26在畢赤酵母中的表達水平。此外,還確定了來源于生物柴油生產過程中產生的副產物粗甘油可以作為一種廉價碳源,用于畢赤酵母進行ReTMan26的發(fā)酵生產。主要研究結果如下:（1）從熱泉中分離、篩選出一株產β-甘露聚糖酶的細菌,通過形態(tài)觀察、生理生化培養(yǎng)特征、16S rDNA序列比對及構建系統(tǒng)發(fā)育樹,鑒定出該細菌為一種嗜熱枯草芽孢桿菌（TBS2）。該菌可在pH 4.0-9.0、35-80℃條件下生長,最適生長pH為6.0-7.0、最適生長溫度為50℃。TBS2所產的β-甘露聚糖酶（BS-Man）的最適反應pH為6.0,最適反應溫度為55℃,在90℃、水溶液狀態(tài)下處理10 min,剩余酶活達到63.6%。（2）通過從NCBI中查找出其它來源于枯草芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶保守序列,設計引物,成功克隆出來源于嗜熱枯草芽孢桿菌TBS2中的耐高溫β-甘露聚糖酶基因TBS2-Man。TBS2-Man基因序列長957 bp,編碼318個氨基酸。通過蛋白結構及基因序列分析,該β-甘露聚糖酶屬于第26糖苷水解酶家族,含有3個潛在的N-糖基化位點（N8、N26與N255）及2個半胱氨酸位點（C48、C68）。在此基礎上,采用克隆出的基因TBS2-Man,構建并篩選出了一株產重組耐高溫β-甘露聚糖酶（ReTMan26）的畢赤酵母工程菌Orig-pPICZαA-X33,該菌株在搖瓶中的發(fā)酵水平為312 U×mL-1,在50 L罐中通過高密度液體發(fā)酵的表達水平為5435 U×m L-1。（3）對重組畢赤酵母Orig-pPICZαA-X33表達的ReTMan26純化后進行酶學性質檢測,結果表明:該酶的最適pH為6.0,在pH 2.0-8.0范圍內穩(wěn)定;最適反應溫度為60℃,有效作用溫度范圍為20-100℃,且在100℃、水溶液條件下處理10 min后,剩余酶活仍然可以達到58.6%;10 mmol×L-1的Mg2+、Mn2+對ReTMan26活性具有促進作用,而Ag+、Hg2+及SDS對ReTMan26具有較強的抑制作用;ReTMan26的Vmax為1612 U×mg-1蛋白,Km值為4.35 mg×mL-1。此外,ReTMan26表現(xiàn)出較強的抗蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）的消化能力。以上酶學性質表明,除其它潛在工業(yè)應用外,ReTMan26適宜作為一種飼料酶進行應用。（4）為探究ReTMan26的耐高溫機理,對該酶進行了氨基酸序列比對及蛋白質三維結構分析。結果表明:更短的氨基酸序列、部分氨基酸位點不同、二硫鍵及N-糖基化可能是造成ReTMan26具有優(yōu)良耐高溫性能的根本原因。為進一步確定N-糖基化及二硫鍵對ReTMan26的穩(wěn)定性,尤其是耐高溫性能的影響,分別采用天然蛋白去糖基化試劑盒及定點突變的方法,去除了ReTMan26中的N-多糖鏈及2個半胱氨酸位點（C48、C68）。研究發(fā)現(xiàn),N-糖基化可提高ReTMan26的最適反應溫度、耐熱性能分別為5℃和7℃。此外,N-糖基化還可提高ReTMan26抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化性能分別為23.7%及25.6%。二硫鍵對ReTMan26的最適反應溫度及提高抗消化酶性能沒有影響,但可提高耐熱性能約3℃。（5）為進一步提高ReTMan26在畢赤酵母X33中的表達水平,對來自于TBS2中的原始ReTMan26編碼基因TBS2-Man（Orig）進行了密碼子優(yōu)化,并構建出了一株含優(yōu)化基因（CoOp）的新重組畢赤酵母CoOp-p PICZαA-X33生產菌株。該菌株在高密度液體發(fā)酵中,ReTMan26的表達水平為10750 U×m L-1,在相同條件下,其生產性能比原重組畢赤酵母Orig-pPICZαA-X33(5412 U×mL-1)提高了98.6%。另外,在經過密碼子優(yōu)化的基因（CoOp）基礎上,繼續(xù)對該基因上游的信號肽（α-factor）進行了Kozak序列（GCCACCATG）改造,實驗結果表明,該方法對提高ReTMan26在畢赤酵母中的表達水平沒有效果,但這對今后構建畢赤酵母重組工程菌表達系統(tǒng),具有一定的參考作用。（6）為降低ReTMan26的生產成本,充分利用廢棄資源,采用來源于生物柴油生產的副產物粗甘油作為畢赤酵母快速生長期間的唯一碳源,結果表明:粗甘油中的皂類物質在添加濃度低于0.3%（相對于發(fā)酵培養(yǎng)基的質量體積比）時,不會抑制高密度液體發(fā)酵時的畢赤酵母菌體生長及ReTMan26生產。在此基礎上,不經任何前處理的粗甘油,可替代純甘油用于ReTMan26的發(fā)酵生產。通過采用粗甘油替代純甘油,ReTMan26的全部發(fā)酵生產成本可降低約4.2%。
宋妍[5]（2018）在《產氣腸桿菌B19 β-甘露聚糖酶基因的克隆表達及酶學性質研究》文中研究表明β-甘露聚糖酶（beta-mannanase）是一種水解類酶,能夠隨機切割線性甘露聚糖,半乳甘露聚糖,葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等主鏈的β-1,4-D-甘露糖甘鍵。由于β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖的價值和需求,來源于微生物的β-甘露聚糖酶的化學特性和結構性質,以及在各種應用被廣泛而深入的研究。β-甘露聚糖酶可以應用在紙漿漂白、降低咖啡粘度、洗滌劑配方和食品和動物飼料等領域中。因此,對β-甘露聚糖酶進行異源表達,分離純化以及酶學性質探究具有重要的研究意義。根據(jù)本實驗室篩選產氣腸桿菌B19菌株的16S rDNA,利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST功能在線比對16S rDNA,得到同源性較高的Enterobacter cloacae P101中的β-甘露聚糖酶基因序列,故以該菌株的β-甘露聚糖酶基因全長序列為模板,通過構建克隆載體,擴增并獲得β-甘露聚糖酶的基因序列,將驗證正確的β-甘露聚糖酶基因構建到pET28a（+）表達載體上,以大腸桿菌BL21（DE3）作為β-甘露聚糖酶異源表達的宿主菌,成功表達出β-甘露聚糖酶。通過Ni柱親和層析法分離純化得到純度較高的β-甘露聚糖酶,該酶蛋白的分子大小約為82.5 kDa。通過重組表達菌株BL21（DE3）-pET28a（+）-ManE異源表達進行β-甘露聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化。最佳的培養(yǎng)條件為:在重組表達菌株OD600約為0.6時加入0.6 mmol/L誘導劑IPTG,誘導溫度為20℃,160 rpm誘導表達12-16 h。重組β-甘露聚糖酶的酶學性質研究結果顯示:最適反應溫度和最適pH分別為55℃和6.5,重組β-甘露聚糖酶在5055℃溫度范圍內熱穩(wěn)定性較好,1 h后殘余酶活仍可保持在85%以上;重組β-甘露聚糖酶在pH 4.07.0區(qū)間內該重組酶的穩(wěn)定較好,保溫1h后測定的殘余酶活保持80%以上。低濃度Co2+、Mn2+、Zn2+、Ba2+和Ca2+對重組β-甘露聚糖酶的酶活有不同程度的激活作用。而K+、Mg2+和Cu2+對該重組酶有不同程度的阻礙作用,其中Cu2+對該重組酶催化活性的抑制作用最強,酶活降低到最大酶活力的65.3%,說明Cu2+是該酶的活性抑制劑。
李程程[6]（2018）在《里氏木霉高產纖維素酶的機理研究和應用》文中研究表明里氏木霉（Trichodermareesei）因其蛋白分泌量大（100g/L）、遺傳性狀穩(wěn)定、生長繁殖迅速、培養(yǎng)條件簡單和生物安全性等特點,已被廣泛用于工業(yè)生產及各種異源蛋白的表達載體。并且,該菌在特定條件下可以產生大量的具有抗癌、抗病毒、抗菌特性的次級代謝產物黃色色素類物質,具有廣泛的商業(yè)價值,次級代謝產物黃色色素的產生對纖維素酶的產生有一定的影響,二者受到相關調節(jié)因子的調控。同時,里氏木霉多個菌株的全基因組測序已經完成,這為研究里氏木霉纖維素酶、色素類物質的高產機制以及二者之間的相關性奠定了基礎,也為基因改造獲得具有優(yōu)良特性的高產菌株提供了輔助手段。本論文主要以里氏木霉RUT-C30為出發(fā)菌株通過基因工程改造獲得了在纖維素誘導條件下高產纖維素酶的基因工程菌TRB1、在纖維素和乳糖誘導下都能高產纖維素酶的里氏木霉基因工程菌SEU-7以及高產色素的基因工程菌ZC121121,并針對以上構建的基因工程菌研究了纖維素酶的高產機制、里氏木霉纖維素酶和色素產生之間的相互轉化機制。之后,我們采用熒光標記的辦法對里氏木霉三種主要的纖維素酶進行標記以研究纖維素酶的真實分布情況以及分泌機制。最后采用轉錄組測序及基因干擾等手段對纖維素酶的產生及其和色素產生的轉化關系進行了深入研究。具體說來主要包含以下內容:1.構建了高產pNPGase/BGL（β-葡萄糖苷酶）的基因工程菌TRB1,并揭示了基因cel3d在纖維素酶高產中的作用及機理以里氏木霉RUT-C30為出發(fā)菌株,采用農桿菌介導的方法構建了高產β-葡萄糖苷酶的基因工程菌TRB1。qRT-PCR以及基因克隆實驗顯示TRB1中cel3d基因受到了干擾,是纖維素酶增加的原因之一。2.構建了乳糖誘導下高產纖維素酶的基因工程菌SEU-7并研究其高產機制首次構建了一株可以在乳糖誘導下高產纖維素酶的基因工程菌SEU-7。與出發(fā)菌株RUT-C30相比,SEU-7的纖維素酶和半纖維素酶活性無論在纖維素還是在乳糖誘導條件下都大幅度提高。以乳糖作為誘導物,在分批培養(yǎng)條件下,FPase（濾紙酶活）活性可以達到13IU/mL;分批補料培養(yǎng)時,活性提高至47IU/mL,此外,在分批培養(yǎng)過程中,SEU-7在纖維素和乳糖誘導條件下均表現(xiàn)出了極高的pNPGase活性,分別為81和144IU/mL,是目前已知菌株中最高的。之后采用qRT-PCR、qPCR以及基因組重測序分析研究了其在不同碳源下的高產機理。3.敲除基因121121過程中引起的并行突變在里氏木霉纖維素酶和黃色色素產生中的開關作用通過構建基因121121干擾的基因工程菌及過表達121121的菌株,揭示了基因121121以及干擾該基因帶來的并行突變在纖維素酶產生和黃色色素類物質sorbicillin分泌過程的開關作用,即,干擾121121以及帶來的并行突變會降低纖維素酶產量但極大程度增加黃色色素sorbicillin的產量,并對該基因工程菌進行了 RNA-seq分析。同時采用液質聯(lián)用（HPLC-MS）的方法檢測了敲除菌株ZC121121和過表達菌株OE121121的代謝產物。4.里氏木霉纖維素酶的產生、分布以及分泌機制研究采用紅色熒光蛋白對三種主要的纖維素酶BGL、CMC/CMCase（內切葡聚糖酶）和CBH/pNPCase（外切葡聚糖酶）進行了標記,研究了三種纖維素酶產生的先后順序、在細胞內的分布情況以及分泌情況,結果發(fā)現(xiàn)BGL在菌絲體內表達量最多,而后是CMC和CBH,然而,BGL的分泌卻晚于CMC和CBH。共聚焦觀察結果表明BGL和CBH是定位到細胞膜上的,而CMC沒有定位到膜上,GC-Cholesterol-PEG-FITC共染、原生質體制備以及超高分辨結果更進一步的證明了 BGL定位到了細胞膜上。通過進一步的內質網共染實驗證明了三種主要的纖維素酶都會被輸送到內質網進行加工修飾,并且三種酶都存在于囊泡中,高爾基體共染實驗證明BGL和CMC都要經過高爾基體分泌到胞外,而CBH則可能不通過或少量通過高爾基體分泌。
張國秀[7]（2017）在《里氏木霉纖維素酶高產菌株遺傳改造及新型糖苷水解酶的挖掘》文中研究表明里氏木霉是生物質降解酶的重要生產者之一,其生產的酶被廣泛應用于工業(yè)生產。一些里氏木霉高產突變菌株已經通過傳統(tǒng)誘變方法獲得。然而,生物質降解酶生產的高成本仍然是其商業(yè)化應用的巨大挑戰(zhàn)。此外,這些突變菌株相應表型下的遺傳機制僅僅被部分地理解。全面地理解遺傳改變對纖維素酶生產的影響有利于開發(fā)更高效的纖維素酶生產菌株。在里氏木霉中,pH也是影響纖維素酶生產的重要因素。質膜H+-ATP酶在調節(jié)胞內pH穩(wěn)態(tài)和營養(yǎng)攝取等生理過程中發(fā)揮著關鍵作用。然而,里氏木霉的質膜H+-ATP酶的功能到目前為止仍然沒有被研究。多種糖苷水解酶的組合使用已經廣泛應用于工業(yè)生產。為了滿足糖苷水解酶在工業(yè)生產中的需求,工業(yè)上迫切需要具有高表現(xiàn)力的糖苷水解酶來降低生產成本。宏基因組學已經成為一種強有力的方法直接研究微生物群落的多樣性和挖掘新型生物催化劑。為了開發(fā)更高效的酶制劑生產菌株和挖掘新的糖苷水解酶,本文從以下三個方面展開了研究。1)一株里氏木霉突變菌株SS-Ⅱ通過多次的NTG誘變在菌株NG14的基礎上分離獲得。與菌株RUT-C30相比,擁有完整Cre1蛋白的SS-Ⅱ在微晶纖維素或乳糖培養(yǎng)下展現(xiàn)出更快的生長和約1.5倍高的羧甲基纖維素酶活性。通過SS-Ⅱ和RUT-C30的轉錄組數(shù)據(jù)的對比分析,我們發(fā)現(xiàn)有1764個基因在微晶纖維素、葡萄糖、乳糖和小麥秸稈下差異化表達。在此基礎上,65個纖維素降解相關的酶、41個轉錄因子和152個轉運蛋白的轉錄數(shù)據(jù)被進一步分析。為了鑒定在SS-Ⅱ中發(fā)生的遺傳突變,我們對其基因組進行了測序。在SS-Ⅱ中,總共有184個單核苷酸位點突變和40個小的插入/缺失被鑒定。此外,157個受突變影響的基因被鑒定。在這些基因中,大多數(shù)涉及運輸、分泌、蛋白質代謝和轉錄。9個在SS-Ⅱ中受突變影響的基因被進一步分析。微晶纖維素培養(yǎng)下,在RUT-C30中敲除其中的3個基因會明顯影響纖維素酶的生產。菌株SS-Ⅱ和RUT-C30的轉錄組比較分析有助于理解代謝轉變在纖維素酶生產中的影響?；蚪M重測序揭露了一些可能影響纖維素酶生產的新的位點和其他一些被忽視的領域。我們的研究為鑒定更多的涉及纖維素酶生產的基因提供了資源,這為構建更高效的生產菌株提供了堅實的理論基礎。此外,我們也構建了里氏木霉光控表達系統(tǒng)用于異源蛋白表達。2)里氏木霉的兩個質膜H+-ATP酶通過基因敲除策略被首次鑒定和功能化表征。通過分析我們發(fā)現(xiàn)基因tre76238作為質膜H+-ATP酶在里氏木霉中發(fā)揮主要功能,而基因tre78757發(fā)揮次要功能。基因tre78757的敲除并不影響菌株表型,而基因tre76238的敲除則會損害菌株將質子從胞內泵出到胞外的能力,pH穩(wěn)態(tài)的失調導致菌株在葡萄糖培養(yǎng)下能夠持續(xù)的累積纖維素酶。轉錄水平分析顯示在敲除菌株De1238中纖維素酶合成相關的基因的轉錄水平大幅度提升。盡管xyr1的轉錄水平并沒有提升,但是EMSA分析顯示在菌株De1238中的確有其他的蛋白與cbh1啟動子發(fā)生了結合。通過pull-down技術以及質譜分析,三個可能涉及纖維素酶基因調控的鋅指蛋白被鑒定。這些發(fā)現(xiàn)為里氏木霉纖維素酶的表達調控提供了新的見解,同時也為通過調節(jié)胞內pH穩(wěn)態(tài)來改善絲狀真菌纖維素酶的生產提供了新的策略。3)為了挖掘新的糖苷水解酶,我們利用棉花生物質作為碳源對土壤樣品微生物進行了富集培養(yǎng)。為了理解棉花生物質的降解過程,我們對微生物群落分泌的糖苷水解酶譜進行表征,結果顯示在這個微生物群落中細胞和纖維素底物之間的物理接觸是纖維素高效降解所必需的。通過16SrRNA分析,具有代表性的微生物群落結構被鑒定,噬纖維細菌很可能在這個群落中對棉花生物質降解起重要作用。通過對宏基因組序列的分析,32個主要的糖苷水解酶家族被鑒定,總共含有2058個候選的基因。16個糖苷水解酶編碼基因被克隆并在大腸桿菌中成功表達,這些蛋白分別對4-硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷、4-硝基苯基-β-D-木糖苷、昆布多糖、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、4-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸、羧甲基纖維素和4-硝基苯基-β-D-甘露糖苷具有水解活性。此外,3個蛋白與最近似的同源物的一致性低于60%。土壤微生物基因組分析為挖掘新型生物質降解酶提供了良好的策略?？寺〉氖畮讉€糖苷水解酶在生物質轉化和產品生產中也具有潛在的應用價值。我們的研究為理解植物生物質降解的途徑以及酶的組成和相互作用提供了一定的見解。
馬清,蔡瑞,姜風超,馬立娟,杜麗平,肖冬光[8]（2017）在《N-糖基化對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達的影響》文中進行了進一步梳理為研究N-糖基化對里氏木霉β-甘露聚糖酶（β-mannanase,Man1）在畢赤酵母GS115中異源表達的影響,采用定點突變的方法,將Man1上3個N-糖基化修飾位點（N131、N158和N329）上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。結果發(fā)現(xiàn),N-糖基化位點的突變對Man1的轉錄水平無明顯影響,突變后獲得的Man1表觀分子質量有輕微下降,與Man1相比,3個突變體N131、N158和N329的甘露聚糖酶活力分別降低了85.43%和79.48%和16.3%;而熱穩(wěn)定性分別提高了7.87%、13.5%和15.37%。由此可見,N-糖基化修飾對于β-甘露聚糖酶的高效表達是必需的,其中N131和N158糖基化位點尤為重要,但是會稍微降低β-甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性。
張飛[9]（2017）在《利用人工鋅指蛋白技術提高里氏木霉Rut-C30纖維素酶產量》文中提出石油資源儲量不斷減少,而且石油基燃料和化學品大量使用產生的環(huán)境污染及氣候變化等問題日益突出,嚴重影響經濟和社會的可持續(xù)發(fā)展。木質纖維素類生物質資源豐富且可再生,特別是各類農林廢棄物,其主要成分半纖維素和纖維素可以水解為糖,進而通過微生物發(fā)酵生產生物燃料和生物基化學品。這一生物煉制技術路線,可望替代石油依賴型經濟,已經得到國內外的廣泛關注。半纖維素易于水解,但纖維素作為植物細胞壁的主要成分提供保護作用,自然進化使其對水解有強抗性,特別是對酶的作用。因此,高效低成本纖維素酶成為建立基于纖維素水解的糖平臺,乃至生物煉制的瓶頸之一。纖維素酶是復合酶系,主要由纖維二糖水解酶、內切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶等組成,高效降解木質纖維素類生物質需要多種酶組分的協(xié)同作用。來自絲狀真菌里氏木霉的Trichoderma reesei Rut-C30是纖維素酶高產菌株之一,已廣泛應用于工業(yè)生產,但纖維素酶發(fā)酵過程酶產量低導致成本高的問題特別突出,無法用于木質纖維素類生物質資源的生物煉制。T.reeseI纖維素酶合成調控機制研究表明,纖維素酶的生物合成主要由Xyr1、Crel等內源轉錄調控因子調控,但其他影響因素還有待進一步闡明。鋅指蛋白具有鋅指結構,是多種生命體系中普遍存在的轉錄因子,利用人工設計的鋅指蛋白文庫進行改造并選育突變體,調控基因轉錄,已廣泛應用于大腸桿菌和酵母等微生物,并成功獲得了耐溫性等表型或外源蛋白過量表達的突變體,但是目前為止還未見其應用在絲狀真菌中的報道。本研究工作首次探討了人工鋅指蛋白（Artificial Zinc Finger Protein,AZFP）對里氏木霉纖維素酶生產的影響,利用AZFP文庫轉化T.reesei Rut-C30,篩選高產纖維素酶的絲狀真菌突變體,并與對照菌株比較,研究突變體纖維素酶組分和蛋白分泌情況。本文主要內容如下:構建了適用于絲狀真菌的表達載體,比較了原生質體轉化和根癌農桿菌介導轉化方法,并對根癌農桿菌介導轉化方法進行了條件優(yōu)化,確定最佳轉化條件為:根癌農桿菌AGL-1生長OD660值達到0.8時,在βH5.3、24℃及乙酰丁香酮濃度200 μM條件下進行轉化共培養(yǎng),轉化效率可達到200個轉化子/106孢子。進而,構建絲狀真菌人工鋅指蛋白表達載體文庫并轉化T.reesei Rut-C30,獲得了近600個轉化子,通過纖維素平板培養(yǎng)和搖瓶液體發(fā)酵篩選,獲得了高產纖維素酶的T.reeseiRut-C30轉化子（U3）。對U3進行性能驗證,發(fā)現(xiàn)其纖維素酶活性比出發(fā)菌株提高了 55%,通過RNA定量分析和纖維素酶組分酶學性質測定,確定U3菌株的β葡萄糖苷酶活性比出發(fā)菌株提高了 8倍,同時內切葡聚糖酶活性提高了 28%。利用粗酶液對堿預處理玉米秸稈進行水解,其葡萄糖收率比出發(fā)菌株T.reesei Rut-C30粗酶液水解過程提高了 115%。這些結果表明:U3菌株纖維素酶酶系的組成在其人工鋅指蛋白AZFP-U3的作用下發(fā)生了顯著變化,從而提高了纖維素組分的酶解效率。對AZFP-U3潛在的靶點基因進行分析,結合實時定量PCR的驗證結果,進一步選擇并對四個可能的靶基因進行功能驗證,分別編碼兩個功能未知假定的轉錄因子（TrireC30125610和TrireC307183）、線粒體內膜轉運蛋白（TrireC30<sub>46633）和糖苷水解酶（TrireC3088814）基因。構建表達載體,將上述基因在T.reesei Rut-C30中過量表達,檢測其對纖維素酶生產的影響,發(fā)現(xiàn)轉錄因子125610的過表達使Rut-C30胞外纖維素酶酶活提高了 200%,同時轉化子T125610胞外蛋白分泌能力提高了 219%。通過人工鋅指蛋白文庫篩選得到的另外一個轉化子U5比U3具有更強的纖維素降解能力,其胞外分泌的纖維素酶活性比出發(fā)菌株提高了 112%,同時檢測到其胞外蛋白分泌量提高了大約86%。比較U5和出發(fā)菌株發(fā)酵獲得的粗酶液對堿預處理后的玉米秸稈進行酶解效果,發(fā)現(xiàn)其葡萄糖收率提高了 33.9%。主要纖維素酶基因轉錄分析和各組分酶活測定都表明U5纖維素酶各組分酶活發(fā)生顯著變化,對U5和出發(fā)菌株進行比較轉錄組學分析,進一步揭示人工鋅指蛋白提高纖維素酶合成的分子機理。轉錄組學分析結果表明:培養(yǎng)24 h時,U5突變株糖苷水解酶、轉運蛋白、轉錄因子及蛋白酶體,參與mRNA監(jiān)測途徑、內質網蛋白加工途徑的基因,轉錄水平比出發(fā)菌株有顯著提高,而且過氧化物酶體、CoA合成途徑、N-糖苷合成途徑、氨酰-tRNA合成途徑、煙酰胺代謝途徑、脂肪酸代謝途徑相關基因轉錄水平也有上調,為纖維素酶轉錄和蛋白修飾加工過程中提供氨基酸前體、輔酶和能量。此外,U5中絲狀真菌蛋白分泌壓力響機制（RESS）受到激活,在48 h時尤為明顯,RESS的激活可使過多的mRNA迅速降解,盡管RESS與纖維素酶合成的關系還有待深入研究,此時突變體U5中主要糖苷水解酶和內質網蛋白加工相關蛋白基因轉錄量與出發(fā)菌株相比仍然顯著上調,表明AZFP-U5對糖苷水解酶轉錄和翻譯后修飾具有促進作用。AZFP-U5潛在的靶點基因轉錄分析也發(fā)現(xiàn)變化,這些基因包括負責蛋白翻譯后修飾、信號傳遞、氨基酸代謝的基因。比較轉錄組學數(shù)據(jù)分析結果,為進一步探討人工鋅指轉錄因子在T.reesei中的作用機制,并尋找關鍵調控基因進行進一步代謝工程改造奠定了基礎。本研究工作利用人工鋅指蛋白技術對T.reesei Rut-C30進行了代謝工程改造,證明人工轉錄因子可以有效用于提高其纖維素酶活性和蛋白分泌能力,為進一步選育高產纖維素酶T.reesei菌株奠定了基礎,也為改造其他絲狀真菌,提高蛋白表達和分泌能力提供了借鑒。
蔡瑞[10]（2016）在《里氏木霉β-甘露聚糖酶的克隆表達及結構域的研究》文中認為木質纖維素生物質是一種豐富的可再生資源,然而由于半纖維素與木質素將纖維素緊緊的包裹在里面,這種結構導致生物質很難被有效利用。目前被廣泛接受的技術路線就是酶解法,因此本論文針對一種具有應用潛力的半纖維素酶β-甘露聚糖酶,對其結構功能及協(xié)同纖維素酶的水解能力進行探討研究。里氏木霉β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）由糖苷水解酶GH5家族的催化結構域、Linker區(qū)域和真菌型碳水結合模塊（CBM）三部分組成。通過RT-PCR方法得到β-甘露聚糖酶全長和兩個截短酶（命名為manl、man1△C1M和man1△LCBM）三種基因片段。Man1和Man1△CBM均能在Pichia pastoris GS115中高效表達,酶活分別達到34.5 IU/mL和42.9 IU/mL,而Man1 △LCBM酶活卻因Linker和CBM模塊的缺失導致蛋白結構發(fā)生變化,酶活僅僅為0.36 IU/mL。重組Man1和Man1 △CBM具有相似的酶學性質,但在溫度穩(wěn)定性上表現(xiàn)出明顯的差異,當在60 ℃下處理120 h后Man1能夠維持72.7%的酶活力,Man1 △CBM則僅能維持47.9%的酶活力。但當70 ℃下處理60 min后,截短酶卻比全長提高了 13.3%。與重組Man1 △CBM相比,Man1對可溶性底物刺槐豆膠和半乳甘露聚糖均表現(xiàn)出相對低的特異性;而當協(xié)助纖維素酶水解纖維素和堿處理的甘蔗渣時,Man1的添加則體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢,尤其在纖維素酶ECⅡ基礎上添加甘露聚糖酶,使還原糖產量分別提高28.54%和20.31%。利用定點突變用中性谷氨酰胺G1n取代β-甘露聚糖酶N-糖基化修飾位點上的天冬酰胺Asn。結果發(fā)現(xiàn)突變后甘露聚糖酶酶活均有所下降,因此N-糖基化修飾對于β-甘露聚糖酶的高效表達是必需的,其中N131和N158糖基化位點尤為重要,突變后分別使甘露聚糖酶酶活降低了 85.43%和79.48%。N329突變體酶活降低幅度較小,僅僅為16.3%,而穩(wěn)定性卻有所提高,與原重組甘露聚糖酶Man1相比提高15.37%。
二、里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表達載體的構建（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結構并詳細分析其設計過程。在該MMU結構中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結構映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉換過程,TLB結構組織等。該MMU結構將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關信息。
實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關系。
文獻研究法：通過調查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學理論和實踐的需要提出設計。
定性分析法：對研究對象進行“質”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。
跨學科研究法：運用多學科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。
功能分析法：這是社會科學用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表達載體的構建（論文提綱范文）
（1）β-甘露聚糖酶在里氏木霉中的高效表達（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符號及縮略詞說明 |
| 第一章 研究背景與立題依據(jù) |
| 1.1 絲狀真菌蛋白表達系統(tǒng) |
| 1.1.1 啟動子的選擇與改造 |
| 1.1.2 轉錄因子改造在蛋白表達中的應用 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在真菌基因編輯中的應用 |
| 1.3 β-甘露聚糖酶的研究進展 |
| 1.3.1 β-甘露聚糖 |
| 1.3.2 β-甘露聚糖酶的分類 |
| 1.3.3 β-甘露聚糖酶的酶學性質 |
| 1.3.4 β-甘露聚糖酶的應用 |
| 1.4 本論文的立題依據(jù)及研究內容 |
| 第二章 草酸青霉甘露聚糖酶Man5A在里氏木霉中的組成型表達及性質研究 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 里氏木霉中man5A組成型表達盒的構建 |
| 2.1.3 常用培養(yǎng)基和儲備液 |
| 2.1.4 大腸桿菌轉化 |
| 2.1.5 大腸桿菌質粒提取 |
| 2.1.6 里氏木霉原生質體的制備及轉化 |
| 2.1.7 轉化子的分離純化 |
| 2.1.8 里氏木霉基因組DNA提取方法 |
| 2.1.9 酶活力的測定 |
| 2.1.10 胞外蛋白濃度的測定 |
| 2.1.11 總還原糖量測定 |
| 2.1.12 熒光定量PCR |
| 2.1.13 豆粕的酶解處理 |
| 2.2 結果與討論 |
| 2.2.1 man5A在里氏木霉基因組中的隨機插入表達 |
| 2.2.2 man5A在里氏木霉基因組中的定點插入表達 |
| 2.2.3 不同長度組成型表達啟動子Pcdna1啟動效率評價 |
| 2.2.4 Man5A酶學性質的初步研究 |
| 2.2.5 β-甘露聚糖酶在豆粕處理中的應用 |
| 2.3 本章小結 |
| 第三章 草酸青霉甘露聚糖酶Man5A在里氏木霉中的誘導型表達研究 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 表達盒的構建 |
| 3.1.3 常用培養(yǎng)基和儲備液 |
| 3.1.4 大腸桿菌轉化 |
| 3.1.5 大腸桿菌質粒提取 |
| 3.1.6 里氏木霉原生質體的制備及轉化 |
| 3.1.7 轉化子的分離純化 |
| 3.1.8 里氏木霉基因組DNA提取方法 |
| 3.1.9 酶活力的測定 |
| 3.1.10 胞外蛋白濃度測定 |
| 3.2 結果與分析 |
| 3.2.1 基于CRISPR/Cas9基因編輯定點插入Pcbh1(mutants)-man5A |
| 3.2.2 基于經典同源重組方法定點插入Pcbh1(mutants)-man5A |
| 3.2.3 過表達XYR1~(A824V)實現(xiàn)man5A的高效表達 |
| 3.3 本章小結 |
| 全文總結與展望 |
| 參考文獻 |
| 攻讀學位期間參與發(fā)表的學術論文 |
| 致謝 |
| 學位論文評聞及答辯情況表~~ |
（2）低纖維素酶背景里氏木霉表達宿主菌的構建（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 里氏木霉表達系統(tǒng) |
| 1.1.1 里氏木霉簡介 |
| 1.1.2 里氏木霉分泌的內源酶 |
| 1.1.2.1 纖維素酶與半纖維素酶 |
| 1.1.2.2 里氏木霉產纖維素酶優(yōu)勢 |
| 1.1.2.3 纖維素酶的應用 |
| 1.1.3 里氏木霉異源蛋白表達策略 |
| 1.1.3.1 構建纖維素酶缺失菌株 |
| 1.1.3.2 啟動子改造 |
| 1.1.3.3 密碼子優(yōu)化 |
| 1.1.3.3 異源蛋白融合表達 |
| 1.2 里氏木霉轉化體系 |
| 1.2.1 優(yōu)良的宿主菌 |
| 1.2.2 里氏木霉的轉化 |
| 1.2.2.1 電穿孔轉化法 |
| 1.2.2.2 T-DNA介導的根瘤農桿菌轉化法 |
| 1.2.2.3 基因槍法 |
| 1.2.2.4 PEG介導的原生質體轉化法 |
| 1.2.3 里氏木霉的篩選標記 |
| 1.2.3.1 抗生素抗性基因 |
| 1.2.3.2 營養(yǎng)獲得型 |
| 1.2.3.3 營養(yǎng)缺陷型 |
| 1.3 里氏木霉遺傳操作體系簡介 |
| 1.3.1 同源重組 |
| 1.3.1.1 同源重組簡介 |
| 1.3.1.2 同源重組在里氏木霉中的應用 |
| 1.3.2 RNAi技術 |
| 1.3.2.1 RNAi技術的作用機理 |
| 1.3.2.2 RNAi在真菌功能研究中的策略 |
| 1.3.2.3 RNAi技術在里氏木霉中的應用 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng) |
| 1.3.3.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的起源 |
| 1.3.3.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的組成 |
| 1.3.3.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作用機理 |
| 1.3.3.4 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的脫靶效應 |
| 1.3.3.5 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在里氏木霉中的應用 |
| 1.4 β-葡萄糖苷酶 |
| 1.4.1 β-葡萄糖苷酶簡介 |
| 1.4.2 β-葡萄糖苷酶的應用 |
| 1.5 β-甘露聚糖酶 |
| 1.5.1 β-甘露聚糖酶簡介 |
| 1.5.2 β-甘露聚糖酶的應用 |
| 1.6 本研究的內容及意義 |
| 第二章 結合CRISPR/Cas9和RNAi技術同時對主要纖維素酶cbh1和eg2 基因進行編輯 |
| 2.1 實驗材料 |
| 2.1.1 菌株與質粒 |
| 2.1.2 培養(yǎng)基與溶液配制 |
| 2.1.2.1 培養(yǎng)基 |
| 2.1.3 實驗儀器與生化試劑 |
| 2.1.3.1 實驗儀器 |
| 2.1.3.2 生化試劑 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 實驗方法 |
| 2.2.1 大腸桿菌和里氏木霉的培養(yǎng) |
| 2.2.2 里氏木霉總DNA的提取 |
| 2.2.3 pEG2i質粒的構建 |
| 2.2.3.1 基因片段獲得 |
| 2.2.3.2 構建中間質粒載體p Pdc1-Eno1 |
| 2.2.4 gRNA-cbh1 的制備 |
| 2.2.4.1 gRNA的體外轉錄 |
| 2.2.5 里氏木霉轉化 |
| 2.2.6 陽性轉化子的篩選 |
| 2.2.7 纖維素酶的誘導表達 |
| 2.2.8 SDS-PAGE及質譜分析 |
| 2.2.9 里氏木霉總RNA的提取 |
| 2.2.10 基因轉錄水平的測定 |
| 2.2.11 纖維素酶酶活的測定 |
| 2.2.11.1 標準曲線的制定 |
| 2.2.11.2 外切纖維素酶酶活的測定 |
| 2.2.11.3 內切纖維素酶酶活的測定 |
| 2.3 結果與分析 |
| 2.3.1 Cas9/gRNA復合物敲除里氏木霉cbh1 基因 |
| 2.3.2 選定轉化子中CBH1和EG2分泌表達情況 |
| 2.3.2.1 SDS-PAGE檢測目的蛋白 |
| 2.3.2.2 纖維素酶酶活的測定 |
| 2.3.3 eg2基因轉錄水平分析 |
| 2.3.4 質譜鑒定 |
| 2.4 討論 |
| 第三章 低纖維素酶背景促進β-葡萄糖苷酶在里氏木霉中的異源表達 |
| 3.1 試驗材料 |
| 3.1.1 菌株和質粒 |
| 3.1.2 培養(yǎng)基與溶液配制 |
| 3.1.3 實驗儀器與生化試劑 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 實驗方法 |
| 3.2.1 大腸桿菌和里氏木霉的培養(yǎng) |
| 3.2.2 pyr4篩選標記的敲除 |
| 3.2.3 表達外源基因載體轉化里氏木霉 |
| 3.2.4 陽性轉化子的篩選 |
| 3.2.5 異源β-葡萄糖苷酶和異源甘露聚糖酶基因的誘導表達 |
| 3.2.6 SDS-PAGE檢測目的蛋白的分子大小 |
| 3.2.7 β-葡萄糖苷酶的酶活測定 |
| 3.2.7.1 pNP標準曲線的繪制 |
| 3.2.7.2 β-葡萄糖苷酶酶活測定方法 |
| 3.2.8 甘露聚糖酶的酶活測定 |
| 3.2.8.1 甘露糖標準曲線的繪制 |
| 3.2.8.2 甘露聚糖酶酶活測定方法 |
| 3.3 結果與分析 |
| 3.3.1 β-葡萄糖苷酶基因Nf Bgl3A的異源表達 |
| 3.3.1.1 p RS-Nf Bgl3A-solo質粒圖譜 |
| 3.3.1.2 篩選陽性轉化子 |
| 3.3.1.3 蛋白表達檢測 |
| 3.3.1.4 pNP標準曲線繪制 |
| 3.3.1.5 β-葡萄糖苷酶酶活的測定 |
| 3.3.2 An Man5A(opt)在里氏木霉中的異源表達 |
| 3.3.2.1 p Pcbh1-An Man5A(opt)-Tcbh1-TEL質粒圖譜 |
| 3.3.2.1 陽性轉化子的PCR驗證 |
| 3.3.2.2 標準曲線的繪制 |
| 3.4 討論 |
| 第四章 木糖苷酶xyl3A和纖維素酶基因cbh2、eg1 的敲除 |
| 4.1 試驗材料 |
| 4.1.1 菌株和質粒 |
| 4.1.2 培養(yǎng)基與溶液配制 |
| 4.1.3 實驗儀器與生化試劑 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 實驗方法 |
| 4.2.1 大腸桿菌和里氏木霉的培養(yǎng) |
| 4.2.2 里氏木霉總DNA的提取 |
| 4.2.3 使用CRISPR/Cas9 敲除xyl3A基因 |
| 4.2.3.1 篩選高效切割xyl3A基因的gRNA |
| 4.2.3.2 sgRNA-xyl3A表達盒的構建 |
| 4.2.3.3 APA-Cas9-sgRNA-xyl3A質粒的構建 |
| 4.2.3.4 Donor DNA的構建 |
| 4.2.4 Cas9/gRNA RNP復合物分別敲除cbh2和eg1 基因 |
| 4.2.4.1 gRNA的制備 |
| 4.2.4.2 Donor DNA的制備 |
| 4.2.5 里氏木霉轉化 |
| 4.2.6 陽性轉化子的篩選 |
| 4.2.7 纖維素酶的誘導表達 |
| 4.2.8 SDS-PAGE檢測目的蛋白的分子大小 |
| 4.2.9 pyr4篩選標記的敲除 |
| 4.3 結果與分析 |
| 4.3.1 使用胞內表達Cas9 方法敲除xyl3A基因 |
| 4.3.1.1 針對xyl3A基因的gRNA篩選 |
| 4.3.1.2 sgRNA-xyl3A與 Cas9 的表達載體的構建 |
| 4.3.1.3 篩選發(fā)生基因組編輯的轉化子 |
| 4.3.1.4 轉化子分泌蛋白的電泳分析 |
| 4.3.2 SUS7 菌株中分別敲除cbh2和eg1 基因 |
| 4.3.2.1 SUS7尿嘧啶缺陷型菌株的獲得 |
| 4.3.2.1 轉化子篩選 |
| 4.3.1.4 轉化子分泌蛋白的電泳分析 |
| 4.4 討論 |
| 第五章 不同CRISPR/Cas9 基因組編輯方法在里氏木霉中的應用探索 |
| 5.1 試驗材料 |
| 5.1.1 菌株和質粒 |
| 5.1.2 培養(yǎng)基與溶液配制 |
| 5.1.3 實驗儀器與生化試劑 |
| 5.1.4 引物 |
| 5.2 實驗方法 |
| 5.2.1 大腸桿菌和里氏木霉的培養(yǎng) |
| 5.2.2 里氏木霉總DNA的提取 |
| 5.2.3 設計II型啟動子驅動gRNA |
| 5.2.3.1 crRNA表達盒的構建 |
| 5.2.3.2 tracRNA表達盒的構建 |
| 5.2.3.3 pAPA-gpd1P-eno1T-cr/trac RNA質粒的構建 |
| 5.2.3.4 擴增用以里氏木霉轉化的Cas9 DNA表達盒片段 |
| 5.2.4 5S rRNA啟動子用于引導gRNA的高效表達 |
| 5.2.5 應用Cas9(D10A)突變體進行基因編輯 |
| 5.2.5.1 Cas9蛋白作用的eg1基因的體外切割驗證實驗 |
| 5.2.5.2 sgRNA表達盒的構建 |
| 5.2.5.3 APA-Cas9(D10A)-sgRNA-eg1 質粒的構建 |
| 5.2.5.4 Donor DNA的構建 |
| 5.2.6 應用小分子調節(jié)CRISPR/Cas9 的基因編輯效率 |
| 5.2.6.1 Cas9蛋白作用的基因的體外切割驗證實驗 |
| 5.2.7 通過添加非同源DNA來增加基因的破壞效率 |
| 5.2.7.1 Cas9蛋白作用的基因的體外切割驗證實驗 |
| 5.2.8 利用熱脅迫提高CRISPR/Cas9 的基因編輯效率 |
| 5.2.8.1 Cas9蛋白作用的基因的體外切割驗證實驗 |
| 5.2.9 里氏木霉轉化 |
| 5.2.10 陽性轉化子的篩選 |
| 5.2.11 纖維素酶的誘導表達 |
| 5.2.12 SDS-PAGE檢測目的蛋白的分子大小 |
| 5.3 結果與分析 |
| 5.3.1 使用 II 型啟動子驅動 gRNA的表達 |
| 5.3.1.1 pAPA-gpd1P-eno1T-cr/tracRNA質粒的構建 |
| 5.3.1.2 轉化子篩選 |
| 5.3.1.3 轉化子的產孢表型 |
| 5.3.1.4 SDS-PAGE分析 |
| 5.3.2 使用5S rRNA啟動子引導gRNA表達 |
| 5.3.2.1 陽性轉化子的驗證 |
| 5.3.3 應用Cas9(D10A)突變體進行基因編輯 |
| 5.3.3.1 Cas9蛋白作用的eg1基因的體外切割驗證實驗 |
| 5.3.3.2 陽性轉化子的驗證 |
| 5.3.3.3 SDS-PAGE分析 |
| 5.3.4 使用小分子化合物調節(jié)CRISPR/Cas9 介導的同源重組效率 |
| 5.3.5 添加非同源DNA來增加基因的編輯效率 |
| 5.3.6 利用熱脅迫嘗試提高CRISPR/Cas9 的基因編輯效率 |
| 5.4 討論 |
| 第六章 全文結論 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 作者簡介 |
（3）木質纖維素酶的生產優(yōu)化、定向進化和生物乙醇應用研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 緒論 |
| 1.1 木質纖維素 |
| 1.2 木質纖維素酶 |
| 1.2.1 木質纖維素酶簡介 |
| 1.2.2 木質纖維素酶的結構與功能 |
| 1.2.3 木質纖維素酶的分類 |
| 1.2.3.1 纖維素酶 |
| 1.2.3.2 半纖維素酶 |
| 1.2.3.3 淀粉酶 |
| 1.2.4 木質纖維素酶的生產者 |
| 1.3 木質纖維素酶的固態(tài)共發(fā)酵 |
| 1.4 二代生物乙醇生產 |
| 1.4.1 國內外生物乙醇研究進展 |
| 1.4.2 二代生物乙醇生產瓶頸 |
| 1.4.3 二代生物乙醇發(fā)酵模式 |
| 1.4.3.1 分步糖化發(fā)酵 |
| 1.4.3.2 同步糖化發(fā)酵 |
| 1.4.3.3 統(tǒng)合生物工藝 |
| 1.4.3.4 不等溫半同步糖化發(fā)酵 |
| 1.5 木質纖維素預處理衍生物對酶的影響 |
| 1.5.1 木質纖維素的預處理 |
| 1.5.2 木質纖維素預處理主要衍生物 |
| 1.5.2.1 有機酸 |
| 1.5.2.2 木質素衍生物 |
| 1.5.2.3 呋喃衍生物 |
| 1.5.3 木質纖維素預處理衍生物對酶的影響 |
| 1.6 木質纖維素酶的分子改造 |
| 1.6.1 BGL活性的定向進化 |
| 1.6.2 BGL溫度的定向進化 |
| 1.6.3 高通量篩選方法 |
| 1.7 本研究立題依據(jù)及研究內容 |
| 第2章 木質纖維素酶的固態(tài)共發(fā)酵優(yōu)化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 實驗材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 藥品 |
| 2.2.3 試劑 |
| 2.2.4 培養(yǎng)基的配制 |
| 2.2.5 主要儀器 |
| 2.3 實驗方法 |
| 2.3.1 葡萄糖標準曲線的制作 |
| 2.3.2 木質纖維素酶活的測定 |
| 2.3.3 對硝基苯酚標準曲線的制作 |
| 2.3.4 纖維素外切酶活和BGL酶活的測定 |
| 2.3.5 木糖標準曲線的制作 |
| 2.3.6 木聚糖酶活的測定 |
| 2.3.7 蛋白質標準曲線的制作 |
| 2.3.8 蛋白質濃度的測定 |
| 2.3.9 接種延滯時間的優(yōu)化 |
| 2.3.10 單因素優(yōu)化 |
| 2.3.10.1 碳源優(yōu)化 |
| 2.3.10.2 氮源優(yōu)化 |
| 2.3.11 響應曲面設計 |
| 2.3.11.1 Plackett-Burman設計 |
| 2.3.11.2 Central Composite設計 |
| 2.4 結果與討論 |
| 2.4.1 標準曲線的確定 |
| 2.4.1.1 葡萄糖標準曲線 |
| 2.4.1.2 對硝基苯酚標準曲線 |
| 2.4.1.3 木糖標準曲線 |
| 2.4.1.4 蛋白質標準曲線 |
| 2.4.2 木質纖維素水解酶產量的比較 |
| 2.4.3 Co-48單因素優(yōu)化結果 |
| 2.4.3.1 最優(yōu)碳源 |
| 2.4.3.2 最優(yōu)氮源 |
| 2.4.4 Co-48響應曲面優(yōu)化結果 |
| 2.4.4.1 響應曲面因子的確定 |
| 2.4.4.2 最優(yōu)回歸方程 |
| 2.4.4.3 二次多項式模型的方差分析 |
| 2.4.4.4 RSM可視化圖形分析 |
| 2.5 本章小結 |
| 第3章 二代生物乙醇生產 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 培養(yǎng)基 |
| 3.2.3 主要試劑 |
| 3.2.4 主要儀器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 乙醇含量標準曲線的制作 |
| 3.3.2 乙醇濃度的測定 |
| 3.3.3 總糖標準曲線的制作 |
| 3.3.4 總糖濃度的測定 |
| 3.3.5 葡萄糖濃度的測定 |
| 3.3.6 麩皮和稻草中成分含量的測定 |
| 3.3.7 稻草的預處理 |
| 3.3.8 不等溫半同步糖化發(fā)酵模式 |
| 3.3.8.1 釀酒酵母種齡優(yōu)化 |
| 3.3.8.2 糖化及其時間的優(yōu)化 |
| 3.3.8.3 發(fā)酵溫度優(yōu)化 |
| 3.3.8.4 二代生物乙醇生產 |
| 3.3.9 水解效率和乙醇產率計算公式 |
| 3.4 結果與討論 |
| 3.4.1 乙醇標準曲線 |
| 3.4.2 總糖標準曲線 |
| 3.4.3 最適接種種齡 |
| 3.4.4 最適發(fā)酵溫度 |
| 3.4.5 最適糖化時間 |
| 3.4.6 二代生物乙醇產量 |
| 3.5 本章小結 |
| 第4章 木質纖維素預處理衍生物對β-葡萄糖苷酶的影響 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 實驗材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 藥品 |
| 4.2.3 試劑 |
| 4.2.4 培養(yǎng)基 |
| 4.2.5 主要儀器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 引物設計 |
| 4.3.2 瓊脂糖凝膠電泳 |
| 4.3.3 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit膠回收 |
| 4.3.4 大腸桿菌TOP10感受態(tài)的制備 |
| 4.3.5 大腸桿菌TOP10的轉化 |
| 4.3.6 質粒提取方法 |
| 4.3.7 畢赤酵母GS115感受態(tài)的制備 |
| 4.3.8 電轉杯的滅菌 |
| 4.3.9 畢赤酵母GS115的電轉化 |
| 4.3.10 真菌總DNA的提取方法 |
| 4.3.11 表達載體的構建 |
| 4.3.12 Po16BGL的異源表達 |
| 4.3.12.1 Po16BGL基因的獲取 |
| 4.3.12.2 Po16BGL與載體連接 |
| 4.3.12.3 陽性克隆子的驗證 |
| 4.3.12.4 畢赤酵母GS115基因工程菌的驗證 |
| 4.3.12.5 Po16BGL的表達 |
| 4.3.13 SDS-PAGE電泳分析 |
| 4.3.14 菌種保藏 |
| 4.3.15 Po16BGL酶學性質的表征 |
| 4.3.15.1 最適pH的測定 |
| 4.3.15.2 最適溫度的測定 |
| 4.3.16 Po16BGL酶促反應動力學的測定 |
| 4.3.16.1 殘余酶活的測定 |
| 4.3.16.2 抑制劑條件下反應速率的測定 |
| 4.3.16.3 動力學常數(shù)計算 |
| 4.4 結果與討論 |
| 4.4.1 Po16BGL序列分析及酶學性質的研究結果 |
| 4.4.1.1 Po16BGL序列和結構分析 |
| 4.4.1.2 Po16BGL的分子量 |
| 4.4.1.3 Po16BGL的最適溫度和最適pH |
| 4.4.2 抑制劑對Po16BGL的影響 |
| 4.4.2.1 有機酸對Po16BGL的抑制 |
| 4.4.2.2 有機酸鈉鹽、無機鹽對Po16BGL的抑制 |
| 4.4.2.3 乙醇對Po16BGL的抑制 |
| 4.4.2.4 酚類化合物、呋喃衍生物對Po16BGL活性的影響 |
| 4.4.3 Po16BGL酶促反應抑制動力學的研究結果 |
| 4.4.3.1 有機酸抑制的酶促反應動力學 |
| 4.4.3.2 有機酸鈉抑制的酶促反應動力學 |
| 4.4.3.3 乙醇抑制的酶促反應動力學 |
| 4.4.3.4 無機鹽抑制的酶促反應動力學 |
| 4.4.3.5 抑制劑的抑制強度 |
| 4.5 本章小結 |
| 第5章 β-葡萄糖苷酶最適溫度的定向進化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 實驗材料 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 藥品 |
| 5.2.3 試劑 |
| 5.2.4 培養(yǎng)基 |
| 5.2.5 主要儀器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 引物設計 |
| 5.3.2 瓊脂糖凝膠電泳 |
| 5.3.3 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit膠回收 |
| 5.3.4 大腸桿菌TOP10感受態(tài)的制備 |
| 5.3.5 大腸桿菌TOP10的轉化 |
| 5.3.6 質粒提取方法 |
| 5.3.7 畢赤酵母GS115感受態(tài)的制備 |
| 5.3.8 電轉杯的滅菌 |
| 5.3.9 表達載體的構建 |
| 5.3.10 畢赤酵母GS115的電轉化 |
| 5.3.11 Po16BGL最適溫度的定向進化 |
| 5.3.11.1 Po16BGL DNA突變與合成 |
| 5.3.11.2 突變DNA與pGAPZαA連接 |
| 5.3.11.3 陽性克隆子的驗證 |
| 5.3.12 高通量篩選 |
| 5.3.13 菌種保藏 |
| 5.3.14 SDS-PAGE電泳分析 |
| 5.3.15 突變酶酶學表征研究 |
| 5.3.15.1 最適pH的測定 |
| 5.3.15.2 最適溫度的測定 |
| 5.4 結果與討論 |
| 5.4.1 Po16BGL定向進化研究結果 |
| 5.4.1.1 易錯PCR的DNA電泳 |
| 5.4.1.2 陽性克隆子的電泳檢測 |
| 5.4.1.3 電轉前的線性化電泳檢測 |
| 5.4.1.4 高通量篩選后的PCR驗證 |
| 5.4.1.5 突變酶SDS-PAGE電泳 |
| 5.4.2 突變酶酶學性質表征 |
| 5.4.2.1 突變酶活性和比活 |
| 5.4.2.2 最適溫度和最適pH |
| 5.4.3 突變酶分子動力學參數(shù) |
| 5.5 本章小結 |
| 第6章 結論與展望 |
| 參考文獻 |
| 附錄 |
| 致謝 |
| 在讀期間公開發(fā)表論文(著)及科研情況 |
（4）一種耐高溫β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中高效表達及其耐高溫機理分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表(Abbreviations) |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 項目背景 |
| 1.2 國內外研究、應用進展 |
| 1.2.1 β-甘露聚糖酶的國內外研究、應用進展 |
| 1.2.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)的研究、應用進展 |
| 1.3 存在的問題 |
| 1.4 立題目的、意義及主要研究內容 |
| 1.4.1 立題目的、意義 |
| 1.4.2 主要研究內容 |
| 第二章 耐高溫 β-甘露聚糖酶天然生產菌種的分離、篩選及鑒定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 實驗試劑和儀器 |
| 2.2.2 培養(yǎng)基組成 |
| 2.2.3 菌體富集培養(yǎng)及篩選 |
| 2.2.4 菌株鑒定 |
| 2.2.5 菌株在不同溫度、pH條件下的生長測試 |
| 2.2.6 菌株搖瓶發(fā)酵 |
| 2.2.7 BS-Man的部分酶學性質檢測 |
| 2.2.8 β-甘露聚糖酶酶活檢測 |
| 2.3 結果與討論 |
| 2.3.1 產 β-甘露聚糖酶的菌株篩選 |
| 2.3.2 菌種鑒定 |
| 2.3.3 TBS2的生長性能 |
| 2.3.4 菌株搖瓶發(fā)酵及酶液純化 |
| 2.3.5 BS-Man的部分酶學性質 |
| 2.4 本章小結 |
| 第三章 耐高溫β-甘露聚糖酶重組畢赤酵母工程菌的構建、表達及其酶學性質研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 載體和菌株 |
| 3.2.2 主要工具酶和試劑 |
| 3.2.3 主要儀器設備 |
| 3.2.4 培養(yǎng)基和主要試劑配制 |
| 3.2.5 TBS2基因組DNA提取及克隆 |
| 3.2.6 序列分析及重組表達載體構建 |
| 3.2.7 重組畢赤酵母工程菌構建、篩選 |
| 3.2.8 高密度液體發(fā)酵 |
| 3.2.9 重組耐高溫β-甘露聚糖酶的分離、純化 |
| 3.2.10 酶學性質檢測 |
| 3.2.11 檢測方法 |
| 3.3 結果與討論 |
| 3.3.1 TBS2基因組提取及克隆 |
| 3.3.2 基因序列分析及重組表達載體構建 |
| 3.3.3 重組畢赤酵母工程菌的構建及篩選 |
| 3.3.4 高密度液體發(fā)酵 |
| 3.3.5 ReTMan26蛋白純化 |
| 3.3.6 ReTMan26酶學性質 |
| 3.4 本章小結 |
| 第四章 Re TMan26的耐高溫機理分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.2.1 表達載體與菌株 |
| 4.2.2 主要工具酶和試劑、培養(yǎng)基配制 |
| 4.2.3 主要儀器 |
| 4.2.4 ReTMan26蛋白質三維結構建模及分析 |
| 4.2.5 ReTMan26脫N-糖基化及純化 |
| 4.2.6 ReTMan26中二硫鍵定點突變、菌體構建、發(fā)酵培養(yǎng)及酶蛋白純化 |
| 4.2.7 穩(wěn)定性對比實驗 |
| 4.2.8 酶動力學常數(shù)檢測 |
| 4.2.9 酶活檢測方法 |
| 4.3 結果與討論 |
| 4.3.1 ReTMan26蛋白質結構分析 |
| 4.3.2 ReTMan26脫N-糖基化處理及純化 |
| 4.3.3 二硫鍵定點突變、菌體構建、發(fā)酵培養(yǎng)及酶蛋白純化 |
| 4.3.4 穩(wěn)定性對比 |
| 4.3.5 酶動力學常數(shù) |
| 4.4 本章小結 |
| 第五章 ReTMan26基因優(yōu)化、改造及其在畢赤酵母中的高效表達 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料與方法 |
| 5.2.1 載體和菌株 |
| 5.2.2 主要工具酶和試劑 |
| 5.2.3 主要儀器 |
| 5.2.4 培養(yǎng)基和主要試劑配制 |
| 5.2.5 基因優(yōu)化、Kozak序列改造及重組質粒構建 |
| 5.2.6 重組畢赤酵母工程菌的構建、篩選 |
| 5.2.7 基因拷貝數(shù)及m RNA豐度檢測 |
| 5.2.8 高密度液體發(fā)酵 |
| 5.2.9 檢測方法 |
| 5.3 結果與討論 |
| 5.3.1 密碼子優(yōu)化、Kozak序列改造及重組表達質粒構建 |
| 5.3.2 轉化及陽性重組子篩選 |
| 5.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)及菌株篩選 |
| 5.3.4 基因拷貝數(shù)及m RNA豐度 |
| 5.3.5 高密度液體發(fā)酵 |
| 5.4 本章小結 |
| 第六章 粗甘油用于ReTMan26發(fā)酵生產的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料與方法 |
| 6.2.1 生產菌株、培養(yǎng)基及試劑 |
| 6.2.2 主要儀器設備 |
| 6.2.3 不控制pH的搖瓶培養(yǎng) |
| 6.2.4 控制pH的5L罐分批發(fā)酵培養(yǎng) |
| 6.2.5 粗甘油中雜質對畢赤酵母菌體生長及ReTMan26生產的影響 |
| 6.2.6 分批高密度液體發(fā)酵 |
| 6.2.7 檢測方法 |
| 6.2.8 粗甘油成分檢測 |
| 6.3 結果與討論 |
| 6.3.1 所用粗甘油性質 |
| 6.3.2 不控制pH的搖瓶培養(yǎng) |
| 6.3.3 控制pH的5L罐分批發(fā)酵培養(yǎng) |
| 6.3.4 粗甘油中各雜質對畢赤酵母菌體生長及ReTMan26生產的影響 |
| 6.3.5 分批高密度液體發(fā)酵 |
| 6.4 本章小結 |
| 主要結論與展望 |
| 1 主要結論 |
| 2 展望 |
| 論文主要創(chuàng)新點 |
| 致謝 |
| 參考文獻 |
| 附錄1 作者在攻讀博士學位期間發(fā)表的論文 |
（5）產氣腸桿菌B19 β-甘露聚糖酶基因的克隆表達及酶學性質研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 甘露聚糖 |
| 1.2 β-甘露聚糖酶介紹 |
| 1.2.1 β-甘露聚糖酶的定義 |
| 1.2.2 β-甘露聚糖酶的催化機制 |
| 1.2.3 β-甘露聚糖酶的來源及性質 |
| 1.3 β-甘露聚糖酶的分子生物學研究進展 |
| 1.3.1 β-甘露聚糖酶基因的克隆 |
| 1.3.2 β-甘露聚糖酶其序列分析 |
| 1.3.3 β-甘露聚糖酶的表達 |
| 1.4 β-甘露聚糖酶的應用 |
| 1.4.1 β-甘露聚糖酶在飼料工業(yè)中的應用 |
| 1.4.2 β-甘露聚糖酶在食品工業(yè)中的應用 |
| 1.4.3 β-甘露聚糖酶在造紙工業(yè)中的應用 |
| 1.4.4 β-甘露聚糖酶在石油開采中的應用 |
| 1.4.5 β-甘露聚糖酶在洗滌劑中的應用 |
| 1.4.6 β-甘露聚糖酶在紡織工業(yè)中的應用 |
| 1.4.7 β-甘露聚糖酶在煙草業(yè)中的應用 |
| 1.4.8 β-甘露聚糖酶作為工具酶的應用 |
| 1.4.9 β-甘露聚糖酶的其它應用 |
| 1.5 本課題研究內容與目的意義 |
| 1.5.1 研究內容 |
| 1.5.2 目的意義 |
| 第二章 β-甘露聚糖酶基因的克隆和異源表達 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株與質粒 |
| 2.2.2 主要化學試劑 |
| 2.2.3 培養(yǎng)基和試劑的配置 |
| 2.2.4 主要儀器 |
| 2.2.5 所用引物及序列 |
| 2.3 實驗方法 |
| 2.3.1 菌株活化 |
| 2.3.2 B19基因組的提取 |
| 2.3.3 克隆載體PMD19-T-ManE的構建 |
| 2.3.4 重組質粒pET28a(+)-ManE的構建 |
| 2.3.5 β-甘露聚糖酶基因序列的生物信息學分析 |
| 2.3.6 重組蛋白的異源表達 |
| 2.3.7 表達蛋白的SDS-PAGE電泳 |
| 2.4 結果與討論 |
| 2.4.1 產氣腸桿菌B19基因組DNA的提取 |
| 2.4.2 β-甘露聚糖酶基因的擴增 |
| 2.4.3 克隆載體pMD19-T-ManE的驗證 |
| 2.4.4 表達載體pET28a(+)-ManE的驗證 |
| 2.4.5 β-甘露聚糖酶基因序列分析 |
| 2.4.6 生物信息學分析 |
| 2.4.7 蛋白酶異源表達的SDS-PAGE檢測 |
| 2.5 本章小結 |
| 第三章 重組酶異源表達條件優(yōu)化及酶學性質研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 實驗材料 |
| 3.2.1 菌種 |
| 3.2.2 主要化學試劑 |
| 3.2.3 試劑配制 |
| 3.2.4 主要儀器 |
| 3.3 實驗方法 |
| 3.3.1 不同溫度對重組酶表達量的影響 |
| 3.3.2 不同IPTG誘導濃度對重組酶表達量的影響 |
| 3.3.3 不同培養(yǎng)時間對重組酶表達量的影響 |
| 3.3.4 重組酶的分離純化 |
| 3.3.5 蛋白質溶液濃度測定 |
| 3.3.6 β-甘露聚糖酶酶活力的測定 |
| 3.3.7 酶學性質研究 |
| 3.4 結果與討論 |
| 3.4.1 溫度對重組酶異源表達量的影響 |
| 3.4.2 IPTG濃度對重組酶異源表達量的影響 |
| 3.4.3 誘導時間對重組酶異源表達量的影響 |
| 3.4.4 標準曲線的繪制 |
| 3.4.5 重組酶的純化 |
| 3.4.6 酶學性質 |
| 3.5 本章小結 |
| 第四章 解淀粉芽孢桿菌DC12轉化的探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株與質粒 |
| 4.2.2 主要化學試劑 |
| 4.2.3 培養(yǎng)基與緩沖液的配制 |
| 4.2.4 主要儀器 |
| 4.3 試驗方法 |
| 4.3.1 克隆載體pMD18-T-tyb的構建 |
| 4.3.2 重組質粒pKSV7-tyb的構建 |
| 4.3.3 解淀粉芽孢桿菌FZB42感受態(tài)細胞制備及轉化 |
| 4.3.4 解淀粉芽孢桿菌DC12感受態(tài)細胞制備及轉化 |
| 4.4 結果與討論 |
| 4.4.1 基因組DNA的提取 |
| 4.4.2 上下游同源臂的擴增 |
| 4.4.3 擴增同源臂tyb |
| 4.4.4 克隆載體pMD18-T-tyb的驗證 |
| 4.4.5 重組質粒pKSV7-tyb的驗證 |
| 4.4.6 重組質粒pKSV7-tyb轉化解淀粉芽孢桿菌FZB |
| 4.4.7 重組質粒pKSV7-tyb轉化解淀粉芽孢桿菌DC |
| 4.5 本章小結 |
| 結論與展望 |
| 本文主要結論 |
| 展望 |
| 參考文獻 |
| 附錄 |
| 攻讀碩士學位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
| 附表 |
（6）里氏木霉高產纖維素酶的機理研究和應用（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 選題背景 |
| 1.2 里氏木霉簡介 |
| 1.3 里氏木霉纖維素酶的研究進展 |
| 1.3.1 發(fā)酵條件影響里氏木霉纖維素酶的產生 |
| 1.3.2 里氏木霉纖維素酶的分泌 |
| 1.3.3 里氏木霉纖維素酶產生的調控機制 |
| 1.3.4 提高纖維素酶產量的有效途徑 |
| 1.4 里氏木霉次級代謝產物黃色色素的研究進展 |
| 1.4.1 里氏木霉黃色色素的作用 |
| 1.4.2 里氏木霉色素產生的調控 |
| 1.5 論文的研究目的和內容 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 本論文選題思路及主要研究內容 |
| 1.5.3 本論文創(chuàng)新點 |
| 參考文獻 |
| 第二章 高產β-葡萄糖苷酶基因工程菌的應用及cel3d在高產纖維素酶中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 實驗部分 |
| 2.2.1 菌株、質粒 |
| 2.2.2 試劑、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 |
| 2.2.3 里氏木霉RUT-C30 DNA的提取 |
| 2.2.4 里氏木霉RUT-C30 RNA的提取 |
| 2.2.5 BGL1表達載體的構建 |
| 2.2.6 菌株遺傳轉化 |
| 2.2.7 纖維素酶活的測定 |
| 2.2.8 TRB1碳源特異性評價 |
| 2.2.9 TRB1的葡萄糖耐受性評價 |
| 2.2.10 DA預處理的玉米秸稈(EDA-PCS)的糖化分析 |
| 2.2.11 發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳和MUG (4-甲基傘形基-β -D-吡喃葡糖苷)酶譜分析 |
| 2.2.12 熒光定量PCR |
| 2.3 結果與討論 |
| 2.3.1 里氏木霉過表達bgl1基因表達載體的構建及瓊脂糖凝膠電泳驗證 |
| 2.3.2 里氏木霉轉化子的篩選及驗證 |
| 2.3.3 過表達bgl1基因對里氏木霉纖維素酶活的影響 |
| 2.3.4 里氏木霉TRB1纖維素酶的高產特性不具有碳源依賴性 |
| 2.3.5 相比于里氏木霉RUT-C30,TRB1表現(xiàn)出了較好的或持平的碳代謝阻遏抑制作用 |
| 2.3.6 EDA-PCS的水解 |
| 2.3.7 SDS-PAGE與MUG分析蛋白分泌特性 |
| 2.3.8 TRB1中cel3d基因表達被破壞 |
| 2.4 本章小結 |
| 參考文獻 |
| 第三章 乳糖誘導下高產纖維素酶的里氏木霉工程菌SEU-7及其高產機制和應用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 實驗部分 |
| 3.2.1 菌株、質粒以及培養(yǎng)條件 |
| 3.2.2 實驗材料與試劑 |
| 3.2.3 菌株的培養(yǎng) |
| 3.2.4 培養(yǎng)基以及所用試劑配方 |
| 3.2.5 里氏木霉基因工程菌的構建 |
| 3.2.6 菌株遺傳轉化 |
| 3.2.7 纖維素酶活的測定 |
| 3.2.8 發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析 |
| 3.2.9 EDA預處理玉米秸稈的糖化能力分析 |
| 3.2.10 基因拷貝數(shù)的檢測 |
| 3.2.11 基因組重測序 |
| 3.2.12 熒光定量PCR |
| 3.3 結果與討論 |
| 3.3.1 高產纖維素酶基因工程菌的構建 |
| 3.3.2 里氏木霉基因工程菌SEU-7無論在纖維素還是乳糖誘導下相比于RUT-C30表現(xiàn)出了極強的產酶能力 |
| 3.3.3 乳糖濃度優(yōu)化以及補料進一步提高了基因工程菌SEU-7的產酶能力 |
| 3.3.4 添加低濃度葡萄糖促進纖維素酶產生 |
| 3.3.5 高濃度葡萄糖仍可促進SEU-7纖維素酶的產生 |
| 3.3.6 里氏木霉SEU-7的生物學特性研究 |
| 3.3.7 里氏木霉SEU-7產生的纖維素酶的水解纖維素能力顯著增加 |
| 3.3.8 并行突變的確定 |
| 3.3.9 過表達bgl1在里氏木霉SEU-7高產纖維素酶中起著重要作用 |
| 3.3.10 里氏木霉SEU-7纖維素酶、半纖維素酶基因以及調節(jié)因子的轉錄水平分析 |
| 3.4 本章小結 |
| 參考文獻 |
| 第四章 敲除基因121121過程中帶來的并行突變在里氏木霉纖維素酶和黃色色素產生中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 實驗部分 |
| 4.2.1 菌株和試劑 |
| 4.2.2 ZC121121的構建及其在纖維素誘導下的產酶情況 |
| 4.2.3 里氏木霉RUT-C30和ZC121121的生長、顯微鏡觀察以及孢子萌發(fā) |
| 4.2.4 酶活以及生物質的檢測 |
| 4.2.5 ZC121121、OE121121和RUT-C30在不同碳源條件下黃色色素的產生 |
| 4.2.6 RNA提取以及熒光定量PCR |
| 4.2.7 RNA-seq分析 |
| 4.3 結果與討論 |
| 4.3.1 里氏木霉ZC121121菌株的構建及纖維素酶的產生 |
| 4.3.2 121121基因干擾帶來的并行突變導致了黃色色素分泌增加 |
| 4.3.3 敲除121121基因過程帶來的并行突變抑制了不同碳源誘導條件下纖維素酶和半纖維素酶的產生 |
| 4.3.4 里氏木霉121121轉化子ZC121121的特性 |
| 4.3.5 敲除121121基因過程帶來的并行突變導致了纖維素條件和葡萄糖條件下纖維素酶調節(jié)因子表達量的變化 |
| 4.3.6 1212121調節(jié)pks相關基因及ypr1、ypr2和xpp1的表達 |
| 4.3.7 ZC121121中sorbicillin的生物合成 |
| 4.3.8 121121基因編碼的蛋白具有廣譜性 |
| 4.4 本章小結 |
| 參考文獻 |
| 第五章 里氏木霉纖維素酶產生、分布及分泌機理研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 實驗部分 |
| 5.2.1 菌株、質粒和培養(yǎng)條件 |
| 5.2.2 重組里氏木霉菌株的構建 |
| 5.2.3 菌株的生長 |
| 5.2.4 利用紅色熒光蛋白跟蹤纖維素酶的分布 |
| 5.2.5 原生質體的制備 |
| 5.2.6 BFA對里氏木霉纖維素酶合成的影響 |
| 5.3 結果與討論 |
| 5.3.1 轉化子的構建 |
| 5.3.2 在所有檢測的纖維素酶當中BGL出現(xiàn)的最早 |
| 5.3.3 BGL的分泌比CMC和CBH都慢 |
| 5.3.4 STED觀察到BGL定位到細胞膜上 |
| 5.3.5 用FITC對β-葡萄糖苷酶和細胞膜進行共定位 |
| 5.3.6 采用原生質體制備的方法證明了BGL確實定位到了細胞膜上 |
| 5.3.7 RBGL、RCMC和RCBH與內質網染料的共染 |
| 5.3.8 BFA對里氏木霉中總蛋白合成的影響 |
| 5.3.9 CBH的分泌不經過或少量經過高爾基體 |
| 5.4 本章小結 |
| 參考文獻 |
| 第六章 總結與展望 |
| 6.1 本論文工作總結 |
| 6.2 后續(xù)工作的展望 |
| 博士期間研究成果 |
| 致謝 |
（7）里氏木霉纖維素酶高產菌株遺傳改造及新型糖苷水解酶的挖掘（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 研究背景 |
| 1.1 里氏木霉發(fā)展簡史 |
| 1.2 里氏木霉的誘變及篩選 |
| 1.2.1 Natick實驗室和在日本開發(fā)的突變菌株 |
| 1.2.2 羅格斯大學開發(fā)的突變菌株 |
| 1.3 系統(tǒng)生物學方法理解里氏木霉纖維素酶的生產 |
| 1.3.1 里氏木霉的基因組 |
| 1.3.2 CAZymes編碼基因在里氏木霉基因組中的分布 |
| 1.3.3 基因組重測序鑒定對纖維素酶生產具有潛在影響的基因 |
| 1.3.4 里氏木霉轉錄組分析 |
| 1.4 里氏木霉CAZymes的表達調控 |
| 1.4.1 里氏木霉分泌的CAZymes |
| 1.4.2 碳源影響纖維素酶和半纖維素酶表達 |
| 1.4.3 轉錄因子調控纖維素酶和半纖維素酶基因表達 |
| 1.4.4 轉運蛋白參與纖維素酶和半纖維素酶表達 |
| 1.5 質膜H~+-ATP酶對胞質pH的調節(jié) |
| 1.5.1 Pma的結構、功能及調節(jié) |
| 1.5.2 細胞響應pH壓力 |
| 1.5.3 pH對里氏木霉纖維素酶和半纖維素酶表達的影響 |
| 1.6 纖維素酶和半纖維素酶在工業(yè)上的應用 |
| 1.6.1 纖維素酶及其生產菌株的分離 |
| 1.6.2 纖維素酶的工業(yè)應用 |
| 1.6.3 半纖維素酶及其生產菌株的分離 |
| 1.6.4 半纖維素酶的工業(yè)應用 |
| 1.7 利用宏基因組手段挖掘新型糖苷水解酶基因 |
| 1.7.1 目標基因富集的策略 |
| 1.7.2 利用宏基因組挖掘新酶的策略 |
| 1.8 本文研究內容及意義 |
| 1.8.1 研究內容 |
| 1.8.2 研究意義 |
| 第2章 重測序和轉錄組分析里氏木霉纖維素酶高產菌株 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株與質粒 |
| 2.2.2 引物序列 |
| 2.2.3 主要試劑和耗材 |
| 2.2.4 常用試劑配制 |
| 2.2.5 主要培養(yǎng)基配制 |
| 2.2.6 主要儀器和設備 |
| 2.2.7 實驗所用程序及軟件 |
| 2.3 實驗方法 |
| 2.3.1 PCR |
| 2.3.2 DNA凝膠電泳 |
| 2.3.3 膠回收DNA片段 |
| 2.3.4 DNA片段與載體快速連接 |
| 2.3.5 質粒小量提取 |
| 2.3.6 酶切體系及條件 |
| 2.3.7 載體與DNA片段連接 |
| 2.3.8 質粒轉化 |
| 2.3.9 根瘤農桿菌感受態(tài)細胞的制備 |
| 2.3.10 電轉 |
| 2.3.11 結合轉移 |
| 2.3.12 孢子擴培、收集和保存 |
| 2.3.13 里氏木霉轉化子篩選和鑒定 |
| 2.3 14 基因組提取 |
| 2.3.15 RNA提取 |
| 2.3.16 cDNA合成和qPCR |
| 2.3.17 標準曲線的制作 |
| 2.3.18 纖維素內切酶活力的測定 |
| 2.3.19 濾紙酶活的測定 |
| 2.3.20 纖維素外切酶活力的測定 |
| 2.3.21 蛋白表達及純化 |
| 2.3.22 脫氫酶活性檢測 |
| 2.3.23 里氏木霉菌株生長檢測 |
| 2.3.24 蛋白濃度檢測 |
| 2.3.25 基因組重測序及數(shù)據(jù)處理 |
| 2.3.26 轉錄組測序及數(shù)據(jù)處理 |
| 2.3.27 SNPs和indels位點驗證 |
| 2.3.28 統(tǒng)計學分析 |
| 2.3.29 質粒構建 |
| 2.4 實驗結果與討論 |
| 2.4.1 高產菌株SS-Ⅱ和RUT-C30表型分析 |
| 2.4.2 菌株SS-Ⅱ和RUT-C30在四種碳源下的轉錄組數(shù)據(jù)比較分析 |
| 2.4.3 纖維素降解相關基因在SS-Ⅱ和RUT-C30中差異表達分析 |
| 2.4.4 轉錄調控因子差異表達分析及人工光控轉錄因子的構建 |
| 2.4.5 轉運體在SS-Ⅱ和RUT-C30中差異表達分析 |
| 2.4.6 菌株SS-Ⅱ基因組重測序數(shù)據(jù)分析 |
| 2.4.7 菌株SS-Ⅱ堿基突變模式分析 |
| 2.4.8 受突變影響的基因GO功能分類 |
| 2.4.9 候選基因用于敲除分析 |
| 2.4.10 敲除菌株纖維素酶活性分析 |
| 2.4.11 敲除菌株△56839和△112034纖維素酶編碼基因轉錄水平分析 |
| 2.4.12 基因tre56839和tre112034的功能分析 |
| 2.5 本章小結 |
| 第3章 里氏木霉質膜H~+-ATP酶的鑒定及其敲除對菌株影響的分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株與質粒 |
| 3.2.2 引物序列 |
| 3.2.3 主要試劑和耗材 |
| 3.2.4 常用試劑及培養(yǎng)基的配制 |
| 3.2.5 主要儀器和設備 |
| 3.2.6 所用程序及軟件 |
| 3.3 實驗方法 |
| 3.3.1 敲除菌株的構建 |
| 3.3.2 生物信息分析及系統(tǒng)進化分析 |
| 3.3.3 菌株培養(yǎng)及RNA提取 |
| 3.3.4 cDNA合成及qPCR分析 |
| 3.3.5 酶活性分析 |
| 3.3.6 胞內外pH檢測 |
| 3.3.7 生物質干重和葡萄糖殘量檢測 |
| 3.3.8 細胞核蛋白提取 |
| 3.3.9 改良型Lowry法測量細胞核蛋白濃度 |
| 3.3.10 制備生物素標記的探針 |
| 3.3.11 電泳遷移率檢測(EMSA) |
| 3.3.12 鏈親和素親和層析分離與探針結合的蛋白 |
| 3.3.13 篩選標記的缺失及驗證 |
| 3.4 實驗結果與討論 |
| 3.4.1 基因tre76238和tre78757的鑒定 |
| 3.4.2 基因tre76238的敲除對菌株纖維素酶生產的影響 |
| 3.4.3 敲除菌株Del238表型分析 |
| 3.4.4 敲除基因tre76238影響菌株將質子泵出到胞外 |
| 3.4.5 敲除基因tre78757不影響菌株纖維素酶生產 |
| 3.4.6 敲除基因tre78757不影響菌株將質子泵出到胞外 |
| 3.4.7 基因tre76238和tre78757雙敲除徹底損害菌株生長 |
| 3.4.8 菌株Del238中纖維素酶合成相關的基因的轉錄分析 |
| 3.4.9 EMSA分析cbh1啟動子區(qū)域 |
| 3.4.10 與cbh1啟動子片段結合的蛋白的分離及鑒定 |
| 3.5 本章小結 |
| 第4章 宏基因組分析棉花降解微生物群及挖掘新型糖苷水解酶 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 土壤樣品 |
| 4.2.2 菌株與質粒 |
| 4.2.3 引物序列 |
| 4.2.4 主要試劑和耗材 |
| 4.2.5 常用試劑配制 |
| 4.2.6 主要培養(yǎng)基配制 |
| 4.2.7 主要儀器和設備 |
| 4.2.8 實驗所用軟件及工具 |
| 4.3 實驗方法 |
| 4.3.1 土壤采樣及加工 |
| 4.3.2 樣品微生物富集 |
| 4.3.3 宏基因組DNA抽提 |
| 4.3.4 MiSeq測序和16S數(shù)據(jù)分析 |
| 4.3.5 HiSeq測序及數(shù)據(jù)分析 |
| 4.3.6 候選基因克隆和表達 |
| 4.3.7 標準曲線的繪制 |
| 4.3.8 糖苷水解酶活力的測定 |
| 4.3.9 酶最適反應溫度的測定 |
| 4.4 實驗結果與討論 |
| 4.4.1 棉花生物質降解 |
| 4.4.2 棉花降解過程中酶的組分分析 |
| 4.4.3 土壤微生物群落組成分析 |
| 4.4.4 宏基因組序列分析 |
| 4.4.5 宏基因組序列功能分析 |
| 4.4.6 糖苷水解酶編碼基因的挖掘 |
| 4.4.7 候選糖苷水解酶編碼基因的克隆和表達 |
| 4.4.8 候選糖苷水解酶活性表征 |
| 4.5 本章小結 |
| 第5章 研究總結及展望 |
| 5.1 總結 |
| 5.2 展望 |
| 參考文獻 |
| 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文 |
| 致謝 |
（8）N-糖基化對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達的影響（論文提綱范文）
| 引文格式: |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 菌株與載體 |
| 1.2 試劑與培養(yǎng)基 |
| 1.3 儀器與設備 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 軟件分析β-甘露聚糖酶Man1中易發(fā)生N-糖基化的位點 |
| 1.4.2 突變載體的構建 |
| 1.4.3 畢赤酵母重組菌株的構建與篩選 |
| 1.4.4 甲醇誘導培養(yǎng) |
| 1.4.5 突變體轉錄水平的測定 |
| 1.4.6 突變體酶活力的測定 |
| 1.4.7 突變體和非突變體重組甘露聚糖酶的純化 |
| 1.4.8 突變體熱穩(wěn)定性的測定 |
| 2 結果與分析 |
| 2.1 糖基化位點的預測 |
| 2.2 突變載體的構建與鑒定 |
| 2.2.1 突變載體的構建 |
| 2.2.2 重組質粒的驗證 |
| 2.3.1 轉錄水平的比較 |
| 2.3.2 酶活力水平的比較 |
| 2.3.3 純化后的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.4 熱穩(wěn)定性的比較 |
| 3 結論 |
（9）利用人工鋅指蛋白技術提高里氏木霉Rut-C30纖維素酶產量（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮寫詞 |
| 1 引言 |
| 2 文獻綜述 |
| 2.1 纖維素酶在不同領域中的應用 |
| 2.2 纖維素酶及纖維素酶生產菌 |
| 2.3 絲狀真菌纖維素酶轉錄調控進展 |
| 2.4 里氏木霉蛋白分泌壓力響應進展 |
| 2.5 絲狀真菌轉化方法和基因工程改造進展 |
| 2.6 人工鋅指蛋白轉錄因子研究進展 |
| 2.7 本論文立題依據(jù)及研究意義 |
| 3 人工鋅指蛋白文庫構建和里氏木霉纖維素酶轉化子篩選 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 實驗材料與方法 |
| 3.3 實驗結果與討論 |
| 3.3.1 里氏木霉Rut-C30轉化方法的選擇 |
| 3.3.2 根癌農桿菌轉化方法的優(yōu)化 |
| 3.3.3 人工鋅指蛋白文庫和里氏木霉轉化子獲得 |
| 3.3.4 里氏木霉纖維素酶轉化子的篩選 |
| 3.4 小結 |
| 4 里氏木霉U3纖維素酶高產分析及生物質酶解特性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 實驗材料與方法 |
| 4.3 實驗結果與討論 |
| 4.3.1 里氏木霉Rut-C30與U3表型差異分析 |
| 4.3.2 里氏木霉U3蛋白分泌和酶活變化 |
| 4.3.3 里氏木霉U3主要纖維素酶和轉錄因子轉錄變化 |
| 4.3.4 里氏木霉U3纖維素酶降解預處理生物質 |
| 4.3.5 人工轉錄因子AZFP-U3功能分析 |
| 4.3.6 人工轉錄因子AZFP-U3靶基因預測和功能驗證 |
| 4.4 小結 |
| 5 里氏木霉U5纖維素酶性質與轉錄組分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 實驗材料與方法 |
| 5.3 實驗結果與討論 |
| 5.3.1 里氏木霉Rut-C30與U5表型分析 |
| 5.3.2 里氏木霉U5蛋白分泌和酶活變化 |
| 5.3.3 里氏木霉U5纖維素酶降解預處理生物質 |
| 5.3.4 里氏木霉U5主要纖維素酶和轉錄因子轉錄變化 |
| 5.3.5 人工轉錄因子AZFP-U5功能分析 |
| 5.3.6 里氏木霉U5轉錄組學分析 |
| 5.3.7 關鍵代謝通路和基因分析 |
| 5.4 小結 |
| 6 結論與展望 |
| 6.1 主要結論 |
| 6.2 創(chuàng)新點 |
| 6.3 展望 |
| 參考文獻 |
| 附錄A 人工鋅指轉錄因子蛋白序列 |
| 附錄B 比較轉錄組中ERAD和UPR相關基因轉錄變化 |
| 附錄C 比較轉錄組中AZFP-U5潛在靶基因轉錄比較 |
| 作者簡介 |
| 攻讀博士學位期間科研項目及科研成果 |
| 致謝 |
（10）里氏木霉β-甘露聚糖酶的克隆表達及結構域的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 木質纖維素 |
| 1.2 木質纖維素降解酶類 |
| 1.3 β-甘露聚糖酶 |
| 1.3.1 β-甘露聚糖酶的來源及性質 |
| 1.3.2 β-甘露聚糖酶的作用機制 |
| 1.3.3 β-甘露聚糖酶的國內外研究進展 |
| 1.3.4 β-甘露聚糖酶的應用 |
| 1.4 里氏木霉 |
| 1.5 畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介 |
| 1.5.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點 |
| 1.5.2 畢赤酵母表達宿主 |
| 1.5.3 畢赤酵母表達載體 |
| 1.5.4 外源基因的整合與轉化 |
| 1.5.5 影響畢赤酵母中外源蛋白表達的因素 |
| 1.6 蛋白質糖基化的研究進展 |
| 1.7 課題的立題背景及研究內容 |
| 1.7.1 立題背景 |
| 1.7.2 研究內容 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實驗材料 |
| 2.1.1 菌株和質粒 |
| 2.1.2 主要儀器 |
| 2.1.3 主要試劑 |
| 2.1.4 常用培養(yǎng)基和主要溶液 |
| 2.2 實驗方法 |
| 2.2.1 β-甘露聚糖酶基因克隆 |
| 2.2.2 畢赤酵母重組表達載體的構建與驗證 |
| 2.2.3 轉化和篩選畢赤酵母重組子 |
| 2.2.4 重組畢赤酵母的誘導表達 |
| 2.2.5 重組甘露聚糖酶的純化和去糖基化分析 |
| 2.2.6 重組甘露聚糖酶的結構分析 |
| 2.2.7 重組甘露聚糖酶的酶學性質分析 |
| 2.2.8 吸附實驗 |
| 2.2.9 協(xié)同纖維素酶水解實驗 |
| 2.2.10 N-糖基化對重組甘露聚糖酶的影響 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 酶活測定 |
| 2.3.2 蛋白分析 |
| 2.3.3 木質纖維素含量的測定 |
| 2.3.4 總還原糖含量的測定 |
| 2.3.5 單糖含量的測定 |
| 3 結果與討論 |
| 3.1 β-甘露聚糖酶基因重組畢赤酵母的構建與表達 |
| 3.1.1 總RNA的提取 |
| 3.1.2 甘露聚糖酶基因成熟肽編碼序列的克隆 |
| 3.1.3 重組表達載體的構建與驗證 |
| 3.1.4 重組畢赤酵母的篩選和誘導表達 |
| 3.1.5 重組甘露聚糖酶的純化與蛋白分析 |
| 3.1.6 圓二色譜與三維結構 |
| 3.1.7 小結 |
| 3.2 重組Man1和Man1△CBM的酶學性質 |
| 3.2.1 最適pH值及pH值穩(wěn)定性 |
| 3.2.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性 |
| 3.2.3 EDTA及金屬離子的影響 |
| 3.2.4 比活力和動力學常數(shù) |
| 3.2.5 小結 |
| 3.3 重組酶協(xié)同纖維素酶水解反應的研究 |
| 3.3.1 重組酶的吸附性能研究 |
| 3.3.2 重組酶協(xié)同纖維素酶水解木質纖維素材料的影響 |
| 3.3.3 小結 |
| 3.4 去N-糖基化位點對重組Man1的影響 |
| 3.4.1 突變體的構建 |
| 3.4.2 三種突變體與重組Man1的比較 |
| 3.4.3 小結 |
| 4 結論 |
| 5 展望 |
| 6 參考文獻 |
| 7 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況 |
| 8 致謝 |
四、里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表達載體的構建（論文參考文獻）
- [1]β-甘露聚糖酶在里氏木霉中的高效表達[D]. 劉琴. 山東大學, 2021(09)
- [2]低纖維素酶背景里氏木霉表達宿主菌的構建[D]. 劉杜娟. 中國農業(yè)科學院, 2020(01)
- [3]木質纖維素酶的生產優(yōu)化、定向進化和生物乙醇應用研究[D]. 易拾. 江西師范大學, 2019(03)
- [4]一種耐高溫β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中高效表達及其耐高溫機理分析[D]. 羅長財. 江南大學, 2018(12)
- [5]產氣腸桿菌B19 β-甘露聚糖酶基因的克隆表達及酶學性質研究[D]. 宋妍. 華南理工大學, 2018(01)
- [6]里氏木霉高產纖維素酶的機理研究和應用[D]. 李程程. 東南大學, 2018(12)
- [7]里氏木霉纖維素酶高產菌株遺傳改造及新型糖苷水解酶的挖掘[D]. 張國秀. 華東理工大學, 2017(07)
- [8]N-糖基化對β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中異源表達的影響[J]. 馬清,蔡瑞,姜風超,馬立娟,杜麗平,肖冬光. 食品科學, 2017(16)
- [9]利用人工鋅指蛋白技術提高里氏木霉Rut-C30纖維素酶產量[D]. 張飛. 大連理工大學, 2017(01)
- [10]里氏木霉β-甘露聚糖酶的克隆表達及結構域的研究[D]. 蔡瑞. 天津科技大學, 2016(07)