一、對禽逆轉(zhuǎn)錄病毒特別是J亞群白血病病毒感染的回顧（論文文獻(xiàn)綜述）
王呈呈[1]（2021）在《K亞群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特異基因表達(dá)及應(yīng)用》文中研究說明K亞群禽白血病病毒（ALV-K）是近些年新發(fā)現(xiàn)的一種外源性禽白血病病毒亞群,該亞群主要存在于中國地方雞群,病毒增殖慢,感染范圍廣,是我國地方雞群主要防控對象之一。相對其它亞群禽白血病病毒,該亞群病毒研究起步晚、感染特性和致病機(jī)制所知少、缺乏特異性診斷試劑和方法,極大限制了對該病毒深入研究和臨床防控檢測。本研究旨在根據(jù)ALV-K毒株的囊膜表面蛋白基因特性,利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和獸醫(yī)免疫學(xué)等技術(shù)方法獲得針對該病毒亞群的特異性蛋白抗原和抗體,并建立基于這些抗原抗體介導(dǎo)的特異性檢測方法,為該亞群病毒深入研究和臨床防控檢測提供物質(zhì)基礎(chǔ)和方法依據(jù)。本研究首先根據(jù)Gen Bank上發(fā)表的ALV-K囊膜表面蛋白gp85基因序列,利用生物信息軟件篩選出與其他亞群同源性較低的特異性抗原基因片段,設(shè)計(jì)引物,以ALV-K-JS11C1毒株的基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增該基因片段,利用原核表達(dá)技術(shù),獲得特異性蛋白抗原;其次,對該蛋白抗原進(jìn)行純化、鑒定、包被,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立檢測該亞群病毒抗體的ELISA方法,對該方法的特異性、靈敏度、重復(fù)性、符合率、保存期等進(jìn)行評價;第三,利用該蛋白抗原免疫接種兔,制備多克隆抗體,檢測其抗體效價和對病毒或抗原的識別特性;第四,利用該蛋白抗原免疫接種Bal b/c小鼠,制備分泌抗體的脾細(xì)胞,與SP2/0細(xì)胞雜交融合,獲得分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞,對雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目、分泌抗體類型和識別特性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,獲得特異性的抗原基因片段大小為310bp,與目前發(fā)表的ALV-K亞群同源性為92.9%～100%,而與其他亞群同源性為37%～79.7%;系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示該基因片段與ALV-K亞群毒株基因親緣關(guān)系很近,與其他亞群較遠(yuǎn);蛋白結(jié)構(gòu)抗原性較高。經(jīng)基因克隆、誘導(dǎo)表達(dá),獲得大小為30k Da的目的蛋白條帶。對該蛋白進(jìn)行純化和包被建立ELISA,并對抗原包被濃度、抗體稀釋度、反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化,確定抗原包被濃度為0.75μg/m L、血清抗體稀釋度為1:800、二抗稀釋濃度為1:5000、一抗孵育時間為45min、二抗孵育時間為60min、顯色時間10min為最佳條件;ELISA檢測陰性血清臨界值為0.705,能區(qū)分ALV-K與其它ALV-A/B/J亞群的雞血清抗體;該方法靈敏度較全長蛋白提高近20倍;板內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)在0.90%～7.33%之間,板間重復(fù)性顯示變異系數(shù)在0.84%～5.44%;與商品化ALV p27抗體檢測試劑盒符合率可達(dá)93.48%;試劑盒至少在5個月內(nèi)有效。利用該重組蛋白免疫兔可獲得效價為8.1×105～5.12×107的血清抗體,所獲得的抗體可用于免疫印跡分析（Western blotting）識別ALV-K gp85蛋白和間接免疫熒光分析（IFA）識別細(xì)胞中的ALV-K病毒。通過細(xì)胞融合和多次亞克隆篩選獲得兩株分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為ALV-K30B、ALV-K23H,其分泌的抗體亞類分別為Ig G2b、Ig G1,制備的腹水抗體效價可達(dá)214和212,所產(chǎn)生的抗體可用于Western blotting特異性識別ALV-K gp85蛋白和IFA識別細(xì)胞中的ALV-K亞群毒株,而不識別ALV-A/J亞群毒株。以上結(jié)果表明,獲取的ALV-K gp85特異性基因片段經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),可獲得成功用于特異性檢測雞血清ALV-K抗體的ELISA包被抗原,也可成功用于制備高效價的多克隆抗體和單克隆抗體。所建立的血清抗體檢測ELISA具有良好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和符合率;所制備的特異性抗體可用于ALV-K病毒及其gp85蛋白的特異性檢測。
閆彩虹[2]（2020）在《江蘇地區(qū)家禽4種免疫抑制病病原檢測及致瘤病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立與應(yīng)用》文中認(rèn)為免疫抑制病病原既可引起家禽發(fā)生原發(fā)性感染甚至死亡,也可損傷其免疫系統(tǒng),導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降,并發(fā)或繼發(fā)感染其他病原,造成家禽生產(chǎn)能力下降和較高的病死率。雞傳染性貧血病毒（CIAV）、馬立克病病毒（MDV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）和禽白血病病毒（ALV）是4種常見的可導(dǎo)致家禽免疫抑制的病毒,在我國養(yǎng)雞場中檢出率較高,且常以亞臨床感染的形式出現(xiàn)。目前關(guān)于這幾種免疫抑制病的流行病學(xué)調(diào)查研究主要集中在廣西、安徽、山東、河南等地區(qū),而關(guān)于江蘇地區(qū)家禽這方面的流行病學(xué)研究資料較少。由MDV、REV和J亞群禽白血病病毒（ALV-J）感染引起的腫瘤疾病在臨床診斷過程中因癥狀相似而較難確診,而且這3種病原的實(shí)驗(yàn)室檢測還是以常規(guī)PCR為主,因此建立一種特異、靈敏、快速的檢測方法,用于病原檢測和臨床診斷,同時為疾病的防控和凈化提供幫助是非常有必要的。本研究應(yīng)用PCR方法對來自江蘇地區(qū)的病禽進(jìn)行4種免疫抑制病病原的檢測,建立了同時檢測3種致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan熒光定量PCR方法,并應(yīng)用于臨床檢測中,以期了解江蘇地區(qū)家禽免疫抑制病病原的感染情況,并為臨床上家禽腫瘤疾病的診斷提供一種快速、特異、敏感的新型技術(shù)手段。1 江蘇地區(qū)家禽4種免疫抑制病病原檢測為了解江蘇地區(qū)家禽免疫抑制病病原的流行情況及其感染間相互作用的關(guān)系,應(yīng)用PCR方法對2016-2019年來自江蘇地區(qū)不同養(yǎng)殖群體的507只病雞、80只病鴨、129只病鵝和42只病鴿進(jìn)行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸檢測,結(jié)果顯示病雞樣品總陽性檢出率為66.07%,CIAV、MDV、REV和ALV的檢出率分別為36.09%、25.84%、10.85%和32.94%,CIAV、MDV、REV和ALV的單一感染檢出率分別為13.61%、8.88%、1.18%和12.03%,二重感染以CIAV+ALV最為常見,檢出率為7.69%,三重感染以CIAV+MDV+ALV最為常見,檢出率為3.94%,四重感染檢出率為0.99%。不同日齡雞檢測結(jié)果顯示,6月齡以上雞CIAV的檢出率顯著降低,3～6月齡雞MDV和ALV的檢出率較高;不同品種雞檢測結(jié)果顯示,蛋雞MDV、REV檢出率顯著高于肉雞、草雞和三黃雞;2016-2019年檢測結(jié)果顯示,江蘇地區(qū)雞群中免疫抑制病病毒仍呈現(xiàn)不同程度的流行,且部分病原的每年檢出率存在差異性。4種免疫抑制病病原感染間相互作用的比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,CIAV和REV、CIAV和ALV感染間存在相互促進(jìn)的趨勢（P<0.01）。209份水禽樣品均未檢測出CIAV核酸,MDV、REV和ALV的檢出率分別為0.96%、1.44%和3.35%,個別樣品還存在REV和ALV的混合感染。病鴿樣品中均未檢測出這四種免疫抑制病病原。結(jié)果表明,雞群中免疫抑制病病原的感染非常普遍,且存在多種病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的檢出率顯著低于雞群;鴿子感染這4種免疫抑制病病原的機(jī)率較低。2雞致瘤病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立為建立同時檢測MDV、REV和ALV-J的方法,本研究根據(jù)MDV meq基因、REV gp90基因和ALV-J env基因,合成特異性引物和TaqMan探針,建立和優(yōu)化反應(yīng)體系和條件,建立了雞3種致瘤病毒的單個和三重TaqMan熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示,本研究建立的3種病毒的單個熒光定量PCR方法具有相同的反應(yīng)體系和條件,操作方便,檢測快速;單個和多重?zé)晒舛縋CR方法均僅特異性擴(kuò)增MDV、REV和ALV-J,與雞其它主要病毒無交叉反應(yīng),特異性較強(qiáng);3種病毒的單個熒光定量PCR方法對MDV、REV和ALV-J的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢出限分別為3.23×101拷貝/μL、3.23×100拷貝/μL和3.23×101拷貝/μL,敏感性較高,三重?zé)晒舛縋CR方法對MDV、REV和ALV-J的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低檢出限分別為3.23×100拷貝/μL、3.23×100拷貝/μL和3.23×101拷貝/μL,與單個敏感性相似;三重?zé)晒舛縋CR方法組內(nèi)與組間重復(fù)性試驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)均小于5%,重復(fù)性良好。應(yīng)用三重?zé)晒舛縋CR方法和普通PCR方法分別對來自江蘇各地具有免疫抑制病表現(xiàn)的120份臨床病雞樣品同時進(jìn)行MDV、REV和ALV-J核酸的檢測,兩者的符合率為94.17%。本研究建立的雞致瘤病毒三重TaqMan熒光定量PCR方法為臨床樣品中MDV、REV和ALV-J核酸的檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速、特異、敏感的新型技術(shù)手段。3兩例疑似腫瘤病雞三重?zé)晒舛縋CR檢測及馬立克病病毒鑒定分析研究為進(jìn)一步檢驗(yàn)三重?zé)晒舛縋CR方法的臨床應(yīng)用性,應(yīng)用建立的三重?zé)晒舛縋CR方法對江蘇兩個雞場送檢的疑似感染腫瘤性病毒的病雞組織樣品進(jìn)行了檢測,并同時進(jìn)行病毒分離,然后對分離出的MDV野毒株進(jìn)行meq和pp38兩個主要致病基因的序列分析。三重?zé)晒舛縋CR結(jié)果顯示送檢病雞樣品MDV核酸均呈陽性,REV和ALV-J核酸均呈陰性,病毒分離鑒定結(jié)果顯示從兩個雞場的病雞抗凝全血中各分離到了 1株MDV Ⅰ型毒株,未分離到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示,JS0316毒株與江蘇分離株Js201801關(guān)系最近,而JS0424毒株則與近年國內(nèi)流行毒株親緣相近。meq基因編碼的氨基酸序列結(jié)果顯示,2個MDV分離株缺乏弱毒疫苗株的特征（A71S,P194-）,具有MDV強(qiáng)毒分離株的分子特征（D80Y,V115A,T139A,P176R）,JS0316分離株meq基因除了具有以上強(qiáng)毒分離株的分子特征外,還與Js201801存在相同的突變（Q93R）,該突變其余參考毒株均未發(fā)生,這可能是MDV江蘇分離株新的分子生物學(xué)特征。除此之外,JS0316和JS0424分離株meq基因分別出現(xiàn)了其他參考毒株均未發(fā)生的氨基酸突變（V123A）和（A/P217T）,JS0316和JS0424分離株pp38基因推導(dǎo)的氨基酸序列也分別出現(xiàn)了特有的氨基酸突變（L981,F240S）和（W67G,V210A）。結(jié)果表明三重?zé)晒舛縋CR檢測結(jié)果和病毒分離結(jié)果一致,發(fā)病雞均感染了馬立克病毒,且分離毒株均具有強(qiáng)毒的分子特征。因此,所建三重?zé)晒舛縋CR方法可用于臨床檢測。
欒秀敏[3]（2020）在《2017-2019年我國部分省份白羽肉雞ALV-J的分離鑒定及env序列分析》文中研究說明禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）感染引發(fā)的多種腫瘤病的統(tǒng)稱,臨床癥狀主要表現(xiàn)為多種臟器腫瘤、免疫抑制和嚴(yán)重的生長遲緩。該病在19世紀(jì)末出現(xiàn)以來,已在世界范圍內(nèi)廣泛流行。該病于20世紀(jì)末在我國開始流行并在2008年達(dá)到高峰,嚴(yán)重影響了我國商品肉雞和蛋雞的養(yǎng)殖,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為控制禽白血病的流行與傳播,我國對禽白血病實(shí)施了嚴(yán)格的凈化工作,力求從種源凈化做起,在全國范圍內(nèi)逐步凈化禽白血病。目前,禽白血病凈化工作已經(jīng)取得了巨大成功,尤其是J亞群禽白血病病毒（subgroup J ALV,ALV-J）在我國商品肉雞和蛋雞養(yǎng)殖業(yè)中得到一定控制,經(jīng)濟(jì)效益得到了明顯提升。然而,2017年以來,我國多個省份肉種雞場再次出現(xiàn)禽白血病,臨床癥狀較之前出現(xiàn)變化,發(fā)病率和死亡率顯著提高。為了解引發(fā)此次禽白血病發(fā)生的病原學(xué)特征,本研究從我國遼寧、吉林、天津、山東、河北和江蘇六個省份21家發(fā)生禽白血病癥狀的養(yǎng)殖場進(jìn)行了系統(tǒng)的流行病學(xué)分析。生產(chǎn)數(shù)據(jù)顯示上述養(yǎng)殖場患病雞臨床癥狀主要出現(xiàn)于開產(chǎn)前后,發(fā)病平均周齡為17.5周,平均日死亡率為6.8/10000。主要癥狀表現(xiàn)為肝臟腫瘤、脾臟腫瘤、腎臟腫瘤以及最新出現(xiàn)的脊骨腫瘤,且脊骨腫瘤出現(xiàn)的養(yǎng)殖場死亡率顯著高于其他養(yǎng)殖場。隨后,病毒分離和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示上述21家養(yǎng)殖場均存在ALV-J的感染,陽性率在20%-100%之間,總體陽性率約為60%,且發(fā)生脊骨腫瘤的山東養(yǎng)殖場陽性率均為100%。隨后,本研究對所分離到的21株代表毒株進(jìn)行了env基因測序與分析。同源性比較顯示:本研究分離的病毒株核酸序列同源性為97.0%-99.9%,氨基酸序列同源性為94.7%-99.8%,說明這些病毒株高度相似,可能有共同的祖先。同時,本研究證實(shí),此次我國多個省份肉種雞養(yǎng)殖場中出現(xiàn)的ALV-J毒株與分離自黃羽肉雞的GD14J2毒株（Genbank登錄號:KU500032）的同源性最高,在95.77%～97.16%之間,明顯高于其他參考毒株,說明這些新毒株與GD14J2的親緣關(guān)系更為密切,但是否這些毒株具有相同的起源目前仍無定論。另一方面,遺傳進(jìn)化分析顯示本研究在相同省份分離到的毒株不具有明顯的地域性,且不同來源的毒株在env基因區(qū)段擁有一致的基因插入或缺失突變,這表明可能引發(fā)此次禽白血病爆發(fā)的ALV-J毒株可能存在多個傳染源,并非直接來自同一毒株。同時,本研究也探討分析了疫苗污染可能在此次ALV-J再次爆發(fā)中發(fā)揮的作用,但結(jié)果顯示發(fā)生禽白血病的養(yǎng)殖場并未使用含有ALV-J外源病毒污染的疫苗,表明病毒可能來自其他途徑。上述研究證實(shí)了引發(fā)此次禽白血病爆發(fā)的毒株屬于ALV-J,探明了其分子特征和基因組變異情況,為臨床防治該病提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。
崔真毓[4]（2020）在《廣西不同黃羽肉雞品系種公雞中禽白血病病毒分離鑒定及一株重組毒株基因組解析》文中研究表明禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起的,以免疫抑制、生長遲緩和多器官組織腫瘤為主要特征的病毒性傳染病,近年來我國黃羽肉雞和純地方品系雞群中ALV相關(guān)報道已有多。目前尚無有效的商品化疫苗和藥物可用于控制禽白血病,對種雞群實(shí)施嚴(yán)格的禽白血病凈化被認(rèn)為是控制禽白血病最有力的措施。在實(shí)施禽白血病凈化過程中,公雞及其精液在ALV傳播中的作用不僅是一個重要的理論問題,也是關(guān)乎凈化效果的實(shí)際技術(shù)問題,了解公雞及其精液中ALV的感染和帶毒狀況、精液和血液中ALV感染狀態(tài)的相關(guān)性對于實(shí)施禽白血病凈化具有重要意義。本研究分別采用血漿和精液實(shí)施病毒分離對廣西地區(qū)12個黃羽肉雞品系的種公雞開展了ALV的分離鑒定和調(diào)查,并對其中一株重組ALV開展了基因組測序和分析,以期為相應(yīng)雞群實(shí)施凈化提供必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。為了解擬開展禽白血病凈化的12個黃羽肉雞品系種公雞中ALV感染狀況,本研究分別采用血漿病毒分離鑒定和精液病毒分離鑒定并一一對應(yīng)的方式對12個黃羽肉雞品系的種公雞開展了ALV的分離鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示,12個品系種公雞經(jīng)血漿病毒分離陽性率分別為0.74%（1/135）、3.46%（8/231）、1.37%（1/73）、3.78%（9/238）、8.12%（38/468）、5.33%（73/1370）、5.45%（9/165）、2.13%（1/47）、0（0/29）、2.5%（1/40）、1.72%（3/174）、2.5%（5/200）,精液病毒分離陽性率分別為0.74%（1/135）、1.73%（4/231）、1.37%（1/73）、1.26%（3/238）、1.71%（8/468）、6.64%（91/1370）、4.24%（7/165）、0（0/47）、0（0/29）、0（0/40）、5.17%（9/174）、1.50%（3/200）,通過大量數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)在多個品系中同一只公雞血液病毒分離和精液病毒分離結(jié)果并不完全一致,多數(shù)雞群血液病毒分離陽性率高于精液病毒分離陽性率,部分雞群精液病毒分離陽性率高于血液病毒分離陽性率,分別對其中4個雞場的6株ALV分離株gp85基因測序分析顯示其均為J亞群ALV（ALV-J）。本研究結(jié)果表明在廣西地區(qū)多個黃羽肉雞品系種公雞中仍存在ALV的流行,需要實(shí)施進(jìn)一步的凈化措施加以控制。在測序過程中初步發(fā)現(xiàn)野毒株GXRJ01株疑似為一株天然重組野毒株,為深入了解其分子特征,本探究通過多對相互重疊的引物對其不同基因區(qū)域分段擴(kuò)增后測序,經(jīng)拼接獲得了GXRJ01株的全基因組,該分離株env基因與ALV-J代表株BR119的同源性高達(dá)98.7%,但其長末端重復(fù)序列（LTR）與E亞群ALV（ALV-E）的代表株同源性介于94.9%-98.4%,推測GXRJ01株很有可能是ALV-J gp85基因和ALV-E的LTR部分發(fā)生自然重組產(chǎn)生的野毒株。上述研究進(jìn)一步顯示了廣西地區(qū)黃羽肉雞品系中ALV基因的復(fù)雜性和多樣性,推測黃羽肉雞雞群中可能存在多種亞群毒株的混合感染繼而提升了重組毒株產(chǎn)生的幾率,提示應(yīng)盡快開展嚴(yán)格的凈化措施以避免ALV在上述雞群中的持續(xù)流行與重組幾率。本研究采用血漿病毒分離鑒定和精液病毒分離鑒定兩種方式同步實(shí)施完成了12種不同黃羽肉雞品系種公雞中ALV感染狀況的調(diào)查,摸清了在上述品系種公雞中ALV帶毒狀況并通過比較發(fā)現(xiàn)了血漿和精液病毒分離鑒定結(jié)果的不對應(yīng)性。此外還發(fā)現(xiàn)并解析了一株ALV天然重組野毒株的基因組序列,相關(guān)研究結(jié)果對推動黃羽肉雞品系禽白血病凈化提供了新的理論數(shù)據(jù)支撐。
趙震東[5]（2020）在《南通地區(qū)禽白血病的流行病學(xué)調(diào)查及其凈化的初步研究》文中研究指明禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）是可引起禽類多種腫瘤及免疫抑制性疾病的反轉(zhuǎn)錄病毒。根據(jù)其囊膜蛋白特征,該病毒可分為A-K共11個亞群。其中A,B,J亞群較為常見,且J亞群目前在國內(nèi)最為常見。ALV-J感染主要造成雞造血細(xì)胞惡性增生,引起髓細(xì)胞瘤、血管瘤及嚴(yán)重的免疫抑制,對國內(nèi)外養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著國內(nèi)ALV凈化工作的推進(jìn),雞群ALV-J的感染及其發(fā)病率顯著下降。ALV-K是近年來在國內(nèi)地方品種雞中分離鑒定出的新型禽白血病病毒。由于ALV-K病毒復(fù)制能力較弱,雞群中ALV-K感染往往不易被檢測出來,正挑戰(zhàn)目前ALV通用檢測及凈化技術(shù)。本研究對南通地區(qū)送檢的疑似ALV感染病料進(jìn)行檢測,分離鑒定到一株K亞群禽白血病病毒,并利用ALV-A/B抗體、ALV-J抗體及ALV抗原（p27）檢測試劑盒對南通地區(qū)8個規(guī)?；胤狡废底娲N雞場開展了 ALV流行病學(xué)檢測,且對兩個品系的種雞雞群三個世代進(jìn)行了禽白血病檢測凈化跟蹤研究。1.南通地區(qū)禽白血病流行病學(xué)調(diào)查為了解南通地區(qū)ALV感染狀態(tài),本研究在對南通地區(qū)送檢的疑似ALV感染病料進(jìn)行PCR檢測、病毒分離鑒定的基礎(chǔ)上,利用商品化的ALV-A/B抗體和ALV-J抗體檢測試劑盒以及本實(shí)驗(yàn)室研制的ALV抗原檢測試劑盒對南通地區(qū)8個規(guī)模化地方品系祖代雞雞場開展了 ALV流行病學(xué)檢測。研究結(jié)果表明,從疑似病料中分離到一株ALV-K,命名為NT181121。8個雞場A/B亞型抗體陽性檢出率為87.5%（7/8）,各雞場陽性率分別為 4%（2/50）、4%（2/50）、0%（0/50）、4%（2/50）、2%（1/50）、6%（3/50）、12%（6/50）以及 4%（2/50）,總體個體陽性率為 4.5%（18/400）;J亞型抗體陽性檢出率為100%（8/8）,各雞場陽性率分別為20%（10/50）、36%（18/50）、14%（7/50）、6%（3/50）、50%（25/50）、6%（3/50）、22%（11/50）以及 26%（13/50）,總體個體陽性率為22.5%（90/400）;血樣ALV抗原陽性檢出率為100%（8/8）,各雞場陽性率分別為 14%（7/50）、22%（11/50）、8%（4/50）、24%（12/50）、26%（13/50）、10%（5/50）、24%（12/50）以及 18%（9/50）,總體個體陽性率為18.25%（73/400）。以上對南通地區(qū)8個規(guī)?；u場外源性ALV感染現(xiàn)狀調(diào)查結(jié)果顯示ALV感染在南通地區(qū)已非常普遍。2.兩個品系種雞群禽白血病凈化的初步研究針對南通地區(qū)ALV感染普遍性問題,在采用ALV凈化的金標(biāo)準(zhǔn)方案基礎(chǔ)上,本研究結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室研制的禽白血病病毒p27抗原夾心ELISA檢測試劑盒,對南通地區(qū)兩個地方品系種雞群（代號分別為3號和6號）進(jìn)行了三個代次的ALV檢測與凈化研究。研究結(jié)果表明,通過三個代次的ALV檢測、凈化淘汰,3號和6號品系種雞群泄殖腔棉拭樣品和全血樣品病毒檢測陽性率均顯著下降。3號品系種雞群ALVp27抗原陽性率由凈化前38.4%下降到4.7%,抗凝血的病毒分離由凈化前11.2%降為1.46%;6號品系種雞群ALVp27抗原陽性率由凈化前19.8%降為6.3%,抗凝血的病毒分離由凈化前6.3%降為0.8%。以上結(jié)果表明這兩個地方品系種雞群經(jīng)過三個代次的凈化,取得了初步的凈化成效。
仇玲玲[6]（2020）在《雞circRNA2420-Bcl11b介導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控ALV-J感染的作用機(jī)制》文中研究表明J亞群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）是一種反轉(zhuǎn)錄病毒,引起家禽免疫抑制、生長抑制和多器官組織出現(xiàn)腫瘤,給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。相對于其他亞型,ALV-J擁有更強(qiáng)的致病性和傳染性,也是目前我國雞群中發(fā)病率最高、感染較為嚴(yán)重、影響深遠(yuǎn)的一種亞群。目前還沒有發(fā)現(xiàn)有效的商業(yè)化藥物或疫苗可供使用,其感染致病致瘤機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究基于前期ALV-J感染與正常脾臟組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),結(jié)合小RNA測序數(shù)據(jù),通過生物信息學(xué)聯(lián)合分析篩選出與ALV-J感染致瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本（包括mRNAs、circRNAs、lncRNAs或miRNAs）、轉(zhuǎn)錄本間可能的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系以及病毒感染的關(guān)鍵信號通路。然后從上游和下游兩個角度揭示雞Bcl11b（B-cell lymphoma/leukemia 11B）在ALV-J病毒感染過程中的作用及分子調(diào)控機(jī)制,并以期進(jìn)一步完善ALV-J感染致瘤機(jī)制的基礎(chǔ)研究,也為尋找有效的生物標(biāo)記以提高抗病育種工作提供理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下:1.為了探索家禽中ALV-J感染過程中關(guān)鍵基因、circRNAs、lncRNAs以及ceNRA互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,同時為解析雞J亞群禽白血病病毒感染分子調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)資料,本研究利用已有的ALV-J自然感染發(fā)病與正常脾臟組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),結(jié)合同樣本的小RNA測序數(shù)據(jù),獲得全面系統(tǒng)的ALV-J感染與非感染雞脾臟組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),并且通過差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本韋恩圖聯(lián)合分析、功能富集分析以及ceRNA互作網(wǎng)絡(luò)等生物信息學(xué)手段共篩選出與ALV-J感染致病致瘤相關(guān)的15個候選基因（包括Bbx、Bcl11b、Foxk1、Pag1、Tyro3、Brat1、Ctsb、Scube3、Ulk3、Dock4、Zfhx3、Fmr1、Aoc3、Ralb 以及 Mll）、多個相關(guān)轉(zhuǎn)錄本及轉(zhuǎn)錄本間可能的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系以及病毒感染的關(guān)鍵信號通路,通過在其他感染組織中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Bcl11b表達(dá)水平差異最為顯著,達(dá)80倍,且Bcl11b信號通路復(fù)雜,可能是ALV-J感染致病致瘤的關(guān)鍵因子。因此,首先將雞Bcl11b基因作為研究ALV-J感染致病致瘤的機(jī)制切入點(diǎn)。2.為探討雞Bcl11b基因的功能,首先克隆獲得了雞Bcl11b的CDS序列,發(fā)現(xiàn)存在可變剪接體,并且發(fā)現(xiàn)一種新的剪接形式,蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)3號外顯子缺失會影響蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的鋅離子結(jié)合位點(diǎn);qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞Bcl11b在肝、脾、肺、淋巴和腎等組織中均有表達(dá),且在脾、肺和淋巴中高表達(dá),在雞胚成纖維細(xì)胞中高表達(dá);進(jìn)一步在Bcl11b基因低表達(dá)的細(xì)胞DF-1中過表達(dá)Bcl11b同時檢測細(xì)胞增殖活力、凋亡及周期變化,發(fā)現(xiàn)Bcl11b的過表達(dá)顯著降低了細(xì)胞活力、提高了細(xì)胞凋亡水平（P<0.05）,促凋亡基因表達(dá)量也顯著升高（P<0.05）,對細(xì)胞周期影響不顯著（P>0.05）,在CEF細(xì)胞中干擾Bcl11b表達(dá)后細(xì)胞凋亡水平顯著降低（P<0.05）,對細(xì)胞周期影響不顯著（P>0.05）。這說明了雞Bcl11b通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡從而抑制細(xì)胞活力和存活,而非阻滯細(xì)胞周期。3.為了進(jìn)一步探索雞Bcl11b基因在ALV-J感染過程中的作用,首先構(gòu)建了 ALV-J體外感染CEF細(xì)胞產(chǎn)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的模型,檢測體外感染過程中Bcl11b基因表達(dá)水平變化趨勢與細(xì)胞凋亡水平一致,同時檢測多個凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)p53蛋白水平在感染后0～2 dpi高表達(dá),其下游蛋白Bax表達(dá)水平在在感染后0～3dpi表達(dá)水平較高,下游作用因子細(xì)胞色素C（CytC）在2-4dpi高表達(dá),符合p53調(diào)控的線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡模式;Bcl11b基因和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)與凋亡變化吻合。這也說明在體外,雞Bcl11b基因參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。4.進(jìn)一步探討了 miRNA靶向Bcl11b參與ALV-J感染的分子機(jī)制,本研究首先克隆獲得雞Bcl11b 3’UTR序列1755 nt;通過miRDB、Targetscan、PicTar等在線預(yù)測軟件并與測序分析數(shù)據(jù)結(jié)合預(yù)測靶向雞 Bcl11b基因的miRNAs并結(jié)合雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗(yàn)證gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p可以靶向雞Bcl11b;通過分別對miRNAs的過表達(dá)和抑制同時檢測對雞Bcl11b的表達(dá)水平以及細(xì)胞凋亡、周期的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p可以通過靶向Bcl11b影響B(tài)cl11b基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,進(jìn)而影響了被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡水平;通過對ALV-J體外感染CEF細(xì)胞過程中Bcl11b基因表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡水平出現(xiàn)拐點(diǎn)的時候（3～5dpi）抑制內(nèi)源性gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p的表達(dá),發(fā)現(xiàn)靶基因Bcl11b表達(dá)水平顯著上調(diào),細(xì)胞凋亡水平也顯著上調(diào)（P<0.05）。這表明gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p通過靶向Bcl11b基因介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。5.為了探究circRNA2420-miRNA-Bcl11b的調(diào)控機(jī)制,首先通過qRT-PCR、分子克隆等方法對circRNA2420特征進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其是高穩(wěn)定閉合環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本,且其成環(huán)并不依賴側(cè)翼內(nèi)含子上的重復(fù)序列;接著對circRNA<sub>2420進(jìn)行過表達(dá)和干擾表達(dá),檢測雞Bcl11b的表達(dá)以及細(xì)胞的凋亡水平變化,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRNA2420后Bcl11b表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05）,細(xì)胞凋亡水平也隨之上調(diào)（P<0.05）;反之干擾circRNA2420表達(dá)后Bcl11b表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05）,細(xì)胞凋亡水平也相應(yīng)下降（P<0.05）,但是細(xì)胞周期沒有變化（P>0.05）;通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗(yàn)證靶向Bcl11b基因的兩個miRNA（gga-miR-1612 和 gga-miR-6701-3p）與 circRNA2420 的作用方式以及雞Bcl11b與circRNA2420的互作,發(fā)現(xiàn)gga-miR-1612可以靶向結(jié)合雞circRNA2420影響熒光素酶活性,circRNA2420也間接影響了Bcl11b基因的活性。說明circRNA2420可以通過吸附miRNAs（包括gga-miR-1612）調(diào)控雞Bcl11b的表達(dá),進(jìn)而影響細(xì)胞的凋亡。6.為了探究Bcl11b介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制,通過ChIP-seq實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bcl11b作為一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子可以靶向多個細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡及信號通路等多種生物學(xué)過程,為揭示Bcl11b的功能及作用機(jī)制提供了線索。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)ALV-J感染過程中circRNA<sub>2420可以通過吸附miR-1612間接促進(jìn)雞Bcl11b基因的表達(dá),而Bcl11b作為一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡調(diào)控ALV-J感染。研究結(jié)果進(jìn)一步完善ALV-J感染致瘤機(jī)制的基礎(chǔ)研究,也為尋找有效的生物標(biāo)記以提高抗病育種工作提供新的靶點(diǎn)和思路。
何書海[7]（2019）在《J亞群禽白血病病毒誘導(dǎo)雞免疫耐受的致病機(jī)制研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理J亞群禽白血病病毒（ALV-J）是一種致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒,在臨床上主要誘發(fā)肉雞和蛋雞發(fā)生髓系細(xì)胞白血病和其它各種類型的腫瘤性疾病。自1991年該病毒被發(fā)現(xiàn)以來,ALV-J在全世界范圍內(nèi)的各種雞群中廣泛流行并呈現(xiàn)間歇性爆發(fā)之勢,曾對世界范圍內(nèi)的養(yǎng)雞業(yè)造成了毀滅性打擊。目前,ALV-J在我國各品系雞群中的感染相當(dāng)普遍,給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除了造成雞的生產(chǎn)性能下降和誘發(fā)腫瘤外,一個更為嚴(yán)重但也容易被忽視的問題是ALV-J感染會造成被感染雞出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫耐受,且免疫耐受是腫瘤形成和機(jī)會性感染的必要條件。遺憾的是,迄今為止人們對ALV-J誘導(dǎo)免疫耐受的根本原因和機(jī)制知之甚少,所以闡明ALV-J誘導(dǎo)宿主免疫耐受的發(fā)病機(jī)制對防控該病具有現(xiàn)實(shí)而重要的意義。本研究通過建立ALV-J免疫耐受感染實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?從發(fā)育學(xué)、細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)角度明確ALV-J感染雞的免疫狀況及其與免疫耐受形成之間的內(nèi)在聯(lián)系;利用現(xiàn)代生命科學(xué)前沿技術(shù),檢測和分析了ALV-J感染細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)差異,明確其在B細(xì)胞發(fā)育和功能相關(guān)信號通路中的作用,并對ALV-J的分子致病機(jī)制進(jìn)行理論概括。為研究先天性感染與后天感染誘導(dǎo)免疫耐受的差異,本研究分別通過胚內(nèi)注射ALV-J模擬先天感染和雛雞注射ALV-J模擬后天感染的方式建立了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。研究發(fā)現(xiàn),ALV-J胚內(nèi)感染可造成被感染雞出現(xiàn)持續(xù)性病毒血癥但沒有抗體反應(yīng)（即免疫耐受）,而雛雞時感染ALV-J則只有一部分雞表現(xiàn)為免疫耐受。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)免疫耐受雞血液中總免疫球蛋白（Ig M和Ig G）水平顯著降低。進(jìn)一步運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測了免疫耐受雞免疫器官中Ig M+和Ig G+B細(xì)胞的數(shù)量和發(fā)育動態(tài),檢測和評價了被感染雞脾臟B細(xì)胞應(yīng)對胸腺非依賴型抗原脂多糖（LPS）刺激后的活化與增殖能力。結(jié)果顯示,免疫耐受雞體內(nèi)的B細(xì)胞向Ig M+和Ig G+抗體生成細(xì)胞（特別是Ig G型細(xì)胞）發(fā)育和分化的能力受到嚴(yán)重的抑制;脾臟生發(fā)中心B細(xì)胞應(yīng)對有絲分裂原刺激后活化與擴(kuò)增能力也被抑制。為了解ALV-J先天感染與后天感染雞對特異性抗原刺激的免疫應(yīng)答能力的差異,進(jìn)一步檢測了宿主應(yīng)對綿羊紅細(xì)胞（SRBC）及馬立克氏病病毒（MDV）減毒1型疫苗刺激所產(chǎn)生的Ig M型和Ig G型抗體滴度。結(jié)果顯示,先天感染雞所產(chǎn)生的抗原特異性Ig M型和Ig G型抗體滴度顯著降低;然而,雖然后天感染雞體內(nèi)抗原特異性Ig G型特異性抗體滴度顯著降低,但I(xiàn)g M型抗體滴度基本正常,這些數(shù)據(jù)提示ALV-J后天感染對雞體內(nèi)B細(xì)胞的早期發(fā)育影響不大。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,ALV-J先天感染抑制了B細(xì)胞的發(fā)育及成熟,并抑制了B細(xì)胞免疫球蛋白的生成和抗體類別轉(zhuǎn)換能力。為了進(jìn)一步探明ALV-J先天感染誘導(dǎo)免疫耐受的細(xì)胞學(xué)機(jī)制,本研究檢測了自雞胚發(fā)育到雛雞的各時段法氏囊B細(xì)胞發(fā)育動態(tài)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果顯示,ALV-J胚內(nèi)感染雞法氏囊發(fā)育嚴(yán)重不良且大部分淋巴濾泡不能分化為明顯的髓質(zhì)和皮質(zhì),提示這些淋巴濾泡處于幼稚狀態(tài);然而孵化后感染ALV-J的雞法氏囊發(fā)育雖然也受到抑制,但大部分淋巴濾泡能夠形成皮質(zhì)部。這些結(jié)果證實(shí)ALV-J先天感染對雞法氏囊B細(xì)胞的發(fā)育影響更大。流式細(xì)胞分析結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ALV-J胚內(nèi)感染會造成更高的B細(xì)胞感染率（約27%）,且免疫組化結(jié)果顯示這些gp85抗原陽性B細(xì)胞體積和核槳比例較大,大多處于發(fā)育早期階段。以上結(jié)果說明,ALV-J的先天感染會導(dǎo)致了胚胎B細(xì)胞的后期發(fā)育抑制,并因此造成B細(xì)胞抗體生成障礙。流式細(xì)胞分析結(jié)果證實(shí)ALV-J阻斷了法氏囊中CD117+祖B細(xì)胞的分化,并且體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ALV-J抑制了CD117+B細(xì)胞體外增殖能力和應(yīng)答LPS和IL-4刺激所發(fā)生的免疫球蛋白基因類別轉(zhuǎn)換重組能力。綜合分析以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),提示ALV-J誘導(dǎo)的免疫耐受與B細(xì)胞發(fā)育受阻和功能障礙密切相關(guān),而導(dǎo)致B細(xì)胞出現(xiàn)這種“無能”狀態(tài)的關(guān)鍵原因就是ALV-J選擇性作用于早期發(fā)育的B細(xì)胞并抑制它們的進(jìn)一步發(fā)育和成熟。相關(guān)ALV-J感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果顯示,ALV-J感染改變了DF-1細(xì)胞中酪氨酸激酶Lyn的蛋白表達(dá)水平。Lyn是B細(xì)胞BCR信號通路中的核心因子,其參與了B細(xì)胞增殖、分化、成熟或耐受等相關(guān)生物學(xué)過程。因此,為明確ALV-J誘導(dǎo)B細(xì)胞無能的分子機(jī)制,本研究進(jìn)一步分析了ALV-J對B細(xì)胞中Lyn的表達(dá)調(diào)控及對BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。Western-blot及免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,ALV-J胚內(nèi)感染雞法氏囊細(xì)胞中的Lyn表達(dá)水平上升。因體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示ALV-J感染雞B細(xì)胞中Lyn表達(dá)異常,本研究進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中研究了ALV-J對Lyn表達(dá)的影響。通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),ALV-J感染B細(xì)胞后其病毒gp85蛋白主要分布于細(xì)胞漿,同時也有一部分B細(xì)胞的胞漿和胞核均有病毒gp85的陽性信號。q RT-PCR和Western-blot檢測結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,即ALV-J感染導(dǎo)致B細(xì)胞內(nèi)Lyn的m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白合成水平均被上調(diào)。Lyn在BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中同時具有正調(diào)控和負(fù)調(diào)控作用,而這種正負(fù)調(diào)控作用取決于其不同磷酸化位點(diǎn)的活化水平。為明確Lyn在ALV-J感染組B細(xì)胞中發(fā)揮的主導(dǎo)作用,本研究進(jìn)一步檢測了BCR信號激活后Lyn蛋白的磷酸化水平及其下游直接底物Syk蛋白的磷酸化水平。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,當(dāng)激活BCR信號后,感染組B細(xì)胞中Tyr397位點(diǎn)（激活正調(diào)控作用）和Tyr507位點(diǎn)（激活負(fù)調(diào)控作用）的磷酸化水平均不同程度的增強(qiáng)。此時,作為BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心激酶同時也是Lyn的直接底物Syk的磷酸化水平就顯得尤為重要。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,此時Syk的磷酸化水平顯著下降,提示Lyn在感染組B細(xì)胞中主要發(fā)揮了抑制BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。為了確證這種作用,本研究進(jìn)一步對B細(xì)胞中的Lyn進(jìn)行了sh RNA干擾并檢測了相關(guān)蛋白的磷酸化水平。檢測結(jié)果顯示,對感染組B細(xì)胞實(shí)施Lyn的sh RNA干擾后,其下游蛋白Syk的磷酸化水平顯著回升。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明Lyn在感染B細(xì)胞中發(fā)揮了抑制BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用,從而導(dǎo)致了B細(xì)胞BCR信號級聯(lián)反應(yīng)受阻。綜上所述,ALV-J誘導(dǎo)的免疫耐受與B無能有關(guān),其根本原因在于ALV-J阻滯了CD117+祖B細(xì)胞的發(fā)育和分化;而導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育和分化障礙的分子機(jī)制是ALV-J激活了Lyn在BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的抑制性作用?？傊?本研究從細(xì)胞和分子兩個維度全面解析了ALV-J誘導(dǎo)免疫耐受機(jī)制,為禽白血病的防控及揭示相關(guān)病毒誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。
沈習(xí)[8]（2019）在《抗A亞群禽白血病病毒單克隆抗體的研制與不同試劑盒臨床檢測差異性分析》文中研究指明禽白血病病毒（Avianleukosisvirus,ALV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬,與禽類多種腫瘤性疾病及生產(chǎn)性能息息相關(guān)。該病毒主要引起禽類產(chǎn)生腫瘤以及慢性消耗性死亡,造成免疫抑制及生長遲緩,產(chǎn)蛋率大幅度下降,給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失。ALV通過垂直和水平兩種方式傳播,限制本病的主要方法是淘汰陽性雞,凈化種群中的ALV-A、B、C、D、J和K等亞群。不同亞群病毒有不同的生物學(xué)特性以及臨床癥狀,臨床上選擇合適的試劑盒是凈化該病毒的關(guān)鍵。本研究通過研制針對A亞群禽白血病病毒gp85的單克隆抗體,并分析不同試劑盒檢測禽白血病的差異性,為生產(chǎn)實(shí)踐中禽白血病的凈化提供研究基礎(chǔ)。1 抗A亞群禽白血病病毒單克隆抗體的制備與鑒定Gp85是ALV的囊膜蛋白,由ALV基因組中env基因編碼,具有亞群特異性。本研究首先設(shè)計(jì)出一對針對A亞群禽白血病病毒env基因的特異性引物,PCR擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)室分離保存的ALV-A-AH10毒株的gp85基因,然后構(gòu)建原核表達(dá)載體PET32a-AH10-gp85,通過轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性轉(zhuǎn)化質(zhì)粒并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對表達(dá)的菌體進(jìn)行超聲波破碎,取離心后的上清和沉淀分別作SDS-PAGE分析,結(jié)果獲得大小約53KD的目的蛋白。純化后的PET32a-AH10-gp85蛋白與適量佐劑乳化后免疫6-8周齡BALB/c雌性小鼠,三次免疫后測小鼠血清抗體效價,對免疫效果較好的加強(qiáng)免疫,三天后取脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。用感染AH10病毒的DF1細(xì)胞板,固定后,對融合成功的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行IFA篩選。陽性孔經(jīng)過2-3次亞克隆,結(jié)果獲得五株穩(wěn)定分泌單克隆抗體,分別命名為ALV-A-1B12、ALV-A-1C12、ALV-A-1E5、ALV-A-1F8 和 ALV-A-3D11。Western-blot 和 IFA試驗(yàn)結(jié)果表明,所獲單抗3D11只針對ALV-A/B囊膜蛋白gp85抗原,而其余四株可與J亞群病毒發(fā)生熒光反應(yīng)。本次研究成功制備出一株針對ALV-A/B的單克隆抗體（3D11）,為快速篩檢田間感染A/B亞群禽白血病病毒的雞群提供了臨床診斷試劑。2不同試劑盒檢測禽白血病肛拭陽性率的差異性分析建立快捷準(zhǔn)確,成本低,可用于大批量田間試驗(yàn)的診斷技術(shù)是防制禽白血病的重要一環(huán)。ELISA檢測方法因其具有靈敏、快捷、適用于大面積檢測等特點(diǎn),在眾多方法中脫穎而出,被廣泛應(yīng)用于禽白血病的種群凈化中。為探索不同ELISA試劑盒針對禽白血病p27抗原檢測靈敏度的差異性,本研究將60只2周齡黃羽雛雞（包括30只活雞、30只死雞）進(jìn)行編號并采集肛拭、血樣及組織樣本。分別用IDEXX公司p27抗原檢測試劑盒和sELISA試劑盒檢測其肛拭樣本。血樣及組織樣本接種DF1細(xì)胞分離病毒,7天后取培養(yǎng)上清進(jìn)行p27抗原檢測及鑒定,分析比較肛拭陽性率差異,并通過PCR、RT-PCR及間接免疫熒光法驗(yàn)證。結(jié)果顯示,sELISA試劑盒肛拭陽性檢出率為68%,IDEXX試劑盒陽性檢出率為27%,且IDEXX公司陽性檢出樣本均存在于sELISA試劑盒陽性檢出的樣本中。陽性差異樣本通過測序分析,進(jìn)一步確認(rèn)為感染K亞群禽白血病病毒,這一結(jié)果顯示,sELISA試劑盒能夠更靈敏有效地檢測陽性肛拭樣本,特別是檢測肛拭中的禽白血病K亞群病毒。
呂孫良[9]（2019）在《湖南省養(yǎng)殖禽類主要病毒性流行病初步調(diào)查》文中指出湖南省是養(yǎng)殖業(yè)大省,每年為省內(nèi)外輸送以雞肉為主的大量禽類制品,但以禽流感（Avian Influenza,AI）為代表的禽類流行病的存在對禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的危害,例如AI和雞傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis,IB）此類急性傳染病能導(dǎo)致禽類迅速大批死亡,而禽白血?。ˋvian Leukosis）和馬立克氏?。∕arek’s Disease）此類慢性傳染病則主要導(dǎo)致免疫功能下降和各類腫瘤的發(fā)生。大部分禽類病毒性流行病的防控主要以預(yù)防為主。迄今,尚未見有湖南省內(nèi)養(yǎng)殖禽類主要病毒性流行病的調(diào)查報道。本研究自2018年1月至2019年2月,收集了來自湖南省16個地區(qū),22個養(yǎng)殖場總共225份血清或組織樣品,利用PCR或逆轉(zhuǎn)錄PCR及T-A克隆技術(shù)對影響禽類健康的6種主要病毒性流行病的病原,即禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）、禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）、馬立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）、雞星狀病毒（Chicken Astrovirus,CAstV）和雞腎炎病毒（Avian Nephritis Virus,ANV）的流行和分布情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果在5個養(yǎng)殖場的送檢樣品中檢測出5株AIV,場陽性率為22.73%（5/22）,總體樣品陽性率為8.44%（19/225）;19個養(yǎng)殖場檢測出E亞群ALV（ALV-E）,1個養(yǎng)殖場檢測出ALV-J,1個養(yǎng)殖場檢測出ALV-F,場陽性率分別為90.47%、4.76%和4.76%。此外,發(fā)現(xiàn)了兩株很可能是新亞群的ALV;3個養(yǎng)殖場檢測出強(qiáng)毒型MDV,場陽性率為14.29%（3/21）,總體樣品陽性率為12.18%（19/156）;有2個養(yǎng)殖場檢測出腎型IBV,場陽性率為9.52%（2/21）,總體樣品陽性率為3.21%（5/156）;2個場檢測出CAstV,場陽性率為9.52%（2/21）,總體樣品陽性率為6.41%（10/156）,且這兩株CAstV有可能是新的亞型;1個場檢測出ANV-2,場陽性率為4.76%（1/21）,總體樣品陽性率為0.64%（1/156）。本次對湖南省內(nèi)禽類病毒性流行病的調(diào)查發(fā)現(xiàn),省內(nèi)各地的禽類養(yǎng)殖場普遍存在有ALV-E,需加強(qiáng)對種雞的篩查;而檢測出的5株AIV為H5和H7亞型,說明H5和H7亞型的防控形勢依然嚴(yán)峻;腎型IBV的檢出說明對IBV的預(yù)防應(yīng)重點(diǎn)放在腎型;強(qiáng)毒型MDV的發(fā)現(xiàn)則提示傳統(tǒng)MDV疫苗可能不能提供有效的免疫保護(hù),需要開發(fā)出新型MDV疫苗;而新型ALV、新型CAstV和ANV-2對于禽類的影響還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證,但對養(yǎng)禽業(yè)的潛在危害需要引起重視。本研究對6類主要的禽類病毒性流行病的病原在湖南省禽類養(yǎng)殖場的流行情況進(jìn)行了初步的調(diào)查,為今后的省內(nèi)禽類疾病防治工作提供了基本的參考資料。
范朦朦[10]（2019）在《J亞群禽白血病RT—PGR檢測方法的建立與應(yīng)用及分離毒株序列分析》文中指出禽白血病是一種廣泛存在于肉雞和蛋雞養(yǎng)殖業(yè)中的一種以引起免疫抑制和腫瘤性疾病為主的傳染性疾病[1],以J亞型禽白血?。ˋLV-J）流行最為廣泛,致病力最強(qiáng)[2-3],表現(xiàn)為高帶毒率,低發(fā)病率和低死亡率[4],多引起生長和免疫抑制[5-8],造成生產(chǎn)性能降低[9-10],給我國養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的危害。目前對于禽白血病尚無有效的藥物和疫苗[11],主要通過檢測淘汰帶毒雞來凈化種群,從根源上杜絕該病的傳播。公雞可以通過輸精將病毒傳染給母雞,對公雞進(jìn)行ALV凈化是雞場凈化ALV的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的檢測方法應(yīng)用最為廣泛的有ELISA法、病毒分離法、IFA免疫熒光實(shí)驗(yàn)等,各有優(yōu)缺點(diǎn)。本研究建立了一種RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR）的檢測方法,采樣方便,檢測快速,可以有效地對公雞和母雞進(jìn)行ALV檢測,陽性檢出率相比傳統(tǒng)檢測法更高,該方法經(jīng)過實(shí)踐應(yīng)用取得了良好的效果。試驗(yàn)一:禽白血病病毒在家禽各組織中的表達(dá)定量分析為了了解ALV-J在家禽各組織器官中表達(dá)的規(guī)律,確定檢測ALV的采樣材料,試驗(yàn)對3只ALV-J患病雞進(jìn)行解剖,提取毛囊、心、肝、脾、肺、腎、十二指腸、空回腸、盲腸、胰臟、泄殖腔上皮組織、輸卵管、卵巢、氣管等十四個組織器官的RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進(jìn)行ALV-J的定量檢測分析,結(jié)果顯示,ALV-J在家禽各組織器官均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異,其中以泄殖腔上皮組織、毛囊、輸卵管、卵巢、腎臟等代謝旺盛的部位表達(dá)量最高。試驗(yàn)二:RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用鑒于ALV-J在泄殖腔上皮組織中表達(dá)量最高,本試驗(yàn)使用雞的泄殖腔棉拭子作為ALV-J的檢測材料,建立了一種RT-PCR的檢測方法（逆轉(zhuǎn)錄PCR）法:提取樣本稀釋液中的RNA,再反轉(zhuǎn)錄成cDNA,最后使用ALV-J特異性引物H5、H7進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行凝膠電泳,最后對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。本試驗(yàn)對建立的PCR法進(jìn)行了退火溫度和引物濃度的優(yōu)化,得出最佳退火溫度為58℃,最佳引物濃度為2.4μM。反應(yīng)靈敏性為3.07×102個拷貝數(shù)的病毒。應(yīng)用試驗(yàn)建立的RT-PCR法對某規(guī)?；B(yǎng)雞場內(nèi)蛋雞進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示RT-PCR法陽性檢出率明顯高于ELISA檢測法和病毒分離檢測法。試驗(yàn)三:不同品系種公雞ALV-J感染率檢測接下來使用試驗(yàn)建立的RT-PCR檢測法對某規(guī)?；B(yǎng)殖場飼養(yǎng)條件相同的19個不同品系的種公雞進(jìn)行ALV-J檢測,共檢種公雞1083只,其中陽性共258只,總陽性率為23.82%,而每個品系的陽性率差異很大,從8.33%-58.33%不等。試驗(yàn)四:分離毒株序列分析為了了解雞場內(nèi)流行毒株的遺傳信息,分析毒株來源及毒株遺傳變異情況,本研究對試驗(yàn)二和試驗(yàn)三養(yǎng)殖場進(jìn)行了ALV-J毐株的致病區(qū)env序列分離,和國內(nèi)外ALV-J參考毒株進(jìn)行序列比對分析,構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,所分離到的兩株ALV-J 株和所有ALV-J參考毒株屬于同一個大分支,和A、B、C、D亞群以及內(nèi)源性E亞群不屬于同一分支,表明所分離到的毒株為J亞型ALV而非其他亞型;另外兩株分離株同屬于一個小分支,具有很高的相似性和非常接近的遺傳關(guān)系,而兩個雞場為引種和供種的關(guān)系,由此推測,引種是傳播該病的一個重要因素。試驗(yàn)五:ALV-J感染雞病理剖檢為了了解ALV-J感染引起的臨床病理變化,探究分離毒株的致病力和致病特性,試驗(yàn)對8只疑似ALV-J病死雞進(jìn)行了病理剖檢,觀察了其臨床病理變化,發(fā)現(xiàn)感染了ALV-J的雞分為有明顯癥狀型和無明顯癥狀型。有明顯癥狀型的雞表現(xiàn)為雞冠發(fā)白、龍骨彎曲、肝臟腫大、心臟瘀血、脾臟壞死、肝臟腫瘤、盲腸腫大、胰臟腫瘤、腸系膜腫瘤、肌胃腺胃腫瘤、胸腺扁桃體腫大等;無明顯癥狀型的雞僅表現(xiàn)為肝臟腫大、腎臟腫大、脾臟腫大等,幾乎沒有其他病理變化,也沒有腫瘤的發(fā)生。
二、對禽逆轉(zhuǎn)錄病毒特別是J亞群白血病病毒感染的回顧（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會科學(xué)用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、對禽逆轉(zhuǎn)錄病毒特別是J亞群白血病病毒感染的回顧（論文提綱范文）
（1）K亞群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特異基因表達(dá)及應(yīng)用（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.1.1 ALV病原學(xué) |
| 1.1.2 ALV流行病學(xué) |
| 1.1.3 ALV致病性 |
| 1.1.4 ALV防控現(xiàn)狀與存在問題 |
| 1.2 K亞群禽白血病病毒(ALV-K) |
| 1.2.1 ALV-K的發(fā)現(xiàn) |
| 1.2.2 ALV-K基因結(jié)構(gòu)及特點(diǎn) |
| 1.2.3 ALV-K致病性及危害 |
| 1.2.4 ALV-K在我國雞群感染現(xiàn)狀 |
| 1.3 ALV抗體檢測ELISA研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 ALV-A/B/J抗體檢測ELISA研究進(jìn)展 |
| 1.3.2 ALV-K抗體檢測ELISA研究進(jìn)展 |
| 1.3.3 ALV-K抗體檢測ELISA存在的問題 |
| 1.4 ALV單克隆抗體研究進(jìn)展 |
| 1.4.1 ALV-A/B/J單克隆抗體研究進(jìn)展 |
| 1.4.2 ALV-K單克隆抗體研究進(jìn)展 |
| 1.4.3 ALV-K單克隆抗體研究存在的問題 |
| 1.5 本研究的目的和意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 試驗(yàn)動物 |
| 2.1.2 病毒、細(xì)胞、抗體和試劑 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 2.2.2 K亞群gp85 蛋白原核表達(dá)體系的建立 |
| 2.2.3 間接ELISA檢測抗體方法的建立 |
| 2.2.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗體制備 |
| 2.2.5 ALV-K gp85 蛋白的單克隆抗體制備 |
| 2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 3.1.1 基因序列分析 |
| 3.1.2 目的蛋白分析 |
| 3.2 ALV-K gp85 特異基因的原核表達(dá) |
| 3.2.1 ALV-K gp85 特異基因克隆PCR產(chǎn)物的鑒定 |
| 3.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 |
| 3.2.3 gp85 特異性蛋白的制備及鑒定 |
| 3.3 ALV-K間接ELISA檢測抗體方法的建立 |
| 3.3.1 間接ELISA條件的優(yōu)化 |
| 3.3.2 特異性試驗(yàn) |
| 3.3.3 敏感性試驗(yàn) |
| 3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) |
| 3.3.5 符合率試驗(yàn) |
| 3.3.6 保存期試驗(yàn) |
| 3.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗體制備 |
| 3.4.1 多克隆抗體效價測定 |
| 3.4.2 多克隆抗體的純化及檢測鑒定 |
| 3.4.3 多克隆抗體的識別檢測 |
| 3.5 ALV-K gp85 蛋白的單克隆抗體制備 |
| 3.5.1 ALV-K gp85 蛋白免疫小鼠效價測定 |
| 3.5.2 雜交瘤細(xì)胞融合觀察 |
| 3.5.3 雜交瘤細(xì)胞抗體分泌鑒定 |
| 3.5.4 腹水制備鑒定及應(yīng)用 |
| 4 討論 |
| 4.1 ALV-K gp85 重組蛋白的制備 |
| 4.2 ALV-K間接ELISA檢測抗體方法的建立 |
| 4.3 ALV-K多克隆抗體的制備 |
| 4.4 ALV-K單克隆抗體的制備 |
| 5 結(jié)論 |
| 6 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間取得學(xué)術(shù)成果 |
（2）江蘇地區(qū)家禽4種免疫抑制病病原檢測及致瘤病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立與應(yīng)用（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符號說明 |
| 第一篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.1 雞傳染性貧血 |
| 1.2 馬立克病 |
| 1.3 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥 |
| 1.4 禽白血病 |
| 1.5 我國家禽免疫抑制病病原感染現(xiàn)狀 |
| 2 免疫抑制病病原檢測方法的研究概況 |
| 2.1 病毒分離 |
| 2.2 血清學(xué)檢測技術(shù) |
| 2.3 分子生物學(xué)檢測技術(shù) |
| 3 本研究的目的和意義 |
| 第二篇 試驗(yàn)研究 |
| 第一章 江蘇地區(qū)家禽4種免疫抑制病病原檢測 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料來源 |
| 1.2 毒株來源 |
| 1.3 主要試劑與儀器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.2 樣品處理 |
| 2.3 樣品DNA的提取 |
| 2.4 樣品RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 |
| 2.5 樣品PCR檢測 |
| 2.6 數(shù)據(jù)整理與分析 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 病原的PCR檢測結(jié)果 |
| 3.2 感染類型分析 |
| 3.3 不同日齡雞免疫抑制病病原檢測結(jié)果分析 |
| 3.4 不同品種雞免疫抑制病病原檢測結(jié)果分析 |
| 3.5 江蘇地區(qū)雞2016-2019年免疫抑制病病原檢測結(jié)果分析 |
| 3.6 4種免疫抑制病病原感染間相互作用的比較 |
| 4 討論 |
| 5 小結(jié) |
| 第二章 雞致瘤病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株來源 |
| 1.2 臨床樣品來源 |
| 1.3 主要試劑與儀器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探針的設(shè)計(jì) |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 熒光定量PCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備與鑒定 |
| 2.4 單個熒光定量PCR方法的建立 |
| 2.5 三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立 |
| 2.6 臨床樣品的檢測和驗(yàn)證 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果 |
| 3.2 重組質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果 |
| 3.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 |
| 3.4 單個熒光定量PCR方法的建立 |
| 3.5 三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立 |
| 3.6 臨床樣品的檢測結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 小結(jié) |
| 第三章 兩例疑似腫瘤病雞三重?zé)晒舛縋CR檢測及馬立克病病毒鑒定分析研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 發(fā)病雞背景資料及流行病學(xué)調(diào)查 |
| 1.2 主要試劑與儀器 |
| 2 方法 |
| 2.1 雞致瘤病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測 |
| 2.2 MDV分離培養(yǎng) |
| 2.3 REV和ALV分離培養(yǎng) |
| 2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) |
| 2.5 致病相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增、測序及序列分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 發(fā)病雞的組織病變 |
| 3.2 雞致瘤病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測結(jié)果 |
| 3.3 REV和ALV分離結(jié)果 |
| 3.4 MDV分離結(jié)果 |
| 3.5 間接免疫熒光試驗(yàn) |
| 3.6 致病相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增及序列分析 |
| 4 討論 |
| 5 小結(jié) |
| 全文結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 本文第二章120份臨床病雞樣品的流行病學(xué)背景資料 |
| 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
（3）2017-2019年我國部分省份白羽肉雞ALV-J的分離鑒定及env序列分析（論文提綱范文）
| 符號說明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 病原學(xué) |
| 1.1.1 ALV的形態(tài) |
| 1.1.2 ALV的物理化學(xué)性質(zhì) |
| 1.1.3 ALV基因組結(jié)構(gòu) |
| 1.1.4 ALV 分類 |
| 1.1.5 ALV的變異與重組 |
| 1.1.6 ALV的致病性 |
| 1.2 流行病學(xué) |
| 1.2.1 流行史 |
| 1.2.2 臨床癥狀與病理變化 |
| 1.2.3 傳染源 |
| 1.2.4 易感動物 |
| 1.2.5 傳播途徑 |
| 1.3 病毒的檢測與診斷 |
| 1.3.1 病毒的分離鑒定 |
| 1.3.2 血清學(xué)檢測 |
| 1.4 禽白血病的綜合防控 |
| 1.5 研究目的和意義 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 樣品來源 |
| 2.1.2 細(xì)胞 |
| 2.1.3 主要分子生物學(xué)試劑與試劑盒 |
| 2.1.4 主要儀器 |
| 2.1.5 主要試劑的配制 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 病雞剖檢 |
| 2.2.2 病理組織學(xué)檢查 |
| 2.2.3 血漿樣品采集 |
| 2.2.4 血漿樣品的處理 |
| 2.2.5 DF-1細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) |
| 2.2.6 血漿樣品病毒分離鑒定 |
| 2.2.7 細(xì)胞上清ALV-p27 抗原ELISA檢測方法 |
| 2.2.8 間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn) |
| 2.2.9 病毒RNA提取 |
| 2.2.10 病毒RNA的 RT-PCR |
| 2.2.11 擴(kuò)增產(chǎn)物回收與純化 |
| 2.2.12 PCR產(chǎn)物與T載體連接 |
| 2.2.13 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.2.14 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.15 重組克隆細(xì)菌的篩選 |
| 2.2.16 質(zhì)粒的提取 |
| 2.2.17 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 |
| 2.2.18 陽性克隆的測序與序列分析 |
| 2.2.19 疫苗中外源病毒污染的檢測 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 生產(chǎn)數(shù)據(jù)分析與剖檢記錄 |
| 3.2 臨床癥狀 |
| 3.3 病理觀察 |
| 3.4 病毒分離與P27檢測結(jié)果 |
| 3.5 IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.6 env基因測序 |
| 3.7 本研究分離株之間的同源性分析 |
| 3.8 本研究分離株與參考毒株序列同源性分析 |
| 3.9 遺傳進(jìn)化分析 |
| 3.10 基因序列分析 |
| 3.11 疫苗外源病毒檢測 |
| 4 討論 |
| 4.1 我國部分地區(qū)白羽肉雞群ALV-J的流行病學(xué)調(diào)查 |
| 4.2 我國白羽肉雞群中新發(fā)ALV-J基因組變異分析 |
| 5 結(jié)論 |
| 6 參考文獻(xiàn) |
| 7 致謝 |
（4）廣西不同黃羽肉雞品系種公雞中禽白血病病毒分離鑒定及一株重組毒株基因組解析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文縮寫對照表 |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 ALV研究進(jìn)展 |
| 1.1.1 ALV的形態(tài) |
| 1.1.2 ALV的理化特性 |
| 1.1.3 ALV基因組 |
| 1.1.4 ALV的分類 |
| 1.1.5 ALV-J的發(fā)現(xiàn) |
| 1.1.6 ALV致病性 |
| 1.2 ALV流行病學(xué) |
| 1.2.1 ALV傳播方式 |
| 1.2.2 ALV-J的流行病學(xué)和凈化 |
| 1.2.3 ALV臨床癥狀與病理變化 |
| 1.2.4 ALV檢測和診斷 |
| 1.3 禽白血病研究現(xiàn)狀與展望 |
| 1.4 禽白血病的綜合防控 |
| 1.5 本研究目的與意義 |
| 第二章 廣西地區(qū)不同黃羽肉雞品系種公雞中禽白血病流行病學(xué)調(diào)查 |
| 2.1 材料與試劑 |
| 2.1.1 主要試劑 |
| 2.1.2 細(xì)胞 |
| 2.1.3 主要儀器設(shè)備 |
| 2.1.4 主要試劑及配制方法 |
| 2.1.5 雞群背景及樣品采集 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 血液樣品采集 |
| 2.2.2 血液樣品處理 |
| 2.2.3 DF-1細(xì)胞復(fù)蘇 |
| 2.2.4 血漿樣品病毒分離鑒定 |
| 2.2.5 應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清ALV-p27 抗原 |
| 2.2.6 精液樣品的采集 |
| 2.2.7 精液樣品的處理 |
| 2.2.8 精液樣品接種病毒 |
| 2.2.9 ELISA試劑盒檢測公雞精液ALV-p27 抗原 |
| 2.2.10 部分毒株gp85基因的測序 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.1 以公雞血液為樣品標(biāo)準(zhǔn)的各品系A(chǔ)LV分離鑒定結(jié)果 |
| 2.3.2 以公雞精液為樣品標(biāo)準(zhǔn)的各品系A(chǔ)LV分離鑒定結(jié)果 |
| 2.3.3 分別以血漿樣品和精液樣品實(shí)施病毒分離的結(jié)果對比 |
| 2.3.4 部分分離毒株的gp85序列分析與亞群鑒定 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第三章 ALV-J天然重組毒GXRJ01 株的分離鑒定與基因組分析 |
| 3.1 材料與試劑 |
| 3.1.1 樣品來源 |
| 3.1.2 細(xì)胞 |
| 3.1.3 主要試劑 |
| 3.1.4 主要儀器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 血漿樣品的采集與處理 |
| 3.2.2 用于基因組測序的引物合成 |
| 3.2.3 病毒RNA提取 |
| 3.2.4 病毒RNA的 RT-PCR |
| 3.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收及純化 |
| 3.2.6 PCR產(chǎn)物與T載體連接 |
| 3.2.7 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 3.2.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 3.2.9 重組克隆細(xì)菌的篩選 |
| 3.2.10 質(zhì)粒的提取 |
| 3.2.11 質(zhì)粒的酶切鑒定 |
| 3.2.12 陽性單克隆的測序與序列分析 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.1 血漿樣品細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離結(jié)果 |
| 3.3.2 用于病毒全基因序列測定的毒株 |
| 3.3.3 全基因組序列與其他亞群的序列比對及遺傳進(jìn)化分析 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 小結(jié) |
| 第四章 全文結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文 |
（5）南通地區(qū)禽白血病的流行病學(xué)調(diào)查及其凈化的初步研究（論文提綱范文）
| 摘要 Abstract 符號說明 第1章 禽白血病概述 |
| 1.1 病原學(xué) |
| 1.1.1 ALV的分類 |
| 1.1.2 禽白血病病毒結(jié)構(gòu) |
| 1.1.3 禽白血病病毒對理化因素的抵抗力 |
| 1.1.4 禽白血病病毒的致病性及致病機(jī)理 |
| 1.2 禽白血病的傳播方式與流行情況 |
| 1.3 禽白血病的診斷與檢測 |
| 1.3.1 病毒的分離鑒定 |
| 1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) |
| 1.3.3 免疫熒光技術(shù)(IFA) |
| 1.3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù) |
| 1.3.5 血清型檢測 |
| 1.4 禽白血病的預(yù)防與控制 |
| 1.4.1 免疫接種 |
| 1.4.2 禽白血病抗性雞的培育 |
| 1.4.3 禽白血病凈化 第2章 南通地區(qū)禽白血病的流行病學(xué)調(diào)查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 細(xì)胞和檢測試劑盒 |
| 2.1.2 樣品來源 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.1.4 主要試劑耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病雞樣品檢測 |
| 2.2.2 規(guī)?；u場樣品的檢測 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.3.1 主要病變觀察 |
| 2.3.2 病毒分離間接免疫熒光結(jié)果 |
| 2.3.3 多重PCR鑒定 |
| 2.3.4 env基因PCR擴(kuò)增 |
| 2.3.5 gp85基因序列分析 |
| 2.3.6 gp37基因序列分析 |
| 2.3.7 禽白血病抗體檢測結(jié)果 |
| 2.3.8 禽白血病病毒p27抗原夾心ELISA檢測試劑盒檢測結(jié)果 |
| 2.4 討論 第3章 兩個品系種雞群禽白血病凈化的初步研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 地方種雞群 |
| 3.1.2 細(xì)胞和檢測試劑盒 |
| 3.1.3 主要試劑耗材 |
| 3.1.4 主要儀器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 禽白血病凈化方案的制定 |
| 3.2.2 待檢樣品的采集 |
| 3.2.3 禽白血病病毒p27抗原檢測 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 第一代次種雞群ALV感染情況 |
| 3.3.2 第二代次種雞群ALV感染情況 |
| 3.3.3 第三代次種雞群ALV感染情況 |
| 3.3.4 雞群初步凈化效果 |
| 3.4 討論 全文總結(jié) 參考文獻(xiàn) 致謝 |
（6）雞circRNA2420-Bcl11b介導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控ALV-J感染的作用機(jī)制（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符號說明 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 禽白血病研究進(jìn)展 |
| 1.1.1 禽白血病概況 |
| 1.1.2 禽白血病病毒研究進(jìn)展 |
| 1.1.3 禽白血病臨床診斷 |
| 1.1.4 J亞群禽白血病病毒致病與致瘤機(jī)制 |
| 1.1.5 禽白血病的防控措施 |
| 1.2 Bcl11b的研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 BCL(B-cell lymphoma/leukemia)家族 |
| 1.2.2 BCL11B的結(jié)構(gòu)與功能 |
| 1.2.3 BCL11B在血液系統(tǒng)腫瘤中的功能 |
| 1.2.4 BCL11B與其他惡性腫瘤的關(guān)系 |
| 1.2.5 家禽中BCL11基因研究進(jìn)展 |
| 1.3 CircRNA研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 CircRNA形成機(jī)制 |
| 1.3.2 CircRNA的生物學(xué)功能 |
| 1.3.3 CircRNA與腫瘤的關(guān)系 |
| 1.3.4 CircRNA在家禽上的研究進(jìn)展 |
| 1.4 本研究的目的與意義 |
| 第2章 ALV-J感染相關(guān)轉(zhuǎn)錄本及互作關(guān)系篩選 |
| 2.1 材料與方法 |
| 2.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.1.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.2 結(jié)果與分析 |
| 2.2.1 雞轉(zhuǎn)錄本特征分析 |
| 2.2.2 感染組與非感染組差異表達(dá)分析 |
| 2.2.3 ALV-J感染相關(guān)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本功能注釋與富集 |
| 2.2.4 ALV-J感染相關(guān)互作網(wǎng)絡(luò)分析與構(gòu)建 |
| 2.2.5 ALV-J感染關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄本驗(yàn)證 |
| 2.3 討論 |
| 2.3.1 雞轉(zhuǎn)錄本特征比較 |
| 2.3.2 ALV-J感染相關(guān)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本聯(lián)合分析 |
| 2.3.3 功能富集分析 |
| 2.3.4 ceRNA互作及共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 |
| 2.3.5 ALV-J感染致病致瘤候選轉(zhuǎn)錄本鑒定 |
| 第3章 雞Bcl11b基因克隆、表達(dá)及功能初步分析 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 3.1.2 試驗(yàn)方法 |
| 3.2 結(jié)果與分析 |
| 3.2.1 雞Bcl11b基因CDS克隆與序列分析 |
| 3.2.2 雞Bcl11b基因表達(dá)規(guī)律分析 |
| 3.2.3 雞Bcl11b基因過表達(dá)對細(xì)胞活力、凋亡及周期的影響 |
| 3.2.4 雞Bcl11b基因干擾對細(xì)胞凋亡及周期的影響 |
| 3.2.5 Bcl11b在ALV-J感染過程的作用 |
| 3.3 討論 |
| 第4章 雞Bcl11b調(diào)控ALV-J感染的作用機(jī)制 |
| 4.1 材料與方法 |
| 4.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 4.1.2 試驗(yàn)方法 |
| 4.2 結(jié)果與分析 |
| 4.2.1 雞Bcl11b 3'UTR獲取 |
| 4.2.2 靶向雞Bcl11b 3'UTR的miRNAs預(yù)測及鑒定 |
| 4.2.3 miRNAs靶向雞Bcl11b基因參與ALV-J的感染 |
| 4.2.4 circRNA_2420-miRNA-Bcl11b網(wǎng)絡(luò)關(guān)系驗(yàn)證 |
| 4.2.5 雞Bcl11b在基因組上結(jié)合位點(diǎn)分析 |
| 4.2.6 Bcl11b基因調(diào)控模式圖 |
| 4.3 討論 |
| 4.3.1 miRNA靶向Bcl11b調(diào)節(jié)ALV-J的感染過程 |
| 4.3.2 家禽circRNA成環(huán)機(jī)制 |
| 4.3.3 circRNA_2420作為ceRNA靶向雞Bcl11b調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡 |
| 4.3.4 轉(zhuǎn)錄因子Bcl11b靶基因分析 |
| 全文結(jié)論 |
| 主要創(chuàng)新點(diǎn) |
| 進(jìn)一步研究設(shè)想 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果 |
| 致謝 |
（7）J亞群禽白血病病毒誘導(dǎo)雞免疫耐受的致病機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 符號說明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 禽白血病病毒概述 |
| 1.1.1 ALVs家族及亞群 |
| 1.1.2 ALVs的結(jié)構(gòu)特征 |
| 1.1.3 ALVs的理化特征 |
| 1.1.4 ALV-J的實(shí)驗(yàn)室宿主系統(tǒng) |
| 1.1.5 ALV-J的致病性 |
| 1.2 禽白血病病毒對免疫系統(tǒng)的損傷及其誘導(dǎo)的免疫耐受 |
| 1.2.1 ALVs對免疫系統(tǒng)損傷的研究進(jìn)展 |
| 1.2.2 ALV-J誘導(dǎo)的免疫耐受 |
| 1.2.3 與免疫耐受相關(guān)的幾個概念 |
| 1.3 雞免疫器官特點(diǎn)及B細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子機(jī)制 |
| 1.3.1 雞免疫器官的組成及發(fā)育特點(diǎn) |
| 1.3.1.1 雞T細(xì)胞的發(fā)育及分化 |
| 1.3.1.2 雞B細(xì)胞的發(fā)育及分化 |
| 1.3.2 B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫及免疫球蛋白產(chǎn)生的分子機(jī)制 |
| 1.3.2.1 B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫 |
| 1.3.2.2 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) |
| 1.3.2.3 免疫球蛋產(chǎn)生的分子機(jī)制 |
| 1.4 BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及Lyn介導(dǎo)B細(xì)胞無能和耐受的分子機(jī)制 |
| 1.4.1 B細(xì)胞抗原受體及BCR信號通路 |
| 1.4.2 Lyn在 BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的正調(diào)控及負(fù)調(diào)控作用 |
| 1.4.3 Lyn介導(dǎo)B細(xì)胞無能和免疫耐受的機(jī)制 |
| 1.4.3.1 無能B細(xì)胞的生物學(xué)特征 |
| 1.4.3.2 Lyn介導(dǎo)B細(xì)胞無能和免疫耐受的分子機(jī)制 |
| 1.5 本研究的目的與意義 |
| 2.材料與方法 |
| 2.1 主要檢測試劑及耗材 |
| 2.2 主要緩沖液 |
| 2.3 抗體 |
| 2.4 細(xì)胞及病毒 |
| 2.4.1 DF-1 細(xì)胞的培養(yǎng)傳代與凍存 |
| 2.4.2 DT40 細(xì)胞的培養(yǎng)傳代與凍存 |
| 2.4.3 雞B淋巴細(xì)胞祖細(xì)胞的分選與培養(yǎng) |
| 2.4.4 細(xì)胞的病毒感染 |
| 2.4.5 病毒TCID50的檢測 |
| 2.5 主要儀器與設(shè)備 |
| 2.6 ALV-J先天感染免疫耐受雞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/td> |
| 2.6.1 先天感染模型 |
| 2.6.2 后天感染模型 |
| 2.6.3 ALV-J p27 抗原的檢測 |
| 2.6.4 抗ALV-J抗體的檢測 |
| 2.7 雞免疫器官病理組織學(xué)觀察 |
| 2.8 免疫組化檢測 |
| 2.9 免疫球蛋白及相關(guān)抗體水平ELISA檢測 |
| 2.9.1 雞血液總免疫球蛋白水平的ELISA檢測 |
| 2.9.2 雞血液抗SRBC抗體及抗MDV抗體水平的ELISA檢測 |
| 2.10 B細(xì)胞中Lyn的 shRNA干擾 |
| 2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測 |
| 2.11.1 法氏囊內(nèi)B細(xì)胞祖細(xì)胞發(fā)育和分化的檢測 |
| 2.11.2 IgM及IgG細(xì)胞比例及B細(xì)胞內(nèi)Ig基因CSR的流式細(xì)胞術(shù)檢測 |
| 2.11.3 B細(xì)胞中Lyn及 Syk的磷酸化蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測 |
| 2.11.4 B細(xì)胞Ca2+流的流式細(xì)胞術(shù)檢測 |
| 2.12 細(xì)胞增殖的CCK-8 檢測 |
| 2.13 熒光定量PCR |
| 2.13.1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 |
| 2.13.2 熒光定量PCR |
| 2.14 蛋白質(zhì)免疫印跡 |
| 2.15 統(tǒng)計(jì)分析 |
| 3.結(jié)果與分析 |
| 3.1 ALV-J免疫耐受雞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/td> |
| 3.2 ALV-J感染雞免疫器官病變特點(diǎn) |
| 3.3 ALV-J胚內(nèi)感染對早期B細(xì)胞發(fā)育的影響 |
| 3.4 ALV-J胚內(nèi)感染對雞體內(nèi)Ig M型和IgG型 B細(xì)胞的影響 |
| 3.5 ALV-J感染對雞特異性體液免疫應(yīng)答能力的影響 |
| 3.6 ALV-J胚內(nèi)感染對生發(fā)中心B細(xì)胞活化及擴(kuò)增的影響 |
| 3.7 ALV-J對不同發(fā)育階段B細(xì)胞的嗜性 |
| 3.8 ALV-J胚內(nèi)感染對CD117~+祖 B細(xì)胞分化的影響 |
| 3.9 ALV-J對CD117~+祖 B細(xì)胞體外增殖的影響 |
| 3.10 ALV-J對CD117~+祖 B細(xì)胞體外分化與成熟的影響 |
| 3.11 ALV-J對CD117~+祖 B細(xì)胞Ig基因類別轉(zhuǎn)換重組的影響 |
| 3.12 感染型DF-1 細(xì)胞中Lyn的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測結(jié)果驗(yàn)證 |
| 3.13 ALV-J感染對法氏囊細(xì)胞中Lyn表達(dá)水平的影響 |
| 3.14 ALV-J對 B細(xì)胞中Lyn的表達(dá)水平的影響 |
| 3.15 ALV-J對 B細(xì)胞中Lyn磷酸化水平的影響 |
| 3.16 ALV-J感染對雞法氏囊細(xì)胞Lyn及 Syk磷酸化水平的影響 |
| 3.17 Lyn shRNA干擾B細(xì)胞中Lyn蛋白表達(dá)水平 |
| 3.18 Lyn shRNA干擾B細(xì)胞中Lyn及 Syk的磷酸化水平 |
| 3.19 ALV-J感染對B細(xì)胞Ca2+流的影響 |
| 4.討論 |
| 4.1 ALV-J先天感染誘導(dǎo)免疫耐受的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制 |
| 4.1.1 B細(xì)胞發(fā)育障礙與ALV-J感染誘導(dǎo)的免疫耐受直接相關(guān) |
| 4.1.2 祖B細(xì)胞克隆無能是ALV-J誘導(dǎo)免疫耐受的重要因素 |
| 4.2 ALV-J誘導(dǎo)B細(xì)胞無能的分子機(jī)制 |
| 4.2.1 ALV-J感染導(dǎo)致BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白Lyn異常表達(dá) |
| 4.2.2 ALV-J激活了Lyn在 BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的負(fù)調(diào)控作用 |
| 5.結(jié)論 |
| 6.參考文獻(xiàn) |
| 7.致謝 |
| 8.攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況 |
（8）抗A亞群禽白血病病毒單克隆抗體的研制與不同試劑盒臨床檢測差異性分析（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符號說明 |
| 計(jì)量單位 |
| 禽白血病概述 |
| 1 禽白血病病毒的基本形態(tài)及特性 |
| 1.1 病毒的分類 |
| 1.2 病毒的基因組結(jié)構(gòu) |
| 1.3 病毒的理化特性 |
| 1.4 病毒的細(xì)胞受體 |
| 1.5 病毒的致病性及致病機(jī)理 |
| 2 禽白血病的流行狀況 |
| 2.1 傳播方式 |
| 2.2 流行現(xiàn)狀 |
| 3 禽白血病的診斷與檢測 |
| 3.1 病毒的分離鑒定 |
| 3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) |
| 3.3 免疫熒光技術(shù) |
| 3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù) |
| 3.5 血清型診斷 |
| 4 禽白血病的預(yù)防與控制 |
| 5 本研究的目的和意義 |
| 研究內(nèi)容一 抗A亞群禽白血病病毒單克隆抗體的研制與鑒定 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 病毒與細(xì)胞來源 |
| 1.2 菌株與載體 |
| 1.3 主要試劑及材料 |
| 1.4 主要儀器 |
| 1.5 主要試劑配制 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 目的片段的擴(kuò)增 |
| 2.1.1 病毒擴(kuò)增與TCID_(50)測定 |
| 2.1.2 細(xì)胞基因組DNA的提取 |
| 2.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 |
| 2.1.4 目的片段的擴(kuò)增 |
| 2.2 目的片段的克隆 |
| 2.2.1 目的片段的回收 |
| 2.2.2 回收產(chǎn)物與pGEM-T-easy的連接 |
| 2.2.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a |
| 2.2.4 陽性克隆的鑒定 |
| 2.3 原核表達(dá)載體PET32a-AH10-gp85的構(gòu)建 |
| 2.3.1 目的基因和表達(dá)載體PET-32a的酶切及回收 |
| 2.3.2 目的片段和表達(dá)載體PET-32a的連接 |
| 2.3.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞 |
| 2.3.4 陽性克隆的鑒定 |
| 2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.4.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.4.2 菌體的超聲波裂解 |
| 2.4.3 重組蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.4.4 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 |
| 2.4.5 重組蛋白的大量表達(dá) |
| 2.5 重組蛋白的純化和鑒定 |
| 2.5.1 重組蛋白的純化 |
| 2.5.2 包涵體的復(fù)性 |
| 2.5.3 重組蛋白western-blot分析 |
| 2.6 單克隆抗體的制備 |
| 2.6.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞及病毒 |
| 2.6.2 主要試劑耗材及儀器 |
| 2.6.3 免疫原的準(zhǔn)備 |
| 2.6.4 實(shí)驗(yàn)動物的免疫 |
| 2.6.5 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 |
| 2.6.6 小鼠脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備 |
| 2.6.7 細(xì)胞融合 |
| 2.7 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆 |
| 2.8 單克隆抗體亞類的鑒定 |
| 2.9 單克隆抗體腹水的制備 |
| 2.10 單克隆抗體的特異性鑒定 |
| 2.11 Western blot鑒定單抗的反應(yīng)性 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 目的基因的擴(kuò)增 |
| 3.2 重組質(zhì)粒PET32a-AH10-gp85的雙酶切鑒定 |
| 3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 3.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 |
| 3.5 純化蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.6 重組蛋白的western-blot分析 |
| 3.7 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選 |
| 3.8 單克隆抗體的特性鑒定 |
| 3.8.1 單克隆抗體的亞類鑒定 |
| 3.8.2 單克隆抗體的特異性鑒定 |
| 3.8.3 單克隆抗體的生物活性鑒定 |
| 4 討論與小結(jié) |
| 研究內(nèi)容二 不同試劑盒檢測禽白血病效果差異性分析 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1 主要試劑和儀器 |
| 2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 樣品采集與病毒分離 |
| 2.2 ELISA檢測處理后樣本 |
| 2.3 病毒基因組提取及PCR檢測 |
| 2.4 RT-PCR檢測活雞差異樣本 |
| 2.5 間接免疫熒光檢測 |
| 3 結(jié)果與分析 |
| 3.1 ELISA檢測結(jié)果 |
| 3.2 PCR檢測結(jié)果 |
| 3.3 RT-PCR檢測結(jié)果 |
| 3.4 IFA檢測結(jié)果 |
| 4 討論與小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（9）湖南省養(yǎng)殖禽類主要病毒性流行病初步調(diào)查（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 緒論 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.1.1 禽流感病毒的病原學(xué) |
| 1.1.2 禽流感病毒的流行趨勢 |
| 1.1.3 禽流感病毒的感染途徑及傳播方式 |
| 1.1.4 禽流感病毒的檢測方法 |
| 1.2 禽白血病病毒概述 |
| 1.2.1 禽白血病病毒的病原學(xué) |
| 1.2.2 禽白血病病毒在養(yǎng)殖雞群中的流行趨勢 |
| 1.2.3 禽白血病病毒的傳播方式 |
| 1.2.4 禽白血病病毒的致病機(jī)理 |
| 1.2.5 禽白血病病毒的檢測方法 |
| 1.3 其余常見禽類病毒 |
| 1.3.1 馬立克氏病病毒 |
| 1.3.2 雞傳染性支氣管炎病毒 |
| 1.3.3 雞星狀病毒與雞腎炎病毒 |
| 1.4 本課題研究目的及方案 |
| 第2章 湖南省禽流感病毒的流行病學(xué)調(diào)查及遺傳進(jìn)化分析 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 樣品采集與處理 |
| 2.2.2 病毒核酸提取 |
| 2.2.3 病毒RNA反轉(zhuǎn)錄 |
| 2.2.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增及引物 |
| 2.2.5 目的片段膠回收 |
| 2.2.6 目的片段T-A克隆測序 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.1 禽流感病毒檢測結(jié)果 |
| 2.3.2 YY1801 株全基因組分析 |
| 2.3.3 4株H5 亞型AIV全基因組分析 |
| 2.4 總結(jié)與討論 |
| 第3章 湖南省禽白血病病毒的流行病學(xué)調(diào)查及基因組遺傳進(jìn)化分析 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 病毒核酸提取 |
| 3.2.2 病毒RNA反轉(zhuǎn)錄 |
| 3.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增及引物 |
| 3.2.4 目的片段膠回收 |
| 3.2.5 目的片段T-A克隆測序 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.3.1 樣品PCR檢測結(jié)果 |
| 3.3.2 env基因擴(kuò)增與序列分析 |
| 3.3.3 XXYI181104株env基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.4 XTLI18100110/209/214 三株env基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.5 XTLI18100110/209/214株env基因的重組分析 |
| 3.4 總結(jié)與討論 |
| 第4章 IBV、MDV和禽星狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查 |
| 4.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 4.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 4.2.1 病毒核酸提取 |
| 4.2.2 病毒RNA反轉(zhuǎn)錄 |
| 4.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增及引物 |
| 4.2.4 目的片段膠回收 |
| 4.2.5 目的片段T-A克隆測序 |
| 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.3.1 MDV檢測結(jié)果及分析 |
| 4.3.2 IBV檢測結(jié)果及分析 |
| 4.3.3 雞星狀病毒與雞腎炎病毒檢測結(jié)果及分析 |
| 4.4 總結(jié)與討論 |
| 結(jié)論與展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 攻讀碩士學(xué)位期間參與發(fā)表論文 |
| 致謝 |
（10）J亞群禽白血病RT—PGR檢測方法的建立與應(yīng)用及分離毒株序列分析（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 摘要 |
| 1 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 禽白血病概述 |
| 1.2 禽白血病的發(fā)展史 |
| 1.3 禽白血病病原分類 |
| 1.4 J亞群禽白血病簡介 |
| 1.5 病原學(xué) |
| 1.5.1 病毒形態(tài) |
| 1.5.2 生物學(xué)特性 |
| 1.5.3 基因組結(jié)構(gòu) |
| 1.5.4 外源性和內(nèi)源性ALV |
| 1.6 禽白血病流行病學(xué)特點(diǎn) |
| 1.6.1 傳染源 |
| 1.6.2 宿主范圍 |
| 1.6.3 傳播途徑 |
| 1.7 禽白血病的危害 |
| 1.8 臨床癥狀及病理變化 |
| 1.9 ALV的診斷與檢測技術(shù) |
| 1.9.1 ELISA檢測法 |
| 1.9.2 病毒分離法 |
| 1.9.3 PCR檢測法 |
| 1.9.4 RT-PCR檢測法 |
| 1.9.5 熒光定量PCR檢測法 |
| 1.9.6 IFA法 |
| 1.9.7 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) |
| 1.10 禽白血病的防治 |
| 1.11 本研究的目的及意義 |
| 2 試驗(yàn)一：禽白血病病毒在家禽各組織中的表達(dá)定量分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 試劑 |
| 2.2.3 引物 |
| 2.2.4 試驗(yàn)儀器與設(shè)備 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 樣本cDNA的制備 |
| 2.3.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 |
| 2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 |
| 2.3.4 定量分析 |
| 2.4 試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.5 討論與小結(jié) |
| 2.5.1 討論 |
| 2.5.2 小結(jié) |
| 3 試驗(yàn)二：RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 試驗(yàn)材料 |
| 3.2.1 試驗(yàn)材料 |
| 3.2.2 樣本采集與保存 |
| 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 |
| 3.3 試驗(yàn)方法 |
| 3.3.1 RT-PCR檢測法試驗(yàn)步驟 |
| 3.3.2 ELISA檢測法 |
| 3.3.3 病毒分離檢測法 |
| 3.4 試驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.4.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 |
| 3.4.2 不同樣本PT-PCR檢測結(jié)果比較 |
| 3.4.3 RT-PCR靈敏性試驗(yàn) |
| 3.4.4 PCR法重復(fù)性驗(yàn)證 |
| 3.4.5 PCR法與ELISA法檢測結(jié)果比較 |
| 3.4.6 ALV-J不同檢測方法結(jié)果比較 |
| 3.4.7 RT-PCR法準(zhǔn)確率評估 |
| 3.5 討論與小結(jié) |
| 3.5.1 討論 |
| 3.5.2 小結(jié) |
| 4 實(shí)驗(yàn)三：不同品系種公雞ALV-J感染率檢測 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 試驗(yàn)結(jié)果 |
| 4.3 討論與小結(jié) |
| 4.3.1 討論 |
| 4.3.2 小結(jié) |
| 5 實(shí)驗(yàn)四 分離毒株序列分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 試驗(yàn)材料 |
| 5.2.2 試驗(yàn)試劑 |
| 5.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 DF-1細(xì)胞病毒增殖 |
| 5.3.2 ELISA檢測 |
| 5.3.3 目的片段的擴(kuò)增 |
| 5.3.4 引物 |
| 5.3.5 參考毒株 |
| 5.4 結(jié)果 |
| 5.4.1 HNlk-01毒株序列分析 |
| 5.4.2 HNzz-01毒株序列分析 |
| 5.4.3 HNlk-01與HNzz-01遺傳進(jìn)化樹分析 |
| 5.5 討論與小結(jié) |
| 5.5.1 討論 |
| 5.5.2 小結(jié) |
| 6 實(shí)驗(yàn)五：ALV感染雞病理剖檢 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料與方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 引物 |
| 6.2.3 方法 |
| 6.2.4 試驗(yàn)儀器與設(shè)備 |
| 6.3 試驗(yàn)結(jié)果 |
| 6.3.1 病理變化剖檢結(jié)果 |
| 6.3.2 ALV-J PCR 擴(kuò)增結(jié)果 |
| 6.4 討論與小結(jié) |
| 6.4.1 討論 |
| 6.4.2 小結(jié) |
| 7 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| ABSTRACT |
| 附錄 |
四、對禽逆轉(zhuǎn)錄病毒特別是J亞群白血病病毒感染的回顧（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]K亞群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特異基因表達(dá)及應(yīng)用[D]. 王呈呈. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2021
- [2]江蘇地區(qū)家禽4種免疫抑制病病原檢測及致瘤病毒三重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立與應(yīng)用[D]. 閆彩虹. 揚(yáng)州大學(xué), 2020(04)
- [3]2017-2019年我國部分省份白羽肉雞ALV-J的分離鑒定及env序列分析[D]. 欒秀敏. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020(02)
- [4]廣西不同黃羽肉雞品系種公雞中禽白血病病毒分離鑒定及一株重組毒株基因組解析[D]. 崔真毓. 廣西大學(xué), 2020(02)
- [5]南通地區(qū)禽白血病的流行病學(xué)調(diào)查及其凈化的初步研究[D]. 趙震東. 揚(yáng)州大學(xué), 2020
- [6]雞circRNA2420-Bcl11b介導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控ALV-J感染的作用機(jī)制[D]. 仇玲玲. 揚(yáng)州大學(xué), 2020(01)
- [7]J亞群禽白血病病毒誘導(dǎo)雞免疫耐受的致病機(jī)制研究[D]. 何書海. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019(01)
- [8]抗A亞群禽白血病病毒單克隆抗體的研制與不同試劑盒臨床檢測差異性分析[D]. 沈習(xí). 揚(yáng)州大學(xué), 2019
- [9]湖南省養(yǎng)殖禽類主要病毒性流行病初步調(diào)查[D]. 呂孫良. 湖南大學(xué), 2019(01)
- [10]J亞群禽白血病RT—PGR檢測方法的建立與應(yīng)用及分離毒株序列分析[D]. 范朦朦. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019(04)
標(biāo)簽：白血病論文; 抗原抗體反應(yīng)論文; 抗原抗體論文; 細(xì)胞免疫論文; 基因合成論文;