一、熒光定量PCR技術(shù)測定HBV-DNA與乙肝血清學(xué)標(biāo)志分析比較（論文文獻(xiàn)綜述）
李茂仕[1]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情評估和耐藥監(jiān)測中的應(yīng)用》文中提出背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共衛(wèi)生問題,肝細(xì)胞內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（ccc DNA）是HBV難以徹底清除進(jìn)而引起不同臨床結(jié)局的根本原因,但因檢測需依賴肝活檢而難以臨床普及;雖然外周血中無法直接檢測ccc DNA,但可通過其他血清指標(biāo)來反映ccc DNA的變化。目前,核苷（酸）類似物（NAs）是主要的抗HBV治療手段,但并不能直接清除ccc DNA,絕大部分的慢性HBV感染者均需長期用藥。盡管高耐藥屏障NAs使用后發(fā)生耐藥的幾率較前大為減少,但因HBV突變的必然性和復(fù)雜性,耐藥株的出現(xiàn)實(shí)際上是NAs長期治療不可避免的臨床問題。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA僅由ccc DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生且不受NAs治療的影響,可較為真實(shí)反映肝內(nèi)ccc DNA的表達(dá)情況。然而,HBV RNA檢測尚無公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法,其在慢性HBV感染者病情評估以及在NAs治療耐藥監(jiān)測中的臨床價(jià)值尚缺乏針對性研究。我們首先使用微滴數(shù)字PCR（dd PCR）技術(shù)建立了定量檢測血清HBV RNA的方法,并使用商業(yè)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行對比評估以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。然后我們觀察了未治的慢性HBV感染者不同臨床表型的血清HBV RNA水平,并追蹤分析了恩替卡韋初治但在隨訪過程中發(fā)生了基因型耐藥（GR）和部分病毒學(xué)應(yīng)答（PVR）患者血清HBV RNA的動力學(xué)特征以及耐藥突變情況,以期為血清HBV RNA應(yīng)用于慢性HBV感染者病情評估以及監(jiān)測耐藥突變提供新的依據(jù)。方法:1.獲取治療和未治療的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法檢測血清HBV RNA水平,使用直線回歸分析和Bland-Altman分析兩種方法的相關(guān)性和一致性;以1例高濃度的HBV RNA樣本進(jìn)行梯度稀釋,兩種檢測方法平行進(jìn)行測定,每個(gè)梯度重復(fù)5次以明確兩種方法的重復(fù)性,敏感性。2.根據(jù)常見臨床指標(biāo)將149例未治的慢性HBV感染者分為HBe Ag陽性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag陽性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag陰性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag陽性伴ALT升高（ENEA）等4種臨床表型。使用q PCR法檢測血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA陰性的患者中實(shí)施肝活檢。使用單因素logistics回歸分析探討HBe Ag陰性患者中與ALT升高相關(guān)的危險(xiǎn)因素。3.以31例HBe Ag陰性、HBV DNA陽性、ALT正常或者輕度異常（<2倍正常參考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者為研究對象,檢測其血清HBV RNA水平,肝活檢Scheuer評分系統(tǒng)對肝臟炎癥評分（G）≥2判定為顯著性肝炎,以受試者工作曲線（ROC）探討血清HBV RNA水平在鑒別顯著性肝炎中的價(jià)值。4.在我院肝炎數(shù)據(jù)庫中篩選出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持續(xù)抗病毒治療過程中被檢出GR的患者3例以及未檢出耐藥的PVR患者2例。耐藥突變的信息是采用一代測序針對血清HBV DNA檢測得到。調(diào)取生物樣本庫中該患者從初治到隨訪終點(diǎn)之間的血清樣本,以dd PCR方法檢測血清HBV RNA水平,觀察其與HBs Ag、HBV DNA動態(tài)變化的特征,并使用三代測序技術(shù)（TGS）對部分隨訪點(diǎn)的血清HBV RNA的反轉(zhuǎn)錄區(qū)進(jìn)行耐藥突變的長期監(jiān)測。結(jié)果1.兩種血清HBV RNA檢測方法在未治療組和治療組中的直線回歸系數(shù)（R2）分別為0.912和0.874,95%一致性界限分別為（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀釋實(shí)驗(yàn)顯示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L時(shí)檢出率均為100%,CV值分別介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L時(shí),隨著梯度稀釋倍數(shù)的增加,檢出率逐漸下降,最低檢測下限（LLo D）分別約為61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可測結(jié)果和稀釋倍數(shù)之間存在顯著性線性相關(guān),R2分別為0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四種臨床表型的可測血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分別為6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型為主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag陽性表型（EPNA和EPEA）為主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA與血清HBV DNA顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,兩者沒有顯著性相關(guān)關(guān)系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA與HBs Ag呈現(xiàn)顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag陰性表型中則無此顯著相關(guān)性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是與HBe Ag陰性患者ALT升高相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,比值比（OR）分別為2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平則處于接近于顯著性的狀態(tài)（P=0.053）。7例血清HBV DNA陰性,但RNA陽性的患者肝組織活檢均顯示為中度或重度肝臟炎癥（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鑒別HBe Ag陰性、DNA陽性、ALT正常或者輕度異常（<2×ULN）患者顯著性肝炎的能力,受試者工作曲線下面積（AUC）為0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA則不具有這種能力（P=0.248）。根據(jù)最大優(yōu)登指數(shù)得出HBV RNA用于鑒別肝臟顯著性炎癥的最佳截?cái)嘀禐?.81 log10 copies/m L,此時(shí)敏感度73.7%,特異度66.7%,準(zhǔn)確度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分別在其抗病毒治療第208、186及142周時(shí)檢測出了耐藥突變,在這時(shí)間點(diǎn)之前,3例患者血清HBV RNA持續(xù)>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我們觀測的抗病毒治療期間HBV RNA持續(xù)>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在換用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分別在此之后的26、22周時(shí)下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平則分別從4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag則幾乎沒有變化(分別上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT區(qū)耐藥位點(diǎn)突變結(jié)果與HBV DNA的耐藥位點(diǎn)檢測結(jié)果是一致的。利用三代測序技術(shù)對HBV RNA RT區(qū)長期監(jiān)測發(fā)現(xiàn),患者GR1和GR3在耐藥發(fā)生之前沒有觀測到常見耐藥位點(diǎn)的突變,而GR2患者則從初治開始就具備rt L180M+M204I突變。結(jié)論:1.我們使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量檢測方法,低濃度血清樣本的檢出是困難的,但可以增加重復(fù)檢測次數(shù)來改善;2.血清HBV RNA在不同臨床表型中的水平存在差異,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的評估。血清HBV RNA與血清HBV DNA均是未治HBe Ag陰性患者ALT升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,因此在血清HBV DNA陰性患者中檢測HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可補(bǔ)充HBV DNA用于反映肝臟炎癥;3.在未經(jīng)治療的正?；蛘咻p度ALT異常（ALT<2×ULN）的HBe Ag陰性患者中,血清HBV RNA可以用來判定肝臟炎癥程度但HBV DNA不具備這樣的能力,因此這部分患者可通過血清HBV RNA水平作為啟動抗病毒治療的依據(jù);4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA測序分析適合用于長期監(jiān)測慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒療效和基因耐藥突變的發(fā)生。總之,血清HBV RNA作為一個(gè)病毒學(xué)指標(biāo),可在血清HBV DNA陰性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag陰性患者中用于肝臟炎癥的評估;血清HBV RNA也適合用于持續(xù)NAs治療患者抗病毒療效的評估以及耐藥突變的長期監(jiān)測,進(jìn)而幫助臨床醫(yī)師為患者制定個(gè)體化管理和治療策略提供參考依據(jù)。
王睿君[2]（2021）在《乙肝疫苗免疫對隱匿性HBV感染持久保護(hù)性的人群分析及HBV早期暴露影響乙肝疫苗抗原特異性濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的作用研究》文中研究表明人群中的研究已證明:在新生兒期接種乙肝疫苗,能有效預(yù)防慢性乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染,兒童的乙肝表面抗原（hepatitis B Surface Antigen,HBsAg）流行率已顯著下降,HBV感染所導(dǎo)致的青少年人群的肝細(xì)胞癌發(fā)病及死亡風(fēng)險(xiǎn)也明顯降低。但疫苗免疫后10-15年,由乙肝疫苗免疫所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗乙肝表面抗原的保護(hù)性抗體（Antibodies against hepatitis B surface antigen,anti-HBs）消失。盡管國內(nèi)外學(xué)者在人群中已開展了多項(xiàng)乙肝疫苗的試驗(yàn)性加強(qiáng)免疫測試,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在anti-HBs陰性的乙肝疫苗接種者中,加強(qiáng)免疫能促進(jìn)anti-HBs產(chǎn)生,但這僅表示機(jī)體存在針對HBsAg的回憶性抗體應(yīng)答,而非抗病毒免疫力存在的直接證據(jù)。與很多腫瘤一樣,肝細(xì)胞癌通常高發(fā)于成人,多種因素可促進(jìn)HBV感染者的肝癌發(fā)生,已有分析發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)在隱匿性HBV感染（occulthepatitis B virus infection,OBI）者中也顯著增加。國內(nèi)外已有的研究發(fā)現(xiàn):疫苗接種人群中存在OBI狀態(tài)。部分出生于HBsAg（+）母親的兒童,在新生兒期已接種乙肝疫苗且在兒童期獲得完全保護(hù)后,在成年后出現(xiàn)HBV感染狀態(tài),包括OBI狀態(tài)。因此,有必要分析新生兒乙肝疫苗免疫后所誘導(dǎo)的保護(hù)作用的持久性,及影響保護(hù)性抗體生成的可能原因。本研究工作包括兩個(gè)部分:第一部分:新生兒期接種乙肝疫苗后對隱匿性HBV感染保護(hù)作用持久性的人群分析（論著已發(fā)表）背景與目的:乙肝病毒核心抗體（Antibodies against hepatitis B core antigen,anti-HBc）陽性狀態(tài)提示既往可能接觸過HBV,但在anti-HBc（+）者的外周血中可檢測到HBV DNA片段,提示存在可能的OBI狀態(tài)。國內(nèi)外已有的研究發(fā)現(xiàn),在乙肝疫苗免疫者HBsAg（-）/anti-HBc（+）體內(nèi)能檢測到HBVDNA,表明部分疫苗免疫者可能有OBI的發(fā)生。由于OBI與多種慢性肝臟疾病包括肝細(xì)胞肝癌相關(guān),因此,確定新生兒乙肝疫苗對成年人群的OBI預(yù)防效果至關(guān)重要。江蘇啟東縣曾是我國HBV高流行地區(qū),為研究新生兒期接種乙肝疫苗對HBV相關(guān)的肝臟疾病及肝癌的保護(hù)作用,本團(tuán)隊(duì)于1983-1990年在啟東縣開展了啟東乙肝干預(yù)研究,當(dāng)時(shí)我國農(nóng)村地區(qū)尚無乙肝疫苗的供應(yīng)。該研究采用整群抽樣方法,以農(nóng)村公社為基礎(chǔ)單位,用單純隨機(jī)法將入組人群分為新生兒乙肝疫苗免疫組（簡稱疫苗組）和新生兒未免疫對照組（簡稱對照組）。其中疫苗組共納入41 182名兒童,有40 211（97.64%）在出生后24h內(nèi)、1月齡、6月齡注射了 3劑血源性乙肝疫苗（5μg/劑）。對照組共納入41 730名兒童,在10歲前未接種乙肝疫苗,當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心于2000年對該地區(qū)1986年后出生者進(jìn)行了乙肝疫苗補(bǔ)種,已確認(rèn)其中的23 368名對照組參與者按0-1-6程序補(bǔ)種了 3針10μg的重組乙肝疫苗。本團(tuán)隊(duì)于2008-2012年（研究對象到達(dá)19-28歲時(shí)）對啟東乙肝干預(yù)研究的參加者進(jìn)行了血清學(xué)和疾病發(fā)生結(jié)局隨訪。本次分析于2018年（研究對象到達(dá)28-35歲）開展,是在2008-2012年血清學(xué)隨訪基礎(chǔ)上進(jìn)行,以確定新生兒乙肝疫苗免疫后對隱匿性HBV感染保護(hù)作用的持久性。方法與結(jié)果:1.研究對象。從2008-2012年隨訪隊(duì)列中抽取約10%作為研究對象,通過檢測HBV感染血清學(xué)標(biāo)志物、HBV DNA及感染性HBV的基因組,即不完全雙鏈松弛環(huán)狀DNA（relaxedcircular DNA,rcDNA）,分析該人群的OBI狀態(tài)。本研究共收集到6 715例血樣,其中疫苗組3 615例,對照組3 100例。2.新生兒期接種乙肝疫苗能誘導(dǎo)有效的抵抗HBV感染的免疫保護(hù)作用。在成年期（28-35 歲）,疫苗組的 HBsAg 陽性率為 1.58%（57/3 615）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）陽性率為 4.70%（170/3 615）,均低于對照組的 7.45%（231/3 100）和 19.48%,（604/3100）（p 均<0.001）。3.新生兒期接種乙肝疫苗者的HBsAg（-）/anti-HBc（+）陽性率,未呈現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的隨年齡增加而升高趨勢。疫苗組HBsAg（-）/anti-HBc（+）陽性率在28-29歲時(shí)為 4.31%（55/1 276）,30-31 歲時(shí)為 4.66%（59/1 266）,32-33 歲時(shí)為 5.74%（49/853）,但在34-35歲為4.29%（7/163）,未呈現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增高趨勢（P for trend=0.261）。但在對照組,該陽性率由28-29時(shí)的17.16%穩(wěn)定升高到34-35歲的25.67%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P for trend<0.001）。4.出生于母親HBsAg（+）的疫苗接種者HBV感染風(fēng)險(xiǎn)增加。在新生兒乙肝疫苗免疫組中,出生于HBsAg（+）母親的成年人HBsAg陽性率為8.5%（32/378）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）陽性率為10%（38/378）;而出生于HBsAg（-）母親的成年人HBsAg 陽性率僅為 0.8%（25/3 237）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）的陽性率為 4.1%（132/3237）。5.新生兒期接種乙肝疫苗的成年人群中存在OBI狀態(tài)。在HBsAg（-）/anti-HBc（+）者中,新生兒乙肝疫苗免疫組的HBV DNA陽性率13.08%（17/130）,對照組陽性率4.18%（12/287）。通過檢測感染性HBV的基因組（HBV rcDNA）存在狀態(tài),在29例HBsAg（-）/anti-HBc（+）/HBVDNA（+）者中檢測到 26 例（90%）血漿中存在 HBV rcDNA,由此確認(rèn)了 HBV的隱匿性感染狀態(tài)。6.新生兒期接種乙肝疫苗未增加疫苗中和抗體作用位點(diǎn)的HBV S區(qū)突變頻率。對HBV PreS-S基因進(jìn)行擴(kuò)增測序,并分析該區(qū)的突變情況,發(fā)現(xiàn)在疫苗組所分離到的HBV中,中和抗體作用位點(diǎn)的S區(qū)基因“a”決定簇的氨基酸突變頻率的并未增加,但Pre S2區(qū)R48K存在高頻突變,與該地區(qū)的OBI感染者的突變情況一致。小結(jié):新生兒期接種乙肝疫苗所誘導(dǎo)的保護(hù)作用可持續(xù)到至少三十年;但部分疫苗接種的成年人中存在隱匿性HBV感染狀態(tài);出生于母親HBsAg（+）攜帶者成年后HBV感染風(fēng)險(xiǎn)增加。第二部分:胚胎期HBV暴露對乙肝疫苗抗原濾泡輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生及抗體應(yīng)答的影響背景與目的:乙肝疫苗的抗原成分是HBV的包膜蛋白HBsAg,其誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體anti-HBs依賴于CD4+T淋巴細(xì)胞的輔助。濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞（T follicular helper cells,Tfh cells）是一類持續(xù)表達(dá)CXCR5的CD4+T淋巴細(xì)胞,其自分泌的白介素21（Interleukin,IL21）能促進(jìn)自身發(fā)育分化。除Tfh細(xì)胞外,NKT也是IL-21的重要來源。而發(fā)育成熟的Tfh細(xì)胞可通過IL21-IL21R,ICOS-ICOSL,CD40L-CD40等促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖分化,及漿細(xì)胞和記憶性B淋巴細(xì)胞形成。過去已有的研究已證實(shí),母體內(nèi)的HBsAg能通過胎盤屏障進(jìn)入到胎兒羊水和臍帶血中,出生于HBV（+）母親者對多種微生物產(chǎn)物的免疫應(yīng)答不同于出生于HBV（-）母親者。因此,我們推測胚胎期暴露于母親HBsAg,有可能通過影響子代體內(nèi)針對HBsAg的Tfh細(xì)胞的分化產(chǎn)生,進(jìn)而影響其輔助抗HBs的抗體應(yīng)答,影響乙肝疫苗的免疫保護(hù)效果。方法與結(jié)果:1.母親HBsAg（+）攜帶狀態(tài)阻礙新生兒針對HBsAg應(yīng)答的特異性干擾素γ（Interferon Gamma,IFNy）,IL4和IL21產(chǎn)生型T淋巴細(xì)胞的形成。共收集到11例出生于HBV不同狀態(tài)母親的新生兒臍帶血,根據(jù)分娩前2周孕婦外周血的HBV DNA和HBV血清學(xué)標(biāo)志物,將其分為HBsAg（+）/HBV DNA>105 IU/mL組（n=2）,HBsAg（+）/HBV DNA≤105 IU/mL 組（n=5）,和 HBsAg（-）/HBV DNA（-）組（n=4）。分別分離3組臍帶血淋巴細(xì)胞后,采用5μg/mL的HBsAg刺激培養(yǎng)5天,利用ELISPOT檢測HBsAg特性的細(xì)胞因子產(chǎn)生型細(xì)胞數(shù)量。發(fā)現(xiàn)出生于HBsAg（+）母親的新生兒臍帶血中HBsAg特異性IFNγ、IL4和IL21產(chǎn)生型T淋巴細(xì)胞數(shù)目均低于出生于HBsAg（-）母親者。在母親HBV DNA>105 IU/mL時(shí),新生兒臍帶血中難以檢測到IL21產(chǎn)生型T淋巴細(xì)胞。2.建立胚胎期暴露于HBsAg的小鼠模型。我們選擇與C57BL/6J遺傳背景相同,并能持續(xù)表達(dá)并分泌HBsAg的HBV轉(zhuǎn)基因雌鼠（HBV-mother,HBV-M）,與C57BL/6J野生雄鼠交配。待孕期19-20天時(shí),分離胎肝,收集胎血及羊水并檢測HBsAg含量。來自HBV-M的所有F1代（HBV-M/F1）胎鼠的羊水中均可檢測到HBsAg,提示該模型在某種程度上可模擬人的胚胎期暴露于HBsAg狀態(tài)。將從胎肝、胎血及羊水中均檢測到HBsAg的F1代小鼠命名為HBV-M/F1+,其HBsAg編碼基因片段整合在肝細(xì)胞內(nèi);將僅在羊水中檢測到HBsAg的F1代小鼠命名為HBV-M/F1-,其肝細(xì)胞不存在HBV片段,僅在胚胎期的羊水中暴露于HBsAg。3.胚胎期暴露于HBsAg阻礙F1代小鼠Tfh細(xì)胞的形成。在HBV-M/F1+和HBV-M/F1-及C57BL/6J野生小鼠4周齡時(shí),每只注射5μg重組乙肝疫苗,通過流式細(xì)胞染色分析發(fā)現(xiàn),所有HBV-M/F1代小鼠,特別是HBV-M/F1+的HBsAg特異性CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞數(shù)目以及HBsAg特異性CD4+T淋巴細(xì)胞分泌的IL21均低于C57BL/6J野生小鼠（p<0.05）。分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)過程中,在加入IL21后,HBV-M F1-小鼠的HBsAg特異性CD4+CXCR5+PD-1+Tfh細(xì)胞比例升高,但HBV-M/F1+小鼠的Tfh細(xì)胞無明顯改變。4.胚胎期暴露于HBsAg能降低F1代小鼠分泌anti-HBs的漿細(xì)胞數(shù)目。注射一劑5μg乙肝疫苗后,HBV-M/F1組小鼠體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞輔助的anti-HBs分泌細(xì)胞數(shù)目明顯低于C57BL/6J組（p<0.01）。然而,分離HBV-M F1-小鼠和HBV-M/F1+小鼠的T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞與C57BL/6J野生的小鼠的B細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分別進(jìn)行共培養(yǎng),在加入IL21后,來自HBV-M/F1-小鼠的CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞可促進(jìn)野生小鼠的B細(xì)胞形成CD138+IgD-漿細(xì)胞,而來自HBV-M/F1+小鼠的Tfh細(xì)胞對野生小鼠CD138+IgD-形成無明顯改變。5.乙肝疫苗的加強(qiáng)免疫增強(qiáng)了 HBV-M/F1-小鼠的anti-HBs應(yīng)答。每間隔2周對HBV-M/F1小鼠進(jìn)行乙肝疫苗免疫,以觀察加強(qiáng)免疫對小鼠抗體應(yīng)答影響,盡管在HBV-M/F1+小鼠中檢測不到anti-HBs的產(chǎn)生,但HBV-M/F1-小鼠體內(nèi)anti-HBs 陽性率從第二次免疫后58%（7/12）增加到第三次免疫后92%（11/12）,與C57BL/6J組小鼠的陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,分別為58%和100%,但是,HBV-M/F1-小鼠的IgG2a/IgG1比值明顯低于C57BL/6J野生小鼠（p<0.01）。小結(jié):胚胎期暴露于HBsAg可阻礙HBsAg特異性的Tfh產(chǎn)生,降低Tfh細(xì)胞分泌的IL21而影響漿細(xì)胞產(chǎn)生anti-HBs的能力。然而,加強(qiáng)免疫通過一定方式增加IL-21產(chǎn)生,從而改善B細(xì)胞針對HBsAg的抗體產(chǎn)生能力,由此增強(qiáng)胚胎期暴露于母親HBsAg但未感染HBV者的anti-HBs應(yīng)答。
劉曉紅[3]（2021）在《血清學(xué)標(biāo)志物檢測隱匿性乙型肝炎病毒感染研究價(jià)值分析及機(jī)制研究》文中研究表明目的探討乙肝表面抗原（HBs Ag）及乙型肝炎e抗原（HBe Ag）陰性,伴表面抗體（HBs Ab）、e抗體（HBe Ab）、核心抗體（HBc Ab）至少一項(xiàng)陽性的血清中,檢測HBV DNA含量對隱匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）的檢出價(jià)值,及探討OBI的發(fā)生機(jī)制。方法采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）檢測乙肝五項(xiàng)病毒血清標(biāo)志物（HBV-M）,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行HBV-DNA含量復(fù)篩,對OBI檢出情況進(jìn)行分析。采用濕化學(xué)法檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總膽紅素（BILT3）,分析受檢患者肝損傷情況。采用CLIA方法檢測丙型肝炎病毒抗體（HCV-Ab）、梅毒抗體（TP-Ab）、人類獲得性免疫缺陷病毒抗體（HIV-Ab）,分析是否合并其他病毒感染及宿主免疫應(yīng)答有無明顯差異。測序法進(jìn)一步檢測HBV病毒是否存在基因突變,分析OBI發(fā)生機(jī)制。結(jié)果本次論文實(shí)驗(yàn)期間收集HBsAg及HBeAg陰性,伴HBs Ab、HBe Ab、HBc Ab至少一項(xiàng)陽性的血清共計(jì)1138份,PCR共檢出35份HBV-DNA陽性,OBI檢出率3.08%,其中HBc Ab、HBs Ab陽性和HBc Ab陽性HBV-M模式的檢出率最高,分別為4.11%、4.04%。HBc Ab隨著樣本吸光度/臨界值（S/Co值）升高,HBV-DNA陽性檢出率依次顯著升高（P<0.05）。596例患者接受肝功能檢查,肝損傷占22.99%,肝損傷組HBV-DNA陽性率、HBc Ab高反應(yīng)性（S/Co值≥10.0）均顯著高于肝正常組（P<0.05）。35例HBV-DNA陽性標(biāo)本接受HCV、TP、HIV檢測,HCV陽性占11.43%,TP陽性占2.86%,HIV陽性為0,合并HCV病毒感染組與合并TP或HIV病毒感染組存在明顯差異（P<0.05）。乙型肝炎病毒基因變異檢測S區(qū)145位點(diǎn)、S區(qū)127位點(diǎn)、C區(qū),未發(fā)現(xiàn)基因突變。結(jié)論常規(guī)檢測HBsAg及HBeAg陰性伴HBcAb陽性提示存在OBI可能,且OBI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)隨HBc Ab反應(yīng)性S/Co值升高而明顯升高。同時(shí)參考肝損傷指標(biāo),提示應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步行HBV DNA含量檢測,為臨床診斷OBI和降低OBI所致乙肝病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)提供參考。
丁文斌[4]（2020）在《乙肝病毒前基因組RNA在肝細(xì)胞癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究》文中研究說明乙型肝炎病毒前基因組RNA（pregenomic RNA,pg RNA）作為乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）的反轉(zhuǎn)錄模板以及HBV聚合酶蛋白（polymerase,Pol）和核心抗原（HBV core antigen,HBc Ag）的翻譯模板,在HBV的生命周期中發(fā)揮了重要作用[1-3]。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)慢性乙肝（Chronic Hepatitis B,CHB）患者的外周循環(huán)血中可以穩(wěn)定的檢測到HBV RNA,且血清HBV RNA主要以pg RNA的形式存在于CHB的外周循環(huán)中;在長期服用核苷類似物（Nucleoside analogs,NAs）抗病毒治療,血清HBV DNA水平在臨床上為陰性（即未檢出）的CHB患者中,其血清pg RNA表達(dá)水平不但與肝內(nèi)pg RNA水平呈正相關(guān)關(guān)系,還可以反映出CHB患者肝臟的炎癥和纖維化程度[4,5]。此外,還有許多研究提出血清pg RNA可以作為一種潛在的生物學(xué)標(biāo)志物,用于評價(jià)NAs抗病毒治療效果,檢測NAs治療中的病毒突變以及指導(dǎo)NAs治療的安全停藥[6-10]。然而,pg RNA在HBV相關(guān)肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的發(fā)生及進(jìn)展過程中發(fā)揮了何種作用尚不明確。此外,相關(guān)研究報(bào)道α干擾素2a（Interferon-α-2a,IFN-α-2a）可以抑制pg RNA的轉(zhuǎn)錄,且在HBV相關(guān)HCC行根治性手術(shù)的患者中,術(shù)后IFN-α-2a輔助治療能夠降低他們HCC的復(fù)發(fā)率并提高總體生存率,但具體作用機(jī)制仍不明確[11-13]。在本研究中,我們首先探索了pg RNA在HBV相關(guān)HCC發(fā)生和進(jìn)展中的作用及機(jī)制。其次,我們探索了干擾IFN-α-2a除了直接抗腫瘤作用外,能否通過抑制pg RNA發(fā)揮預(yù)防HBV相關(guān)HCC發(fā)生和進(jìn)展的作用。本研究分為以下兩個(gè)部分。本研究的第一部分中,我們首先從本中心臨床樣本庫中選取了136例術(shù)前服用NAs藥物抗病毒治療至少48周,血清HBV DNA陰性的慢乙肝肝癌患者,對其術(shù)前的血清,術(shù)中切除的肝癌及癌旁組織中pg RNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示癌旁組織中pg RNA的表達(dá)高于癌組織,且血清pg RNA表達(dá)與癌旁組織pg RNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.63,p<0.001）。接下來我們根據(jù)患者血清pg RNA的表達(dá)水平,使用中位數(shù)法把患者分為血清pg RNA高表達(dá)組和血清pg RNA低表達(dá)組,然后對其基本臨床病理學(xué)信息進(jìn)行分析和比較。結(jié)果顯示血清pg RNA高表達(dá)不但與更低的腫瘤分化程度（p=0.014）,更嚴(yán)重的肝臟炎癥程度（p=0.006）,纖維化程度（p=0.013）及肝硬化（p=0.040）相關(guān),而且還與HBV e抗原（HBV e antigen,HBe Ag）陽性（p=0.004）和HBV表面抗原（HBV surface antigen,HBs Ag）滴度（p=0.007）密切相關(guān)。此外,血清pg RNA高表達(dá)在患者的總生存期（Overall survival,OS）更短（p=0.0166）,肝癌的累計(jì)復(fù)發(fā)率（Cumulative recurrence rate,CRR）更高（p=0.0157）。多因素分析表明血清pg RNA高表達(dá)是肝癌患者手術(shù)后死亡（OS:95%CI=1.197-3.356,p=0.008）和肝癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（CRR:95%CI=1.167-3.058,p=0.010）。對臨床數(shù)據(jù)的分析提示pg RNA可能在HCC發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。接下來我們通過體內(nèi)體外等功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索pg RNA在肝癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用。我們使用pg RNA特異性短發(fā)卡RNA（sh-RNA）成功構(gòu)建了穩(wěn)定干擾pg RNA的Hep G2.2.15肝癌細(xì)胞系。同時(shí),我們使用pg RNA全長過表達(dá)質(zhì)粒成功在肝癌細(xì)胞Hep G2.2.15和Huh7中過表達(dá)了pg RNA并挑取了穩(wěn)定過表達(dá)單克隆。Cell Counting Kit-8（CCK-8）,克隆形成,Ed U,細(xì)胞流式,成球及體內(nèi)和體外絕對稀釋等實(shí)驗(yàn)表明敲低pg RNA的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的增殖能力,克隆形成能力,抑制肝癌細(xì)胞的抗細(xì)胞凋亡能力,同時(shí)抑制肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性（簡稱干性）和成瘤能力;而在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)pg RNA后,肝癌細(xì)胞的增殖能力,克隆形成能力,抗凋亡能力,干性及成瘤能力進(jìn)一步增強(qiáng)。體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了pg RNA與HCC的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。在探索pg RNA促進(jìn)HBV相關(guān)HCC發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制研究過程中,通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)[14],銀染實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)譜分析,我們發(fā)現(xiàn)pg RNA可與一個(gè)經(jīng)典的促癌分子胰島素樣生長因子2 m RNA結(jié)合蛋白3（Insulin-like growth factor 2 m RNA binding protein 3,IGF2BP3）直接結(jié)合并相互調(diào)節(jié)。接下來,我們又通過RNA pull-down和蛋白免疫印跡（Western blot）,RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）及免疫熒光（Immunofluorescence,IF）和RNA原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH）共聚焦等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了pg RNA與IGF2BP3的直接相互結(jié)合作用,且兩者結(jié)合后pg RNA的穩(wěn)定性得到增強(qiáng)。接下來,通過一系列的實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)預(yù)測分析,我們發(fā)現(xiàn)pg RNA通過海綿樣吸附mi RNA-let-7e-5p,在轉(zhuǎn)錄后修飾水平上調(diào)IGF2BP3的表達(dá)。此外,通過細(xì)胞功能的加減法實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)pg RNA對肝癌增殖能力和干性的促進(jìn)作用可以被進(jìn)一步干擾IGF2BP3所阻斷?？傊?我們的研究發(fā)現(xiàn)在CHB患者體內(nèi),pg RNA與IGF2BP3之間存在相互調(diào)節(jié)作用。一方面,pg RNA與IGF2BP3直接結(jié)合,且兩者結(jié)合后pg RNA的穩(wěn)定性會升高;另一方面,pg RNA可通過海綿樣吸附作用,隔離IGF2BP3抑制性的mi R-let-7e-5p,增加IGF2BP3 m RNA的穩(wěn)定性,從而在轉(zhuǎn)錄后修飾水平上調(diào)IGF2BP3蛋白的表達(dá)。綜上所述,我們第一部分部分的研究發(fā)現(xiàn)pg RNA-IGF2BP3信號軸在HBV相關(guān)HCC發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要作用。本研究的第二部分中,我們探索IFN-α-2a能否通過抑制HBV-pg RNA,進(jìn)而抑制HBV相關(guān)HCC的發(fā)生和進(jìn)展。我們使用IFN-α-2a處理Hep G2.2.15肝癌細(xì)胞不同的時(shí)間段后,對pg RNA和IGF2BP3的表達(dá)變化進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,當(dāng)我們使用IFN-α-2a處理細(xì)胞0-24 h時(shí),pg RNA和IGF2BP3 m RNA的表達(dá)從處理4 h后開始明顯下降,但I(xiàn)GF2BP3蛋白水平未明顯變化。接下來,我們使用IFN-α-2a處理細(xì)胞更長的時(shí)間（0-7天）,結(jié)果顯示pg RNA和IGF2BP3的m RNA的表達(dá)水平從處理4 h起開始明顯下降,IGF2BP3蛋白水平從處理24 h后開始明顯下降。此外,當(dāng)我們用IFN-α-2a處理不表達(dá)pg RNA但遺傳背景與Hep G2.2.15相同的Hep G2細(xì)胞相同時(shí)間后,IGF2BP3無論在m RNA還是蛋白水平均未發(fā)生明顯變化。這些結(jié)果提示IFN-α-2a無法直接下調(diào)IGF2BP3的表達(dá),而是通過抑制pg RNA進(jìn)而下調(diào)IGF2BP3的表達(dá),發(fā)揮抑制HCC進(jìn)展的作用。接下來,我們通過體內(nèi)體外細(xì)胞功能加減法實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證IFN-α-2a是否通過抑制pg RNA發(fā)揮抑制HCC發(fā)生和復(fù)發(fā)的作用。首先,我們使用IFN-α-2a和等體積生理鹽水分別處理pg RNA過表達(dá)單克隆和對應(yīng)的陰性對照單克隆細(xì)胞。結(jié)果顯示pg RNA的過表達(dá)可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)IFN-α-2a對肝癌細(xì)胞增殖能力和干性的抑制作用。接下來,我們使用pg RNA過表達(dá)單克隆和對應(yīng)陰性對照單克隆細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下荷瘤模型,并使用IFN-α-2a或等體積生理鹽水分別處理相應(yīng)的裸鼠。結(jié)果顯示過表達(dá)pg RNA后可以部分逆轉(zhuǎn)IFN-α-2a對皮下荷瘤生長的抑制作用。綜上,這些結(jié)果提示IFN-α-2a除了直接抗腫瘤生長作用外,在HBV相關(guān)HCC中還可以通過阻斷pg RNA-IGF2BP3軸從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力和干性,最終發(fā)揮抑制HCC進(jìn)展的作用。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)IFN-α-2a可以抑制pg RNA的轉(zhuǎn)錄[15]。此外,最近的研究也發(fā)現(xiàn)在HBV pg RNA的5’和3’末端莖環(huán)結(jié)構(gòu)上存在N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修飾位點(diǎn),且m6A修飾程度增強(qiáng)后,HBV的所有轉(zhuǎn)錄本（包括pg RNA）的穩(wěn)定性及相應(yīng)的翻譯產(chǎn)物會被下調(diào)[16]。因此,我們接下來探索IFN-α-2a處理對pg RNA穩(wěn)定性及其m6A修飾的影響。通過放線菌素D（Actinomycin D）轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)并進(jìn)一步計(jì)算pg RNA半衰期,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)IFN-α-2a處理48 h后,pg RNA的穩(wěn)定性明顯下調(diào)。接下來我們通過基因特異性m6A q PCR,進(jìn)一步驗(yàn)證IFN-α-2a處理對pg RNA的m6A修飾的影響。結(jié)果顯示,IFN-α-2a處理能夠明顯增加pg RNA的m6A修飾水平。同時(shí)我們也檢測了經(jīng)IFN-α-2a處理后,m6A修飾過程中三個(gè)重要蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）,甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）以及脂肪和肥胖相關(guān)蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）的表達(dá)變化[17]。結(jié)果顯示,經(jīng)IFN-α-2a處理的Hep G2.2.15細(xì)胞中METTL3和METTL14的表達(dá)明顯升高,而FTO的表達(dá)明顯下降。提示IFN-α-2a可能通過上調(diào)肝癌細(xì)胞中甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14的表達(dá)同時(shí)下調(diào)去甲基酶FTO的表達(dá),進(jìn)而增加pg RNA的m6A修飾水平。綜上所述,我們該部分的研究發(fā)現(xiàn)IFN-α-2a除了直接的抗腫瘤作用外,在HBV相關(guān)HCC中還可以通過增加HBV-pg RNA的m6A修飾水平,促進(jìn)pg RNA的降解,從而抑制pg RNA-IGF2BP3信號軸,發(fā)揮預(yù)防HCC發(fā)展的作用。
徐博文[5]（2020）在《用探針法雙重定量PCR同時(shí)檢測乙型肝炎病毒前基因組RNA和DNA》文中指出現(xiàn)有的抗病毒藥物比如核苷類似物（nucleotide analogues,NAs）、聚乙二醇化的干擾素α（PEGylated interferon alpha,PEG-IFNα）等可以有效抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的復(fù)制,但是難以清除肝細(xì)胞內(nèi)的HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）。殘余的cccDNA容易導(dǎo)致停藥后慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）的復(fù)發(fā)甚至進(jìn)展。因此肝內(nèi)cccDNA的水平是判斷乙肝是否被治愈的重要參考指標(biāo)。然而直接肝臟穿刺活檢檢測肝內(nèi)cccDNA的水平屬于有創(chuàng)檢查,無法作為常規(guī)臨床檢查手段,需要尋找無創(chuàng)的替代手段,比如血清學(xué)檢查反映肝內(nèi)cccDNA的水平等。乙型肝炎病毒cccDNA可以生成0.7kb、2.1kb、2.4kb、3.5kb等多種不同長度的轉(zhuǎn)錄本,其中3.5kb的前基因組RNA（pregenomic RNA,pgRNA）是唯一能夠反轉(zhuǎn)錄生成松弛環(huán)狀DNA（relaxed circular DNA,rc DNA）負(fù)鏈的轉(zhuǎn)錄本。rc DNA是完整HBV顆粒的必要組成,因此pgRNA是HBV復(fù)制周期中的關(guān)鍵分子。血清中的pgRNA水平被證明和肝臟內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性具有較好的相關(guān)性,尤其在經(jīng)過NAs治療的病人,血清pgRNA比血清HBV DNA更能反映肝內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性,并且能夠幫助判斷停用抗病毒藥物后乙肝在病毒學(xué)水平復(fù)發(fā)的幾率,對于指導(dǎo)停藥時(shí)機(jī)具有重要意義。因此血清pgRNA有望成為新的臨床檢驗(yàn)指標(biāo)。盡管血清HBV RNA有獨(dú)特的臨床意義,但是其仍然無法替代HBV DNA成為更好的臨床檢測指標(biāo):HBV DNA水平不僅是決定患者是否進(jìn)行抗病毒治療的重要依據(jù),同時(shí)也是評價(jià)患者病毒學(xué)應(yīng)答的重要指標(biāo)。另外有研究顯示,HBV RNA與DNA的比值在不同自然感染史的CHB患者之間存在顯著差異,因此HBV DNA和RNA的綜合水平對于判斷HBV感染階段、疾病預(yù)后具有重要意義。但是目前臨床上只有標(biāo)準(zhǔn)化的HBV DNA檢測試劑盒,而無HBV RNA的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。如果將來HBV RNA成為新的臨床檢驗(yàn)指標(biāo),也往往需要同時(shí)檢測HBV DNA和RNA,如果分別檢測必定帶來耗費(fèi)更多人力、時(shí)間、試劑、耗材和檢測樣品等問題。另一方面,目前檢測HBV RNA尚無公認(rèn)的常規(guī)方法,既往文獻(xiàn)中的檢測手段均存在一定局限。例如本課題的研究證明了直接抽提RNA并用oligo d T或基因特異性引物（gene specific primer,GSP）反轉(zhuǎn)錄的定量PCR可能因?yàn)殡y以消除的HBV DNA污染而存在定量不準(zhǔn),并且即使用DNase消化RNA提取物中的DNA也無法完全排除HBV DNA的干擾。還有其它文獻(xiàn)報(bào)道了利用Quantigene核酸定量、微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR,dd PCRds）等新技術(shù)進(jìn)行HBV RNA的檢測,雖然具有高靈敏度、特異性等優(yōu)點(diǎn),但是由于需要先進(jìn)且昂貴的配套設(shè)備,目前只適用于實(shí)驗(yàn)室研究,尚難以在臨床得到普及和推廣。本課題開發(fā)了一種新的利用雙重?zé)晒舛縋CR同時(shí)檢測核酸提取物中pgRNA和DNA的方法,在克服了以往檢測HBV RNA方法容易受到HBV DNA污染局限的同時(shí),實(shí)現(xiàn)了兩項(xiàng)指標(biāo)的雙檢,相較于分別檢測HBV DNA和RNA,可節(jié)省一半以上時(shí)間,以及減少一半的樣本量需求,并且我們證明了該檢測體系具有較高的特異性、準(zhǔn)確性。本課題共設(shè)計(jì)有兩種檢測策略,第一種是反轉(zhuǎn)錄后拷貝數(shù)相減法的定量策略,適用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清標(biāo)本,理論上也適合用于血清的檢測;第二種策略是針對第一種的改良,方法是特異性擴(kuò)增帶錨定序列的c DNA然后定量,該改良檢測策略對于檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞標(biāo)本都能夠勝任。綜上,本課題設(shè)計(jì)的檢測方法可以同時(shí)定量檢測核酸提取物中HBV DNA和HBV RNA且具有定量準(zhǔn)確、特異性好等優(yōu)點(diǎn),另外操作簡單,節(jié)約了時(shí)間和人力物力成本,需要的檢測樣本量較少,因此能夠較好地滿足臨床檢驗(yàn)需求,具有潛在的轉(zhuǎn)化價(jià)值。
劉賀[6]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因組突變分析及時(shí)空動力學(xué)研究》文中研究表明目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重組體的遺傳變異情況;探尋藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗體（HBsAb）雙陽性發(fā)生率及原因;分析HBV/CD重組體的時(shí)空動態(tài)傳播過程和進(jìn)化遺傳學(xué)特征（包括基因序列起源、核苷酸替換率和居群動力學(xué)等）。方法:利用多階段隨機(jī)抽樣的方法,在西藏自治區(qū)和青海省海南州進(jìn)行社區(qū)藏族人群血清樣本采集,西藏七個(gè)地市中共收集HBsAg陽性血清樣本852例,青海省收集HBsAg 陽性血清樣本411例。按照采樣地區(qū)藏族人群人口分布情況,選取具有代表性的血清樣本進(jìn)行DNA提取,分別對HBV全長和BCP區(qū)采用巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增、測序和拼接,以獲得HBV全序列。對獲得的全序列進(jìn)行重組分析,對不同重組型的基線情況、遺傳變異、血清型進(jìn)行比較;對重組體內(nèi)不同基因型片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb雙陽性血清樣本做為觀察組,并以1:4配比選擇年齡、性別、病毒DNA水平和HBeAg狀態(tài)同質(zhì)的HBsAg 陽性/HBsAb陰性血清樣本作為對照組,對兩組間基因序列S區(qū)、PreS區(qū)氨基酸突變率、缺失和全基因組核苷酸突變位點(diǎn)分布情況進(jìn)行比較。使用自NCBI中檢索、收集的HBV C2亞基因型、D基因型和CD重組體全長序列,合并本研究中獲得的185株全長序列,構(gòu)建數(shù)據(jù)庫。使用BEAST軟件包對CD重組體中的D基因型片段和D1-5亞基因型;CD重組體中的C基因型片段和C2亞基因型分別進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)分析。同時(shí),對CD1和CD2全長序列單獨(dú)進(jìn)行溯祖分析,并使用貝葉斯skyline重建方法推斷種群數(shù)量的歷史變化。結(jié)果:共獲得185條HBV全長序列,其基因分型主要為CD重組基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799為D基因型,其余部分為C基因型;49株CD2型,其nt10-1499為D基因型,其余部分為C基因型;除CD重組型,還獲得了 4株C2亞基因型序列。185株測序樣本中,HBeAg陽性組的病毒DNA水平高于HBeAg陰性組（P=0.001）;HBeAg陰性組年齡高于HBeAg陽性組（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型區(qū)域均與C2亞基因型最為接近;CD重組體的D基因型段（nt10-799）與D4亞基因型最為接近,而CD2型nt800-1499序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中與D1-D3更為接近。CD2型重組體主要分布于與印度接壤的山南地區(qū)和日喀則市（P=0）。CD重組體在S區(qū)氨基酸aa76、aa120和aa129與D基因型存在差異。HBV/CD重組體的主要血清學(xué)型為ayw2型（175/181,96.7%）。與CD1型相比,CD2型存在較多的S207N突變。HBV/CD重組體的T1762/A1764雙突變發(fā)生率低于C基因型,與D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突變頻率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突變水平與C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg陽性樣本的雙陽性率為2.14%（27/1263）。在S蛋白全長、N端,MHR（aa100-169）,“a”決定簇（aa124-147）,莖環(huán)結(jié)構(gòu)第一環(huán)（aa124-137）,第二環(huán)（aa139-147）和C端的氨基酸突變率,雙陽性組均顯著高于對照組;雙陽性組中PreS區(qū)缺失顯著高于對照組（以上結(jié)果中,均為P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突變率在兩組間無顯著性差異（P=0.19;P=0.89）。PreC/C區(qū)C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在兩組間的分布均存在顯著差異。雙陽性組和對照組的核苷酸點(diǎn)突變比較,PreS/S區(qū)C3189A和T825C、P區(qū)C930A在兩組間分布存在顯著性差異。其中,PreS區(qū)C129T（S155L）僅存在于對照組;PreS區(qū)C3189A（D103E）和S區(qū)T825C（V224A）突變僅存在于雙陽性組。HBVD基因型和CD重組體中的D型區(qū)域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亞洲南部,其平均進(jìn)化速率約為1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位點(diǎn)/年。D4亞基因型是CD1和CD2中最為接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）進(jìn)入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化為CD1和CD2內(nèi)相應(yīng)片段。CD1型較CD2型出現(xiàn)更早,表明先形成D基因型區(qū)段為nt10-799的CD1,后續(xù)形成D基因型區(qū)段為10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重組體分別形成三個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化群。HBV/CD1重組體自1980年代開始至2000年,其種群大小保持穩(wěn)定;HBV/CD2重組體自1997年首次報(bào)道以來,其種群大小經(jīng)過短暫上升之后,隨即出現(xiàn)了明顯的下降趨勢。全球C2亞型片段的傳播最先起源于亞洲東部,首先傳播到中國西北和亞洲北部,隨后東亞分離株又進(jìn)一步播散到美洲。結(jié)論:HBV/CD重組體是高原地區(qū)流行的主要基因型。HBeAg陰性組患者體內(nèi)重組體DNA水平更高,病毒復(fù)制速度較快,病情處于進(jìn)展期。年齡增長是導(dǎo)致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中發(fā)生轉(zhuǎn)陰的主要原因。HBV/CD1重組來源為D4和C2亞基因型;HBV/CD2可能經(jīng)過重組來源為D1-3、D4和C2亞基因型的多次重組?；诟骰蛐偷牡乩矸植?形成CD重組體的主要重組來源可能為中國（C2亞基因型）和印度（D4亞基因型）。與D基因型相比,HBV/CD重組體的主要血清型無明顯變化。HBV/CD重組體感染者均在高海拔地區(qū)生活,造成這種現(xiàn)象的可能原因是高原居民具有相近的遺傳背景特征或長期的高海拔生活導(dǎo)致其具有相同或相似的生活習(xí)慣。青藏高原HBV表面抗原陽性人群中HBsAg和HBsAb雙陽性的發(fā)生率接近大多數(shù)不同基因型的既往研究結(jié)果。與對照組相比,雙陽性組的氨基酸突變率在S區(qū)全長及其內(nèi)的各個(gè)區(qū)段均顯著增加。S區(qū)高突并不是血清雙陽性病的充分必要條件,并不能完全解釋HBsAg/HBsAb共存現(xiàn)象,PreS區(qū)的改變可能是導(dǎo)致HBsAg/HBsAb雙陽性的因素之一。S區(qū)T825C（V224A）、PreS區(qū)C3189A（D103E）僅存在于雙陽性組中,這些氨基酸變異導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,可能是雙陽性發(fā)生的重要條件。HBVD基因型最可能的起源地是南亞地區(qū)。D基因型原型株在18世紀(jì)中葉逐步從印度傳播到中亞進(jìn)而傳播到歐洲、地中海地區(qū)和非洲。在此過程中,19世紀(jì)中葉先后分化出D1、D3和D2亞基因型。同時(shí)19世紀(jì)中葉自印度向東北方向傳播,逐步形成D4亞基因型并在1910年左右進(jìn)入青藏高原及周邊地區(qū)與C2型發(fā)生重組,這與英軍兩次入侵西藏時(shí)間相吻合。歐洲主要HBV D亞型的傳播可追溯到二十世紀(jì)早期,包括第一次世界大戰(zhàn)特別是第二次世界大戰(zhàn)在內(nèi)的一段時(shí)期。此過程可能與戰(zhàn)爭中產(chǎn)生的創(chuàng)傷、輸血和疫苗注射,以及有組織的大規(guī)模人口遷移導(dǎo)致HBV的快速傳播和演化有關(guān)。C2基因型向美洲等地的播散則與亞洲在二十世紀(jì)八九十年代的歐美移民潮有關(guān),隨著大量東亞地區(qū)亞裔人口向歐美等發(fā)達(dá)國家移民導(dǎo)致C2亞基因型的世界范圍傳播。
楊宇婷[7]（2020）在《兒童隱匿性乙肝病毒感染風(fēng)險(xiǎn)及檢測方法的研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理背景:雖然乙肝疫苗免疫接種計(jì)劃在中國已實(shí)行近30年,我國仍然是乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）中高度流行國家。本次研究主要通過對乙肝疫苗接種后中國兒童HBV相關(guān)血清標(biāo)志物的變化情況進(jìn)行分析,從而對兒童隱匿性HBV感染（occult HBV infection,OBI）風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估,并對OBI檢測方法進(jìn)行研究。方法:對215,624名0-16歲于2012年8月-2017年12月在重醫(yī)附屬兒童醫(yī)院住院的兒童乙肝血清標(biāo)志物檢測結(jié)果進(jìn)行分析,探究兒童OBI風(fēng)險(xiǎn)。在HBV的不同基因區(qū)段進(jìn)行引物探針的設(shè)計(jì),病毒核酸的提取,PCR擴(kuò)增反應(yīng),探索OBI檢測的新思路。結(jié)果:1-16歲兒童中HBV核心抗體（HBcAb）陽性率約為5.99%。HBV表面抗原（HBsAg）,0歲組為0.3%,1-9歲組為0.55%,當(dāng)年齡>9歲時(shí)顯著升高,為1.40%。并已初步建立一種多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)用于OBI的檢測,該方法檢測靈敏度高、特異性好、操作簡便。結(jié)論:此研究是首次通過分析中國兒童在乙肝疫苗免疫接種后的HBV血清標(biāo)志物的變化情況,從而探究隱匿性HBV感染風(fēng)險(xiǎn),并嘗試建立一種新型OBI檢測技術(shù)。在1-16歲兒童中可能存在有較高比例的隱匿性HBV感染,并且有突破性感染發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此,建立一種準(zhǔn)確、高效、臨床適用性的OBI檢測方法,對OBI進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的檢測將尤為重要。
董沖[8]（2020）在《應(yīng)用HBcAb陽性供肝的兒童肝移植受者術(shù)后新發(fā)乙肝風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)防方案的研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的:研究乙肝病毒核心抗體（HBcAb）陽性供肝應(yīng)用于兒童肝移植受者的危險(xiǎn)因素及探討乙肝疫苗主動免疫預(yù)防術(shù)后新發(fā)乙肝（HBV）的療效及影響因素。方法:1、對天津市第一中心醫(yī)院自2012年8月至2014年11月150例兒童親體肝移植的供受者資料進(jìn)行回顧性分析,依據(jù)供者血清HBcAb檢測結(jié)果分為HBcAb陽性組和HBcAb陰性組,對兩組兒童受者的新發(fā)HBV感染情況以及臨床資料進(jìn)行比較分析。根據(jù)肝移植術(shù)后是否有新發(fā)HBV感染分為新發(fā)HBV組及非新發(fā)HBV組,統(tǒng)計(jì)分析兩組供者性別、血清HBcAb檢測結(jié)果、供肝組織共價(jià)閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸（HBV cccDNA）檢測結(jié)果、受者手術(shù)時(shí)間、術(shù)中失血量、術(shù)中輸注紅細(xì)胞量、術(shù)中輸注血漿量、術(shù)中輸液總量、供者年齡、供者體重、移植物重量方面的差異。2、對天津市第一中心醫(yī)院自2016年9月至2018年9月139例接受強(qiáng)化乙肝疫苗免疫方案預(yù)防HBcAb陽性供肝術(shù)后新發(fā)HBV感染的兒童肝移植受者進(jìn)行前瞻性研究,根據(jù)肝移植術(shù)后是否有新發(fā)HBV分為新發(fā)HBV組及非新發(fā)HBV組,比較兩組間供者和受者的特征、手術(shù)信息以及移植物和受者的情況,應(yīng)用單變量和多變量分析確定乙肝疫苗預(yù)防治療后新發(fā)HBV感染的危險(xiǎn)因素,并根據(jù)術(shù)后3個(gè)月內(nèi)乙肝表面抗體滴度變化進(jìn)行分組,分為:A組HBs Ab滴度>1000IU/L;B組HBs Ab滴度200-1000IU/L;C組HBs Ab滴度<200IU/L,觀察影響抗體滴度變化的因素。3、兒童受者疫苗反應(yīng)的強(qiáng)度根據(jù)受者術(shù)前使用乙肝疫苗支數(shù)分為強(qiáng)反應(yīng)組（≤3支）,中反應(yīng)組（4～6支）,弱反應(yīng)組（>6支）,分別在應(yīng)用疫苗前、疫苗后1周和疫苗后2周,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血各淋巴細(xì)胞比例及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測NK細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B的差異;酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測外周血細(xì)胞因子γ干擾素（IFN-γ）和白介素2（IL-2）分泌動態(tài)變化;免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）和RT-PCR法檢測NK細(xì)胞Toll樣受體3（TLR3）、Toll樣受體9（TLR9）和視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I（RIG-I）蛋白表達(dá)及信使核糖核酸（mRNA）轉(zhuǎn)錄水平,明確其與乙肝疫苗反應(yīng)性的差異。結(jié)果:1.符合入組條件的兒童受者共125例,中位隨訪時(shí)間為8個(gè)月（3～31個(gè)月）,包括供者血清HBcAb陽性組47例和供者血清HBcAb陰性組78例,兩組的新發(fā)HBV感染例數(shù)分別為8例（17.02%）和1例（1.28%）,差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）;余臨床資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有供肝組織中共檢出HBV cccDNA陽性者11例,檢出率為8.8%,其中供者血清HBcAb陽性組供肝組織中HBV cccDNA陽性者10例,占比21.3%,供者血清HBcAb陰性組檢出1例,占比1.3%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;11例接受HBV cccDNA陽性供肝的兒童移植術(shù)后新發(fā)HBV感染者4例,感染率36.4%,其余114例接受HBV cccDNA陰性供肝的兒童移植術(shù)后新發(fā)HBV感染者5例,感染率4.4%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。新發(fā)HBV組供者血清HBcAb（+）和供肝組織HBV cccDNA（+）例數(shù)高于非新發(fā)HBV組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。供者血清HBcAb（+）與供肝組織HBV cccDNA（+）兩者之間具有相關(guān)性。2.受者中位隨訪時(shí)間為23.5±15.7月,有5例（3.6%）出現(xiàn)新發(fā)HBV感染,肝移植術(shù)后新發(fā)HBV感染的平均時(shí)間為11.6個(gè)月（6～18個(gè)月）。隨訪期間,與新發(fā)HBV感染的受者相比,新發(fā)HBV感染的移植物和受者均存活。多因素邏輯回歸分析受者術(shù)前抗體滴度<1000 IU/L,移植物HBV-DNA>1000copies、術(shù)后3個(gè)月HBs Ab下降速度和術(shù)中血漿用量大于400 ml是影響乙肝疫苗主動免疫方案效果的主要因素;術(shù)后3個(gè)月內(nèi)乙肝表面抗體滴度變化與術(shù)中血漿的用量相關(guān)。3.研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用乙肝疫苗一周后,強(qiáng)反應(yīng)組外周血NK細(xì)胞的比例及NK細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B的能力、血清中細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量、NK細(xì)胞中TLR3、TLR9和RIG-I蛋白及mRNA的表達(dá)均較中反應(yīng)組和弱反應(yīng)組明顯增高（P<0.05）;應(yīng)用乙肝疫苗兩周后,與中反應(yīng)組和強(qiáng)反應(yīng)組相比,弱反應(yīng)組外周血NK細(xì)胞的比例及NK細(xì)胞分泌穿孔素和顆粒酶B的能力、血清中細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量、NK細(xì)胞中TLR3、TLR9和RIG-I蛋白及mRNA的表達(dá)仍然明顯偏低（P<0.05）。結(jié)論:1.供者血清HBcAb（+）是兒童肝移植術(shù)后新發(fā)HBV感染的危險(xiǎn)因素,與供肝組織HBV cccDNA（+）相關(guān),故應(yīng)用HBcAb（+）供肝需要給予合適的預(yù)防治療;2.乙肝疫苗主動免疫治療方案能夠有效地預(yù)防HBcAb陽性供肝兒童肝移植術(shù)后新發(fā)HBV感染,術(shù)前快速使HBs Ab滴度達(dá)到1000 IU/L以上是降低術(shù)后新發(fā)HBV的關(guān)鍵因素;3.影響兒童受者乙肝疫苗反應(yīng)強(qiáng)度的因素與受者NK細(xì)胞的比例和功能密切相關(guān),其機(jī)制可能是TLR3、TLR9及RIG-I相關(guān)的天然免疫模式識別受體信號通路。
王同同[9]（2020）在《超敏HBV DNA檢測在慢性HBV感染者中的動態(tài)監(jiān)測價(jià)值》文中指出目的HBV DNA的檢測對于確定乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染者病毒復(fù)制水平具有重要意義。本文利用超敏檢測技術(shù),探討低病毒載量（≤500IU/m L）背景下,HBV DNA水平與乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e antigen,HBe Ag）、肝功能各指標(biāo)的相關(guān)性,以及HBV DNA、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）隨著抗病毒時(shí)間的趨勢變化。方法篩選370例傳統(tǒng)熒光定量法檢測HBV DNA病毒載量≤500IU/m L的慢性HBV感染者的血清標(biāo)本,對應(yīng)的超敏HBV DNA水平也同時(shí)被檢測,將抗病毒治療的221例患者按照DNA水平分為超敏陰性（-）組和超敏陽性（+）組,并分析兩組中肝功能各指標(biāo),HBe Ag統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;治療組患者按照治療時(shí)間進(jìn)一步分為抗病毒治療半年,一年,兩年和三年,149例未治療慢性HBV感染者設(shè)為對照組,分析HBV DNA陽性率,ALT異常率隨著抗病毒時(shí)間的變化趨勢;分析ALT血清水平顯示異常的情況下,HBV DNA陽性率隨治療時(shí)間的趨勢關(guān)系。結(jié)果ALT異常率在超敏陰性（-）組和超敏陽性（+）組中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.048）;谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）異常率兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.773>0.05）;另外,肝功能各指標(biāo)血清學(xué)水平在兩組中均沒有差異（P>0.05）而HBe Ag陽性率在兩組中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。超敏HBV DNA陽性率隨抗病毒治療時(shí)間不同,其趨勢檢驗(yàn)顯示負(fù)相關(guān)（χ2=39.823,P<0.001）;而ALT異常率也具有趨勢相關(guān)性（χ2=4.029,P=0.045）。ALT顯示異常的患者中隨抗病毒治療時(shí)間的增加,超敏HBV DNA陽性率逐漸降低,未治療組與治療組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.922,P=0.001）;組間比較,采用Bonferroni法調(diào)整α水平后,治療兩年、三年與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002,P=0.001）。結(jié)論超敏定量檢測在低病毒載量HBV感染者中具有重要價(jià)值,較傳統(tǒng)熒光定量檢測有更高的HBV DNA陽性檢出率,準(zhǔn)確了解病毒復(fù)制水平,減少假陰性造成的病情誤判;結(jié)合低病毒載量背景下的ALT和HBe Ag等指標(biāo),動態(tài)監(jiān)測患者的實(shí)際情況,有助于選擇最佳治療方案。
巫智勇[10]（2020）在《國產(chǎn)試劑與Roche試劑HBV DNA熒光定量PCR檢測方法的精度比較》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的:了解Roche公司Cobas PCR試劑與國產(chǎn)HBV熒光定量PCR試劑對HBV DNA檢測的差異性,以更好地指導(dǎo)抗病毒治療。方法:收集安醫(yī)大一附院2019年3月至2019年6月期間門診和住院的未經(jīng)和已經(jīng)進(jìn)行核苷類藥物治療的慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化患者的血清70份,采用相關(guān)性分析來評價(jià)Cobas檢測和國產(chǎn)檢測對不同HBV DNA載量標(biāo)本的精確性。HBV DNA定量檢測:HBV DNA分別用Cobas定量試劑（Roche）和上海之江生物科技股份有限公司試劑（ZJ）進(jìn)行檢測。擴(kuò)增反應(yīng)分別在Cobas Taq Man 48 PCR儀和美國Applied Biosystem公司生產(chǎn)的ABI 7500基因擴(kuò)增儀進(jìn)行。同一份標(biāo)本采用2種試劑進(jìn)行平行檢測,具體操作和結(jié)果判定參照試劑盒說明進(jìn)行。結(jié)果:1.上海之江生物科技股份有限公司生產(chǎn)的試劑ZJ試劑檢測結(jié)果與Roche檢測結(jié)果的總體相關(guān)系數(shù)r=0.612,P=0.004,說明兩者之間存在顯著的線性相關(guān)。2.國產(chǎn)試劑對于病毒載量低于106 copy/ml的標(biāo)本檢測結(jié)果的問題突出體現(xiàn)在三個(gè)方面:1)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性差;2)相當(dāng)比例的標(biāo)本國產(chǎn)試劑出現(xiàn)檢測值≤1000copy/ml,病毒載量越低,出現(xiàn)檢測值低于下限的比例越高。3)病毒載量低于106 copy/ml的標(biāo)本,國產(chǎn)試劑檢測結(jié)果的重復(fù)性差,同一標(biāo)本不同批次的檢測結(jié)果可以相差1個(gè)數(shù)量級。在103<HBV DNA≤106范圍內(nèi),P值大于0.05,提示兩種檢驗(yàn)方法間不存在顯著相關(guān)性,在HBV DNA>107copy/ml范圍以上,兩種檢驗(yàn)方法間存在顯著的線性相關(guān)。3.ZJ試劑檢測結(jié)果≤1000copy/ml而Roche檢測結(jié)果>1000copy/ml的,即ZJ試劑檢測結(jié)果呈假陰性的標(biāo)本有16例,占37.2%。結(jié)論:1.國產(chǎn)試劑與Roche試劑具有較好的相關(guān)性,表明國產(chǎn)試劑總體來說反映了標(biāo)本中的病毒載量水平,可以用于常規(guī)檢測。國產(chǎn)試劑與Roche試劑在病毒載量高于107 copy/ml以上時(shí)具有較好的相關(guān)性,在病毒載量低于≤106 copy/ml范圍內(nèi)的檢測精度相關(guān)性差。2.血清HBV DNA高滴度或低滴度持續(xù)存在是乙型肝炎病情進(jìn)展和肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素,血清HBV DNA的高精度檢測至關(guān)重要,建議對于HBV DNA低于106 copy/ml的標(biāo)本,尤其是經(jīng)過抗病毒治療后國產(chǎn)檢測低于檢測下限的,應(yīng)當(dāng)使用用Cobas高精度病毒載量檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測或復(fù)測,盡量避免假陰性結(jié)果而延誤患者病情。
二、熒光定量PCR技術(shù)測定HBV-DNA與乙肝血清學(xué)標(biāo)志分析比較（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會科學(xué)用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、熒光定量PCR技術(shù)測定HBV-DNA與乙肝血清學(xué)標(biāo)志分析比較（論文提綱范文）
（1）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情評估和耐藥監(jiān)測中的應(yīng)用（論文提綱范文）
| 縮略語表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴數(shù)字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的對比評價(jià) |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.3 討論 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特點(diǎn)及其臨床意義 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 第四章 恩替卡韋耐藥及部分病毒學(xué)應(yīng)答患者血清HBV RNA動力學(xué)特征以及用于長期監(jiān)測耐藥突變的初步研究 |
| 4.1 研究對象和方法 |
| 4.2 結(jié)果 |
| 4.3 討論 |
| 全文總結(jié)與研究展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 慢性乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的文章 |
| 致謝 |
（2）乙肝疫苗免疫對隱匿性HBV感染持久保護(hù)性的人群分析及HBV早期暴露影響乙肝疫苗抗原特異性濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的作用研究（論文提綱范文）
| 中英文縮寫與注解 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分: 新生兒期接種乙肝疫苗后對隱匿性HBV感染保護(hù)作用持久性的人群分析 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料和方法 |
| (三) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| (四) 討論 |
| (五) 小結(jié) |
| 第二部分: 胚胎期HBV暴露對乙肝疫苗抗原濾泡輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生及抗體應(yīng)答的影響 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料與方法 |
| (三) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| (四) 討論 |
| (五) 小結(jié) |
| 綜述 濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞的發(fā)育分化及其與B淋巴細(xì)胞相互作用 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 基金資助情況 |
| 發(fā)表文章 |
| 個(gè)人簡歷 |
| 致謝 |
（3）血清學(xué)標(biāo)志物檢測隱匿性乙型肝炎病毒感染研究價(jià)值分析及機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 中文論著摘要 |
| 英文論著摘要 |
| 英文縮略語 |
| 前言 |
| 實(shí)驗(yàn)材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新性的自我評價(jià) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 文獻(xiàn)綜述 隱匿性乙型肝炎病毒感染的研究現(xiàn)狀 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 在學(xué)期間科研成績 |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡歷 |
（4）乙肝病毒前基因組RNA在肝細(xì)胞癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 縮略詞表 |
| 第一部分 HBV-pgRNA通過與IGF2BP3相互調(diào)控,促進(jìn)HBV相關(guān)HCC的發(fā)生和進(jìn)展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、小結(jié) |
| 六、參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 IFN-α-2a通過增加pgRNA的m6A修飾降低其穩(wěn)定性,阻斷pg RNA-IGF2BP3 信號軸,抑制HCC的進(jìn)展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 五、小結(jié) |
| 六、參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 文獻(xiàn)綜述 乙型肝炎病毒前基因組 RNA 在乙肝相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制及臨床應(yīng)用中的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明 |
| 致謝 |
（5）用探針法雙重定量PCR同時(shí)檢測乙型肝炎病毒前基因組RNA和DNA（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 縮略詞表 |
| 第一部分 用于檢測培養(yǎng)上清中 HBV DNA 和 RNA 的雙重定量PCR 體系的建立 |
| 一、引言 |
| 二、材料與方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 用拷貝數(shù)相減法檢測 hep G2.2.15 細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中的 HBV DNA 和 RNA |
| 一、引言 |
| 二、材料與方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 雙重定量 PCR 檢測 HBV DNA 和 RNA 的方法的改良 |
| 一、引言 |
| 二、材料與方法 |
| 三、結(jié)果 |
| 四、討論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 工作小結(jié) |
| （一）主要研究內(nèi)容 |
| （二）下一步需要解決的問題 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 HBV RNA 的檢測方法和臨床意義研究進(jìn)展 |
| 一、病毒復(fù)制周期中的血清HBV RNA |
| 二、血清HBV RNA的種類和檢測方法 |
| 三、血清HBV RNA與其他HBV標(biāo)記物的相關(guān)性 |
| 四、血清HBV RNA的臨床意義 |
| 五、血清HBV RNA的研究展望 |
| 六、總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明 |
| 致謝 |
（6）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因組突變分析及時(shí)空動力學(xué)研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文縮略語表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料與方法 |
| 1.樣本來源 |
| 2.引物及擴(kuò)增條件 |
| 3.主要試劑、耗材及生產(chǎn)廠家 |
| 4.主要儀器設(shè)備及生產(chǎn)廠家 |
| 5.HBV生物信息學(xué)分析主要軟件 |
| 6.實(shí)驗(yàn)方法 |
| 7.HBV熒光定量PCR檢測 |
| 8.生物信息學(xué)分析方法 |
| 9.統(tǒng)計(jì)分析 |
| 10.質(zhì)量控制 |
| 二、結(jié)果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列擴(kuò)增結(jié)果 |
| 2.HBV DNA全長序列分型分析 |
| 3.青藏地區(qū)HBV/CD重組體不同區(qū)段系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果 |
| 4.青藏高原藏族人群全長序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重組體全序列基因變異分析結(jié)果 |
| 6.HBV血清型分析結(jié)果 |
| 三、討論 |
| 四、小結(jié) |
| 第二部分 HBV/CD重組型表面抗原抗體雙陽性研究 |
| 一、材料與方法 |
| 1.樣本來源 |
| 2.DNA序列拼接與分析 |
| 3.HBV熒光定量PCR檢測 |
| 4.統(tǒng)計(jì)分析 |
| 二、結(jié)果 |
| 1.HBsAg和HBsAb雙陽性的發(fā)生率 |
| 2.雙陽性組和對照組的基本信息 |
| 3.PreS/S區(qū)氨基酸突變率分析結(jié)果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突變位點(diǎn)分析結(jié)果 |
| 三、討論 |
| 四、小結(jié) |
| 第三部分 HBV/CD重組體時(shí)空動力學(xué)分析 |
| 一、材料與方法 |
| 1.HBV全長基因序列數(shù)據(jù)庫構(gòu)建 |
| 2.數(shù)據(jù)庫內(nèi)序列的基因型和重組分析 |
| 3.用于時(shí)空動態(tài)分析的主要工具和軟件 |
| 4.時(shí)空動態(tài)分析方法 |
| 5.統(tǒng)計(jì)分析 |
| 二、結(jié)果 |
| 1.HBV全長基因序列數(shù)據(jù)庫構(gòu)建情況 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析結(jié)果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析結(jié)果 |
| 4.HBV/CD1重組體tMRCA及種群動態(tài)分析結(jié)果 |
| 5.HBV/CD2重組體tMRCA及種群動態(tài)分析結(jié)果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型時(shí)空動態(tài)分析結(jié)果 |
| 三、討論 |
| 四、小結(jié) |
| 全文小結(jié)與展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb雙陽性研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 在讀期間發(fā)表文章 |
| 致謝 |
（7）兒童隱匿性乙肝病毒感染風(fēng)險(xiǎn)及檢測方法的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 兒童乙肝疫苗接種后隱匿性HBV感染的情況分析 |
| 1 研究對象與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 隱匿性乙肝病毒感染檢測方法的建立 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 攻讀碩士期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄 |
（8）應(yīng)用HBcAb陽性供肝的兒童肝移植受者術(shù)后新發(fā)乙肝風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)防方案的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 縮略語/符號說明 |
| 前言 |
| 研究現(xiàn)狀、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、乙肝病毒核心抗體陽性供肝應(yīng)用于兒童親體肝移植受者的危險(xiǎn)因素分析 |
| 1.1 對象和方法 |
| 1.1.1 供受者資料 |
| 1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1.3 血清學(xué)及病毒學(xué)測 |
| 1.1.4 肝臟組織HBV-DNA及HBV cccDNA的檢測 |
| 1.1.5 肝臟組織活檢及HBsAg檢測 |
| 1.1.6 HBV-YMDD測序分析 |
| 1.1.7 新發(fā)HBV感染標(biāo)準(zhǔn) |
| 1.1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 |
| 1.2 結(jié)果 |
| 1.2.1 一般資料 |
| 1.2.2 根據(jù)供者HBcAb檢測結(jié)果進(jìn)行分組 |
| 1.2.3 供者HBcAb陽性組及陰性組術(shù)后新發(fā)HBV感染情況 |
| 1.2.4 HBV cccDNA與受者新發(fā)HBV感染的關(guān)系 |
| 1.2.5 新發(fā)HBV感染的危險(xiǎn)因素分析 |
| 1.2.6 供者血清HBcAb(+)與供肝組織HBV cccDNA(+)相關(guān)性分析 |
| 1.2.7 兒童受者新發(fā)HBV感染的診斷、治療及結(jié)局 |
| 1.3 討論 |
| 1.3.1 應(yīng)用HBcAb陽性供肝對兒童肝移植的必要性 |
| 1.3.2 應(yīng)用HBcAb陽性供肝的受者新發(fā)HBV感染的風(fēng)險(xiǎn)性 |
| 1.3.3 應(yīng)用HBcAb陽性供肝受者新發(fā)HBV感染的機(jī)制 |
| 1.3.4 應(yīng)用HBcAb陽性供肝兒童受體術(shù)后新發(fā)HBV感染的預(yù)防治療 |
| 1.4 小結(jié) |
| 二、乙肝疫苗主動免疫治療方案預(yù)防HBcAb陽性供肝兒童肝移植術(shù)后新發(fā)HBV感染的研究 |
| 2.1 對象和方法 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.2.1 乙肝疫苗主動免疫預(yù)防方案的一般情況 |
| 2.2.2 供受者特征對乙肝疫苗主動免疫預(yù)防術(shù)后新發(fā)HBV的影響 |
| 2.2.3 受者手術(shù)情況對乙肝疫苗主動免疫預(yù)防術(shù)后新發(fā)HBV的影響 |
| 2.2.4 受者術(shù)后HBsAb滴度下降速度對乙肝疫苗預(yù)防術(shù)后新發(fā)HBV的影響 |
| 2.2.5 術(shù)后并發(fā)癥對乙肝疫苗主動免疫預(yù)防術(shù)后新發(fā)HBV的影響 |
| 2.2.6 影響乙肝疫苗主動免疫預(yù)防兒童肝移植術(shù)后新發(fā)HBV的因素 |
| 2.2.7 新發(fā)HBV感染案例的特點(diǎn)及診斷、治療 |
| 2.2.8 兒童肝移植受者術(shù)后HBsAb滴度變化的影響因素 |
| 2.3 討論 |
| 2.3.1 應(yīng)用乙肝疫苗主動免疫預(yù)防兒童肝移植術(shù)后新發(fā)HBV的意義 |
| 2.3.2 乙肝疫苗主動免疫的方案及效果 |
| 2.3.3 肝移植術(shù)后HBsAb滴度變化速度的影響 |
| 2.3.4 影響乙肝疫苗主動免疫預(yù)防兒童肝移植術(shù)后新發(fā)HBV的因素 |
| 2.4 小結(jié) |
| 三、兒童受者強(qiáng)化乙肝疫苗方案反應(yīng)差異性分析 |
| 3.1 對象和方法 |
| 3.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 |
| 3.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.2.1 乙肝疫苗反應(yīng)強(qiáng)度分組情況及各組受者的特征 |
| 3.2.2 受者NK細(xì)胞比例對乙肝疫苗反應(yīng)強(qiáng)度的影響 |
| 3.2.3 受者NK細(xì)胞的功能對乙肝疫苗反應(yīng)強(qiáng)度的影響 |
| 3.2.4 NK細(xì)胞中模式識別受體信號通路對乙肝疫苗反應(yīng)強(qiáng)度的影響 |
| 3.2.5 受者血清中細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ含量對乙肝疫苗反應(yīng)速度的作用 |
| 3.3 討論 |
| 3.3.1 研究影響乙肝疫苗反應(yīng)強(qiáng)度因素的必要性 |
| 3.3.2 影響強(qiáng)化乙肝疫苗方案反應(yīng)強(qiáng)度的機(jī)制 |
| 3.4 小結(jié) |
| 全文結(jié)論 |
| 論文創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 綜述 乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白研究進(jìn)展 |
| 綜述參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡歷 |
（9）超敏HBV DNA檢測在慢性HBV感染者中的動態(tài)監(jiān)測價(jià)值（論文提綱范文）
| 英文縮略詞表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 結(jié)果 |
| 4 討論 |
| 5 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 本人簡歷 |
| 研究生期間獲獎(jiǎng)情況 |
| 學(xué)術(shù)論文 |
| 在讀期間參加的科研工作 |
| 致謝 |
| 綜述 低載量HBV DNA在慢性乙型肝炎中的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
（10）國產(chǎn)試劑與Roche試劑HBV DNA熒光定量PCR檢測方法的精度比較（論文提綱范文）
| 英文縮略語 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 個(gè)人簡歷 |
| 致謝 |
| 綜述 慢性乙型肝炎的病毒學(xué)檢測及預(yù)后 |
| 參考文獻(xiàn) |
四、熒光定量PCR技術(shù)測定HBV-DNA與乙肝血清學(xué)標(biāo)志分析比較（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情評估和耐藥監(jiān)測中的應(yīng)用[D]. 李茂仕. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué), 2021(01)
- [2]乙肝疫苗免疫對隱匿性HBV感染持久保護(hù)性的人群分析及HBV早期暴露影響乙肝疫苗抗原特異性濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的作用研究[D]. 王睿君. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2021
- [3]血清學(xué)標(biāo)志物檢測隱匿性乙型肝炎病毒感染研究價(jià)值分析及機(jī)制研究[D]. 劉曉紅. 錦州醫(yī)科大學(xué), 2021(01)
- [4]乙肝病毒前基因組RNA在肝細(xì)胞癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究[D]. 丁文斌. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué), 2020
- [5]用探針法雙重定量PCR同時(shí)檢測乙型肝炎病毒前基因組RNA和DNA[D]. 徐博文. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué), 2020(02)
- [6]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因組突變分析及時(shí)空動力學(xué)研究[D]. 劉賀. 中國疾病預(yù)防控制中心, 2020(02)
- [7]兒童隱匿性乙肝病毒感染風(fēng)險(xiǎn)及檢測方法的研究[D]. 楊宇婷. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2020(12)
- [8]應(yīng)用HBcAb陽性供肝的兒童肝移植受者術(shù)后新發(fā)乙肝風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)防方案的研究[D]. 董沖. 天津醫(yī)科大學(xué), 2020(06)
- [9]超敏HBV DNA檢測在慢性HBV感染者中的動態(tài)監(jiān)測價(jià)值[D]. 王同同. 安徽醫(yī)科大學(xué), 2020(02)
- [10]國產(chǎn)試劑與Roche試劑HBV DNA熒光定量PCR檢測方法的精度比較[D]. 巫智勇. 安徽醫(yī)科大學(xué), 2020(02)
標(biāo)簽：基因型論文; 乙肝表面抗原陽性論文; 乙肝陰性論文; 兩對半論文; 乙肝核心抗體論文;