一、Transforming growth factor-β1 suppresses serum deprivation-induced apop-tosis via activation of ERK1/ERK2 and the inhibition of p38 activity and ceramide production（論文文獻綜述）

Matias Estaras,Antonio Gonzalez^[1]（2021）在《Modulation of cell physiology under hypoxia in pancreatic cancer》文中研究指明In solid tumors, the development of vasculature is, to some extent, slower than the proliferation of the different types of cells that form the tissue, both cancer and stroma cells. As a consequence, the oxygen availability is compromised and the tissue evolves toward a condition of hypoxia. The presence of hypoxia is variable depending on where the cells are localized, being less extreme at the periphery of the tumor and more severe in areas located deep within the tumor mass. Surprisingly, the cells do not die. Intracellular pathways that are critical for cell fate such as endoplasmic reticulum stress, apoptosis, autophagy, and others are all involved in cellular responses to the low oxygen availability and are orchestrated by hypoxia-inducible factor. Oxidative stress and inflammation are critical conditions that develop under hypoxia. Together with changes in cellular bioenergetics, all contribute to cell survival. Moreover, cell-to-cell interaction is established within the tumor such that cancer cells and the microenvironment maintain a bidirectional communication. Additionally, the release of extracellular vesicles, or exosomes, represents short and long loops that can convey important information regarding invasion and metastasis. As a result, the tumor grows and its malignancy increases. Currently, one of the most lethal tumors is pancreatic cancer. This paper reviews the most recent advances in the knowledge of how cells grow in a pancreatic tumor by adapting to hypoxia. Unmasking the physiological processes that help the tumor increase its size and their regulation will be of major relevance for the treatment of this deadly tumor.

張樹文^[2]（2021）在《基于氧化應激探討槲皮素防治椎間盤退變的實驗研究》文中認為目的:（1）以D-半乳糖構(gòu)建髓核細胞衰老模型,并探討其誘導髓核細胞衰老的氧化應激機制;（2）分析槲皮素對D-半乳糖誘導髓核細胞衰老、衰老相關(guān)分泌表型以及細胞外基質(zhì)合成、分解代謝的影響;探討槲皮素通過p38 MAPK信號通路調(diào)控自噬減輕D-半乳糖誘導髓核細胞衰老退變的分子機制;（3）經(jīng)皮細針纖維環(huán)穿刺建立SD大鼠尾椎椎間盤退變模型,探究槲皮素在椎間盤退變防治中的作用。方法:（1）通過CCK-8細胞活性實驗、細胞周期實驗評估D-半乳糖對髓核細胞增殖活性的影響;應用衰老相關(guān)標記物檢測D-半乳糖對髓核細胞衰老及衰老相關(guān)分泌表型的影響;通過RT-q PCR、免疫熒光以及翻紅O染色分析D-半乳糖誘導髓核細胞衰老對細胞外基質(zhì)代謝的影響;通過檢測細胞內(nèi)活性氧ROS、超氧化物歧化酶SOD和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA明確D-半乳糖誘導髓核細胞衰老的氧化應激機制。（2）通過CCK-8細胞活性實驗、細胞周期實驗評估槲皮素對D-半乳糖抑制髓核細胞增殖活性的影響;通過β-半乳糖甘酶染色、β-半乳糖甘酶活性、RT-q PCR等分析槲皮素對D-半乳糖誘導髓核細胞衰老及衰老相關(guān)分泌表型的影響;使用條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)模式分析槲皮素抑制髓核細胞衰老及衰老相關(guān)分泌表型對單核巨噬細胞遷移和極化作用的影響;通過Western blot分析槲皮素對MAPK（JNK、ERK、p38）信號通路的影響。（3）通過Western blot、免疫熒光以及電鏡掃描明確槲皮素對髓核細胞自噬的激活作用;使用3-MA抑制劑抑制自噬明確槲皮素通過激活自噬減輕D-半乳糖誘導的髓核細胞衰老和細胞外基質(zhì)降解的保護作用;使用p38MAPK抑制劑SB203580明確槲皮素通過調(diào)節(jié)p38MAPK介導的自噬保護椎間盤退變。（4）通過X線透視和MRI掃描在影像學上評估槲皮素防治椎間盤退變的作用;使用HE染色評估椎間盤的病理變化,阿利新藍和翻紅O-固綠染色、免疫組織化學分析椎間盤組織中細胞外基質(zhì)蛋白聚糖的含量和分布;應用免疫組織化學評估槲皮素對細針穿刺誘導椎間盤細胞凋亡和自噬指標的影響。結(jié)果:（1）CCK-8細胞增殖活性和細胞周期結(jié)果表明50g/L的D-半乳糖明顯降低髓核細胞的增殖活性并出現(xiàn)細胞周期G1期阻滯;β-半乳糖甘酶染色、β-半乳糖甘酶活性以及衰老相關(guān)蛋白p53、p21、p16均明顯增加;RT-q PCR結(jié)果提示衰老相關(guān)分泌表型在衰老髓核細胞中明顯增加,以CCL2和MMP13最為顯著;RT-q PCR、免疫熒光、翻紅O染色結(jié)果表明衰老髓核細胞中II型膠原和蛋白聚糖明顯降低;D-半乳糖誘導氧化應激反應,包括ROS和MDA含量的升高以及超氧化物歧化酶SOD活性的降低。（2）CCK-8結(jié)果表明25u M槲皮素對髓核細胞活性無影響,且逆轉(zhuǎn)D-半乳糖對髓核細胞活性的抑制作用;細胞周期結(jié)果表明槲皮素減輕D-半乳糖引起的G1周期阻滯;條件培養(yǎng)基對單核巨噬細胞的遷移和極化實驗表明槲皮素抑制髓核細胞衰老的條件培養(yǎng)基減少了單核巨噬細胞的遷移和向M1型巨噬細胞的極化作用;Western blot結(jié)果表明槲皮素通過調(diào)節(jié)JNK、ERK、p38 MAPK信號通路保護髓核細胞免受氧化應激損傷。（3）Western Blot、免疫熒光以及電鏡結(jié)果表明槲皮素可以激活自噬并通暢自噬流,自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3II/I的表達升高,p62表達降低,給予3-MA預處理髓核細胞明顯降低了槲皮素對髓核細胞自噬激活的作用;抑制自噬減少了槲皮素對髓核細胞外基質(zhì)的保護作用,促進衰老相關(guān)蛋白和衰老相關(guān)分泌的表達;槲皮素降低了由D-半乳糖引起的p38MAPK、m TOR的磷酸化水平,抑制p38MAPK的磷酸化可以激活髓核細胞自噬并促進自噬流通暢。（4）細針穿刺成功構(gòu)建椎間盤退變模型,椎間盤高度指數(shù)明顯降低、Pfirrmann分級明顯升高;槲皮素延緩細針穿刺誘導的椎間盤退變,增加椎間盤高度指數(shù),降低Pfirrmann分級。HE染色結(jié)果表明模型組髓核面積減小,細胞數(shù)量減少,髓核與纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂,槲皮素延緩椎間盤退變的進展,改善病理改良評分。阿利新藍、翻紅O-固綠以及蛋白聚糖免疫組織化學染色結(jié)果提示穿刺模型組損傷區(qū)髓核組織蛋白聚糖大量丟失且異常分布,槲皮素有效減少了蛋白聚糖的丟失和異常分布。免疫組織化學分析凋亡相關(guān)蛋白Bax和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1,研究結(jié)果表明槲皮素處理減輕髓核細胞凋亡并促進髓核細胞的自噬水平。結(jié)論:（1）50g/L的D-半乳糖通過氧化應激途徑誘導髓核細胞衰老和衰老相關(guān)分泌表型,降低髓核細胞活性,阻滯細胞周期,且加速細胞外基質(zhì)分解代謝。（2）槲皮素預處理通過調(diào)控MAPK信號通路改善D-半乳糖誘導的髓核細胞衰老和衰老相關(guān)分泌表型的表達。（3）槲皮素通過p38MAPK介導的自噬抑制氧化應激誘導髓核細胞衰老退變。（4）槲皮素減輕細針穿刺誘導的椎間盤退變,影像學和組織病理學結(jié)果證實了其對椎間盤退變潛在的防治效果。

程勁^[3]（2020）在《氫化鎂調(diào)控PLIN2緩解結(jié)晶腎損傷的作用和機制研究》文中指出研究背景腎結(jié)石是全球的常見疾病,可以導致慢性腎臟病,甚至腎臟喪失,給許多國家?guī)砹顺林氐纳鐣?jīng)濟和醫(yī)療負擔。2017年全國關(guān)于腎結(jié)石的流行病調(diào)查顯示:腎結(jié)石的發(fā)生率為6.4%,且10年的復發(fā)率為52%。腎結(jié)石的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都在增加,這些增加在性別、種族和年齡上都可以看到,代謝功能障和飲食習慣的改變可能是一個關(guān)鍵的驅(qū)動力,此外,全球變暖可能會影響這些趨勢。最近的流行病學研究表明,腎結(jié)石與心血管疾病、高血壓、肥胖、糖尿病、代謝綜合征有關(guān),這些都是公認的慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease,CKD）危險因素。因此,深入研究腎結(jié)石的發(fā)生、發(fā)展機制,加強預防和治療迫在眉睫。大量的研究已經(jīng)證實80-90%的結(jié)石成分為草酸鈣（calcium oxalate,Ca Ox）。無論是動物實驗還是臨床實驗均顯示,腎小管上皮細胞暴露于高草酸或Ca Ox結(jié)晶中,晶體中會產(chǎn)生過量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）,導致?lián)p傷和炎癥。在結(jié)石患者和實驗誘導的Ca Ox腎結(jié)石大鼠的尿液中都可以檢測到氧化應激和炎癥的主要標志。抗氧化處理可以減少草酸鈣結(jié)晶腎動物模型的腎臟損傷。由此可見,氧化應激和炎癥反應在整個Ca Ox結(jié)石形成、進展過程中起著重要作用。氫作為自然界最簡單和最豐富的元素,曾經(jīng)被認為對高等生物沒有任何生物學效應,自日本科學家發(fā)現(xiàn)氫氣可通過選擇性抗氧化治療疾病后,氫氣在各個領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注和研究,且發(fā)現(xiàn)氫氣在多種疾病模型和人類疾病中顯示出預防和治療效果。近年來,固態(tài)氫載體的生物學效應,成為氫醫(yī)學的熱點。納米氫化鎂（MagnesiumHydride,Mg H2）是一種新型高效的鎂基儲氫材料,具有高儲氫、質(zhì)量輕等優(yōu)點,能夠水解緩慢釋放氫氣,持續(xù)時間長。2016年首次有學者將氫化鎂用于生物學研究,研究結(jié)果提示氫化鎂能夠改善喂食高脂飲食的野生型小鼠的血漿甘油三酯水平,并延長了它們的平均壽命,可能的機制是氫化鎂在體內(nèi)產(chǎn)生氫氣,氫氣刺激過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α（PGC-1α）基因表達促進脂肪酸代謝。因為氫化鎂較氫氣具有攜帶方便,使用方便,且體內(nèi)緩慢釋放氫氣,具有一定的量效關(guān)系,所以推測氫化鎂對結(jié)晶腎損傷模型應有一定的改善作用。但是氫化鎂對結(jié)晶腎損傷的保護機制仍不明確,需要進一步研究。Perilipin2（PLIN2）是一種脂肪相關(guān)分化蛋白,主要定位于細胞內(nèi)脂滴表面,促進胞內(nèi)脂滴形成,保護甘油三酯免受脂解。PLIN2作為特異性性標記物可以推測動脈粥樣硬化的脂質(zhì)積聚情況,而且還可以影響多種代謝相關(guān)性疾病如胰島素抵抗、糖尿病、脂肪肝及肥胖癥等都。本研究旨在探討氫化鎂是否具有改善結(jié)晶腎模型腎損傷的程度及是否能夠通過PLIN2發(fā)揮其改善作用。研究目的一、氫化鎂改善草酸鹽誘導的結(jié)晶腎損傷的作用研究二、氫化鎂緩解結(jié)晶腎損傷的潛在靶點篩選三、氫化鎂調(diào)控PLIN2緩解結(jié)晶腎損傷的機制研究研究方法一、動物模型的建立及分組動物實驗一:購買36只雄性野生型C57B/L6小鼠（8周齡）,隨機分為6組,分別是鹽水組（Con,n=6）、乙醛酸鹽組（Gly,n=6）、乙醛酸鹽+氫化鎂50mg/Kg組（Gly+MH50,n=6）、乙醛酸鹽+氫化鎂100mg/Kg組（Gly+MH100,n=6）、乙醛酸鹽+氫化鎂200mg/Kg組（Gly+MH200,n=6）、乙醛酸鹽+氫化鎂400mg/Kg組（Gly+MH400,n=6）。動物實驗二:另40只雄性C57BL/6小鼠（8周齡）,隨機分為5個實驗組:鹽水組（Con,n=8）;乙醛酸誘導的草酸鈣結(jié)晶組（Gly,n=8）;乙醛酸+氫化鎂組（GH,n=8）;乙醛酸+氫氧化鎂組（GOH,n=8）;乙醛酸+玉米油組（GV,n=8）。動物實驗一:提前2天分別使用50、100、200、400 mg/kg劑量的Mg H2灌胃治療。第3天給予乙醛酸鹽腹腔注射造模,1天一次,連續(xù)注射5天,第8天處死小鼠。動物實驗二:提前2天分別予氫化鎂（200mg/kg）、氫氧化鎂（450mg/kg）、玉米油0.1ml灌胃,第3天給予乙醛酸鹽腹腔注射造模,1天一次,連續(xù)注射5天,第8天處死小鼠。二、腎組織病理染色腎組織取材固定后,進行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘片,按照實驗步驟,進行H&E、Masson、Vonkossa、免疫組化、免疫熒光等染色,使用光學顯微鏡和熒光顯微鏡進行拍照。三、小鼠腎功能及氧化應激指標的檢測小鼠麻醉后,眼球取血、靜置、離心、取上清,備用。采取競爭法酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)（ELISA）,購買相應檢測指標的Kit,根據(jù)實驗步驟檢測。四、細胞培養(yǎng)、分組和干預使用小鼠腎小管上皮細胞（TCMK-1）作為體外實驗細胞,配制DMEM培養(yǎng)基,在DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液）。細胞實驗分組:Con組:TCMK-1細胞,每天定時觀察細胞狀態(tài)、更換新鮮培養(yǎng)基未添加任何刺激;Na Ox組:加入草酸鈉濃度（0.5m M）共孵育,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時;Na Ox+H2組:加入草酸鈉濃度（0.5m M）后放入含氫細胞培養(yǎng)箱12小時,12小時后取出放培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。Con+H2組:TCMK-1細胞同樣放入含氫細胞培養(yǎng)箱12小時,12小時后取出放培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。五、細胞活力檢測使用CCK-8檢測試劑盒檢測,根據(jù)實驗步驟,在96孔培養(yǎng)板中加入不同濃度的草酸鈉,在培養(yǎng)箱中孵育不同的時間,另一個96孔板增加含氫培養(yǎng),最后加入CCK-8溶液,利用酶標儀測定其在450nm處OD值。六、細胞內(nèi)ROS檢測配制DCFH-DA至10umol/l,將收集好的細胞置于DCFH-DA中,放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)20分鐘取出,流式細胞儀檢測DCF水平。七、細胞線粒體膜電位的檢測根據(jù)試劑盒的說明將CCCP（10m M）1:1000加入到細胞培養(yǎng)液中,配成終濃度10μM,孵育細胞20分鐘,裝載JC-1,通過流式細胞儀檢測線粒體的膜電位。八、組織與細胞蛋白檢測利用總蛋白提取試劑提取組織或細胞蛋白,研磨、離心、取上清液,BCA法檢測樣品蛋白的濃度,加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）,100℃金屬浴,5-10min。-20℃冰箱保存,通過蛋白免疫印跡法檢測進目的蛋白水平。九、組織和細胞RNA檢測使用Trizol試劑提取組織或細胞總RNA,檢測RNA濃度,利用商品化kit使m RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏 DNA,SYBR Green染料法檢測實時熒光定量PCR。十、代謝組學、高通量轉(zhuǎn)錄組檢測和生物信息學預測利用超高壓液相色譜-四級桿-時間飛行串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF-MS）方法檢測腎組織代謝組學。高通量轉(zhuǎn)錄組檢測步驟:腎組織總RNA提取、總RNA純度和完整性檢測、文庫構(gòu)建、上機測序、測序數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列比對分析、表達量分析、表達量差異分析、RNA-SEQ篩選差異基因、GO分析及KEGG分析、差異基因篩選及驗證。使用NCBI GEO Data Sets驗證PLIN2在腎臟的表達水平。預測PLIN2上游轉(zhuǎn)錄因子步驟:首先利用NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索PLIN2上游啟動子序列;接著利用UCSC數(shù)據(jù)庫（http://genome.ucsc.edu/）預測與PLIN2啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子;然后利用JASPAR數(shù)據(jù)庫（http://jaspar.genereg.net/）分析預測的轉(zhuǎn)錄因子與PLIN2上游啟動子序列的結(jié)合位點。十一、統(tǒng)計學方法計量數(shù)據(jù)采用（均數(shù)±標準誤）表示,應用Grapha Pad軟件繪制統(tǒng)計圖表繪制及分析數(shù)據(jù),采用兩獨立樣本t檢驗和單因素方差分析one-way ANOVA進行各組之間的統(tǒng)計分析,各組間兩兩比較采用Tukey post-hoc檢驗,p<0.05表示組間有統(tǒng)計學差異。結(jié)果一、氫化鎂改善結(jié)晶腎損傷的病理評價（一）氫化鎂治療結(jié)晶腎損傷的具有劑量效應關(guān)系通過給予不同劑量的氫化鎂干預乙醛酸鹽誘導結(jié)晶腎損傷小鼠,腎組織行H&E、Masson、Vonkossa染色等,發(fā)現(xiàn)隨著氫化鎂劑量的增加,腎損傷程度逐漸減輕,而且結(jié)晶/結(jié)石沉積有所減少,氫化鎂200mg/kg和400mg/kg改善作用無明顯差異,為后續(xù)動物實驗奠定了基礎(chǔ)。（二）氫化鎂改善結(jié)晶腎損傷模型腎功能及腎小管損傷小鼠腎組織病理結(jié)果顯示,乙醛酸鹽誘導的小鼠腎小管急性損傷明顯,伴有大量草酸鈣結(jié)晶沉積,且纖維化相關(guān)指標FN、TGF-β顯著高表達,TUNEL染色,凋亡細胞明顯,氫化鎂治療組,不僅小管急性損傷有所改善,草酸鈣結(jié)晶也明顯減少及FN、TGF-β、凋亡細胞均顯著減少。同時氫化鎂治療組小鼠腎功能有所改善。氫氧化鎂組和玉米油組均無上述作用。二、氫氣對草酸鈉處理后的TCMK-1細胞活力及氧化應激的影響細胞CCK8結(jié)果提示氫氣可以改善草酸鈉誘導的TCMK-1細胞活力的下降。草酸鈉誘導TCMK-1細胞內(nèi)ROS水平升高,并使線粒體膜電位下降,氫氣能夠降低草酸鈉誘導產(chǎn)生的ROS,并通過上調(diào)線粒體膜電位改善線粒體的功能。三、小鼠腎組織代謝組學分析用UPLC-Q-TOF/MS分析5組小鼠腎組織勻漿（Con,Gly,GH,GOH,GV）樣品,結(jié)果顯示草酸鈣晶體腎損傷模型出現(xiàn)代謝紊亂,主要包括能量代謝、磷脂代謝和氨基酸代謝途徑的變化,而氫化鎂治療在一定程度回調(diào)上述代謝紊亂,其中以磷脂代謝回調(diào)最顯著。磷脂作為生物膜的主要成分,在氫化鎂治療后顯著逆轉(zhuǎn),表明氫化鎂的治療可能是通過細胞膜保護實現(xiàn)的。四、小鼠腎組織高通量轉(zhuǎn)錄組測序與分析利用RNA-SEQ對氫化鎂治療的結(jié)晶腎小鼠進行差異基因篩選,得到差異基因總數(shù)2539,其中上調(diào)基因總數(shù)1543個,下調(diào)基因996個,并對差異基因進行GO分析及KEGG分析。選擇部分差異基因進行q RT-PCR驗證,與測序結(jié)果相一致。結(jié)合腎組織代謝組學結(jié)果,選擇與脂質(zhì)代謝高度相關(guān)的PLIN2基因作為下一步研究對象。五、PLIN2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子生物信息學預測和體內(nèi)外驗證利用生物信息學篩選出4個重要的PLIN2上游轉(zhuǎn)錄因子,分別是STAT4、C-JUN、PPARγ和PPARα,選擇強相關(guān)的C-JUN和STAT4進行下一步驗證發(fā)現(xiàn)p-C-JUN在結(jié)晶腎小鼠腎組織中高表達,且定位于腎小管上皮細胞胞核內(nèi),體內(nèi)外實驗WB檢測也證實p-C-JUN在模型組升高,氫化鎂治療后可回調(diào),與PLIN2趨勢一致,p-STAT4在小鼠模型中沒有高表達,且沒有定位在上皮細胞核內(nèi)。六、氫化鎂改善結(jié)晶腎損傷小鼠氧化應激、炎癥和脂質(zhì)過氧化水平體內(nèi)實驗:利用ELISA方法,檢測結(jié)晶腎小鼠血清炎癥指標（TNF-α,IL-1β）,氧化應激指標（GSH,NO）,脂質(zhì)過氧化指標（MDA,4HNE）,結(jié)果提示,氫化鎂可以有效的改善結(jié)晶腎損傷的炎癥反應、氧化應激和脂質(zhì)過氧化水平。體外實驗:流式細胞儀記錄草酸鈉處理后TCMK-1細胞內(nèi)ROS的水平和線粒體膜電位,結(jié)果提示,Na Ox組細胞內(nèi)ROS水平升高,線粒體膜電位下降,氫氣處理后,上述指標均可回調(diào)。結(jié)論一、氫化鎂能夠有效的緩解結(jié)晶腎腎小管損傷,改善腎功能,改善機體炎癥、氧化應激和凋亡水平。二、氫化鎂可能是通過清除ROS,抑制C-JUN活化,下調(diào)PLIN2,改善脂質(zhì)過氧化來實現(xiàn)的。

金山^[4]（2020）在《TGF-β1的巖藻糖基化修飾對卵巢癌細胞線粒體自噬的影響及機制》文中研究指明目的:在課題組前期工作基礎(chǔ)上,檢測TGF-β1對卵巢癌細胞自噬和線粒體自噬的影響;構(gòu)建Lewis y抗原過表達或低表達的卵巢癌細胞系,檢測TGF-β1的巖藻糖基化修飾對卵巢癌自噬和線粒體自噬的影響,并對其調(diào)控機制進行初步探討,為卵巢癌的治療尋找新的靶點提高理論依據(jù)。研究方法:1、通過Western blot檢測不同濃度和時間點的TGF-β1作用下卵巢癌細胞自噬相關(guān)蛋白表達的變化。通過免疫熒光檢測TGF-β1處理后卵巢癌細胞中LC3變化情況。添加自噬抑制劑氯喹（Chloroquine,CQ）阻斷自噬流,通過Western blot、免疫熒光等方法觀察TGF-β1作用后卵巢癌細胞自噬流的變化情況。瞬時轉(zhuǎn)染雙熒光標記的LC3腺病毒后檢測TGF-β1作用下卵巢癌細胞自噬流的變化情況。通過TMRM染色檢測TGF-β1作用前后卵巢癌細胞線粒體膜電位變化情況。繼而通過Western blot檢測不同濃度和時間點TGF-β1作用下對卵巢癌細胞線粒體自噬發(fā)生的影響。通過免疫熒光檢測TGF-β1作用下線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1的表達情況。通過Annexin V/FITC流式方法檢測不同濃度TGF-β1作用下卵巢癌細胞凋亡發(fā)生情況。隨之添加自噬抑制劑3-Methyladenine（3-MA）后檢測卵巢癌細胞凋亡發(fā)生水平的變化。2、首先分別轉(zhuǎn)染FUT1質(zhì)粒和shFUT1病毒,構(gòu)建Lewis y抗原過表達和低表達卵巢癌細胞模型,檢測Lewis y和TGF-β1的表達,并利用免疫共沉淀方法驗證TGF-β1和Lewis y抗原結(jié)構(gòu)關(guān)系。我們繼而在此細胞模型的基礎(chǔ)上重新檢測第一部分方法內(nèi)容。3、通過Western blot檢測TGF-β1作用后卵巢癌細胞中TAK1蛋白表達。轉(zhuǎn)染siTAK1后分別通過Western blot、免疫熒光、雙熒光標記的LC3腺病毒、TMRM檢測TGF-β1作用下干擾TAK1表達對卵巢癌細胞自噬、自噬流、線粒體膜電位及線粒體自噬發(fā)生的變化情況;同時檢測相關(guān)通路變化情況。結(jié)果:1、隨著TGF-β1處理濃度的升高自噬因子LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5和Atg7的表達水平也增高,同時p62的蛋白表達下調(diào),并均呈濃度依賴性。不同時間點TGF-β1作用下,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7等在12、24、48h達到蛋白水平的峰值,p62則與時間呈負相關(guān)。用免疫熒光檢測LC3的變化,TGF-β1作用后LC3熒光呈紅色明亮小斑點,而未處理組熒光呈散在紅色熒光。用CQ處理TGF-β1添加前后的細胞,TGF-β1處理后LC3的表達水平升高更明顯,同時Beclin-1、Atg5、Atg7、p62等蛋白表達情況進一步驗證了上述結(jié)果。免疫熒光檢測下,TGF-β1組LC3的紅色熒光小斑點增多更明顯。用Ad-m RFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細胞,與對照組相比,TGF-β1顯著促進呈黃色熒光信號的自噬小體的積累。TMRM檢測提示TGF-β1引起細胞線粒體膜電位去極化。不同濃度TGF-β1處理后,PINK1、Bnip3、Parkin等線粒體自噬蛋白表達均隨著TGF-β1濃度升高而增高,呈濃度依賴性。不同時間點TGF-β1作用下,PINK1、Bnip3、Parkin等蛋白均在24h達到峰值;免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比,TGF-β1作用24h后PINK1熒光明顯增強,表達明顯升高。流式檢測發(fā)現(xiàn),隨著TGF-β1濃度的增加,卵巢癌細胞凋亡率亦增加,呈濃度依賴性;自噬抑制劑3-MA處理后可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1導致的細胞凋亡。2、FUT1基因轉(zhuǎn)染后,細胞中Lewis y表達增加,TGF-β1及其上的Lewis y表達較轉(zhuǎn)染前增加,同時發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5和Atg7的蛋白表達均增高,p62蛋白水平下調(diào);同時促進TGF-β1對細胞自噬的作用。FUT1基因轉(zhuǎn)染后,細胞TMRM染色熒光變?nèi)?線粒體膜電位呈去極化;并促進了TGF-β1引起的線粒體膜電位去極化。FUT1基因轉(zhuǎn)染后,線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Bnip3、Parkin等表達增高,且促進TGF-β1對線粒體自噬的作用。轉(zhuǎn)染shFUT1后結(jié)果與之相反。shFUT1轉(zhuǎn)染后,細胞凋亡率增高,部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1引起的細胞凋亡。3、TGF-β1作用下細胞中TAK1蛋白表達增加。在TGF-β1作用下,轉(zhuǎn)染siTAK1后抑制卵巢癌細胞自噬以及線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達和線粒體膜電位的去極化;FUT1基因轉(zhuǎn)染后,部分逆轉(zhuǎn)了上述現(xiàn)象。在TGF-β1作用下,轉(zhuǎn)染siTAK1后,PI3K、Akt、ERK1/2無明顯改變,但p-PI3K、p-Akt、p-ERK1/2表達明顯下調(diào);添加MEK或PI3K通路抑制劑后TAK1對自噬和線粒體自噬的作用下調(diào)。TGF-β1處理后,mTOR表達無明顯改變,p-mTOR表達下調(diào),FUT1基因轉(zhuǎn)染后,p-mTOR蛋白下調(diào)更加明顯,干擾TAK1后則減弱了p-mTOR蛋白的下調(diào)。結(jié)論:1、TGF-β1促進卵巢癌細胞自噬的發(fā)生,并呈濃度依賴性;引起細胞線粒體膜電位去極化,促進卵巢癌細胞線粒體自噬的發(fā)生。TGF-β1引起細胞發(fā)生凋亡,呈濃度依賴性;抑制自噬可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的細胞凋亡。2、TGF-β1存在Lewis y抗原修飾,且TGF-β1的Lewis y抗原修飾進一步促進卵巢癌細胞自噬的發(fā)生;加劇線粒體膜電位的去極化,增強線粒體自噬的發(fā)生。TGF-β1的Lewis y抗原修飾減弱TGF-β1誘導細胞凋亡的作用。3、TGF-β1通過TAK1誘導卵巢癌細胞發(fā)生自噬,引起膜電位的去極化以及線粒體自噬的發(fā)生,TGF-β1的Lewis y抗原修飾進一步促進上述作用。TGF-β1與其受體結(jié)合激活TAK1,通過磷酸化PI3K/Akt以及ERK1/2信號通路,調(diào)控下游mTOR蛋白的磷酸化,進而影響自噬和線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達,從而調(diào)控自噬和線粒體自噬的發(fā)生。

Mei Li Ng,Nagendra S Yarla,Mario Menschikowski,Olga A Sukocheva^[5]（2018）在《Regulatory role of sphingosine kinase and sphingosine-1-phosphate receptor signaling in progenitor/stem cells》文中研究表明Balanced sphingolipid signaling is important for the maintenance of homeostasis. Sphingolipids were demonstrated to function as structural components, second messengers, and regulators of cell growth and survival in normal and disease-affected tissues. Particularly, sphingosine kinase 1 （SphK1） and its product sphingosine-1-phosphate （S1P） operate as mediators and facilitators of proliferation-linked signaling. Unlimited proliferation （selfrenewal） within the regulated environment is a hallmark of progenitor/stem cells that was recently associated with the S1P signaling network in vasculature, nervous,muscular, and immune systems. S1P was shown to regulate progenitor-related characteristics in normal and cancerstemcells（CSCs） viaG-protein coupled receptorsS1Pn（n=1 to 5）. The SphK/S1P axis is crucially involved in the regulation of embryonic development of vasculature and the nervous system, hematopoietic stem cell migration, regeneration of skeletal muscle, and development of multiple sclerosis. The ratio of the S1P receptor expression, localization, and specific S1P receptoractivated downstream effectors influenced the rate of selfrenewal and should be further explored as regeneration related targets. Considering malignant transformation,it is essential to control the level of self-renewal capacity.Proliferation of the progenitor cell should be synchronized with differentiation to provide healthy lifelong function of blood, immune systems, and replacement of damaged ordead cells. The differentiation-related role of SphK/S1P remains poorly assessed. A few pioneering investigations exploredpharmacologicaltoolsthattargetsphingolipid signaling and can potentially confine and direct self-renewal towards normal differentiation. Further investigation is required to test the role of the SphK/S1P axis in regulation of self-renewal and differentiation.

李國華^[6]（2018）在《orexin-A對缺氧海馬神經(jīng)元的作用及機制研究》文中研究指明前言阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea,OSA）是一種十分普遍但并未被全面認識的疾病,對各個年齡段的患者均可帶來心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的健康危害。其發(fā)作時由于頻繁的呼吸暫停和上呼吸道部分或完全阻塞導致睡眠時反復發(fā)生間歇性低氧血癥、高碳酸血癥,微覺醒或覺醒,擾亂睡眠結(jié)構(gòu)[1]。近年來,阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的患者經(jīng)常被報道出現(xiàn)認知損害[2-4]。這種認知障礙與相關(guān)大腦區(qū)域的損傷密切相關(guān),尤其是海馬,在間歇性缺氧產(chǎn)生（intermittent hypoxi,IH）過量的一系列活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）[5]的介導下可能發(fā)生細胞凋亡,引起空間記憶和學習受損[6]。OSA患者經(jīng)常伴隨著orexin-A水平的增加[7,8]。Orexin是一種多功能興奮性神經(jīng)肽,通過激活 orexin-1 受體（orexin receptor 1,OX1R）和 orexin-2 受體（orexin receptor 2,OX2R）來發(fā)揮多種生理功能的調(diào)節(jié)作用,如睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)。此外,Orexin系統(tǒng)還參與海馬等與學習記憶功能相關(guān)腦區(qū)的功能活動。雖然進行了諸多研究OSA與認知障礙的相關(guān)研究,但是,目前OSA引起認知功能損害的確切機制尚不完全明確。本實驗擬從體外觀察orexin-A對間歇性缺氧狀態(tài)下海馬神經(jīng)元的作用,并進一步探究其潛在作用通路及分子機制。目的建立大鼠海馬神經(jīng)元間歇性缺氧模型,利用檢測細胞凋亡率評價orexin-A對缺氧狀態(tài)下海馬神經(jīng)元的影響。首先,利用Western blot檢測p-ERK1/2的表達,以明確orexin-A誘導ERK1/2磷酸化加重了缺氧狀態(tài)下海馬神經(jīng)元的損傷,并采用MEK阻滯劑U0126抑制ERK1/2通路以進一步驗證;其次,利用siRNA技術(shù)分別沉默PLC β 1和PLC β 4,以明確在引起ERK1/2活化的orexin-A-OXlR/OX2R-Gq-PLC-/PKC信號通路中具體是哪一個PLC亞單位參與。方法1.急性分離出生24h內(nèi)的Wistar大鼠海馬組織,用胰蛋白酶消化與機械吹打相結(jié)合的方法分離海馬神經(jīng)元進行原代細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察神經(jīng)元的形態(tài)學特征,并采用免疫細胞化學技術(shù),用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）抗體鑒定神經(jīng)元純度。2.培養(yǎng)4d的大鼠海馬神經(jīng)元用于實驗研究,放入三氣培養(yǎng)箱中,缺氧（1%02,5%CO2 和 94%N2）5min 復氧（21%O2,5%CO2 和 74%N2）1Omin,共進行 64 次循環(huán);orexin-A處理組海馬神經(jīng)元在給予間歇性缺氧后,加入orexin-A使其終濃度分別為1nM,3nM,1OnM和100nM。繼續(xù)培養(yǎng)48h后,收集各組細胞Annexin V-FITC/PI雙染后入流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測。3.將體外培養(yǎng)4d的大鼠海馬神經(jīng)元隨機分為對照組、IH組、IH+orexin-A（100Nm/L）組和 IH+orexin-A（100Nm/L）+U0126 組,干預處理后繼續(xù)培養(yǎng) 48h,提取各組海馬神經(jīng)元總蛋白,采用Western blot法檢測p-ERK1/2的表達。4.將體外培養(yǎng)4d的大鼠海馬神經(jīng)元隨機分為對照組、IH組、IH+orexin-A（100Nm/L）組和 IH+orexin-A（100Nm/L）+U0126 組,干預處理后繼續(xù)培養(yǎng) 48h,收集各組細胞Annexin V-FITC/PI雙染后入流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測。5.將體外培養(yǎng)4d的大鼠海馬神經(jīng)元隨機分為control siRNA（-）組、control siRNA（+）組、siRNA-PLCβ1（-）組、siRNA-PLCβ1（+）組、siRNA-PLCβ 4（-）組和 siRNA-PLC β 4（+）組。（-）組給予 1H 處理、（+）組給予 IH+orexin-A干預處理后繼續(xù)培養(yǎng)48h,提取各組海馬神經(jīng)元總蛋白,采用Western blot法檢測p-ERK1/2的表達。6.將體外培養(yǎng)4d的大鼠海馬神經(jīng)元隨機分為control siRNA（-）組、control siRNA（+）組、siRNA-PLCβ1（-）組、siRNA-PLCβ1（）組、siRNA-PLCβ 4（-）組和 siRNA-PLC β 4（+）組。（-）組給予 IH 處理、（+）組給予 IH+orexin-A干預處理繼續(xù)培養(yǎng)48h,收集各組細胞Annexin V-PE/7AAD雙染后入流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測。結(jié)果1.細胞形態(tài)學特征:剛種植時所有細胞呈圓形,胞體小而透亮,大小均勻,懸浮分布于種植液中。種植24h后可見細胞貼壁良好,胞體增大,折光性好,呈梭形或不規(guī)則形,絕大部分細胞伸出短小突起。種植40h后神經(jīng)元胞體進一步增大,突起明顯伸長,可見清晰樹突和軸突,相鄰細胞間形成聯(lián)系,突起進一步延伸,相互交織成網(wǎng)狀。第7-10天胞體飽滿透亮,突起連接更為緊密,細胞呈現(xiàn)集中分布趨勢。2.神經(jīng)元純度檢測:將培養(yǎng)8d的海馬神經(jīng)元爬片采用免疫細胞化學技術(shù),神經(jīng)元的胞漿和突起被染成綠色,鏡下計數(shù)后神經(jīng)元純度可達90.5%。3.海馬神經(jīng)元凋亡率檢測:①海馬神經(jīng)元經(jīng)間歇性缺氧處理后,分別于6h、24h、48h進行神經(jīng)細胞凋亡率檢測,結(jié)果顯示,海馬神經(jīng)元的凋亡率逐漸從6.73±1.22%上升至 10.80±0.92%、15.5±1.51%和 25.8±2.01%。②海馬神經(jīng)元給予間歇性缺氧再經(jīng)過orexin-A干預處理,48小時后進行細胞凋亡率檢測。與單純給予間歇性缺氧的海馬神經(jīng)元凋亡率（26.8±1.87%）相比,orexin-A處理后海馬神經(jīng)元凋亡率增加,分別是28.5±2.11%（orexin-A 1Nm/L）、31.8±1.98%（orexin-A3Nm/L）、36.2±2.27%（orexin-A 10Nm/L）和 35.5±2.46%（orexin-A 100Nm/L）并隨orexin-A終濃度的升高而進一步增加。當orexin-A 終濃度≥10Nm/L時,海馬神經(jīng)元凋亡率有顯著性增高（P<0.05）。4.慢病毒轉(zhuǎn)染效率測定三組腺病毒（control siRNA、siRNA-PLCβ1 和 siRNA-PLCβ4）轉(zhuǎn)染效率均>90%。5.Orexin-A加重缺氧海馬神經(jīng)元損傷的作用通過ERK1/2磷酸化產(chǎn)生①大鼠海馬神經(jīng)元給予間歇性缺氧處理后,與對照組相比p-ERK1/2表達量增加（P<0.05）;再加入orexin-A作用后,p-ERK1/2表達量進一步升高,顯著高于IH組（P<0.05）;給予U0126預處理后,海馬神經(jīng)元p-ERK1/2表達量低于IH+orexin-A 組（P<0.05）。②IH組大鼠海馬神經(jīng)元與對照組相比凋亡率增加（P<0.05）;加入orexin-A作用后,細胞凋亡率較IH組又明顯升高（P<0.05）;給予U0126預處理的IH+orexin-A組海馬神經(jīng)元凋亡率較IH+orexin-A組顯著降低（P<0.05）。（見圖3）6.Orexin-A通過PLCβ1引起ERK1/2磷酸化加重缺氧海馬神經(jīng)元損傷①大鼠海馬神經(jīng)元經(jīng)過IH+orexin-A處理后,control siRNA（+）組和siRNA-PLCβ4（+）組p-ERK1/2表達量分別較各自對照組control siRNA（-）組和siRNA-PLCβ4（-）組顯著升高（P<0.05）;而 siRNA-PLCβ1（+）組經(jīng)過 IH+orexin-A處理后,p-ERK1/2表達量較對照組siRNA-PLCβ1（-）組無明顯變化。②沉默大鼠海馬神經(jīng)元PLCβ1基因后給予IH+orexin-A處理,細胞凋亡率較對照組siRNA-PLCβ1（-）組明顯降低（P<0.05）;而沉默大鼠海馬神經(jīng)元PL Cβ1基因組和空病毒組細胞凋亡率較各自對照組無明顯變化。結(jié)論1.本課題所采用方法培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元在數(shù)量、純度及存活能力方面均較好。2.間歇性缺氧誘導的海馬神經(jīng)元凋亡是一個漸進性過程,呈時間依賴性。3.Orexin-A對缺氧海馬神經(jīng)元具有損傷性作用。同時這種損害性作用具有濃度依賴性,在orxin-A終濃度≥10Nm/L時出現(xiàn),隨著orexin-A終濃度的增加,細胞凋亡率增加。4.Orexin-A加重缺氧海馬神經(jīng)元損傷的作用通過ERK1/2磷酸化產(chǎn)生。U0126可抑制orexin-A誘導的ERK1/2磷酸化水平升高,減輕orexin-A對缺氧狀態(tài)下海馬神經(jīng)元的損傷性作用,降低細胞凋亡率,發(fā)揮了細胞保護作用。5.Orexin-A通過PLC亞單位-PLCβ1引起ERK1/2磷酸化加重缺氧海馬神經(jīng)元損傷,而不是PLCβ4。

李星^[7]（2017）在《鉛致阿爾茨海默癥樣變神經(jīng)毒性及對相關(guān)通路蛋白表達的影響》文中認為鉛是一種常見的神經(jīng)毒物,對神經(jīng)系統(tǒng)具有異常親和力,可誘發(fā)嚴重的神經(jīng)功能障礙和學習認知功能損傷。學習記憶和認知是高級中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的基本體現(xiàn)。海馬不僅是學習記憶發(fā)生與認知功能塑形的關(guān)鍵場所,也是鉛神經(jīng)毒性作用的主要靶位點。胰島素/Pi3k/Akt和MAPKs信號通路的活化表達是細胞增殖、分化、凋亡、遷移等過程發(fā)生和發(fā)展的分子基礎(chǔ),其表達紊亂或活化異?？蓪е乱幌盗屑膊顟B(tài)及病理表現(xiàn)的發(fā)生。阿爾茨海默癥（Alzheimer‘s disease,AD）是一種原發(fā)型進行性神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病受環(huán)境和遺傳因素的共同調(diào)節(jié)。進行性認知功能障礙,及學習記憶能力損傷是AD的典型臨床癥狀,該過程中常伴隨Tau蛋白過磷酸化、神經(jīng)元大量凋亡、突觸結(jié)構(gòu)/功能退化及通路蛋白表達異常。雖然AD發(fā)病機制尚不清楚,但大量研究數(shù)據(jù)提示,Aβ表達異常和蓄積可能是各種原因誘導AD發(fā)病的共同通路。近期研究發(fā)現(xiàn),AD可能并不屬于單純的老年型疾病,其發(fā)病亦具有一定的胚胎源性,這符合成人疾病的胚胎基礎(chǔ)假說（Fe BAD）的論述。已知孕哺期鉛暴露會誘發(fā)嚴重影響子代中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育;且人群研究結(jié)果證實發(fā)育早期鉛暴露與兒童智力損傷,空間學習記憶能力障礙、認知和注意力下降具有強相關(guān)性,但該機制尚不十分清楚。本研究擬運用小鼠孕哺期鉛暴露模型和PC12細胞染毒模型,檢測孕早期鉛暴露對子代小鼠血鉛和海馬鉛含量、海馬Aβ相關(guān)蛋白（IDE）和學習記憶相關(guān)蛋白（NGF）表達的影響;結(jié)合體外實驗,觀察鉛暴露對神經(jīng)細胞生長發(fā)育的影響,探討該過程中可能涉及的AD相關(guān)蛋白,神經(jīng)發(fā)育相關(guān)因子及MAPKs信號通路蛋白表達變化,對鉛的細胞和神經(jīng)毒性進行闡述和分析,為AD發(fā)病機理的探討及神經(jīng)功能修復提供理論依據(jù)。目的1.通過構(gòu)建鉛中毒動物模型,比較孕哺期鉛暴露對仔鼠學習記憶能力的影響,檢測各濃度鉛暴露組海馬IDE和NGF的差異表達,評估孕哺期母體鉛暴露對子代小鼠神經(jīng)元發(fā)育和功能表達的影響,進而說明鉛的致AD樣病變作用。2.通過構(gòu)建體外細胞染毒模型,分析對比不同劑量及不同時間鉛暴露對AD相關(guān)細胞因子,神經(jīng)發(fā)育相關(guān)因子和胞內(nèi)信號蛋白表達的影響,探索鉛暴露對Aβ及其衍生物表達的影響,說明鉛致AD樣病變作用并探討其對信號傳導通路表達的影響,為AD的防治和鉛毒性的干預治療提供線索。材料與方法1研究對象動物模型:將懷孕SPF級昆明小鼠隨機分為4組,每組10只,1個對照組及3個鉛暴露組。孕鼠自懷孕第1d起（E0）至仔鼠斷乳時,分別給予醋酸鉛含量為0%（對照組）、0.1%（低劑量組）、0.2%（中劑量組）和0.5%（高劑量組）的去離子飲用水。仔鼠出生后仍由母鼠喂養(yǎng)照料至PND21。細胞株:選用褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株作為實驗對象,經(jīng)分化處理后,分別給予終濃度為0μM、20μM、100μM和500μM的醋酸鉛染毒。2.方法2.1動物實驗2.1.1采用Z-5000石墨爐原子吸收光譜儀測定仔鼠血鉛和海馬鉛濃度。2.1.2采用Morris水迷宮實驗評價仔鼠的學習記憶能力。2.1.3采用Western Blot檢測IDE和NGF在不同劑量鉛暴露組中的表達量。分別采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)對IDE和NGF在海馬組織中的分布和表達進行了描述（對照組和高劑量組）。2.2細胞實驗2.2.1采用MTT法檢測不同暴露濃度及暴露時間對細胞活性的影響。2.2.2采用Western Blot技術(shù)檢測AD相關(guān)蛋白（Aβ和Aβ寡聚體）,神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白（IGF1/IGF1R）及胞內(nèi)信號通路相關(guān)蛋白（IR、p-Akt、IDE、ERK1/2、JNK1/2/3、P38）蛋白表達的改變,采用實時定量PCR分析APP、INSR、IDE和IGF1/IGF1R基因m RNA的表達。3.統(tǒng)計分析實驗使用SPSS 21.0軟件包（SPSS Inc,USA）進行統(tǒng)計分析,兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗,多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析,兩兩比較使用Bonferroni檢驗法,若不滿足正態(tài)分布,則使用秩和檢驗,若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布則以均數(shù)±標準差（x±s）表示,檢驗水平為α=0.05。結(jié)果1.動物實驗結(jié)果1.1孕哺期母體鉛暴露對仔鼠血鉛、海馬鉛含量及其學習記憶能力的影響不同劑量孕哺期鉛暴露后,PND21仔鼠血鉛和海馬鉛含量顯著高于對照組（P<0.05）。Morris水迷宮結(jié)果顯示,中、高暴露劑量組仔鼠的逃避潛伏期和錯誤次數(shù)均顯著高于對照組（P<0.05）。1.2.孕哺期母體鉛暴露對仔鼠海馬組織IDE和NGF蛋白表達的影響1.2.1 Western Blot結(jié)果顯示,各鉛暴露組仔鼠海馬IDE和NGFβ蛋白表達水平較對照組均明顯降低（P<0.05）。1.2.2免疫組化結(jié)果顯示,高劑量鉛暴露組仔鼠海馬CA1區(qū)NGF免疫組化陽性反應物的平均灰度值明顯低于對照組（P<0.05）。1.2.3免疫熒光實驗結(jié)果顯示,高劑量鉛暴露組仔鼠海馬神經(jīng)元活性劑IDE免疫熒光抗體的平均光密度均顯著低于對照組（P<0.05）。2.細胞實驗結(jié)果1.醋酸鉛處理對PC12細胞增殖的影響根據(jù)細胞的數(shù)量變化及形態(tài)學改變最終選擇0μM、20μM、100μM和500μM醋酸鉛暴露濃度及12h、24h和72h來開展后續(xù)研究。2.醋酸鉛處理對PC12細胞Aβ和Aβ寡聚體表達的影響不同濃度醋酸鉛暴露12h后,500μM染鉛組PC12細胞Aβ的表達低于對照組（P<0.05）;Aβ寡聚體蛋白在20μM染鉛組細胞中的表達低于對照組（P<0.05）,100μM和500μM染鉛組PC12細胞Aβ蛋白的表達水平高于對照組（P<0.05）。染毒24h后,各染鉛組細胞Aβ的表達水平均低于對照組（P<0.05）;Aβ寡聚體蛋白在各染鉛組細胞中的表達無明顯改變（P>0.05）。染毒72h后,Aβ蛋白在100μM和500μM染鉛組細胞中的表達低于對照組（P<0.05）;Aβ寡聚體蛋白在各染鉛組細胞中的表達均高于對照組（P<0.05）。3.醋酸鉛處理對PC12細胞IGF1/IGF1R表達的影響醋酸鉛暴露12h后,20μM染鉛組PC12細胞IGF1的表達高于對照組（P<0.05）,IGF1和IGF1R蛋白在100μM和500μM染鉛組細胞中的表達均低于對照組（P<0.05）。染毒24h后,IGF1蛋白在各染鉛組細胞中的表達均低于對照組（P<0.05）;IGF1R蛋白在20μM和500μM染鉛組細胞中的表達低于對照組（P<0.05）。染毒72h后,IGF1蛋白在各染鉛組細胞中的表達均低于對照組（P<0.05）;100μM和500μM染鉛組細胞IGF1R的表達低于對照組（P<0.05）。4.醋酸鉛處理對PC12細胞IR、p-Akt、IDE表達的影響染毒12h后,20μM染鉛細胞IR的表達低于對照組（P<0.05）,100μM染鉛組細胞IR和p-Akt蛋白表達水平均高于對照組（P<0.05）;500μM染鉛組細胞p-Akt的表達低于對照組（P<0.05）;500μM染鉛組細胞IDE的表達低于對照組（P<0.05）。染毒24h后,20μM及100μM染鉛組細胞IR的表達低于對照組（P<0.05）;p-Akt蛋白在20μM和100μM染鉛組細胞中的表達顯著高于對照組（P<0.05）,500μM染鉛組細胞p-Akt的表達量則明顯低于對照組（P<0.05）;IDE蛋白在各染鉛組細胞中的表達均低于對照組（P<0.05）。染毒72h后,IR蛋白在20μM和500μM染鉛組細胞中的表達低于對照組（P<0.05）;p-Akt蛋白在500μM染鉛組細胞中的表達低于對照組（P<0.05）;100μM及500μM染鉛組細胞IDE的表達低于對照組（P<0.05）。5.醋酸鉛處理對PC12細胞MAPK信號通路相關(guān)蛋白（ERK1/2、JNK1/2/3、P38）表達的影響不同濃度醋酸鉛處理12h后,與對照組比較,各染鉛組細胞ERK1的表達增高,而ERK2和P38蛋白表達降低（P<0.05）;500μM染鉛組細胞JNK1的表達低于對照組（P<0.05）;20μM及100μM染鉛組細胞JNK2的表達高于對照組（P<0.05）;100μM及500μM染鉛組細胞JNK3的表達低于對照組（P<0.05）。染毒24h后,與對照組比較,20μM染鉛組細胞ERK1表達顯著升高,而500μM染鉛組細胞ERK1蛋白表達降低（P<0.05）;ERK2蛋白在各染鉛組細胞中的表達均低于對照組（P<0.05）;100μM及500μM染鉛組細胞JNK1的表達低于對照組（P<0.05）;500μM染鉛組細胞JNK2蛋白的表達低于對照組（P<0.05）;20μM及500μM染鉛組細胞JNK3的表達低于對照組（P<0.05）;P38蛋白在100μM和500μM染鉛組細胞中的表達低于對照組（P<0.05）。染毒72h后,與對照組比較,各染鉛組細胞ERK2及JNK1蛋白的表達均降低（P<0.05）;500μM染鉛組細胞ERK1的表達低于對照組（P<0.05）;100μM染鉛組細胞JNK2的表達高于對照組（P<0.05）,500μM染鉛組細胞JNK2的表達低于對照組（P<0.05）;JNK3蛋白在100μM及500μM染鉛組細胞中的表達均低于對照組（P<0.05）;100μM及500μM染鉛組細胞P38的表達低于對照組（P<0.05）。6.醋酸鉛對PC12細胞APP、INSR、AKT、IDE和IGF1/IGF1R轉(zhuǎn)錄水平的影響PCR結(jié)果顯示,醋酸鉛處理12h后,APP m RNA在各染鉛組細胞中的表達無明顯改變（P>0.05）;20μM染鉛組細胞INSR m RNA的表達低于對照組（P<0.05）;各染鉛組細胞AKT m RNA的表達均低于對照組（P<0.05）;各實驗組細胞IDE m RNA的表達無顯著差異（P>0.05）;20μM和100μM染鉛組細胞IGF1/IGF1R m RNA的表達均低于對照組（P<0.05）。染毒24h后,20μM及100μM染鉛組細胞APP m RNA的表達高于對照組（P<0.05）;100μM染鉛組細胞INSR m RNA的表達低于對照組（P<0.05）;20μM及100μM染鉛組細胞AKT m RNA的表達低于對照組（P<0.05）;20μM染鉛組細胞IDE m RNA的表達低于對照組（P<0.05）;100μM染鉛組細胞IGF1 m RNA的表達低于對照組（P<0.05）,各實驗組細胞IGF1R m RNA的表達無明顯差異（P>0.05）。染毒72h后,20μM及100μM染鉛組細胞APP m RNA的表達均低于對照組（P<0.05）;僅20μM染鉛組細胞INSR m RNA的表達低于對照組（P<0.05）;AKT m RNA在20μM及100μM染鉛組細胞中的表達低于對照組（P<0.05）;IDE m RNA在各實驗組中的表達無明顯改變（P>0.05）;20μM和100μM醋酸染鉛組細胞IGF1/IGF1R m RNA的表達均低于對照組（P<0.05）。結(jié)論1.孕哺期母體鉛暴露可導致仔鼠血鉛和海馬鉛濃度明顯升高,抑制Aβ降解酶IDE及神經(jīng)生長因子NGF的表達,損傷仔鼠的空間學習能力,該損傷效應呈暴露濃度依賴性。提示子代學習記憶能力障礙、腦AD樣神經(jīng)退行性變與孕哺期母體鉛暴露密切相關(guān)。2.細胞染毒實驗結(jié)果與動物研究結(jié)果相一致。醋酸鉛暴露會對PC12細胞AD相關(guān)蛋白表達產(chǎn)生影響,該過程可能涉及胞內(nèi)信號通路蛋白的異常表達。鉛暴露在抑制ERK2、JNK1/3及P38蛋白表達的同時,刺激了ERK1和JNK2 MAPKs的表達。說明鉛暴露可通過誘發(fā)信號通路表達異常來誘導AD樣病變的產(chǎn)生。

孔剛^[8]（2016）在《IQGAP1在高糖誘導足細胞凋亡中的作用及其機制探討》文中進行了進一步梳理研究背景糖尿病是臨床上一種常見內(nèi)分泌性疾病,它是由于多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病,是由于胰島素分泌和（或）作用缺陷所致。持續(xù)高血糖與長期代謝紊亂等可導致全身組織器官的多種并發(fā)癥,尤其是眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的慢性進行性病變、功能減退或衰竭。糖尿病的全身血管并發(fā)癥分為大血管并發(fā)癥和微血管并發(fā)癥,糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一,其臨床表現(xiàn)主要為高血壓、水腫、嚴重蛋白尿、低白蛋白血癥和進行性腎功能減退;腎臟病理主要表現(xiàn)為結(jié)節(jié)狀或彌漫性系膜細胞增殖、基底膜(（GBM）增厚,系膜細胞外基質(zhì)積聚、足細胞足突融合,腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。糖尿病腎病是目前世界范圍內(nèi)導致終末期腎病（end stage renal disease,ESRD）的首位位病因,增加各國衛(wèi)生保健事業(yè)支出的同時也給予社會、家庭、個人帶來沉重負擔。在我國糖尿病腎病發(fā)病率以及在終末期腎衰竭透析患者中所占的比例也成逐年增加趨勢,嚴重影響了患者的生存質(zhì)量。因此,探討糖尿病腎病的發(fā)病機制、及早發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病并給予適當干預治療措施對廣大糖尿病腎病患者具有重要的社會和現(xiàn)實意義。DN的發(fā)病機制十分復雜,涉及到糖脂代謝紊亂、炎癥介質(zhì)釋放、血流動力學異常、細胞因子、氧化應激以及細胞凋亡等多因素的作用。近年來的研究顯示,腎小球濾過屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變,尤其是作為腎小球濾過屏障重要組成成分的足細胞損傷,在糖尿病腎病的進展中發(fā)揮了舉足輕重的作用,被認為是引起DN蛋白尿和腎小球硬化的關(guān)鍵因素。因此,研究足細胞的損傷為DN的預防和治療帶來了新的契機。足細胞又稱為臟層腎小球上皮細胞,附著于腎小球基底膜外側(cè),與腎小球基底膜（glomerular basement membrane,GBM）、內(nèi)皮細胞共同構(gòu)成腎小球濾過屏障。足細胞的主要作用是對蛋白質(zhì)的濾過及GBM成分的更新起著舉足輕重的作用。由于足細胞是高度分化細胞,增殖能力較差,當足細胞受到損傷時,尿蛋白漏出增加,從而加重腎衰竭的發(fā)生,而蛋白尿又進一步加重足細胞的損傷。在DN的發(fā)生發(fā)展中,足細胞的改變主要包括足細胞數(shù)目減少,細胞凋亡增加,流動性增強,直至足細胞從GBM上脫落隨尿液排出,導致GBM裸露,形成局灶粘連和腎小球硬化。DN足細胞損傷機制復雜,其不是單由某個因素所誘發(fā),而是多個因素的聯(lián)合作用。主要包括腎蛋白（nephrin）、高血糖、整合素、機械應力、炎性反應、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的激活、AGEs的蓄積、GH-胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor,IGF）-I軸、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、類肝素硫酸蛋白聚糖（HSPG）、腫瘤抑制基因（wT1）、Podocalyxin蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體（perox-isome proliferatoractivated receptor,PPAR）、脂聯(lián)素、微小 RNA（micro RNA,miRNA）、TGF-β1、氧化應激及細胞凋亡等。有研究顯示,IQ結(jié)構(gòu)域GTP酶活化蛋白1（IQdomainGTPase-activating protein 1,IQGAP1）是一種含有多個蛋白結(jié)合域的支架蛋白,近期研究發(fā)現(xiàn)IQGAP1在細胞黏附遷移、維持細胞形態(tài)以及調(diào)節(jié)細胞凋亡等眾多生命過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用[1,2]。IQGAP1是否參與高糖誘導的足細胞凋亡尚未見報道,基于上述理論基礎(chǔ),我們設(shè)計并進行了本次研究。本課題分為兩部分,第一步部分,采用體外培養(yǎng)人腎臟足細胞（HPC）,觀察高糖刺激對IQGAP1表達和分布以及對足細胞凋亡的影響。第二部分,進一步觀察IQGAP1與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路以及腎素□血管緊張素□醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在足細胞凋亡中的作用,探討高糖誘導腎臟足細胞凋亡的分子機制,從而為更好的治療糖尿病腎病提供理論支持。第一部分高糖刺激對足細胞中IQGAP1表達和分布以及凋亡的影響研究目的:1、觀察人腎臟足細胞在體外高糖刺激下IQGAP1表達情況;2、觀察人腎臟足細胞在體外高糖刺激下IQGAP1分布情況;3、觀察人腎臟足細胞在體外高糖刺激下細胞凋亡情況。研究方法:HPC在33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,以含有10%胎牛血清及γ-干擾素（10 U/ml）的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞使其增殖,傳代后更換為不含Y-干擾素的RPMI 1640培養(yǎng)液,置入37° C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天,促進細胞分化成熟,用于后續(xù)實驗。HPC被隨機分為3組:A組:正常對照組（Normal Control,NC,）、B組:甘露醇對照組（Manitol+Glucose Control,MG）和C組:高糖組（High Glucose,HG）。NC組細胞給予D-glucose5.5mmol/L,為了控制高滲透壓對細胞實驗結(jié)果可能帶來的影響,MG組給予D-glucose5.5mmol/L+24.5mol/L甘露醇作為對照,HG組給予D-glucose 30mmO1/L。各組細胞同步培養(yǎng)0、12、24、48、72小時后分別收集,應用免疫熒光法觀察IQGAP1在各組環(huán)境足細胞中的表達及其分布情況,real-time PCR法檢測IQGAPlmRNA在各組不同環(huán)境下足細胞中的表達情況。用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。研究結(jié)果:1、從Fig.1-1可以看出IQGAP1在足細胞的胞漿與細胞核中都有表達,但主要存在于細胞核內(nèi);2、Fig.1-2、Fig.1-3A、3B、3C顯示,在0小時,正常對照組、甘露醇對照組和高糖組IQGAP1的表達量無顯著性差異;在48小時,免疫熒光顯示:甘露醇組與正常糖組比較,IQGAP1的表達量變化不大,差異無統(tǒng)計學意義,但在高糖刺激下,IQGAP1的表達水平明顯下調(diào),IQGAP1的表達量與正常糖對照組比較明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義;3、Fig.1-4A、B、C、D顯示,流式細胞儀檢測足細胞凋亡,將位于右下象限的早期凋亡細胞和位于右上象限的晚期凋亡細胞之和記錄為凋亡細胞。0小時,正常糖組凋亡率1.73%±0.13%,甘露醇組凋亡率2.1%±0.15%,高糖組凋亡率2.1%±0.12%,各組凋亡率無顯著性差異（P＞0.05）;24小時,正常糖組凋亡率26.39%±4.57%,甘露醇組凋亡率30.44%±5.15%,高糖組凋亡率56.15%±6%;在48小時,正常糖組足細胞凋亡率37.76%±5.6%,甘露醇組凋亡率36.77%±4.27%,高糖組凋亡率68.9%±6.64%。與正常糖組比較,甘露醇組凋亡率無顯著性變化,高糖組凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論:1、在正常糖組、甘露醇組和高糖組三組的足細胞培養(yǎng)中,IQGAP1在胞漿與細胞核中均有表達,但主要存在于細胞核內(nèi);2、高糖可以顯著下調(diào)IQGAP1的表達,且隨時間的延長下調(diào)表達進一步加劇;3、高糖可以顯著提升足細胞的凋亡,且隨時間的延長凋亡率逐漸增加。第二部分IQGAP1在高糖誘導足細胞凋亡中的作用及其機制探討研究目的:1、通過流式細胞儀檢測,觀察人腎臟足細胞在體外高糖刺激下細胞凋亡情況以及探討與IQGAP1的關(guān)系;2、通過 RT-PCR、Western blotting 觀察 IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2 的表達情況,進一步探討IQGAP1與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路中p-ERK1/2、ERK1/2的關(guān)系以及在足細胞凋亡中的作用;3、觀察在高糖組足細胞培養(yǎng)中加入貝那普利（10 μ mol/L）后IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2的蛋白表達情況以及細胞凋亡情況,進一步探討IQGAP1與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的作用關(guān)系,以及在足細胞凋亡中的作用;4、觀察在高糖組足細胞培養(yǎng)中加入ERK1/2的特異性抑制劑u0126（10 μmol/L）后IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2的蛋白表達情況以及細胞凋亡情況,進一步探討IQGAP1在足細胞凋亡中的作用。研究方法:將上述在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天后成熟HPC隨機分為5組（A-E組）:A組:正常糖對照組（5.5mmol/Lglucose,NC）、B組:甘露醇對照組（24.5mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L glucose,MG）、C 組:高糖組（30 mmol/L glucose,HG）、D 組:貝那普利組（30 mmol/L glucose+10 μmol/L benazepril）、E 組:u0126抑制劑組（30 mmol/L glucose +10 μmol/L u0126）。各組細胞同步培養(yǎng)Oh、12h、24h、48h、72h時后收集,應用免疫熒光法觀察IQGAP1在各組環(huán)境足細胞中的表達及其分布情況,real-time PCR、Western blotting 檢測 IQGAPlmRNA及蛋白在不同環(huán)境下足細胞中的表達情況。通過Western blot法檢測ERK1/2和P-ERK1/2的含量。用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。研究結(jié)果:1、HG抑制了 IQGAP1的表達,增加P-ERK1/2的表達,并且促進了 HPC的凋亡;2、貝那普利可以減輕高糖引起的IQGAP1抑制,上調(diào)IQGAP1的表達,下調(diào)P-ERK1/2水平。48小時,D組凋亡率50.54%±6.25%,比C組凋亡率68.9%±6.64%明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義,說明貝那普利可以減輕引起高糖引起的HPC的凋亡;3、U0126對高糖引起的IQGAP1的抑制沒有影響。48小時,E組凋亡率3.19%±1.68%,比C組凋亡率68.9%±6.64%明顯下降,提示U0126可顯著減少HPC的凋亡率。結(jié)論:1、高糖通過下調(diào)IQGAP1的表達、增加p-ERK蛋白表達,促進HPC細胞的凋亡;2、貝那普利可上調(diào)IQGAP1的表達,減輕高糖誘導的細胞凋亡;3、U0126抑制劑可減輕高糖引起的足細胞凋亡,但對高糖引起的IQGAP1的抑制沒有影響;4、IQGAP1通過與ERK1/2MAPK信號通路、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）相互作用,參與了足細胞的凋亡,對糖尿病腎病的進展起到一定作用。

袁若石^[9]（2016）在《癌癥內(nèi)源性網(wǎng)絡理論及其非線性隨機動力學基礎(chǔ)》文中指出癌癥是一種典型的復雜疾病,它的發(fā)病機理不能由單個的基因、蛋白以及分子通路來解釋。我們也不能通過“線性疊加”式的簡單推理來組合各個相關(guān)因素而對癌癥形成一個完整的理解,類似于物理學中的多體問題?？焖俜e累的大量組學數(shù)據(jù),為癌癥及復雜疾病的研究提供了越來越多的可用信息,但同時也需要我們在背后分子機制的基礎(chǔ)上來進行整合、分析和處理,才有可能解釋癌癥的復雜性并確定各種相關(guān)的基因、蛋白以及分子通路的實際作用。為此,一個統(tǒng)一的、定量的癌癥內(nèi)源性網(wǎng)絡假說被提出:生物在漫長的演化過程中形成了一個內(nèi)源性的分子-細胞網(wǎng)絡以完成發(fā)育過程以及生理功能的調(diào)控,癌癥則是這個內(nèi)源性網(wǎng)絡中的一個或者一組固有的穩(wěn)定狀態(tài)。這個穩(wěn)定狀態(tài)在演化的歷史過程中可能具有特定的功能,但現(xiàn)在對于整個生物體來說并不是有利的。癌癥內(nèi)源性網(wǎng)絡中至少部分的關(guān)鍵因子已經(jīng)在各類研究中被分別獨立的發(fā)現(xiàn)了,這反過來也說明生物系統(tǒng)中存在著層次化的組織結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)使得一個核心網(wǎng)絡能夠從目前已知的生物學知識中被構(gòu)建出來,并能隨著生物學知識的積累而被不斷地完善。通過分析這個核心網(wǎng)絡在狀態(tài)空間中的隨機非線性動力學行為,我們發(fā)現(xiàn)了一系列穩(wěn)定狀態(tài)分別對應生物體正常的生理和不正常的病理表型,包括自然涌現(xiàn)出來的癌癥狀態(tài)。癌癥內(nèi)源性網(wǎng)絡的動力學模型由于其固有的隨機性、非線性和高維狀態(tài)空間,對傳統(tǒng)的理論方法提出了挑戰(zhàn)。為此我們發(fā)展了一套源于達爾文演化理論的處理隨機過程的理論框架,并解決了一系列理論、計算問題。具體來說,我們提出了一種全新的隨機微分方程的積分方法,A-型隨機積分,并給出了它和傳統(tǒng)的Ito積分之間存在著的一個簡潔的轉(zhuǎn)換關(guān)系。這種新的積分方式具有明確的物理意義和獨到的優(yōu)勢:由隨機微分方程所確定的隨機過程的穩(wěn)態(tài)分布滿足Boltzmann-Gibbs分布,我們證明了其中的勢函數(shù)（哈密頓量）是系統(tǒng)確定性動力學部分的全局李雅普諾夫函數(shù),這個結(jié)論在任意噪聲強度下都是成立的。這就使得穩(wěn)態(tài)分布的最可幾狀態(tài)與系統(tǒng)的確定性部分的穩(wěn)定不動點重合。我們又在一系列典型的動力系統(tǒng),包括不動點、極限環(huán)和混沌系統(tǒng)中顯式給出了勢函數(shù)的構(gòu)造。因此,我們的方法在隨機性和確定性之間建立了一種對應,原來求解偏微分方程（如Fokker-Planck方程）得到穩(wěn)態(tài)分布中關(guān)鍵位置信息（如穩(wěn)態(tài)、過渡態(tài)）的問題很大程度上可以轉(zhuǎn)化為求解系統(tǒng)確定性部分的常微分方程的不動點問題（求解代數(shù)方程）。相比隨機模擬穩(wěn)態(tài)分布,這極大減少了計算量,使得分析、研究數(shù)百維的隨機動力學模型成為可能。因此這套方法也在生物、物理、化學、控制、經(jīng)濟等領(lǐng)域中存在著廣泛的應用前景。而傳統(tǒng)的隨機積分方法比如Ito和Stratonovich積分并不具有這種優(yōu)勢,具體的計算和數(shù)值模擬實驗都證明了這一點。由此建立的內(nèi)源性網(wǎng)絡的非線性隨機動力學模型能夠綜合各種因素,給出了一個比當前流行的、在網(wǎng)絡上進行簡單推理來分析因果關(guān)系更為合理的、在一般情形下適用的框架。我們構(gòu)建了前列腺癌和急性早幼粒細胞白血病的內(nèi)源性網(wǎng)絡模型,并發(fā)展了一整套計算工具。這些定量的網(wǎng)絡模型通過收集獨立的分子生物學和生化實驗中所揭示的分子間相互作用“組裝”而成,能夠重現(xiàn)臨床觀測到的現(xiàn)象并給出新的理論預言。內(nèi)源性網(wǎng)絡理論還可以被應用到其他類型的復雜疾病中去,比如本文中所討論的成骨細胞異常導致骨質(zhì)疏松的核心調(diào)控網(wǎng)絡模型。我們建立的這套框架可以作為探索復雜疾病新療法的“干實驗”平臺,尤其在尋找抗癌藥物組合這一“濕實驗”面臨巨大挑戰(zhàn)的領(lǐng)域:我們的方法可以整合已有的生物學知識,利用計算方法找到可能的組合藥物靶點,為“濕實驗”指明方向。

張弦^[10]（2016）在《TLR4介導的信號通路對肝細胞凋亡的影響及氧化苦參堿的干預機制研究》文中研究指明第一部分TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號通路對大鼠肝BRL-3A細胞凋亡的影響目的探討大鼠肝BRL-3A細胞中是否有Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）介導的PI3K/AKT/GSK3β信號通路,及該通路在BRL-3A細胞凋亡中的作用與機制,為急性肝衰竭（acute liver failure,ALF）的預防和治療提供新的靶點。方法采用大鼠肝BRL-3A細胞,運用脂多糖（lipopolsaccharide,LPS）建立肝細胞凋亡模型。分別應用TLR4抑制劑（CLI-095）、PI3K/AKT抑制劑（LY294002）和GSK3β抑制劑（LiCl）預處理BRL-3A細胞,以減弱或加強TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號轉(zhuǎn)導通路的作用。CCK-8法檢測細胞活力;流式細胞術(shù)（Flow cytometry,FCM）檢測細胞凋亡率;Hoechst 33342染色法觀察LPS刺激及TLR4抑制劑阻斷后細胞凋亡的形態(tài);Western-blot法檢測BRL-3A細胞內(nèi)AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、Bax、Bcl-2及active-caspase-3蛋白的表達;實時定量PCR法（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）檢測BRL-3A細胞內(nèi)Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA的表達;免疫熒光法觀察GSK3β核易位情況。結(jié)果（1）CCK-8法結(jié)果顯示,LPS（10μg/ml）刺激BRL-3A細胞不同時間（1、3、6、12、24 h）后,細胞活力均明顯低于對照組（P<0.05）,LPS作用于BRL-3A細胞24 h后其活力為對照組的58%（P<0.05）。（2）Hoechst 33342染色法結(jié)果顯示,LPS刺激后,隨著刺激時間的延長,BRL-3A細胞凋亡增多,并出現(xiàn)壞死細胞,刺激24 h可見細胞核碎片和核固縮。TLR4抑制劑（CLI-095）預處理組凋亡細胞明顯減少,未見凋亡小體。（3）流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,LPS（10μg/ml）刺激BRL-3A細胞不同時間（1、3、6、12、24h）后,細胞凋亡率逐漸上升（p<0.01）,24hbrl-3a細胞凋亡率達68.30%。與lps組比較,cli-095+lps組可以減少lps刺激引起的brl-3a細胞凋亡率（p<0.05）;ly294002+lps組細胞凋亡率增加（p<0.05）;licl+lps組細胞凋亡率下降（p<0.05）。（4）western-blot法結(jié)果顯示,正常對照組brl-3a細胞中有akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9的表達;lps組p-aktser473和p-gsk3βser9的表達低于正常對照組（p<0.05）;與lps組比較,cli-095+lps組p-aktser473和p-gsk3βser9的表達有所上調(diào);而ly294002+lps組的p-aktser473和p-gsk3βser9表達下調(diào)（p<0.05）;licl+lps組p-gsk3βser9的表達上調(diào)（p<0.05）。（5）免疫熒光法檢測gsk3β核易位結(jié)果顯示,正常對照組中g(shù)sk3β主要表達在brl-3a細胞質(zhì)中;lps組gsk3β大多易位到胞核;與lps組比較,cli-095、licl預處理組gsk3β核易位均不同程度減弱,ly294002預處理組gsk3β核易位作用增強。（6）rt-qpcr法檢測結(jié)果顯示,與正常對照組比較,lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna的表達均上調(diào)（p<0.05）;與lps組比較,cli-095+lps組及l(fā)icl+lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達降低（p<0.05）;ly294002+lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達上調(diào)（p<0.05）。（7）western-blot法測定結(jié)果顯示,與正常對照組比較,lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達均上調(diào)（p<0.05）。與lps組比較,cli-095+lps組及l(fā)icl+lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達降低（p<0.05）;ly294002+lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達上調(diào)（p<0.05）。結(jié)論（1）brl-3a細胞中有tlr4介導的pi3k/akt/gsk3β信號通路。（2）brl-3a細胞tlr4激活后,p-aktser473和p-gsk3βser9表達下調(diào),使bax/bcl-2及active-caspase-3的表達增加,細胞凋亡率升高。brl-3a細胞凋亡過程中有tlr4介導的pi3k/akt/gsk3β信號通路的參與。第二部分tlr4/p38/jnk信號通路對大鼠肝brl-3a細胞凋亡的影響目的探討大鼠肝brl-3a細胞中是否有tlr4介導的p38/jnk信號通路,及該通路在brl-3a細胞凋亡中的作用與機制,為急性肝衰竭的預防和治療提供新的靶點。方法采用大鼠肝brl-3a細胞,應用lps建立肝細胞凋亡模型。分別運用tlr4抑制劑（cli-095）、p38抑制劑（sb203580）、jnk抑制劑（sp600125）及erk抑制劑（fr180204）預處理brl-3a細胞,以影響tlr4/p38/jnk信號轉(zhuǎn)導通路的作用。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率;western-blot法檢測brl-3a細胞內(nèi)jnk、p-jnk、p38、p-p38、bax、bcl-2及active-caspase-3蛋白的表達;rt-qpcr檢測大鼠肝細胞bax、bcl-2及caspase-3mrna的表達。結(jié)果（1）流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,lps組細胞凋亡率高于正常對照組（p<0.05）;而cli-095+lps組、sb203580+lps組、sp600125+lps組細胞凋亡率顯著低于lps組（p<0.05）;fr180204+lps與lps組比較無明顯差異。（2）western-blot結(jié)果顯示,lps組p-p38,p-jnk表達明顯高于正常對照組（p<0.05）;cli-095+lps組、sb203580+lps組、sp600125+lps組p-p38,p-jnk表達顯著低于lps組（p<0.05）;fr180204+lps組與lps組比較無明顯差異。（3）rt-qpcr結(jié)果顯示,lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna明顯高于正常對照組（p<0.05）;cli-095+lps組、sb203580+lps組和sp60012+lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達均顯著低于lps組（p<0.05）;fr180204+lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達無明顯變化。（4）western-blot結(jié)果顯示,lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達比正常對照組高（p<0.05）;cli-095+lps組、sb203580+lps組和sp60012+lps組bax/bcl-2及active-caspase-3表達顯著低于lps組（p<0.05）;fr180204+lps組與lps組比較無明顯差異。結(jié)論（1）brl-3a細胞中有tlr4介導的p38/jnk信號通路。（2）brl-3a細胞tlr4激活后,p-p38、p-jnk表達增加,使bax/bcl-2的比例和active-caspase-3表達增加,從而促進brl-3a細胞的凋亡。brl-3a細胞凋亡過程中有tlr4介導的p38/jnk信號通路的參與。第三部分氧化苦參堿對大鼠肝brl-3a細胞凋亡的抑制作用及其機制研究目的探討氧化苦參堿（oxymatrine,omt）對lps誘導的大鼠肝brl-3a細胞凋亡的抑制作用及其機制,為omt抑制肝細胞凋亡提供更多的實驗依據(jù)。方法采用lps誘導大鼠肝brl-3a細胞建立細胞凋亡模型。應用cck-8法測定omt對brl-3a細胞活力的影響;生物化學法測定不同劑量omt對lps誘導的brl-3a細胞乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase,ldh）釋放率的影響。根據(jù)ldh釋放率選擇omt濃度為0.75、1.5、3.0g/l進行后續(xù)實驗。然后實驗分5組:正常對照組,lps組,omt低劑量+lps組,omt中劑量+lps組,omt高劑量+lps組。hochest33342染色觀察細胞凋亡形態(tài);流式細胞儀檢測細胞凋亡率;rt-qpcr法檢測brl-3a細胞中bax、bcl-2、caspase-3mrna的表達;western-blot法檢測brl-3a細胞中akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9、p38、p-p38、jnk、p-jnk、bax、bcl-2和active-caspase-3蛋白的表達;免疫熒光觀察gsk3β核易位情況。結(jié)果（1）不同劑量的（0.3756.0g/l）omt和brl-3a細胞共培養(yǎng)24h,brl-3a細胞生長狀態(tài)良好。（2）lps刺激brl-3a細胞后,ldh釋放率增加（p<0.01）,而omt預處理后能明顯降低ldh的釋放率（p<0.05或p<0.01）。（3）cck-8法結(jié)果顯示,lps組細胞活力明顯降低（p<0.05）,omt預處理可以明顯減弱由lps引起的細胞活力降低（p<0.05或p<0.01）。（4）流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:lps組brl-3a細胞凋亡率明顯高于正常對照組（p<0.05）,omt預處理可以顯著降低由lps刺激引起brl-3a細胞凋亡率的增加（p<0.05）。（5）hochest33342染色結(jié)果顯示,lps組可見brl-3a細胞凋亡增多,omt預處理后凋亡細胞明顯減少。（6）western-blot檢測結(jié)果顯示,lps組tlr4表達增加（p<0.05）,p-aktser473和p-gsk3βser9表達降低（p<0.05）,p-p38、p-jnk表達增加（p<0.05）;與lps組比較,omt中、高劑量預處理可以下調(diào)tlr4的表達,并上調(diào)p-aktser473和p-gsk3βser9的表達（p<0.05）,下調(diào)p-p38、p-jnk的表達（p<0.05或p<0.01）。（7）免疫熒光結(jié)果顯示,omt預處理能明顯減少lps刺激引起的gsk3β核易位。（8）rt-qpcr結(jié)果顯示,lps組bax/bcl-2及caspase-3mrna表達明顯增高（p<0.05）。與lps組比較,omt預處理能明顯降低由lps誘導的brl-3a細胞中bax/bcl-2及caspase-3mrna表達上調(diào)（p<0.05或p<0.01）。（9）western-blot結(jié)果顯示,omt預處理能明顯降低由lps誘導的brl-3a細胞中bax/bcl-2及active-caspase-3表達上調(diào)（p<0.05）。結(jié)論（1）omt預處理可以顯著降低由lps誘導的brl-3a細胞凋亡。（2）omt能上調(diào)經(jīng)lps刺激的brl-3a細胞p-aktser473和p-gsk3βser9水平,減少lps刺激引起的gsk3β核易位,降低經(jīng)lps激活的p38和jnk磷酸化水平,下調(diào)bax/bcl-2的比例和active-caspase-3的表達,從而明顯抑制brl-3a細胞凋亡。（3）omt通過tlr4/pi3k/akt/gsk3β及tlr4/p38/jnk信號通路抑制brl-3a細胞凋亡。第四部分氧化苦參堿對急性肝衰竭大鼠肝細胞凋亡的抑制作用及其機制研究目的探討氧化苦參堿（omt）對lps/d-galn誘導的急性肝衰竭大鼠肝細胞凋亡的抑制作用及其機制,為臨床防治急性肝衰竭抑制肝細胞凋亡尋找有效的藥物。方法采用lps/d-galn建立大鼠急性肝衰竭模型。100只大鼠隨機分為5組:正常對照組,模型組,omt低、中、高劑量組。應用he染色光鏡觀察肝臟病理學改變;透射電鏡觀察細胞凋亡情況;全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase,alt）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateaminotransferase,ast）水平;elisa法測定各組大鼠外周血腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor,tnf-α）和白介素-1β（interleukin-1β,il-1β）水平;流式細胞術(shù)測定各組大鼠肝細胞凋亡率;western-blot檢測肝組織中akt、p-aktser473、gsk3β、p-gsk3βser9、p38、p-p38、jnk、p-jnk、bax、bcl-2和active-caspase-3的表達。免疫組化s-p法觀察肝組織tlr4、bax、bcl-2和active-caspase-3的表達;結(jié)果（1）各組大鼠死亡率及肝臟大體情況,正常對照組和omt低、中、高劑量組無大鼠死亡;模型組大鼠死亡率達30%。模型組可見肝臟大體腫脹明顯,表面彌漫出血,大片瘀斑,呈暗紅色,omt低、中、高劑量組肝臟大體不同程度的好轉(zhuǎn)。（2）he染色見模型組肝細胞明顯壞死,大片狀壞死和出血,僅少量肝細胞殘存,散在分布,無正常肝小葉結(jié)構(gòu),纖維網(wǎng)狀支架塌陷,匯管區(qū)大量炎癥細胞浸潤。透射電鏡顯示模型組肝細胞壞死明顯,形態(tài)不規(guī)則,可見核皺縮和核碎裂,見凋亡小體,肝細胞內(nèi)線粒體嚴重損害,無明顯細胞器結(jié)構(gòu)。omt各劑量預處理可不同程度改善肝組織病理損傷。（3）生化分析儀測定結(jié)果顯示,模型組大鼠外周血ast、alt的水平明顯高于正常對照組（p<0.05）,omt各劑量組,ast、alt的水平顯著低于模型組（p<0.05）。（4）elisa法結(jié)果顯示,模型組大鼠外周血tnf-α和il-1β水平明顯高于正常對照組（P<0.01）,OMT各劑量組,TNF-α和IL-1β水平顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01）。（5）流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,模型組肝細胞凋亡率明顯增加（P<0.05）,與模型組比較,OMT中、高劑量預處理可以降低肝細胞凋亡率（P<0.05）。（6）Western-blot法結(jié)果顯示,模型組TLR4表達增加（P<0.05）,P-AKTSer473和P-GSK3βSer9表達降低（P<0.05）,P-P38、P-JNK表達增加（P<0.05）;與模型組比較,OMT中、高劑量預處理可以下調(diào)TLR4的表達（P<0.05）,并上調(diào)P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達（P<0.05）,下調(diào)P-P38、P-JNK的表達（P<0.05）。（7）Western-blot法檢測Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白結(jié)果顯示,模型組Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表達明顯高于正常對照組（P<0.05）。與模型組比較,OMT預處理可下調(diào)Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表達（P<0.05）。（8）免疫組化法結(jié)果顯示,模型組TLR4、Bax、active-caspase-3表達明顯增高,Bcl-2的表達較正常對照組有所下降（P<0.05）。與模型組比較,OMT預處理可下調(diào)TLR4、active-caspase-3及Bax的表達,上調(diào)Bcl-2的表達（P<0.05）。結(jié)論（1）OMT預處理能改善LPS/D-GalN誘導的急性肝衰竭大鼠肝組織病理損傷,明顯降低血清轉(zhuǎn)氨酶,保護肝細胞。（2）OMT能降低急性肝衰竭大鼠肝組織TLR4的表達、上調(diào)P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達,下調(diào)GSK3β表達;下調(diào)P-P38、P-JNK的表達,使TNF-α和IL-1β水平降低,下調(diào)Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表達,從而明顯抑制肝細胞凋亡。（3）OMT通過TLR4/PI3K/AKT/GSK3β及TLR4/P38/JNK信號通路抑制急性肝衰竭大鼠肝細胞凋亡。

二、Transforming growth factor-β1 suppresses serum deprivation-induced apop-tosis via activation of ERK1/ERK2 and the inhibition of p38 activity and ceramide production（論文開題報告）

（1）論文研究背景及目的

此處內(nèi)容要求：

首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。

寫法范例：

本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細分析其設(shè)計過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。

（2）本文研究方法

調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。

觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。

實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關(guān)系。

文獻研究法：通過調(diào)查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。

實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學理論和實踐的需要提出設(shè)計。

定性分析法：對研究對象進行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。

定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。

跨學科研究法：運用多學科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。

功能分析法：這是社會科學用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。

模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。

三、Transforming growth factor-β1 suppresses serum deprivation-induced apop-tosis via activation of ERK1/ERK2 and the inhibition of p38 activity and ceramide production（論文提綱范文）

（2）基于氧化應激探討槲皮素防治椎間盤退變的實驗研究（論文提綱范文）

（3）氫化鎂調(diào)控PLIN2緩解結(jié)晶腎損傷的作用和機制研究（論文提綱范文）

（4）TGF-β1的巖藻糖基化修飾對卵巢癌細胞線粒體自噬的影響及機制（論文提綱范文）

（5）Regulatory role of sphingosine kinase and sphingosine-1-phosphate receptor signaling in progenitor/stem cells（論文提綱范文）

（6）orexin-A對缺氧海馬神經(jīng)元的作用及機制研究（論文提綱范文）

（7）鉛致阿爾茨海默癥樣變神經(jīng)毒性及對相關(guān)通路蛋白表達的影響（論文提綱范文）

（8）IQGAP1在高糖誘導足細胞凋亡中的作用及其機制探討（論文提綱范文）

（9）癌癥內(nèi)源性網(wǎng)絡理論及其非線性隨機動力學基礎(chǔ)（論文提綱范文）

（10）TLR4介導的信號通路對肝細胞凋亡的影響及氧化苦參堿的干預機制研究（論文提綱范文）

四、Transforming growth factor-β1 suppresses serum deprivation-induced apop-tosis via activation of ERK1/ERK2 and the inhibition of p38 activity and ceramide production（論文參考文獻）

• [1]Modulation of cell physiology under hypoxia in pancreatic cancer[J]. Matias Estaras,Antonio Gonzalez. World Journal of Gastroenterology, 2021(28)
• [2]基于氧化應激探討槲皮素防治椎間盤退變的實驗研究[D]. 張樹文. 新疆醫(yī)科大學, 2021(01)
• [3]氫化鎂調(diào)控PLIN2緩解結(jié)晶腎損傷的作用和機制研究[D]. 程勁. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學, 2020(05)
• [4]TGF-β1的巖藻糖基化修飾對卵巢癌細胞線粒體自噬的影響及機制[D]. 金山. 中國醫(yī)科大學, 2020(01)
• [5]Regulatory role of sphingosine kinase and sphingosine-1-phosphate receptor signaling in progenitor/stem cells[J]. Mei Li Ng,Nagendra S Yarla,Mario Menschikowski,Olga A Sukocheva. World Journal of Stem Cells, 2018(09)
• [6]orexin-A對缺氧海馬神經(jīng)元的作用及機制研究[D]. 李國華. 山東大學, 2018(12)
• [7]鉛致阿爾茨海默癥樣變神經(jīng)毒性及對相關(guān)通路蛋白表達的影響[D]. 李星. 鄭州大學, 2017(11)
• [8]IQGAP1在高糖誘導足細胞凋亡中的作用及其機制探討[D]. 孔剛. 山東大學, 2016(08)
• [9]癌癥內(nèi)源性網(wǎng)絡理論及其非線性隨機動力學基礎(chǔ)[D]. 袁若石. 上海交通大學, 2016(03)
• [10]TLR4介導的信號通路對肝細胞凋亡的影響及氧化苦參堿的干預機制研究[D]. 張弦. 蘇州大學, 2016(11)

標簽：細胞凋亡論文;  對照組論文;  細胞自噬論文;  神經(jīng)元細胞論文;  線粒體論文;