一、反義核酸對體外培養(yǎng)A型精原細(xì)胞端粒酶活性的影響（論文文獻(xiàn)綜述）
于敏莉[1]（2012）在《維甲酸對雞胚生殖細(xì)胞增殖和減數(shù)分裂調(diào)控的研究》文中研究說明家禽的胚胎發(fā)育有獨(dú)特的規(guī)律,通過對家禽原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell, PGC）的體外研究,可以更深入地了解其胚胎發(fā)育過程及影響因素,并可對其基因進(jìn)行遺傳操作,制作各種研究模型,從而為生殖生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等研究提供了一個(gè)優(yōu)良的動(dòng)物模型。為了更深層次揭示禽類生殖細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞內(nèi)部和外源性調(diào)控機(jī)理、性腺發(fā)育和配子形成的分子機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)以海蘭雞雞胚為材料,分離了不同時(shí)期的PGC,進(jìn)行體外培養(yǎng)并優(yōu)化培養(yǎng)模型,研究了維甲酸（RA）對PGC粘附和增殖的作用及其胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制,同時(shí)還研究了RA對胚胎期卵巢生殖細(xì)胞減數(shù)分裂啟動(dòng)過程中的調(diào)控作用,探索基于LV-siRNA的慢病毒載體法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家禽的可行性,建立Raldh2基因敲除的轉(zhuǎn)基因雞模型,為進(jìn)一步研究胚胎早期發(fā)育的機(jī)理、轉(zhuǎn)基因家禽的制備奠定了基礎(chǔ)。1.雞胚PGC的分離、培養(yǎng)及鑒定在體視顯微鏡下用玻璃針分離19期3.5d雞胚生殖嵴部位或28期5.5d雞胚性腺,胰蛋白酶+EDTA消化分散組織,用KO-DMEM添加7.5%胎牛血清和10ng/ml白血病抑制因子（LIF）、10ng/ml堿性成纖維生長因子（bFGF）、10ng/ml干細(xì)胞生長因子（SCF）、0.1mMMEM非必需氨基酸、0.1mMβ-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺（Glu）、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)液,通過PGC和體細(xì)胞體外共培養(yǎng)的方式建立原代培養(yǎng)模型。然后傳代于雞胚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。同時(shí)我們從13-15期雞胚血液中分離提取PGC,在飼養(yǎng)層上進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。傳至3-5代后,用堿性磷酸酶（AKP）、過碘酸雪夫氏（PAS）化學(xué)反應(yīng)及c-kit、SSEA-1,3,4、EMA-1等免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定PGC,用PCNA和BrdU摻入法檢測細(xì)胞的增殖活性。并收集PGC集落,采用RT-PCR方法檢測干細(xì)胞多能性相關(guān)基因（Pou5fl,Sox2和Nanog）的表達(dá)。上述結(jié)果表明我們建立的PGC-體細(xì)胞共培養(yǎng)模型較好的維持了PGC的生物特性及未分化狀態(tài),且具有較強(qiáng)的增殖活性。因此,該模型是可用于PGC體外增殖和分化調(diào)控的研究。2.RA對雞胚PGC粘附和增殖的影響及其機(jī)理的研究本實(shí)驗(yàn)研究了RA對雞胚PGC粘附和增殖的影響及其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。結(jié)果表明：經(jīng)過RA（0.1-10μM）處理后,PGC的集落數(shù)目和面積呈時(shí)間和劑量依賴性增加。同時(shí)RA能夠促進(jìn)細(xì)胞間的粘附,提高粘附蛋白E-鈣粘蛋白、α-連鎖蛋白和β-連鎖蛋白的mRNA水平,增強(qiáng)PGC的粘附性,并存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。流式分析結(jié)果顯示,PGC經(jīng)過RA處理4天后,S/G2期（4N）的PGC數(shù)量顯著增加,說明此部分細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入有絲分裂期。此外,RA能激活PGC中PKC和Akt活性,促進(jìn)NF-κB的核轉(zhuǎn)移,提高鈣粘蛋白和β-catenin的磷酸化水平,然而這些刺激作用分別被LY294002（P13K抑制劑）,KP372-1（Akt抑制劑）,SN50（NF-κB抑制劑）和H7（PKC抑制劑）所阻斷。RA顯著上調(diào)PGC中細(xì)胞周期蛋白cyclin D1/E, CDK2/6和原癌基因c-fos, c-myc（?）勺表達(dá),但是這種上調(diào)作用被H7、LY294002、KP372-1和SN50所抑制：綜上所述,在體外培養(yǎng)條件下,RA通過PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)及與PKC/β-catenin之間的交聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)雞胚PGC的增殖,揭示RA在調(diào)控雞胚胎生殖細(xì)胞發(fā)育中起著重要的作用。3.RA對雞胚生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控機(jī)理的研究在本實(shí)驗(yàn)中,我們結(jié)合胚胎期卵巢的體外培養(yǎng)和RNA干擾等手段,探索RA對雞胚胎期生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控及作用機(jī)制。SCP3和γH2AX免疫熒光染色結(jié)果表明,雞胚卵巢生殖細(xì)胞在15.5天進(jìn)入減數(shù)分裂,比例逐漸增加,到18.5天,進(jìn)入減數(shù)分裂的細(xì)胞幾乎遍布整個(gè)卵巢。減數(shù)分裂早期標(biāo)志基因Strs8mRNA的表達(dá)在12.5天開始顯著上調(diào),早于減數(shù)分裂啟動(dòng)的時(shí)間：而減數(shù)分裂標(biāo)志基因Scp3和Dmcl mRNA（?）內(nèi)表達(dá)則在15.5天顯著上調(diào),再次驗(yàn)證雞胚卵巢生殖細(xì)胞在15.5天進(jìn)入減數(shù)分裂；RA合成酶基因Raldh2在15.5天顯著上調(diào)而降解酶Cyp26bl卻逐漸下降,表明Raldh2在RA聚集并維持減數(shù)分裂中的重要作用；RA受體RARβ則略微升高,表明其在RA啟動(dòng)減數(shù)分裂中的介導(dǎo)作用。而在雄性睪丸中,這些基因的表達(dá)變化很小,一直保持較低水平。10.5天和12.5天雞胚卵巢在無血清的體外培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng)5天和3天,生殖細(xì)胞能白發(fā)啟動(dòng)減數(shù)分裂：在培養(yǎng)體系中添加RA能明顯增加進(jìn)入減數(shù)分裂的細(xì)胞比例,顯著上調(diào)了減數(shù)分裂相關(guān)基因Stra8,Scp3和Dmcl（?）的mRNA表達(dá)水平。Raldh2shRNA干擾后顯著抑制了RA誘導(dǎo)減數(shù)分裂啟動(dòng)的作用。綜上所述,我們的研究表明,RA及其信號(hào)通路對減數(shù)分裂啟動(dòng)中的重要調(diào)控作用,并首次報(bào)道了Raldh2基因敲減能夠顯著抑制生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂。4.利用shRNA慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞模型研究生殖細(xì)胞的發(fā)育本實(shí)驗(yàn)采用RNA干涉（RNAi）的方法,成功設(shè)計(jì)了三對針對Raldh2基因序列的保守區(qū)域的shRNA （short hairpin）分子,并構(gòu)建質(zhì)粒干涉載體。轉(zhuǎn)染雞胚15.5天卵巢生殖細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%-90%。通過qRT-PCR及SCP3免疫熒光染色檢測,結(jié)果表明Raldh2-gallus-1224很好的抑制了Raldh2的表達(dá),成功篩選出能高效抑制Raldh2復(fù)制的靶位點(diǎn)。針對有效位點(diǎn)構(gòu)建了攜帶有能高效抑制Raldh2的shRNA慢病毒載體,將包裝后的病毒注射到X期雞胚胚盤內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作,建立Raldh2基因敲減的轉(zhuǎn)基因雞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Raldh2基因敲減的轉(zhuǎn)基因雞胚外觀與對照組的雞胚相比無明顯差異,卵巢形態(tài)大致正常,應(yīng)用PCR檢測GFP在胚體內(nèi)的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)我們成功制備了轉(zhuǎn)基因雞模型,且qRT-PCR檢測到Raldh2的表達(dá)顯著下降。本實(shí)驗(yàn)為探索基于LV-siRNA慢病毒載體法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家禽的可行性,建立基因敲減的轉(zhuǎn)基因雞模型,為研究卵泡發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雞胚PGC的體外共培養(yǎng)模型可用于PGC增殖和分化調(diào)控的研究,經(jīng)AKP、PAS及c-kit、SSEA-1、3、4和EMA-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色和干細(xì)胞多能性相關(guān)基因（Pou5fl,Sox2和Nanog）表達(dá)的RT-PCR檢測等多種方法證實(shí)了PGC的原始性。利用此模型我們研究了維甲酸在PGC體外培養(yǎng)中的促增殖和粘附作用及其分子機(jī)理：我們還描述了雞胚卵巢生殖細(xì)胞體內(nèi)減數(shù)分裂啟動(dòng)中的形態(tài)學(xué)和分子變化,通過組織培養(yǎng)和RNA干擾等手段研究了RA對減數(shù)分裂啟動(dòng)的調(diào)控作用。這些發(fā)現(xiàn)將為禽類干細(xì)胞系的建立和轉(zhuǎn)基因模型的制備奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為進(jìn)一步研究生殖細(xì)胞的發(fā)育提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
王大虎[2]（2011）在《端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義》文中研究指明目的:食管癌（esophageal carcinoma, EC）是全世界最常見的消化道惡性腫瘤之一,我國的食管癌發(fā)病率較高,河北省磁縣更是食管癌的高發(fā)區(qū),嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量和生命健康。端粒、端粒酶在腫瘤細(xì)胞的永生化和演進(jìn)中扮演重要角色。端粒酶的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞無限制地增殖和腫瘤的發(fā)生。端粒（telomere）作為分子鐘控制著人類細(xì)胞的復(fù)制與衰老,與細(xì)胞的壽命密切相關(guān)。正常細(xì)胞每次分裂,端粒DNA長度會(huì)縮短55～200 bp,經(jīng)歷多次分裂后縮短至其下限時(shí),細(xì)胞最終凋亡或死亡。端粒酶（telomerase）是一種以自身RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄酶,其核心組分之一端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase , hTERT）是端粒酶發(fā)揮活化作用的重要途徑,它的表達(dá)調(diào)控在端粒酶活性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,是細(xì)胞呈現(xiàn)端粒酶活性的決定因素。已有大量研究發(fā)現(xiàn),在惡性腫瘤的發(fā)生中存在有端粒DNA長度的縮短,并且端粒酶的激活維持了大多數(shù)組織的端粒長度,抵消了細(xì)胞分裂導(dǎo)致的端粒DNA消耗。說明端?？s短在惡性腫瘤的演變中起重要作用。已有大量研究表明,人體正常細(xì)胞除少量細(xì)胞如精原細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞外,大多數(shù)細(xì)胞的端粒酶幾乎都是無活性的,而與之相反在絕大多數(shù)惡性腫瘤中端粒酶活性高表達(dá),表達(dá)率高達(dá)90%以上。因此端粒酶的活化可能是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種基因改變中起到了至關(guān)重要的作用,并且可以作為最具普遍性和特異性的腫瘤分子標(biāo)記物,在腫瘤的診斷和治療中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,將有可能阻止腫瘤細(xì)胞惡性增殖,這種特性使端粒酶成為當(dāng)今腫瘤診治研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法檢測端粒DNA長度、端粒酶hTERT蛋白含量及細(xì)胞內(nèi)DNA含量在食管癌高發(fā)區(qū)現(xiàn)場人食管癌、異型增生及正常食管的表達(dá),探討與食管癌發(fā)生及生物學(xué)行為的關(guān)系,試圖為食管癌的早期診斷提供客觀參考指標(biāo),并為揭示食管癌的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制提供理論依據(jù)。采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增反應(yīng)（TRAP）-ELISA和TRAP -銀染法半定量技術(shù),檢測食管癌及異型增生組織中端粒酶活性的表達(dá),探討端粒酶活性與食管癌發(fā)生發(fā)展及其與臨床病理因素的關(guān)系。PinX1基因作為端粒酶的內(nèi)源性抑制基因,近年來被認(rèn)為是一種潛在的抑癌基因,其表達(dá)可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在胃癌、大腸癌及白血病患者中PinX1表達(dá)明顯下降,端粒酶活性增強(qiáng)。但是也有研究顯示PinX1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)與正常組織無顯著差異,而與之相應(yīng)的是此類腫瘤中大部分端粒酶活性也增強(qiáng)。目前PinX1基因在腫瘤細(xì)胞中的作用和對端粒酶活性的調(diào)控及在細(xì)胞癌變中的機(jī)制尚不十分清楚。有關(guān)PinX1基因在食管癌中的研究國內(nèi)外也鮮有報(bào)道。PinX1基因的作用越來越引起人們的重視,但到目前為止,PinX1基因在食管癌中生物學(xué)意義、作用機(jī)理國內(nèi)外的報(bào)道很少,并且沒有適合研究PinX1基因的食管癌細(xì)胞模型。由于基因轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為治療腫瘤等基因表達(dá)異常的有效手段,那么,通過外源性過表達(dá)PinX1基因能否抑制食管癌細(xì)胞的增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本實(shí)驗(yàn)中利用多項(xiàng)技術(shù),應(yīng)用細(xì)胞模型研究PinX1在人食管癌、異型增生組織及正常食管組織中的表達(dá),探討PinX1與食管癌發(fā)生發(fā)展及與食管癌臨床分期、病理分型及預(yù)后的相關(guān)性,并分析與端粒酶活性表達(dá)的相關(guān)性。研究轉(zhuǎn)染PinX1基因前后細(xì)胞增殖凋亡等的變化,初步了解該基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞的生物學(xué)影響。同時(shí)我們應(yīng)用TRAP-ELISA和TRAP-銀染法檢測轉(zhuǎn)染前后Eca109細(xì)胞端粒酶活性的變化,進(jìn)一步探討PinX1基因與端粒酶的關(guān)系。方法:1端粒DNA長度及端粒酶hTERT在食管癌高發(fā)區(qū)人群中的表達(dá)及生物學(xué)意義收集采集自河北省磁縣食管癌高發(fā)區(qū)現(xiàn)場的咬檢組織1000例,所有患者未接受過化療和放療。從中選取130例,根據(jù)病情分為3組,第1組為正常食管組織36例,第2組為異型增生組織50例,第3組為食管鱗癌組織44例。經(jīng)病理組織學(xué)診斷,50例異型增生食管粘膜組織中,22例為輕度增生組織,28例為重度增生組織;44例食管鱗狀細(xì)胞癌中,20例為高分化鱗癌、11例為中分化鱗癌,13例為低分化鱗癌,25例侵及纖維膜及周圍軟組織,19例未侵及纖維膜;20例為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,24例為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。采用流式細(xì)胞術(shù)方法（flow cytometry, FCM）和免疫組織化學(xué)方法（immunohistochemistry, IHC）檢測測端粒DNA長度、端粒酶hTERT蛋白含量及細(xì)胞內(nèi)DNA含量在食管癌高發(fā)區(qū)現(xiàn)場人食管癌、異型增生及正常食管的表達(dá),分析與食管癌發(fā)生及與臨床病理特征的關(guān)系。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表達(dá)及其生物學(xué)意義收集食管鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本130例,每例標(biāo)本分別取癌組織、癌旁組織（距癌邊緣2-5cm）及手術(shù)切緣正常食管粘膜（距癌邊緣5cm以上）。從中選取50例食管鱗狀細(xì)胞癌、異型增生及正常食管粘膜組織。經(jīng)病理組織學(xué)診斷,50例食管鱗狀細(xì)胞癌,39例為高中分化鱗癌,11例為低分化鱗癌,34例侵及纖維膜,16例未達(dá)到纖維膜,17例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,33例未轉(zhuǎn)移。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、流式細(xì)胞術(shù)方法（flow cytometry, FCM）、TRAP-ELISA和TRAP-銀染法檢測食管癌組織、異型增生、正常粘膜組織中端粒酶活性和PinX1基因和蛋白的表達(dá),分析端粒酶活性和PinX1表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系。3基因轉(zhuǎn)染PinX1對食管癌Eca109細(xì)胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影響利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建pCDNA3.1（+）-PinX1重組質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將pCDNA3.1（+）-PinX1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞,同時(shí)也設(shè)置空載體pCDNA3.1轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后用G418進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選,篩選出來的陽性細(xì)胞分別命名為Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1細(xì)胞。應(yīng)用激光共聚焦方法測定轉(zhuǎn)染效率,MTS方法檢測過表達(dá)PinX1對Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109細(xì)胞生長抑制作用。FCM方法檢測細(xì)胞生長周期和細(xì)胞凋亡。RT-PCR、FCM、Western-blot方法檢測Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109細(xì)胞中PinX1基因及蛋白的表達(dá),TRAP-ELISA和TRAP-銀染法檢測端粒酶活性在細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果:1端粒DNA長度及端粒酶hTERT在食管癌高發(fā)區(qū)人群中的表達(dá)及生物學(xué)意義FCM檢測端粒長度結(jié)果顯示,端粒DNA長度在食管癌組織中表達(dá)量與正常食管組織相比明顯縮短,在食管正常組織、異型增生組織、癌組織的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低趨勢（P<0.01）;端粒DNA長度在食管輕度增生、重度增生之間呈逐漸降低趨勢,重度增生組與輕度增生組相比明顯縮短（P<0.01）,輕度增生組與正常組比較無顯著性差異（P>0.05）。隨著細(xì)胞學(xué)分級(jí)增高,端粒DNA長度Q-FISH值逐漸降低,端粒DNA長度與細(xì)胞學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.79, P <0.01）。FCM檢測端粒酶hTERT基因蛋白含量,在癌、重度增生、輕度增生和正常食管的FI值分別為1.84±0.21、1.39±0.24、1.13±0.19和0.87±0.18,癌組hTERT含量高于重度增生組（P <0.01）、重度增生組高于輕度增生組（P<0.01）,輕度增生組與正常組相比無顯著性差別。隨著細(xì)胞學(xué)分級(jí)增高, hTERT的FI值隨之升高, hTERT蛋白含量與細(xì)胞學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.83, P<0.01）。根據(jù)FI值>1.0為陽性表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn),輕度增生組、重度增生組和癌組hTERT蛋白陽性表達(dá)率分別為68.18%、92.86%和95.45%,重度增生組和癌組的表達(dá)率都高于輕度增生組（P<0.01）。FCM檢測正常組、輕度增生組、重度增生組和癌組細(xì)胞DNA含量,DI值分別為1.03±0.34、1.06±0.28、1.17±0.25和1.54±0.37,正常組、輕度增生組和重度增生組的DI值呈上升趨勢（P>0.05）,癌組的DI值明顯高于重度增生組。DI值與細(xì)胞學(xué)分級(jí)正相關(guān)（r=0.62, P<0.01）;正常組、輕度增生組、重度增生組和癌組DNA異倍體率分別為11.11（4/36）、9.09（2/22）、28.57（8/28）和81.82（36/44）,癌組異倍體率高于重度增生組（P<0.01）,重度增生組高于輕度增生組（P<0.05）;從正常組到癌組PI值分別為10.98±4.11、14.15±4.76、18.97±5.27和28.79±5.47,隨著細(xì)胞學(xué)分級(jí)的升高,PI值增大,癌組顯著高于重度增生組（P<0.01）,重度增生組高于輕度增生組（P<0.05）。PI值與細(xì)胞學(xué)分級(jí)正相關(guān)（r=0.64, P<0.01）。130例食管樣本的DI值與PI值高度正相關(guān)（r=0.76, P<0.01）;端粒長度Q-FISH值與端粒酶hTERT蛋白FI值負(fù)相關(guān)（r=-7.49, P<0.01）;端粒Q-FISH值與DI值負(fù)相關(guān)（r=-0.41, P<0.01）。IHC結(jié)果顯示:端粒酶hTERT蛋白陽性顆粒呈棕黃色,陽性物質(zhì)全部位于上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的核內(nèi)。在異型增生組織,端粒酶hTERT蛋白的陽性表達(dá)部位主要集中在基底細(xì)胞層及其上方的細(xì)胞核內(nèi),隨著食管黏膜上皮增生程度的加重,hTERT陽性細(xì)胞逐漸增多,陽性細(xì)胞帶上移。正常食管粘膜組織中陽性表達(dá)率為11.1%（4/36）,異型增生組織和癌組織hTERT蛋白陽性表達(dá)率分別為44.0%（22/50）和86.37%（38/44）。三者陽性率比較,癌組織顯著高于異型增生組織（P<0.01）,異型增生組織高于正常上皮組織（P<0.01）。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表達(dá)及其生物學(xué)意義端粒酶活性檢查結(jié)果顯示,在食管癌、異型增生和正常食管組織中,陽性表達(dá)率分別為84.0%、62.0%及6.0%,食管癌及異型增生組織與正常食管粘膜比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。端粒酶活性的平均A值分別為食管癌組織1.457±0.838、食管異型增生組織0.429±0.346和正常食管粘膜組織0.073±0.039。三組間兩兩比較端粒酶活性的平均A值均存在高度顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。按正常食管粘膜組織、食管異型增生組織和食管鱗癌組織的序列,端粒酶陽性表達(dá)率和平均A值依次明顯增高。食管癌組織中端粒酶陽性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān),而端粒酶活性的平均A值與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);食管癌組織中端粒酶陽性表達(dá)率及端粒酶活性的平均A值與其他臨床病例因素如年齡、性別和浸潤深度等無關(guān)。RT-PCR及FCM檢測PinX1結(jié)果顯示,PinX1 mRNA及蛋白在食管癌組織中表達(dá)均顯著低于食管正常粘膜（P <0.01）,在食管正常粘膜、異型增生、癌組織之間呈現(xiàn)逐漸降低趨勢（P <0.05）。食管癌組織中,PinX1 mRNA和蛋白與分化程度、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P <0.05）,與性別和年齡無明顯相關(guān)（P >0.05）。食管癌組織中端粒酶活性表達(dá)與PinX1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（rs =-0.883,P=0.000）。3基因轉(zhuǎn)染PinX1對食管癌Eca109細(xì)胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影響應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,將pCDNA3.1（+）-PinX1重組質(zhì)粒及空載體pCDNA3.1成功轉(zhuǎn)染入Eca109細(xì)胞中,并應(yīng)用G418成功篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染pCDNA3.1- PinX1重組質(zhì)粒與空載體pCDNA3.1的陽性克隆細(xì)胞分別記為Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1細(xì)胞。MTS法測定增殖情況結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染PinX1基因后,Eca109細(xì)胞生長明顯減慢（P<0.05）;而Eca109細(xì)胞與僅轉(zhuǎn)染入空載體的Eca109細(xì)胞生長比較,兩者無明顯差異（P>0.05）。FCM測定細(xì)胞生長周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染PinX1基因的Eca109細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞數(shù)（%）為70.58±5.26,明顯高于未轉(zhuǎn)染或僅轉(zhuǎn)染空載體的食管癌Eca109細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞數(shù)（%）（分別為53.14±4.83及47.27±3.73）（P<0.05）。說明轉(zhuǎn)染PinX1基因后,細(xì)胞的增殖明顯變慢,細(xì)胞生長阻滯于G0/G1期（Fig. 3-9）。FCM測定細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡表明:轉(zhuǎn)染PinX1基因的Eca109細(xì)胞的凋亡率（%）為23.28±5.73,明顯高于未轉(zhuǎn)染或僅轉(zhuǎn)染空載體的食管癌Eca109細(xì)胞的凋亡率（%）（分別為0.27±0.18及3.40±1.09）（P<0.05）。說明轉(zhuǎn)染入PinX1基因后,細(xì)胞發(fā)生早期凋亡改變。RT-PCR、Western-blot和FCM檢測結(jié)果顯示,Eca109/ PinX1細(xì)胞中PinX1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較Eca109/pCDNA3.1、Eca109細(xì)胞顯著升高（P <0.05）。細(xì)胞端粒酶活性的檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染PinX1基因后,細(xì)胞端粒酶活性明顯降低（P<0.05）。轉(zhuǎn)染前后Eca109中端粒酶活性表達(dá)與細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）表達(dá)呈正相關(guān)性（rs=0.451,P=0.000）。結(jié)論:1端粒DNA長度在食管癌前細(xì)胞及癌細(xì)胞中明顯縮短,并且隨病變程度加重而遞減。端粒酶hTERT、細(xì)胞內(nèi)DNA含量和PI值在食管上皮癌變發(fā)生中明顯遞增,提示食管癌變與三者密切相關(guān)。端粒DNA長度、端粒酶hTERT在食管癌前病變早期即出現(xiàn)變化,可以做為監(jiān)測食管癌發(fā)生發(fā)展的參考指標(biāo)。端粒酶hTERT與食管癌的臨床病理特征無關(guān),不能做為食管癌病人預(yù)后的指標(biāo)。端?？s短、端粒酶hTERT高表達(dá)都與食管癌變密切相關(guān),有望以上述二者為靶點(diǎn)指導(dǎo)抗腫瘤的基因治療。2食管癌及異型增生組織中存在端粒酶活性表達(dá),并存在量的差異。端粒酶活性在異型增生即呈現(xiàn)高表達(dá),隨著病變的加重,端粒酶活性依次顯著增高,提示端粒酶參與了食管癌的發(fā)生與發(fā)展,端粒酶的激活是食管癌的早期事件。端粒酶可望成為食管癌的病情監(jiān)測及早期診斷的生物學(xué)指標(biāo)。端粒酶活性A值與食管癌的組織學(xué)分級(jí)和淋結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示食管癌端粒酶活性A值可作為判斷療效和評價(jià)預(yù)后的指標(biāo)。PinX1在食管癌組織中表達(dá)顯著低于食管正常組織,在食管正常組織、異型增生組織、癌組織之間呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。PinX1在食管癌中表達(dá)和病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān),分級(jí)越高,PinX1表達(dá)越低。浸潤深度達(dá)到纖維膜者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的PinX1表達(dá)要低于浸潤深度未達(dá)到纖維膜者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。認(rèn)為PinX1是一種潛在的食管癌相關(guān)基因,檢測PinX1的表達(dá)水平可能對評價(jià)食管癌惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后評估有重要的臨床價(jià)值。食管癌組織中端粒酶活性與PinX1表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性,證實(shí)PinX1抑制端粒酶活性。3首次應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法建立食管癌細(xì)胞株Eca109/PinX1,目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見相關(guān)報(bào)道。Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1基因后,細(xì)胞的增殖明顯變慢,細(xì)胞生長阻滯于G0/G1期,細(xì)胞發(fā)生早期凋亡改變。Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染PinX1基因后,端粒酶活性明顯降低,并且端?；钚耘c細(xì)胞增殖指數(shù)呈顯著正相關(guān),考慮在食管癌細(xì)胞中PinX1基因通過降低端粒的活性,減弱細(xì)胞的增殖,有望成為食管癌治療的分子靶點(diǎn)。
鄭小波[3]（2010）在《c-jun對仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌影響的機(jī)理研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理兩性配子的生成是動(dòng)物繁衍的前提和基礎(chǔ),睪酮在精子生成過程中具有十分重要的作用。睪酮不僅在精子生成過程中具有十分重要的作用,而且睪酮還參與維持雄性動(dòng)物的第二性征,對精子的活力、授精的成功率也有重要的影響。間質(zhì)細(xì)胞是雄性動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生睪酮最主要的細(xì)胞,研究間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的調(diào)控機(jī)制對于深入認(rèn)識(shí)精子生成的分子機(jī)制,預(yù)防和治療雄性不育均有十分重要的意義。關(guān)于睪酮合成機(jī)制的研究以往多集中在下丘腦-垂體-睪丸軸內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和促性腺激素對睪酮合成的影響上,但近年來的研究表明,原癌基因的表達(dá)在睪酮合成中起著十分重要的作用。本研究以榮昌豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,利用體內(nèi)體外模型探討原癌基因c-jun對睪酮合成的調(diào)節(jié)機(jī)制,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)原癌基因在精子生成中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。大量的研究表明,睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌也伴有某些原癌基因的表達(dá)變化,特別是即時(shí)早期基因的表達(dá)變化。這些即時(shí)早期基因主要包括fos成員和jun家族。我們以c-jun為目的基因,以1、3、5周齡的榮昌仔豬睪丸為研究對象,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法和放射免疫法研究了c-jun mRNA在仔豬睪丸中的表達(dá)及表達(dá)與血漿睪酮水平的關(guān)系,并切片觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：c-jun mRNA在1、3、5周齡仔豬睪丸組織中均有表達(dá)。其中3周齡表達(dá)較高,5周齡次之,1周齡較低,3周齡與5周齡和1周齡相比存在顯著差異（P<0.05）。血漿睪酮水平在第3周最高,在其他時(shí)期較低,3周齡與1周齡、5周齡比較差異顯著（P<0.01）,3周齡仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸完整,5周齡數(shù)量有所下降。c-jun mRNA的表達(dá)與血漿睪酮水平及間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化可能存在一致性。3周齡榮昌仔豬睪丸作為研究睪酮分泌機(jī)制的材料是適宜的。通過不同時(shí)間仔豬睪丸組織c-jun mRNA表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),其表達(dá)水平與血漿睪酮濃度檢測結(jié)果有一致性。為了進(jìn)一步了解c-jun mRNA表達(dá)和睪酮分泌的關(guān)系,采用了體外培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究,目的是排除其他細(xì)胞（如支持細(xì)胞、生精細(xì)胞）的干擾。通過錐蟲藍(lán)試驗(yàn)和3β-HSD酶活性檢測,用酶解法結(jié)合差速離心分離的榮昌仔豬間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多,純度較高,其活力為（93.0±4.9）%,純化后的細(xì)胞百分率為（85.1±3.6）%。睪酮基礎(chǔ)分泌量隨培養(yǎng)的時(shí)間延長而增高,兩者呈線性關(guān)系（r=0.826,P<0.01）,培養(yǎng)至4h后增長峰趨于平緩。隨著hCG刺激濃度的增加,睪酮分泌量增加,兩者呈明顯線性關(guān)系（r=0.893,P<0.01）。當(dāng)hCG濃度達(dá)到50IU/mL時(shí),誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量最高。本實(shí)驗(yàn)中均采用50IU/mL為hCG誘導(dǎo)濃度。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確了解c-jun mRNA表達(dá)與睪酮分泌的關(guān)系,我們采用了反義核酸技術(shù),即將c-jun基因制備成反義c-junASODNs與體外培養(yǎng)的3周齡睪丸間質(zhì)細(xì)胞共育,了解c-jun表達(dá)與睪酮分泌的量效關(guān)系。同時(shí),通過MTT和TUNEL法了解睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌過程中細(xì)胞增殖和凋亡的作用。結(jié)果顯示,c-jun ASODNs以劑量依賴性方式抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下睪酮分泌（P<0.01）及睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖（P<0.01）,當(dāng)加入1μmol/L c-junASODNs時(shí),顯著抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡（P<0.05）。這表明c-jun可促進(jìn)基礎(chǔ)狀態(tài)下仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌,這種作用與c-jun促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分泌有基礎(chǔ)性分泌和促性腺激素誘導(dǎo)的分泌,后者受下丘腦—垂體—性腺軸調(diào)節(jié)。絨毛膜促性腺激素hCG可與間質(zhì)細(xì)胞表面受體結(jié)合,使ATP（?）→cAMP,而cAMP可動(dòng)員膽固醇經(jīng)過一系列中間步驟,最終生成睪酮。本試驗(yàn)通過c-jun ASODNs誘導(dǎo)觀察c-jun在調(diào)節(jié)hCG誘導(dǎo)的仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的作用,采用c-jun ASODNs拮抗c-jun,維拉帕米阻斷鈣通道,添加cAMP觀察其對體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hCG可刺激榮昌仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌,c-jun ASODNs（0.125-2μmol/L）呈劑量依賴性抑制hCG誘導(dǎo)離體睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分泌（P<0.01）,加用cAMP后睪酮分泌增加,可逆轉(zhuǎn)c-jun ASODNs抑制hCG誘導(dǎo)離體睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌。維拉帕米（10-5mol/L）可增加c-jun ASODNs抑制睪酮分泌作用。因此,推測c-jun在促進(jìn)hCG誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮過程中,主要通過以下信號(hào)途徑傳遞信息：（1）hCG作用于仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜特異性受體,通過G蛋白介導(dǎo),激活腺苷酸環(huán)化酶,從而使cAMP生成增多,然后以cAMP作為第二信使,通過cAMP-PKA途徑導(dǎo)致核內(nèi)原癌基因c-jun轉(zhuǎn)錄和翻譯,其表達(dá)產(chǎn)物間或產(chǎn)物與c-fos蛋白在亮氨酸拉鏈區(qū)（1eucne zipper）形成同源或異源二聚體復(fù)合物,與靶基因的AP-1 （activator protein 1）位點(diǎn)結(jié)合,直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,激活一些晚期基因轉(zhuǎn)錄,如P450c17mRNA,后經(jīng)過一系列酶作用,促進(jìn)睪酮的合成和分泌。（2）hCG作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜上特異性受體,使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高,然后以Ca2+作為第二信使,通過IP3-DAG-鈣調(diào)蛋白激酶途徑繼而使核內(nèi)原癌基因c-jun轉(zhuǎn)錄激活。其表達(dá)產(chǎn)物間或產(chǎn)物與c-fos蛋白在亮氨酸拉鏈區(qū)形成同源或異源二聚體復(fù)合物,與靶基因的AP-1位點(diǎn)結(jié)合,直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,激活一些晚期基因轉(zhuǎn)錄,如P450c17 mRNA,然后經(jīng)過一系列酶作用,促進(jìn)睪酮的合成和分泌。綜上所述,我們可以得到以下結(jié)論：1、c-jun mRNA在1、3、5周齡榮昌仔豬睪丸中均有表達(dá),3周齡較高,其變化趨勢與血漿中睪酮水平變化有一致性。2、酶解法結(jié)合差速離心分離的榮昌仔豬間質(zhì)細(xì)胞活力強(qiáng),純度較高,數(shù)量較多。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,睪酮分泌量增加,4h達(dá)峰值。隨著hCG的濃度增加,睪酮分泌增加,50IU/mL的hCG刺激的睪酮分泌達(dá)峰值。3、c-jun能劑量依賴性促進(jìn)基礎(chǔ)狀態(tài)下的睪酮分泌,可能與促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。4、c-jun能劑量依賴性影響hCG誘導(dǎo)的睪酮分泌。5、c-jun在調(diào)節(jié)hCG誘導(dǎo)睪酮的分泌過程中,可能的機(jī)制是通過hCG→激活受體→激活第二信使（cAMP,Ca2+）→誘導(dǎo)c-jun基因轉(zhuǎn)錄mRNA→在胞漿內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物c-Jun進(jìn)入核內(nèi)其表達(dá)產(chǎn)物間或產(chǎn)物與c-fos蛋白在亮氨酸拉鏈區(qū)（1eucine zipper）形成同源或異源二聚體復(fù)合物,與靶基因的AP-1 （activator protein-1）位點(diǎn)結(jié)合→激活一些晚期基因轉(zhuǎn)錄,如P450c17mRNA,后經(jīng)過一系列酶促作用→促進(jìn)睪酮的合成和分泌。
劉成武[4]（2008）在《病毒載體介導(dǎo)的微型核酶對犬賈第蟲端粒酶活性的影響》文中提出本研究在對犬賈第蟲（G. canis）病毒研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了犬賈第蟲病毒（GCV）通用型轉(zhuǎn)染載體,在載體中引入了抗性盒、多克隆酶切位點(diǎn)和內(nèi)源性啟動(dòng)子,并在G. canis體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)了綠色熒光蛋白基因;根據(jù)國外報(bào)到的藍(lán)氏賈第蟲的端粒重復(fù)序列設(shè)計(jì)了寡聚核苷酸探針[5′-TAGGG-3′]5與Bal31-EcoRI不同消化時(shí)間的G. canis基因組DNA進(jìn)行雜交鑒定,確定了我國G. canis端粒重復(fù)序列為（TAGGG）n;在此基礎(chǔ)上,采用改進(jìn)的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法（TRAP）首次對G. canis滋養(yǎng)體時(shí)期和包囊時(shí)期的端粒酶活性進(jìn)行了檢測,并在滋養(yǎng)體時(shí)期檢測到很強(qiáng)的端粒酶活性,而包囊時(shí)期未檢測到端粒酶活性;將兩端攜帶反義GcTERT基因的微型核酶插入到犬賈第蟲病毒載體pNEO/GDH/MCS中,構(gòu)建兩個(gè)核酶嵌合型犬賈第蟲病毒載體TRzS和TRzL,其體外轉(zhuǎn)錄體對GcTERT基因體外轉(zhuǎn)錄RNA切割效率分別為76.14%和83.42%,同時(shí)構(gòu)建一個(gè)反義RNA載體,切割效率為31.56%;體內(nèi)試驗(yàn)表明TRzS和TRzL對GcTERT基因表達(dá)抑制效果顯著,最高可分別達(dá)84%和72%,端粒酶活性明顯降低的同時(shí),轉(zhuǎn)染組蟲體細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常對照組（P<0.01）。本試驗(yàn)成功的構(gòu)建和應(yīng)用了犬賈第蟲病毒通用型載體,為進(jìn)行賈第蟲細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)對G. canis端粒酶活性的研究,也為將來以端粒酶作為化療的靶位點(diǎn),進(jìn)行賈第蟲病的預(yù)防和治療提供新思路。
閆登科[5]（2007）在《c-raf在精原干細(xì)胞中的表達(dá)及作用的研究》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理目的:完善大鼠精原干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)技術(shù);研究c-raf對精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的存活作用及機(jī)制。方法:非連續(xù)密度梯度離心及差速貼壁法分離精原干細(xì)胞;c-kit細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定精原干細(xì)胞;基因測序和SeqMan、檢驗(yàn)精原干細(xì)胞擴(kuò)增DNA和c-raf的同源性;MTT比色法檢測體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞的存活及增殖情況,觀察c-raf AON對精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)存活的量效關(guān)系及c-raf AON對精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)存活的時(shí)效關(guān)系;RT-PCR檢測c-raf mRNA和caspase-3 mRNA的表達(dá)情況;TUNEL檢測c-raf AON對精原干細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:非連續(xù)密度梯度離心及差速貼壁法分離的精原干細(xì)胞,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)其存活率分別為92.3%和91.5%;分離后的精原干細(xì)胞經(jīng)c-kit鑒定其純度為90.1%;精原干細(xì)胞在含10%NBS的DMEM中培養(yǎng)120h時(shí)增殖達(dá)高峰,在無10%NBS的DMEM中培養(yǎng)其存活率持續(xù)下降;精原干細(xì)胞擴(kuò)增DNA和c-raf的同源性為98%;15μmol/L c-raf AON作用12h后精原干細(xì)胞存活率下降（P<0.05）,于18h后存活率持續(xù)下降（P<0.05）;與對照組相比c-raf AON組的c-raf mRNA水平明顯下調(diào)（P<0.05）,而caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.05）;c-raf AON組凋亡指數(shù)（40.5%）明顯大于對照組（30.2%）和錯(cuò)義組（29.4%）的凋亡指數(shù)（P<0.05）。結(jié)論:非連續(xù)密度梯度離心結(jié)合差速貼壁法是分離精原干細(xì)胞的有效方法;c-kit可作為鑒定精原干細(xì)胞的分子標(biāo)志物;精原干細(xì)胞在含10%NBS的DMEM培養(yǎng)基中短期增殖;c-raf在九天的雄性SD大鼠的精原干細(xì)胞上表達(dá);c-raf可能通過抑制凋亡而促進(jìn)精原干細(xì)胞存活;c-raf可能通過下調(diào)capspase-3的表達(dá)而抑制精原干細(xì)胞凋亡。
高嶺[6]（2007）在《丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及端粒酶活性影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究》文中提出喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，位居頭頸部上皮源性惡性腫瘤的第2位，占全身腫瘤的1.2％～1.6％。近年來，世界多數(shù)地區(qū)喉癌的發(fā)病率及死亡率均有明顯增高趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康與生命。雖然近幾十年來傳統(tǒng)的治療方式如手術(shù)、放療、化療等已有很大改進(jìn)，提高了患者的5年生存率，但手術(shù)治療往往嚴(yán)重破壞患者的喉功能而致殘；放療僅對早期喉癌療效好，對于大多數(shù)就診時(shí)即為中、晚期或治療后又出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的患者往往效果不佳；而化療又由于其嚴(yán)重的毒、副作用常使得患者不能耐受治療，從而使這些治療方式仍受到極大限制。因此，積極尋求治療喉癌的新途徑成為廣大耳鼻咽喉科研究者面臨的新課題。近年來，隨著對腫瘤發(fā)生機(jī)理研究的不斷深入，針對腫瘤發(fā)生機(jī)制多環(huán)節(jié)而起作用的新型抗腫瘤藥物不斷發(fā)展，新的抗癌藥物不斷應(yīng)用于臨床，但因存在不少急需解決的問題，其臨床應(yīng)用前景仍受到很大限制。而以在維持腫瘤的生長中起重要作用的端粒酶為靶點(diǎn)的端粒酶抑制劑和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的凋亡誘導(dǎo)劑等，因其作用機(jī)制廣泛，潛在的毒性反應(yīng)較輕，已引起腫瘤研究者的廣泛關(guān)注。組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDIs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的靶向抗腫瘤藥物，它主要通過調(diào)節(jié)組蛋白的乙酰化狀態(tài)來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引起相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)分化、凋亡以及端粒酶活性抑制等一系列結(jié)果而達(dá)到治療腫瘤的目的。丁酸鈉（sodium butyrate，SB）是食物纖維在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種無毒的四碳短鏈脂肪酸，是HDIs中的一類小分子化合物。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，丁酸鈉能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，并且在誘導(dǎo)凋亡過程中，還能有效地抑制細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)，具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng)。進(jìn)一步研究表明，丁酸鈉對人前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤均有明顯的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，且對機(jī)體無明顯毒副作用。這些研究結(jié)果提示丁酸鈉有望成為一種高效、低毒的凋亡誘導(dǎo)劑和端粒酶抑制劑在腫瘤治療中發(fā)揮作用。目前對丁酸鈉抗腫瘤作用的研究已涉及消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及骨腫瘤等相關(guān)系統(tǒng)腫瘤，但丁酸鈉對頭頸部腫瘤影響的報(bào)道較少，有關(guān)其對喉癌作用的研究，迄今國內(nèi)、外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。隨著細(xì)胞培養(yǎng)方法的發(fā)展與普及，應(yīng)用體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞尋找新抗癌藥物的研究已逐漸成為最重要的初篩手段之一。Hep-2為人喉上皮樣癌細(xì)胞系，因其保留了大部分人喉鱗癌的生物學(xué)特性，已被廣泛用于喉癌診斷、治療的體外研究。為探討丁酸鈉在喉癌治療中的作用，本研究在體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)及多種分子生物學(xué)技術(shù)觀察了丁酸鈉對Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影響并探討其發(fā)生機(jī)制，為藥物治療喉癌拓展新的思路和方法。機(jī)體內(nèi)部環(huán)境與體外環(huán)境有著很大的差異，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能確切反映藥物在體內(nèi)對腫瘤的殺傷情況。為進(jìn)一步明確丁酸鈉經(jīng)體內(nèi)代謝后對腫瘤的影響，本研究在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Hep-2細(xì)胞株建立人喉癌裸鼠皮下移植瘤模型，應(yīng)用適當(dāng)濃度的丁酸鈉進(jìn)行分組治療實(shí)驗(yàn)，觀察丁酸鈉的抑瘤作用以及荷瘤裸鼠的毒性反應(yīng)，并探討其發(fā)生機(jī)制，為藥物的開發(fā)、應(yīng)用提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為以下三部分。第一部分丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及凋亡的影響方法1．采用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl terazolium，MTT）比色法測定經(jīng)0.625、1.25、2.5、5、10mmol／L丁酸鈉分別作用12、24、36、48、60、72h后Hep-2細(xì)胞增殖活性的改變，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。2．應(yīng)用透射電鏡觀察經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用48h的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。3．采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucl-eotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling，TUNEL）技術(shù)分別檢測經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用0（對照）、24、48、72h的細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。4．分別提取經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細(xì)胞DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，顯示凋亡細(xì)胞DNA片段化。5．采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布。6．分別制備經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細(xì)胞爬片，采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞Ki-67抗原和Survivin蛋白表達(dá)情況。7．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。MTT法采用兩因素方差分析加LSD法兩兩比較，TUNEL法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測均采用單因素方差分析加LSD法兩兩比較。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1．丁酸鈉作用后細(xì)胞的增殖活性受到明顯抑制，不同濃度組間（P＜0.01）、不同時(shí)間組間（P＜0.05）均存在顯著性差異。10mmol／L丁酸鈉作用72h后細(xì)胞生長抑制率達(dá)70.43％。丁酸鈉作用后細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，且隨藥物濃度增加、作用時(shí)間延長而更顯著。2．2.5mmol／L丁酸鈉作用48h，透射電鏡下顯示核染色質(zhì)濃縮、邊集及凋亡小體等典型的凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。3．2.5mmol／L丁酸鈉作用48、72h，瓊脂糖凝膠電泳均可見清晰的DNA梯狀條帶。4．TUNEL法顯示，2.5mmol／L丁酸鈉作用24、48、72h后細(xì)胞AI由作用前的2.27±1.18分別增加至13.63±1.90、22.25±3.56和33.50±2.75，不同時(shí)間組間差異有顯著性（P＜0.01）。5．流式細(xì)胞術(shù)顯示，隨丁酸鈉作用時(shí)間延長，細(xì)胞凋亡率逐漸增加（不同時(shí)間組間有顯著性差異，P＜0.01），G0／G1期細(xì)胞比例逐漸升高（P＜0.01），S期細(xì)胞比例逐漸降低（P＜0.01），而G2／M期細(xì)胞比例無明顯變化（P＞0.05）；細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）降低趨勢明顯（P＜0.01）。6．丁酸鈉作用后，細(xì)胞Ki-67抗原和Survivin蛋白表達(dá)均受到抑制，隨丁酸鈉作用時(shí)間延長，Ki-67和Survivin陽性細(xì)胞平均光密度（mean optical density，MOD）值均逐漸降低，不同時(shí)間組間均有顯著性差異（P＜0.01）。第二部分丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞端粒酶活性及端粒酶三組分mRNA表達(dá)的影響方法1．采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增（telomeric repeat amplification protocal，TRAP）-銀染法檢測經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用0、24、48、72h的Hep-2細(xì)胞端粒酶活性，并應(yīng)用凝膠圖象分析系統(tǒng)對檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析，研究丁酸鈉對Hep-2細(xì)胞端粒酶活性的影響。2．采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)檢測經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用0、24、48、72h后細(xì)胞端粒酶三組分的mRNA表達(dá)情況，并對檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析，研究丁酸鈉對Hep-2細(xì)胞端粒酶三組分表達(dá)的影響，以期了解丁酸鈉影響細(xì)胞端粒酶活性的作用部位。3．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用單因素方差分析加LSD法兩兩比較。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1．丁酸鈉作用后Hep-2細(xì)胞端粒酶活性降低。經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用24、48、72h后細(xì)胞端粒酶活性分別比藥物作用前下降了25.36％、61.11％、86.68％，不同時(shí)間組間有顯著性差異（P＜0.01）。2．經(jīng)2.5mmol／L丁酸鈉作用24、48、72h后細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA表達(dá)水平分別比藥物作用前下降了20.92％、55.09％、75.80％，不同時(shí)間組間有顯著性差異（P＜0.01）；而端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）和端粒酶相關(guān)蛋白（human telomerase associated protein 1，hTP1）mRNA表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)無明顯改變（P＞0.05）。第三部分丁酸鈉對人喉癌裸鼠移植瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究方法1．選用4-6w齡BALB／C-nu／nu雌性裸小鼠12只，于裸鼠右腋部皮下接種Hep-2細(xì)胞，建立人喉癌裸鼠移植瘤模型。成瘤后隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6只，治療組每d向腫瘤組織局部注射丁酸鈉，劑量為2.2mg／g體質(zhì)量；對照組注射同體積PBS（0.01M，pH7.4）。共治療4w。2．每d觀察裸鼠的精神、飲食及活動(dòng)狀況。每w測量瘤體大小及裸鼠體質(zhì)量，繪制腫瘤生長變化曲線，進(jìn)行藥物毒性評價(jià)。治療結(jié)束時(shí)處死小鼠，剝除腫瘤稱重，計(jì)算抑瘤率。光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤及心、肝、肺、脾、腎等重要臟器變化。3．應(yīng)用透射電鏡觀察移植瘤超微結(jié)構(gòu)變化。4．采用TUNEL法檢測移植瘤細(xì)胞凋亡情況，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)。5．采用免疫組化技術(shù)檢測移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白表達(dá)情況，并對染色結(jié)果進(jìn)行定量分析。6．采用TRAP-銀染法檢測移植瘤端粒酶活性，并對檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析。7．采用RT-PCR技術(shù)檢測移植瘤端粒酶三組分mRNA表達(dá)情況，并對檢測結(jié)果進(jìn)行半定量分析。8．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1．與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長較慢，腫瘤體積小于對照組，且隨治療時(shí)間延長，這種抑制效果更加明顯。治療結(jié)束時(shí)，兩組瘤體積、瘤質(zhì)量均存在顯著性差異（P＜0.05），體積抑瘤率和質(zhì)量抑瘤率分別達(dá)58.81％和60.33％。2．光鏡下，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)壞死面積明顯大于對照組，細(xì)胞異形性較對照組小，分化程度稍高于對照組，可見核固縮等凋亡表現(xiàn)。3．透射電鏡下，實(shí)驗(yàn)組可見染色質(zhì)濃縮、邊集等典型的凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。4．與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中凋亡細(xì)胞明顯增多，兩組AI分別為：3.10±0.37、29.70±1.84，組間有顯著性差異（P＜0.01）。5．實(shí)驗(yàn)組Ki-67抗原和Survivin蛋白表達(dá)均低于對照組。兩組Ki-67陽性細(xì)胞MOD值分別為：0.278±0.012、0.186±0.100；兩組Survivin陽性細(xì)胞MOD值分別為：0.149±0.007、0.098±0.009，組間均有顯著性差異（P＜0.01）。6．實(shí)驗(yàn)組端粒酶活性明顯低于對照組。兩組端粒酶活性灰度值分別為：3858.00±412.67、2018.83±269.84，組間有顯著性差異（P＜0.01）。7．與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組hTERT mRNA表達(dá)明顯減弱，兩組hTERT mRNA表達(dá)相對光密度（relative optical density，ROD）值分別為：0.60±0.05、0.26±0.03，組間有顯著性差異（P＜0.01）；而兩組hTR mRNA和hTP1 mRNA表達(dá)水平無顯著差異（P值均＞0.05）。8．治療過程中，裸鼠未見明顯不良反應(yīng)，各組末體質(zhì)量（final body weight，F(xiàn)BW）／初體質(zhì)量（initial body weight，IBW）均＞0.8，無毒性反應(yīng)。各組心、肝、肺、脾、腎等重要臟器均無腫瘤轉(zhuǎn)移及器質(zhì)性改變。結(jié)論本文采用免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)以及多種分子生物學(xué)技術(shù)首次檢測了丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞及人喉癌裸鼠移植瘤的增殖、凋亡、細(xì)胞周期、Ki-67抗原、Survivin蛋白表達(dá)、端粒酶活性及端粒酶三組分mRNA表達(dá)的影響，得出如下結(jié)論：1．丁酸鈉對Hep-2細(xì)胞具有增殖抑制作用，這種抑制作用呈時(shí)間劑量依賴性。2．丁酸鈉對Hep-2細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，這種作用存在時(shí)間依賴性。3．丁酸鈉能下調(diào)Hep-2細(xì)胞Ki-67抗原表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性。此作用可能是其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。4．丁酸鈉能下調(diào)Hep-2細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性。其對細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用可能是通過下調(diào)Survivin表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。5．丁酸鈉參與Hep-2細(xì)胞周期調(diào)控，使細(xì)胞阻滯于G0／G1期。丁酸鈉對細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及端粒酶抑制作用可能均與其G0／G1期阻滯有關(guān)。6．丁酸鈉能抑制Hep-2細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)，并下調(diào)其端粒酶活性，二者均呈時(shí)間依賴性；而對hTR mRNA和hTP1 mRNA表達(dá)無影響。提示丁酸鈉對Hep-2細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用可能是通過下調(diào)hTERT基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。7．成功構(gòu)建了人喉癌Hep-2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，證實(shí)丁酸鈉能抑制喉癌移植瘤生長，且對機(jī)體無明顯毒、副作用。8．與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，丁酸鈉能下調(diào)喉癌裸鼠移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白表達(dá)；并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)下調(diào)hTERT mRNA表達(dá)而抑制端粒酶活性。9．本研究首次從體內(nèi)外證實(shí)了丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞及人喉癌裸鼠移植瘤的生長抑制作用，其機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期于G0／G1期、下調(diào)Ki-67抗原及Survivin蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、下調(diào)hTERT mRNA表達(dá)而抑制端粒酶活性、進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖有關(guān)。為丁酸鈉的臨床研究提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。
高曉東[7]（2007）在《端粒酶hTERT基因反義核酸對TNF-α誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞（T24）凋亡的影響》文中研究說明目的端粒是真核細(xì)胞染色體末端特殊的DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，人類端粒含有TAGGG重復(fù)序列，具有重要的生物學(xué)功能。端?？煞€(wěn)定染色體，防止染色體末端融合，保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)基因。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，85％-90％以上的腫瘤細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性。因而抑制端粒酶活性具有潛在的腫瘤防治的前景。人類端粒酶主要由三部分組成：人類端粒酶RNA成分（hTR），人類端粒酶相關(guān)蛋白（TEP1），人類端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位（hTERT）。hTR的功能是為染色體端粒延伸起模板作用，人類端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶催化亞單位hTERT是端粒酶活性表達(dá)的關(guān)鍵組分和限速因子。hTERT基因mRNA在膀胱癌細(xì)胞中同時(shí)表現(xiàn)出高水平的表達(dá)，與端粒酶活性的表達(dá)一致。端粒酶RNA的反義核酸可以抑制端粒酶活性和腫瘤細(xì)胞的生長。本實(shí)驗(yàn)探討hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸（AS PS-ODN）對膀胱癌細(xì)胞T24端粒酶活性抑制作用及hTERT基因的反義寡核苷酸對細(xì)胞因子TNF-α誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的影響。方法采用TRAP-銀染法及TRAP-PCR-ELISA法檢測膀胱癌細(xì)胞的端粒酶活性；采用RT-PCR方法檢測hTERT基因mRNA的表達(dá)水平；以間接免疫熒光標(biāo)記法通過流式細(xì)胞儀檢測hTERT基因蛋白水平的變化；采用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)觀察hTERT AS PS-ODN與TNF-α共同作用對膀胱癌細(xì)胞T24生長活力的影響；倒置顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；通過流式細(xì)胞儀測定凋亡細(xì)胞的百分率。結(jié)果hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸（AS PS-ODN）作用于膀胱癌細(xì)胞T24 48h，其端粒酶活性下降，作用72h，其端粒酶活性受到抑制，與正義寡核苷酸組，空白對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）；hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸（AS PS-ODN）作用于膀胱癌細(xì)胞T24后，hTERT基因mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平均明顯下降，與正義寡核苷酸組，空白對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）；hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌細(xì)胞T24后加入TNF-α作用48小時(shí)，膀胱癌細(xì)胞T24的抑制率與對照組，S PS-ODN組，AS PS-ODN組，TNF-α組及S PS-ODN+TNF-α組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌細(xì)胞T24后加入TNF-α作用48小時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)變化：hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌細(xì)胞T24后加入TNF-α作48小時(shí)，凋亡細(xì)胞的百分率分別同對照組，S PS-ODN組，AS PS-ODN組，TNF-α組及S PS-ODN+TNF-α組相比有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論通過hTERT基因的全硫代修飾反義寡核苷酸（ASPS-ODN）能特異性抑制hTERT基因的表達(dá)降低膀胱癌細(xì)胞T24端粒酶活性：hTERT基因反義核酸對TNF-α誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞T24凋亡有增敏作用。
曹波[8]（2006）在《嘉陵江重慶主城區(qū)水源水中有機(jī)污染物雄性生殖毒性的研究》文中研究表明水體有機(jī)物污染嚴(yán)重威脅人們飲用水安全和環(huán)境保護(hù),地面水被各種各樣的有機(jī)物污染,如多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯和農(nóng)藥等。我國經(jīng)濟(jì)快速增長工業(yè)化發(fā)展以及城市化的進(jìn)程加劇了我國江河湖泊的水污染,目前水環(huán)境污染狀況是主要河流有機(jī)物污染嚴(yán)重,流經(jīng)城市河段普遍受到污染。我國規(guī)定的優(yōu)先控制污染物68種中有59種是有機(jī)污染物,從對人體健康的危害和生態(tài)平衡的破壞性來看,有毒有機(jī)污染物在環(huán)境中往往具有長效性,不易降解,可通過生物鏈蓄集,且對環(huán)境的破壞和人體健康的危害多具不可逆性,對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。我國松花江、珠江、黃浦江和太湖等主要河流與湖泊均檢測到了多種有機(jī)污染物,其中包括了多種優(yōu)先控制污染物;嘉陵江位于三峽水庫的上游,是重慶居民主要飲用水水源,同時(shí)也是重慶大量工業(yè)和生活污水的最后排放口,三峽成庫后由于流速減慢,水體自凈能力降低,水體有機(jī)物污染可能會(huì)加重。已有大量研究指出環(huán)境污染是引起人類男性生殖能力下降的重要原因,有機(jī)污染物是可能的因素,例如增塑劑污染、農(nóng)藥的使用等。其中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)是典型的睪丸毒劑,可引起睪丸萎縮,精子數(shù)目與活力下降,造成動(dòng)物的不育。外來化學(xué)物的睪丸毒性往往表現(xiàn)為對生精過程的破壞,生精過程受許多因素影響,細(xì)胞凋亡是外來化學(xué)物質(zhì)睪丸損傷的主要分子機(jī)理,有研究認(rèn)為生精細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能是由于生精細(xì)胞促分化因子受到抑制,或者促生精細(xì)胞凋亡因子受到激發(fā)引起的,兩種因子在正常生理過程中保持均衡,維持著正常生精過程的平衡。其中fas與其受體結(jié)合啟動(dòng)生精細(xì)胞凋亡,而干細(xì)胞生長因子（stem cell factor, scf）促進(jìn)生精細(xì)胞分化發(fā)育成為成熟精子,同時(shí)具有抑制生精細(xì)胞凋亡的作用。有人認(rèn)為生精細(xì)胞與精子細(xì)胞凋亡是外來化學(xué)物睪丸損傷的最終反應(yīng),外來化合物有可能通過影響scf/c-kit系統(tǒng)與fas/fasL系統(tǒng)平衡而造成生精過程損傷。大量實(shí)驗(yàn)室證據(jù)表明在較高劑量條件下有機(jī)污染物可對雄性睪丸造成損害,但實(shí)際暴露過程中機(jī)體是與多種化學(xué)物接觸。目前對于環(huán)境中化學(xué)物混合作用的具體機(jī)制缺乏深入的研究,混合物作用機(jī)制,一般認(rèn)為有相乘作用,拮抗作用與相加作用。研究混合物作用的模式主要有兩類,一類是人為采用不同的化合物組合,觀察混合物對機(jī)體的效應(yīng),根據(jù)效應(yīng)的強(qiáng)度判斷是否有聯(lián)合作用;另一種是直接觀察自然界有機(jī)提取物,多以水中有機(jī)提取物作為受試物,觀察其對機(jī)體的效應(yīng)。我室前期研究發(fā)現(xiàn)嘉陵江水中可檢出鄰苯二甲酸酯類和多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物,并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)水中有機(jī)提取物具有類雌激素類活性。本研究中我們采用XAD-2樹脂提取嘉陵江重慶市段某自來水廠取水點(diǎn)水樣,提取水中有機(jī)污染物,對有機(jī)污染物進(jìn)行GC/MS分析,采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織動(dòng)物發(fā)育/生殖篩選實(shí)驗(yàn)程序421,評價(jià)水中有機(jī)污染物對實(shí)驗(yàn)大鼠的雄性生殖毒性,確定生殖毒作用的靶器官,并對毒作用的分子機(jī)制進(jìn)行研究。本研究分為以下三個(gè)部分:一、采用固相萃取技術(shù)提取水中有機(jī)污染物,并進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析,初步確定水源水中有機(jī)污染物種類。二、采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織生殖/發(fā)育毒性篩選試驗(yàn),用水源水中有機(jī)提取物染毒實(shí)驗(yàn)大鼠,進(jìn)行生殖毒性評價(jià),確定生殖毒性的靶器官。三、根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定生殖靶器官或靶作用位點(diǎn),重點(diǎn)對其誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果與結(jié)論一、于2004年7月（豐水期）采集嘉陵江重慶市主城區(qū)段水樣,應(yīng)用GCMS分析技術(shù),共定性出有機(jī)污染物8種。有2種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì),6種多環(huán)芳烴類物質(zhì)。在已檢出的有機(jī)污染物中,有2種屬于我國水環(huán)境優(yōu)先控制污染物,分別是鄰苯二甲酸二正辛酯、熒葸,說明嘉陵江重慶市主城區(qū)段水源水中存在有機(jī)物污染,本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本室之前的結(jié)果相近。二、本研究中動(dòng)物染毒劑量分別為2L/kg.bw/day,16L/kg.bw/day,80L/kg.bw/day,玉米油作為溶劑對照。實(shí)驗(yàn)期間染毒動(dòng)物體重?zé)o明顯改變,孕鼠在懷孕第三周食物消耗量明顯下降,高劑量組明顯低于對照組。睪丸、卵巢臟器系數(shù)比值各劑量組與對照組相比無明顯改變,高劑量組附睪臟器系數(shù)比值明顯高于對照組。低劑量組可觀察到睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生,中高劑量組可觀察到間質(zhì)細(xì)胞減少。各個(gè)劑量組均可觀察到生精上皮空泡變性,初級(jí)精母細(xì)胞減少。附睪尾精子計(jì)數(shù)與附睪重量比值,隨染毒劑量增加而下降,其中高劑量組明顯低于對照組,高劑量組精子頭部畸形率明顯高于對照組。低劑量組雄性大鼠血清睪酮含量明顯高于高劑量組,提示水中有機(jī)提取物對染毒動(dòng)物睪酮分泌有影響。中高劑量組雄性大鼠血清卵泡刺激素含量明顯低于對照組。染毒動(dòng)物交配率,受孕率各染毒組間無明顯差異,仔鼠個(gè)數(shù)體重各染毒組間均無明顯差異,高劑量組活產(chǎn)指數(shù)明顯低于對照組,染毒組觀察到孕鼠分娩時(shí)有死胎出現(xiàn)以及部分仔鼠出生后被母鼠咬死,提示水中有機(jī)提取物對仔鼠的發(fā)育以及孕鼠的神經(jīng)行為有一定影響。上述資料提示本項(xiàng)目條件下水中有機(jī)提取物對人群的生殖健康有潛在的危害,水中有機(jī)污染物引起的生殖損傷應(yīng)引起高度重視。三、已有研究證實(shí)環(huán)境污染物可以誘導(dǎo)睪丸生精細(xì)胞凋亡增加。我們的研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)大鼠精原細(xì)胞有凋亡發(fā)生,但染毒組與對照組相比無明顯差異（P>0.05）,同時(shí)觀察到精子細(xì)胞凋亡發(fā)生,高劑量組明顯高于對照組（P<0.05）。Fas及Fas配體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡是環(huán)境污染物睪丸毒性的重要發(fā)生機(jī)制,我們發(fā)現(xiàn)水中有機(jī)污染物可引起高劑量組精原細(xì)胞與減數(shù)分裂前生精細(xì)胞Fas與FasL蛋白明顯增加,但是精原細(xì)胞與生精細(xì)胞凋亡并未增加,說明在本研究條件下,Fas與FasL表達(dá)增加并不引起細(xì)胞凋亡增加。我們未觀察到精子細(xì)胞有Fas與FasL蛋白表達(dá),精子細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能有其它的原因,有待進(jìn)一步研究。c-kit蛋白是生精過程中生精細(xì)胞發(fā)育分化的重要指標(biāo),主要在精原細(xì)胞上表達(dá)。我們的結(jié)果顯示,高劑量組c-kit表達(dá)陽性細(xì)胞增加,提示精原細(xì)胞明顯增加,生精過程受到阻滯。綜上所述,嘉陵江重慶主城區(qū)段水中有機(jī)提取物具有睪丸毒性,對仔鼠發(fā)育可能有不利影響,睪丸生精細(xì)胞是可能的靶作用位點(diǎn)。水中有機(jī)物的睪丸毒性分子機(jī)制需要進(jìn)一步采用體外實(shí)驗(yàn)深入研究,也需要獲得人群流行病學(xué)資料闡明人群生殖損傷與水中有機(jī)污染物之間的關(guān)系。為了早期發(fā)現(xiàn)和診斷人群生殖損傷,還應(yīng)尋找敏感的生物標(biāo)志物。
王白燕[9]（2006）在《納米載體介導(dǎo)的hTERT反義寡核苷酸對EC9706細(xì)胞的抑制作用研究》文中研究表明食管癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，治療效果尚不理想，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，找到一種新的治療食管癌的方法成為可能。 端粒（telomere）是位于真核細(xì)胞線性染色體末端，由高度保守的簡單重復(fù)的DNA序列和蛋白質(zhì)組成的特殊結(jié)構(gòu)，對于保護(hù)染色體、防止染色體融合、降解是非常重要的。端粒酶（telomerase）是一種核蛋白，由3種亞單位成分：即人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒酶相關(guān)蛋白Ⅰ（telomerase associated protein，TPI）組成，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)端粒酶是細(xì)胞永生化和腫瘤發(fā)生必不可少的，是人體內(nèi)最具腫瘤特異性和高表達(dá)的生物學(xué)標(biāo)志。其中hTERT是端粒酶活性的表達(dá)亞基，它幾乎存在于所有的惡性腫瘤中，hTERT的表達(dá)與端粒酶活性相一致，是端粒酶活性的決定性因素。因此，hTERT成為靶向端粒酶抗癌策略的理想靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，91％的食管癌組織中可檢測到端粒酶活性及其逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)。 反義核酸技術(shù)是一門全新的基因工程技術(shù)，近年來發(fā)展迅速。利用反義核酸技術(shù)，人工合成靶向hTERT的反義寡核苷酸（Antisense oligodeoxynucleotides，ASODN），抑制hTERT mRNA表達(dá)和端粒酶活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是目前進(jìn)行腫瘤基因治療的方向之一。未經(jīng)修飾的寡核苷酸（Oligonucleotides，ODNs）易被胞內(nèi)核酸酶降解，作用效果較差。研究者們利用各種不同的病毒或非病毒基因
楊俊玲[10]（2006）在《原癌基因c-src在精原干細(xì)胞中表達(dá)及作用的研究》文中研究說明目的：探索及完善精原干細(xì)胞的分離、鑒定和體外培養(yǎng)技術(shù)；研究原癌基因c-src對體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞存活及與凋亡密切相關(guān)的caspase-3表達(dá)的影響。 方法：非連續(xù)密度梯度離心及差速貼壁法分離精原干細(xì)胞；c-Kit和TERT細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定精原干細(xì)胞；用MTT比色法檢測精原干細(xì)胞的存活及增殖情況，觀察AS-src對精原干細(xì)胞存活的劑量性影響及AS-src對精原干細(xì)胞存活的時(shí)間性影響；用RT-PCR檢測c-src mRNA和caspase-3 mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：非連續(xù)密度梯度及差速貼壁法分離精原干細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率分別為92.5％和92.1％；分離后所獲取的細(xì)胞c-Kit和TERT免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞數(shù)平均值分別為90.8±1.0％和91.7±1.2％；精原干細(xì)胞在含10％NBS的DMEM中培養(yǎng)96h時(shí)增殖達(dá)高峰；10μmol／l AS-src作用12h后精原干細(xì)胞存活率下降（P＜0.05），于24h，48h，72h持續(xù)下降（P＜0.01）；與S-src和空白對照組相比，AS-src組c-src mRNA水平明顯下調(diào)，而caspase-3 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。 結(jié)論：非連續(xù)密度梯度結(jié)合差速貼壁法是分離精原干細(xì)胞的有效方法；以c-Kit及TERT作為marker分子通過免疫組織化學(xué)檢測為精原干細(xì)胞的鑒定提供較為充分的依據(jù)；精原干細(xì)胞可以在含10％NBS的DMEM培養(yǎng)基中短期增殖；c-Src可以促進(jìn)精原干細(xì)胞的存活；c-Src可能通過PI-3K／PKB途徑，導(dǎo)致Caspase-3磷酸化從而抑制精原干細(xì)胞的凋亡。
二、反義核酸對體外培養(yǎng)A型精原細(xì)胞端粒酶活性的影響（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對研究對象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、反義核酸對體外培養(yǎng)A型精原細(xì)胞端粒酶活性的影響（論文提綱范文）
（1）維甲酸對雞胚生殖細(xì)胞增殖和減數(shù)分裂調(diào)控的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一節(jié) 禽類原始生殖細(xì)胞的研究進(jìn)展 |
| 1.1 干細(xì)胞的起源 |
| 1.2 干細(xì)胞的生物學(xué)特性 |
| 1.3 禽類PGC的特性 |
| 1.4 PGC的起源 |
| 1.5 禽類PGC的遷移 |
| 1.6 原始生殖細(xì)胞的應(yīng)用 |
| 1.6.1 PGC作為研究胚胎發(fā)育的體外模型 |
| 1.6.2 PGC在種質(zhì)資源保護(hù)中的應(yīng)用 |
| 1.6.3 轉(zhuǎn)基因家禽的制備 |
| 1.6.4 藥物生產(chǎn) |
| 1.7 小結(jié) |
| 第二節(jié) 細(xì)胞外基質(zhì)對PGC遷移的影響及調(diào)控 |
| 2.1 粘附蛋白的結(jié)構(gòu)和影響因素 |
| 2.2 E-鈣粘蛋白的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié) |
| 2.2.1 E-鈣粘蛋白生物學(xué)特性 |
| 2.2.2 E-鈣粘蛋白/連鎖蛋白復(fù)合體的生物學(xué)特性 |
| 2.2.3 E-鈣粘蛋白的調(diào)控 |
| 2.3 粘附分子在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用 |
| 2.4 粘附分子在生殖細(xì)胞發(fā)育中的作用 |
| 2.5 ECM在PGC遷移中的作用 |
| 第三節(jié) 禽類原始生殖細(xì)胞增殖的調(diào)控 |
| 3.1 PGC的增殖 |
| 3.2 生長因子對PGC增殖的調(diào)控 |
| 3.2.1 白血病抑制因子 |
| 3.2.2 干細(xì)胞生長因子 |
| 3.2.3 堿性成纖維生長因子 |
| 3.2.4 腫瘤壞死因子TNF-α和cAMP |
| 3.2.5 維甲酸(RA) |
| 3.2.6 其它細(xì)胞因子 |
| 3.2.7 負(fù)調(diào)控因子 |
| 3.3 細(xì)胞信號(hào)通路對PGC增殖的調(diào)控 |
| 3.3.1 LIF信號(hào)通路 |
| 3.3.2 BMP信號(hào)通路 |
| 3.3.3 Wnt途徑 |
| 3.3.4 Oct4 |
| 3.3.5 Nanog |
| 3.3.6 Sox2 |
| 3.3.7 NF-κB信號(hào) |
| 3.4 細(xì)胞周期相關(guān)基因控制PGC的增殖 |
| 第四節(jié) 禽類原始生殖細(xì)胞分化的調(diào)控 |
| 4.1 禽類性腺發(fā)育 |
| 4.1.1 胚胎性腺的基本過程 |
| 4.1.2 PGC與性腺發(fā)生和發(fā)育的關(guān)系 |
| 4.2 禽類性腺發(fā)育的調(diào)控及其機(jī)理 |
| 4.2.1 減數(shù)分裂 |
| 4.2.2 維甲酸在PGC分化中的調(diào)控 |
| 4.2.3 Nanos2和PGC分化 |
| 4.2.4 FGF9在PGC分化中的調(diào)控 |
| 4.3 卵母細(xì)胞發(fā)生的分子調(diào)控 |
| 4.3.1 卵母細(xì)胞的發(fā)生 |
| 4.3.2 禽類卵巢的發(fā)育 |
| 第五節(jié) 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究生殖細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)理 |
| 5.1 轉(zhuǎn)基因雞的研究現(xiàn)狀 |
| 5.2 RNA干擾的研究進(jìn)展 |
| 5.2.1 小RNAs的分類 |
| 5.2.2 RNAi作用機(jī)制 |
| 5.2.3 RNAi作用的特點(diǎn) |
| 5.2.4 siRNA與shRNA的比較 |
| 5.2.5 RNA干擾的應(yīng)用 |
| 5.3 轉(zhuǎn)基因雞的制備方法 |
| 5.3.1 慢病毒感染法 |
| 5.3.2 原始生殖細(xì)胞介導(dǎo)法 |
| 5.3.3 精子載體法 |
| 5.3.4 顯微注射法 |
| 5.4 RNAi轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究 |
| 5.4.1 RNAi轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究現(xiàn)狀 |
| 5.4.2 RNAi制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的優(yōu)勢 |
| 5.4.3 RNAi轉(zhuǎn)基因動(dòng)物存在的問題與應(yīng)用前景 |
| 第六節(jié) 本研究的目的和內(nèi)容 |
| 6.1 本研究的目的和意義 |
| 6.2 研究目標(biāo)及內(nèi)容 |
| 第二章 維甲酸對雞胚原始生殖細(xì)胞粘附調(diào)控機(jī)理的研究 |
| 第一節(jié) 雞胚原始生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立及優(yōu)化 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料與方法 |
| 1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要試劑及配制 |
| 1.2.4 飼養(yǎng)層的制備 |
| 1.2.5 生殖嵴和性腺PGC的分離、純化和培養(yǎng) |
| 1.2.6 血液中PGC的分離、純化和培養(yǎng) |
| 1.2.7 雞胚PGC的染色鑒定 |
| 1.2.8 RT-PCR檢測PGC特異基因的表達(dá) |
| 1.2.9 性腺切片免疫組織化學(xué)染色 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.3.1 生殖嵴、性腺PGC體外分離培養(yǎng)及鑒定 |
| 1.3.2 血液PGC體外分離培養(yǎng)及鑒定 |
| 1.4 討論 |
| 1.4.1 PGC的分離及培養(yǎng) |
| 1.4.2 雞胚PGC的培養(yǎng)條件 |
| 1.4.3 雞胚PGC的鑒定 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第二節(jié) 維甲酸對雞胚原始生殖細(xì)胞粘附的影響及其機(jī)理的研究 |
| 摘要 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 主要試劑及配制 |
| 2.2.4 PGC培養(yǎng)及藥物處理 |
| 2.2.5 PGC集落粘附性的檢測 |
| 2.2.6 SSEA-1和β-catenin雙標(biāo)免疫熒光染色 |
| 2.2.7 細(xì)胞周期流式分析 |
| 2.2.8 RNA提取和常規(guī)RT-PCR |
| 2.2.9 Real-Time RT-PCR |
| 2.2.10 蛋白質(zhì)的提取和Western Blot分析 |
| 2.2.11 數(shù)據(jù)分析 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.3.1 RARs和RA合成酶在PGC及性腺中的表達(dá)情況 |
| 2.3.2 RA對PGC粘附性的作用 |
| 2.3.3 PKC在RA對增強(qiáng)PGC問粘附性中的介導(dǎo)作用 |
| 2.3.4 β-catenin在RA增強(qiáng)PGC粘附性中的介導(dǎo)作用 |
| 2.3.5 RA在體外對PGC增殖的影響 |
| 2.3.6 PKC在RA對PGC促增殖中的作用 |
| 2.3.7 RA對細(xì)胞周期蛋白mRNA表達(dá)水平的影響 |
| 2.3.8 RA在體外對PGC細(xì)胞周期的影響 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 第三章 維甲酸對雞胚原始生殖細(xì)胞增殖調(diào)控的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料與方法 |
| 1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要試劑及配制 |
| 1.2.4 PGC培養(yǎng)及藥物處理 |
| 1.2.5 BrdU摻入鑒定PGC的增殖 |
| 1.2.6 細(xì)胞周期流式分析 |
| 1.2.7 RNA提取和常規(guī)RT-PCR |
| 1.2.8 Real-Time RT-PCR |
| 1.2.9 蛋白質(zhì)的提取和Western Blot分析 |
| 1.2.10 數(shù)據(jù)分析 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.3.1 RA在體外對PGC增殖的影響 |
| 1.3.2 PI3K/Akt在RA對PGC促增殖中的介導(dǎo)作用 |
| 1.3.3 NF-κB在RA對PGC促增殖中的介導(dǎo)作用 |
| 1.3.4 RA及抑制劑對細(xì)胞周期蛋白mRNA表達(dá)水平的影響 |
| 1.3.5 RA及抑制劑對PGC細(xì)胞周期的影響 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第四章 維甲酸對雞胚生殖細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控機(jī)理的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料與方法 |
| 1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要試劑及配制 |
| 1.2.4 樣品采集 |
| 1.2.5 雞胚性腺組織培養(yǎng)和處理 |
| 1.2.6 雞胚卵巢生殖細(xì)胞的分離培養(yǎng)和處理 |
| 1.2.7 Raldh2 siRNA轉(zhuǎn)染 |
| 1.2.8 雞胚性腺組織的冰凍切片 |
| 1.2.9 雞胚性腺組織石蠟切片制作 |
| 1.2.10 胚胎期卵巢形態(tài)學(xué)觀察 |
| 1.2.11 性腺冰凍切片免疫熒光染色 |
| 1.2.12 RNA提取和Real-Time RT-PCR |
| 1.2.13 數(shù)據(jù)分析 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.3.1 胚胎期雞胚卵巢發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征 |
| 1.3.2 胚胎期雞卵巢減數(shù)分裂階段的變化 |
| 1.3.3 減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)的在不同時(shí)期雞胚性腺中的表達(dá)情況 |
| 1.3.4 RA合成和降解酶在不同時(shí)期雞胚性腺中的表達(dá)情況 |
| 1.3.5 AO染色觀察體外培養(yǎng)卵巢的內(nèi)部結(jié)構(gòu) |
| 1.3.6 RA在體外對減數(shù)分裂的影響 |
| 1.3.7 Raldh2 shRNA干擾 |
| 1.3.8 Raldh2基因敲減對減數(shù)分裂的影響 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第五章 利用shRNA慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞模型 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料與方法 |
| 1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要試劑及配制 |
| 1.2.4 玻璃針的制備 |
| 1.2.5 siRNA的設(shè)計(jì) |
| 1.2.6 病毒滴度的復(fù)核(有限稀釋法測定) |
| 1.2.7 靶細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn) |
| 1.2.8 293FT細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 1.2.9 病毒的生產(chǎn) |
| 1.2.10 病毒滴度分析 |
| 1.2.11 雞胚病毒注射 |
| 1.2.12 PCR檢測目的基因的表達(dá) |
| 1.2.13 數(shù)據(jù)分析 |
| 1.3 結(jié)果 |
| 1.3.1 慢病毒滴度測定結(jié)果 |
| 1.3.2 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間綠色熒光蛋白的表達(dá)分析 |
| 1.3.3 shRNA高效抑制Raldh2復(fù)制靶位點(diǎn)的篩選 |
| 1.3.4 轉(zhuǎn)基因個(gè)體的PCR分析 |
| 1.3.5 轉(zhuǎn)基因雞胚15.5天卵巢形態(tài) |
| 1.4 討論 |
| 1.5 小結(jié) |
| 第六章 結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn) |
| 1.1 結(jié)論 |
| 1.2 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 博士期間發(fā)表文章 |
（2）端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文縮寫 |
| 引言 |
| 第一部分 端粒DNA 長度及端粒酶hTERT 在食管癌高發(fā)區(qū)人群中的表達(dá)及生物學(xué)意義 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 附圖 |
| 附表 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第二部分 食管癌中的端粒酶活性和PinX1 的表達(dá)及其生物學(xué)意義 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 附圖 |
| 附表 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第三部分 基因轉(zhuǎn)染PinX1 對食管癌Eca109 細(xì)胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 附圖 |
| 附表 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 結(jié)論 |
| 綜述 端粒、端粒酶和PinX1 與腫瘤的關(guān)系 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡歷 |
（3）c-jun對仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌影響的機(jī)理研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1.1 原癌基因的研究概況 |
| 1.1.1 原癌基因(proto-onco gene) |
| 1.1.2 即刻早期基因(immediate-early gene,IEG) |
| 1.1.3 編碼核內(nèi)蛋白的原癌基因 |
| 1.1.4 轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors)與細(xì)胞基因調(diào)控 |
| 1.1.5 堿性亮氨酸拉鏈bZIP(basic leucine zipper)家族中的轉(zhuǎn)錄因子AP-1(activated protein 1)家族 |
| 1.2 原癌基因c-jun的生物學(xué)特性 |
| 1.2.1 原癌基因c-jun的結(jié)構(gòu)與功能 |
| 1.2.2 c-jun表達(dá)的活性調(diào)控 |
| 1.2.3 c-Jun蛋白的磷酸化 |
| 1.2.4 Jun-Fos異源二聚體的形成 |
| 1.2.5 Jun/Fos與轉(zhuǎn)錄因子AP-1 |
| 1.2.6 c-jun家族在細(xì)胞致癌中的作用 |
| 1.3 原癌基因c-jun與細(xì)胞之間的關(guān)系 |
| 1.3.1 原癌基因c-jun與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化 |
| 1.3.2 原癌基因c-jun與細(xì)胞分化 |
| 1.3.3 原癌基因c-jun與細(xì)胞凋亡 |
| 1.4 原癌基因c-jun在不同組織器官中的表達(dá)及與疾病的關(guān)系 |
| 1.4.1 原癌基因c-jun與中樞神經(jīng)系統(tǒng) |
| 1.4.2 原癌基因c-jun與心血管系統(tǒng) |
| 1.4.3 原癌基因c-jun與炎癥性疾病 |
| 1.4.4 原癌基因c-jun與腫瘤和癌癥 |
| 1.5 原癌基因c-jun與生殖的關(guān)系 |
| 1.5.1 c-jun對雄性生殖的影響 |
| 1.5.2 c-jun對雌性生殖的影響 |
| 1.6 一些外部因素影響后的原癌基因c-jun變化 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的背景和意義 |
| 2.2 主要研究內(nèi)容 |
| 2.2.1 c-jun在榮昌仔豬睪丸組織中的表達(dá)及與睪酮分泌的關(guān)系 |
| 2.2.2 c-jun對離體培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響 |
| 2.2.3 c-jun調(diào)節(jié)hCG誘導(dǎo)榮昌仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的作用機(jī)制 |
| 2.3 研究的技術(shù)路線 |
| 第三章 c-jun在仔豬睪丸組織中的表達(dá)及與睪酮分泌的關(guān)系 |
| 3.1 材料與方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 3.2 結(jié)果 |
| 3.2.1 不同日齡榮昌仔豬睪丸組織結(jié)構(gòu)的變化 |
| 3.2.2 總RNA的純度和完整性鑒定 |
| 3.2.3 擴(kuò)增曲線與溶解曲線 |
| 3.2.4 比較目的基因和參照基因的擴(kuò)增效率 |
| 3.2.5 仔豬睪丸組織中c-jun mRNA的表達(dá)分析 |
| 3.2.6 不同時(shí)期榮昌仔豬血漿睪酮水平 |
| 3.3 討論 |
| 第四章 c-jun對體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要試劑 |
| 4.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 4.1.3 儀器設(shè)備 |
| 4.1.4 試驗(yàn)方法 |
| 4.1.5 檢測方法 |
| 4.1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 4.2 結(jié)果 |
| 4.2.1 體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能 |
| 4.2.2 不同濃度c-jun ASODNs對仔豬間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響 |
| 4.2.3 不同濃度c-jun ASODNs對仔豬間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 |
| 4.2.4 不同濃度c-jun ASODNs對基礎(chǔ)狀態(tài)下仔豬間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響 |
| 4.3 討論 |
| 4.3.1 體外培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性 |
| 4.3.2 鑒定間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志—3β-HSD |
| 4.3.3 c-jun對仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響 |
| 4.3.4 c-jun對仔豬睪丸問質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 |
| 4.3.5 c-jun對仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響 |
| 第五章 c-jun調(diào)節(jié)hCG誘導(dǎo)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的作用機(jī)制 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 主要試劑 |
| 5.1.2 主要儀器 |
| 5.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 5.1.4 試驗(yàn)方法 |
| 5.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 |
| 5.2 結(jié)果 |
| 5.2.1 不同濃度c-jun ASODNs對hCG誘導(dǎo)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌的影響 |
| 5.2.2 cAMP對c-jun調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的影響 |
| 5.2.3 維拉帕米對c-jun調(diào)節(jié)hCG誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的影響 |
| 5.3 討論與結(jié)論 |
| 第六章 綜合與小結(jié) |
| 論文的創(chuàng)新點(diǎn) |
| 主要參考文獻(xiàn) |
| 縮略詞表 |
| 博士在校期間發(fā)表的論文及參加的課題情況 |
| 致謝 |
（4）病毒載體介導(dǎo)的微型核酶對犬賈第蟲端粒酶活性的影響（論文提綱范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文獻(xiàn)綜述 |
| 第一章 賈第蟲病毒及載體研究進(jìn)展 |
| 1 賈第蟲病毒的研究進(jìn)展 |
| 2 賈第蟲病毒載體的研究進(jìn)展 |
| 第二章 端粒、端粒酶的研究進(jìn)展及與寄生蟲的關(guān)系 |
| 1 端粒的結(jié)構(gòu)與功能 |
| 2 端粒酶的研究進(jìn)展 |
| 3 寄生蟲端粒酶的研究進(jìn)展 |
| 第二篇 研究內(nèi)容 |
| 第一章 犬賈第蟲病毒通用型轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第二章 犬賈第蟲端粒重復(fù)序列的鑒定 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第三章 犬賈第蟲端粒酶活性的檢測 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第四章 犬賈第蟲病毒轉(zhuǎn)染載體介導(dǎo)的微型核酶對 GcTERT 基因體外轉(zhuǎn)錄體切割效果的研究 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 第五章 犬賈第蟲病毒轉(zhuǎn)染載體介導(dǎo)的微型核酶對端粒酶活性抑制效果的研究 |
| 1 材料與方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 4 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻博期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他成果 |
| 附錄 藍(lán)氏賈第蟲和犬賈第蟲端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(TERT)序列比較 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致謝 |
| 導(dǎo)師及作者簡介 |
（5）c-raf在精原干細(xì)胞中的表達(dá)及作用的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 動(dòng)物 |
| 2.1.2 試劑及其配制方法 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SSCs 的分離、純化、鑒定及體外培養(yǎng) |
| 2.2.2 c-raf 擴(kuò)增DNA 序列測定與分析 |
| 2.2.3 c-raf AON 對SSCs 存活、增殖的檢測 |
| 2.2.4 c-raf 及caspase-3 的mRNA 表達(dá)的測定 |
| 2.2.5 SSCs 凋亡的檢測 |
| 2.3 統(tǒng)計(jì)處理 |
| 第三章 結(jié)果 |
| 3.1 SSCs 的分離、純化 |
| 3.2 SSCs 的鑒定及純度 |
| 3.3 SSCs 的體外培養(yǎng) |
| 3.4 SSCs 擴(kuò)增DNA 與c-raf 的同源性 |
| 3.5 c-raf 對SSCs 存活及增殖的作用 |
| 3.6 c-raf mRNA、caspase-3mRNA 的表達(dá) |
| 3.7 c-raf 在SSCs 凋亡中的作用 |
| 第四章 討論 |
| 4.1 SSCs 的分離、純化、鑒定及體外培養(yǎng) |
| 4.2 c-raf 基因在SSCs 上的表達(dá) |
| 4.3 c-raf 對SSCs 存活的影響 |
| 4.4 c-raf 與SSCs 凋亡的關(guān)系 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附圖 |
| 攻讀學(xué)位期間的研究成果 |
| 綜述 |
（6）丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及端粒酶活性影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 論文部分 丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及端粒酶活性影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究 |
| 前言 |
| 第一部分 丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及凋亡的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 第一部分照片 |
| 第二部分 丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞端粒酶活性及端粒酶三組分mRNA表達(dá)的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 第二部分照片 |
| 第三部分 丁酸鈉對人喉癌裸鼠移植瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 第三部分照片 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述部分 組蛋白乙?；?去乙酰化與腫瘤的關(guān)系及組蛋白去乙?；敢种苿┑难芯窟M(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 英文縮寫詞索引 |
| 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文 |
| 致謝 |
（7）端粒酶hTERT基因反義核酸對TNF-α誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞（T24）凋亡的影響（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 一. 前言 |
| 二. 研究對象，材料和方法 |
| 三. 結(jié)果 |
| 四. 討論 |
| 五. 結(jié)論 |
| 六. 參考文獻(xiàn) |
| 七. 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
| 八. 致謝 |
| 九. 附錄 |
（8）嘉陵江重慶主城區(qū)水源水中有機(jī)污染物雄性生殖毒性的研究（論文提綱范文）
| 中英文縮寫詞表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 論文正文 嘉陵江重慶主城區(qū)水源水中有機(jī)污染物雄性生殖毒性研究 |
| 前言 |
| 第一部分：嘉陵江重慶主城區(qū)水源水中有機(jī)提取物定性研究 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 第二部分：嘉陵江重慶主城區(qū)水源水中有機(jī)提取物雄性生殖毒性評價(jià) |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 第三部分：嘉陵江重慶主城區(qū)水源水中有機(jī)提取物睪丸毒性分子機(jī)制初步研究. |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 小結(jié) |
| 全文總結(jié) |
| 致謝 |
| 照片 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 環(huán)境因素生殖損傷中的生精細(xì)胞凋亡 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 博士生階段已發(fā)表論文及會(huì)議交流論文 |
（9）納米載體介導(dǎo)的hTERT反義寡核苷酸對EC9706細(xì)胞的抑制作用研究（論文提綱范文）
| 論文部分 |
| 題目：納米載體介導(dǎo)的hTERT反義寡核苷酸對EC9706細(xì)胞的抑制作用研究 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結(jié)果 |
| 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 綜述部分 |
| 新型納米載體、端粒酶與腫瘤在治療方面的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 英文縮寫 |
| 致謝 |
（10）原癌基因c-src在精原干細(xì)胞中表達(dá)及作用的研究（論文提綱范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、前言 |
| 四、材料方法 |
| 五、結(jié)果 |
| 六、討論 |
| 七、結(jié)論 |
| 八、參考文獻(xiàn) |
| 九、致謝 |
| 十、附圖 |
| 十一、綜述 |
四、反義核酸對體外培養(yǎng)A型精原細(xì)胞端粒酶活性的影響（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]維甲酸對雞胚生殖細(xì)胞增殖和減數(shù)分裂調(diào)控的研究[D]. 于敏莉. 浙江大學(xué), 2012(08)
- [2]端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義[D]. 王大虎. 河北醫(yī)科大學(xué), 2011(10)
- [3]c-jun對仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌影響的機(jī)理研究[D]. 鄭小波. 西南大學(xué), 2010(05)
- [4]病毒載體介導(dǎo)的微型核酶對犬賈第蟲端粒酶活性的影響[D]. 劉成武. 吉林大學(xué), 2008(11)
- [5]c-raf在精原干細(xì)胞中的表達(dá)及作用的研究[D]. 閆登科. 南昌大學(xué), 2007(03)
- [6]丁酸鈉對人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡及端粒酶活性影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[D]. 高嶺. 鄭州大學(xué), 2007(06)
- [7]端粒酶hTERT基因反義核酸對TNF-α誘導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞（T24）凋亡的影響[D]. 高曉東. 蘭州大學(xué), 2007(04)
- [8]嘉陵江重慶主城區(qū)水源水中有機(jī)污染物雄性生殖毒性的研究[D]. 曹波. 第三軍醫(yī)大學(xué), 2006(03)
- [9]納米載體介導(dǎo)的hTERT反義寡核苷酸對EC9706細(xì)胞的抑制作用研究[D]. 王白燕. 鄭州大學(xué), 2006(12)
- [10]原癌基因c-src在精原干細(xì)胞中表達(dá)及作用的研究[D]. 楊俊玲. 南昌大學(xué), 2006(02)
標(biāo)簽：端粒酶論文; 細(xì)胞增殖論文; 分泌蛋白論文; 睪丸萎縮論文; 細(xì)胞轉(zhuǎn)染論文;