一、兔抗M13噬菌體酶標(biāo)抗體的制備（論文文獻(xiàn)綜述）
王麗娟[1]（2021）在《抗非洲豬瘟病毒豬源單鏈抗體噬菌體文庫的構(gòu)建及抗體的篩選》文中研究指明單鏈抗體（ScFv）是通過一段柔性多肽（Linker）將抗體重鏈可變區(qū)（VH）與輕鏈可變區(qū)（VL）連接起來所形成的一種新型基因工程抗體,與單克隆抗體（MAb）相比,ScFv不僅保留了完整單克隆抗體的特異性,還有分子量小、異源性低等特點(diǎn),使其在靶向治療與診斷檢測方面具備廣泛的應(yīng)用前景。本研究以非洲豬瘟病毒（ASFV）為研究對(duì)象,構(gòu)建了抗ASFV的豬源噬菌體單鏈抗體文庫,并從中篩選出可以穩(wěn)定表達(dá)的具有ASFV反應(yīng)活性的豬源ScFv,為ASFV的診斷提供一種新型原材料。首先,根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫中公布的豬源抗體基因序列設(shè)計(jì)重疊PCR（SOE-PCR）引物,分離自然感染ASFV的抗體陽性豬外周血淋巴細(xì)胞,提取其總RNA作為擴(kuò)增模板,在上述引物作用下經(jīng)過兩輪巢式PCR獲得豬源抗體VH及VL基因,再通過一輪SOE-PCR,利用一段Linker序列將VH與VL連接形成VH-Linker-VL,獲得ScFv基因,測序發(fā)現(xiàn),ScFv的基因多樣性良好,達(dá)到90%以上,符合建庫要求。隨后,將ScFv與pHEN-2噬菌粒載體進(jìn)行雙酶切連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TG1宿主菌,獲得一個(gè)庫容量為1.13×108的原始文庫,經(jīng)輔助噬菌體M13K07拯救后,獲得初始豬源ScFv噬菌體文庫,經(jīng)測定,文庫滴度為8.0×1013cfu/m L。包被ASFV抗原檢測板,對(duì)噬菌體文庫進(jìn)行親和富集,經(jīng)3輪篩選后,獲得顯著富集的抗ASFV ScFv噬菌體文庫,同時(shí)篩選出4株特異性抗ASFV的ScFv,其中VH-VLλ6和VH-VLλ11與ASFV的反應(yīng)活性較好,PCR擴(kuò)增VH-VLλ6和VH-VLλ11序列,測序后進(jìn)行NCBI Ig Blast序列比對(duì)分析,結(jié)果證實(shí)VH-VLλ6和VH-VLλ11為豬源ScFv。最后,將VH-VLλ6和VH-VLλ11分別構(gòu)建至pET30a表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá),在IPTG的誘導(dǎo)下,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析,分別在約27 KDa處發(fā)現(xiàn)目的條帶,且主要以包涵體形式存在,經(jīng)鎳柱純化后純度達(dá)到90%以上。進(jìn)一步以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）鑒定VH-VLλ6和VH-VLλ11與ASFV之間的反應(yīng)性,結(jié)果證實(shí),獲得的兩株經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的單鏈抗體與ASFV具有較好的反應(yīng)活性。綜上所述,本研究以SOE-PCR技術(shù)為依托,以自然感染ASFV的抗體陽性豬外周血淋巴細(xì)胞總RNA為模板,成功構(gòu)建了一個(gè)豬源單鏈抗體噬菌體文庫,從文庫中篩選得到兩株特異性抗ASFV的ScFv,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明篩選得到的兩株ScFv確實(shí)具有ASFV反應(yīng)活性。該抗體的成功制備填補(bǔ)了目前市場上ASFV ScFv的空白,為ASFV診斷與防控的原材料來源提供了新渠道。
王博[2]（2021）在《我國優(yōu)勢(shì)種海蛇毒多組學(xué)分析、抗毒血清制備以及毒腺中活性組分淘選》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理第一部分我國兩種優(yōu)勢(shì)種海蛇毒多組學(xué)比較分析海蛇屬蛇目眼鏡蛇科海蛇亞科,全球共70余種,我國分布有17種,優(yōu)勢(shì)種為平頦海蛇（Hydrophis curtus,H.curtus）和青環(huán)海蛇（Hydrophis cyanocinctus,H.cyanocinctus）,在北部灣及海南、福建近海最為多見。海蛇毒是由多種蛋白、多肽和小分子物質(zhì)共同組成的混合物,其主要組分為神經(jīng)毒素和多種酶類,致死性極強(qiáng)。由于海蛇種類、地域分布及獵食對(duì)象的不同,海蛇毒中所含的蛋白種類和占比也有一定差異。為了更好地研究我國海域平頦海蛇毒（H.curtus venom,Hcu V）和青環(huán)海蛇毒（H.cyanocinctus venom,Hcy V）的組成,比較分析兩者差異情況,本部分以平頦海蛇和青環(huán)海蛇為研究對(duì)象,首先構(gòu)建了海蛇毒腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫;其次利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),通過蛋白組學(xué)方法對(duì)兩種海蛇毒的蛋白組成進(jìn)行了比較分析;在組學(xué)基礎(chǔ)之上,我們又進(jìn)一步對(duì)海蛇毒相關(guān)的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定與分析。主要結(jié)果如下:1.首先應(yīng)用Illumina Hi Seq?平臺(tái)對(duì)我國兩種海蛇毒腺進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,成功構(gòu)建了高質(zhì)量的毒腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,平頦海蛇和青環(huán)海蛇毒腺分別獲得38,710和35,716條unigenes序列。我們將毒腺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在公共數(shù)據(jù)庫（NR、KEGG、GO、KOG、Swiss Prot）中進(jìn)行了功能注釋,在NR數(shù)據(jù)庫中,兩種海蛇毒腺注釋序列來源最多的3個(gè)物種均為Notechis scutatus,Pseudonaja textilis,Ophiophagus hannah;在KEGG注釋中,平頦海蛇和青環(huán)海蛇毒腺分別注釋了10,949和10,683條unigenes,主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和疾病發(fā)生相關(guān)的路徑中;對(duì)簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats,SSR）位點(diǎn)檢測,平頦海蛇和青環(huán)海蛇毒腺轉(zhuǎn)錄組中分別發(fā)現(xiàn)了15,171和12,908個(gè)SSR位點(diǎn),其中以單核苷酸為重復(fù)單元的類型占比最高,均超過了50%。通過與Uni Prot動(dòng)物毒素庫（Uni Prot animal toxin and venom database）Blast比對(duì),在兩種海蛇毒腺中總共篩選到了17種蛇毒蛋白,充分挖掘了海蛇毒腺中蛇毒蛋白功能基因的資源。2.通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),獲得Hcu V和Hcy V蛋白組分的原始肽段,匹配檢索Uni Prot動(dòng)物毒素?cái)?shù)據(jù)庫,在Hcu V和Hcy V中分別鑒定到47和38種毒素相關(guān)蛋白。根據(jù)功能分類,鑒定到的毒素相關(guān)蛋白可歸為15個(gè)家族,主要包括:三指毒素、蛋白酶類、磷脂酶類、富含半胱氨酸毒素蛋白類、毒素因子、離子通道抑制劑等。這些毒素多見于蛇類,但也有少數(shù)見于其它有毒生物,包括蜘蛛（Lycosa singoriensis）、蝎子（Lychas mucronatus）、芋螺（Conus textile）等。3.通過毒素蛋白組比較分析發(fā)現(xiàn),不同毒素家族在Hcu V和Hcy V中所占比例不同,具體的蛋白組成也有一定差異。Hcu V和Hcy V中比例最高的兩類毒素均為三指毒素（主要包括短鏈和長鏈神經(jīng)毒素）和磷脂酶A2,在Hcu V中所占比例分別為54%和38%,在Hcy V中分別為69%和22%,與文獻(xiàn)報(bào)道的不同海域海蛇毒的組成及占比有明顯差異。兩種海蛇毒的生物學(xué)活性測定結(jié)果表明,Hcu V和Hcy V的小鼠半數(shù)致死量(LD50)分別為0.34 mg/kg和0.24 mg/kg,都有很強(qiáng)的致死性;兩種海蛇毒均檢測到明顯的神經(jīng)毒性、磷脂酶A2活性,以及微弱的蛋白酶活性和間接溶血毒性,但無明顯的促凝與抗凝活性,這些活性檢測結(jié)果與組學(xué)分析結(jié)果相一致。本部分通過對(duì)Hcu V和Hcy V進(jìn)行多組學(xué)分析,并結(jié)合蛇毒生物學(xué)活性檢測,揭示了我國兩種優(yōu)勢(shì)種海蛇毒組成的分子多樣性,也提示毒素蛋白組成比例的不同與其咬傷癥狀表現(xiàn)和致死效應(yīng)之間可能存在的關(guān)系,為后續(xù)研制針對(duì)我國海域海蛇咬傷中毒的抗毒血清提供了重要基礎(chǔ)。第二部分抗平頦海蛇毒血清的制備及其抗毒效果評(píng)價(jià)海蛇毒主要組分為神經(jīng)毒素,能阻斷神經(jīng)突觸傳遞,從而產(chǎn)生一系列中毒癥狀。海蛇毒的毒性極強(qiáng),可誘發(fā)嚴(yán)重的呼吸衰竭,死亡率高,目前針對(duì)海蛇咬傷最有效的急救方式是盡快注射抗毒血清,但我國僅生產(chǎn)幾種抗陸地蛇毒血清,對(duì)海蛇咬傷救治效果不佳。第一部分研究結(jié)果提示,不同海域、不同種類的海蛇,其毒素組成存在一定差異,因此有必要研制特異性針對(duì)我國海域優(yōu)勢(shì)種海蛇毒的抗毒血清,本論文第二部分即以我國海域優(yōu)勢(shì)種平頦海蛇毒為抗原,經(jīng)過抗原處理、免疫馬匹、抗體純化等步驟,制備了高效價(jià)的抗毒血清;并進(jìn)一步對(duì)抗海蛇毒血清的體內(nèi)外抗毒效果進(jìn)行了評(píng)價(jià),明確了抗毒血清的有效用量和使用時(shí)機(jī),為今后臨床應(yīng)用提供了參考。主要結(jié)果如下:1.采用0.6%甲醛濃度滅活毒素再添加弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化,使毒素抗原獲得最大的免疫原性,免疫馬匹后50天采血可獲得最高效價(jià)的馬血清;經(jīng)過酶消化、硫酸銨沉淀、超濾、柱層析等抗體純化步驟后,抗海蛇毒血清中抗體F（ab’）2蛋白純度達(dá)到91.6%,雜質(zhì)大量減少,同時(shí)具備較好的毒素中和能力。2.抗平頦海蛇毒血清（H.curtus antivenom,Hcu AV）體外抗毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Hcu AV對(duì)平頦海蛇毒和青環(huán)海蛇毒均有良好中和效果:1 m L Hcu AV能夠?qū)?.2 mg平頦海蛇毒或0.9 mg青環(huán)海蛇毒,使半數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活,提示Hcu AV能交叉中和多種海蛇毒,并為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的抗毒血清用量提供了依據(jù)。3.Hcu AV體內(nèi)抗毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,海蛇咬傷中毒后注射Hcu AV能顯著提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活率,但需在短時(shí)間內(nèi)（出現(xiàn)中毒癥狀前）盡早注射足量抗毒血清才能達(dá)到較好的救治效果,預(yù)防用藥和延遲用藥均無法降低中毒死亡率。同時(shí),Hcu AV能有效減輕海蛇毒造成的多器官病理學(xué)變化。本部分以平頦海蛇毒為抗原,制備了高效價(jià)、高純度的抗平頦海蛇毒馬血清,能有效中和Hcu V和Hcy V,覆蓋我國海域優(yōu)勢(shì)種海蛇毒。海蛇咬傷后盡快注射足量抗毒血清,能顯著地降低中毒死亡率,保護(hù)機(jī)體臟器免受損傷,為今后抗海蛇毒血清的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第三部分平頦海蛇毒腺中活性組分的淘選與效應(yīng)分析海蛇毒由多種酶類、非酶類蛋白和多肽、小分子物質(zhì)組成,是一類重要的海洋生物毒素。海蛇毒除了劇烈的毒性之外,也含有多種結(jié)構(gòu)特異、功能新穎的活性物質(zhì),具有多樣的藥理學(xué)效應(yīng)如:鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗血栓等。海蛇毒中的活性物質(zhì)是海洋生物資源開發(fā)研究的熱點(diǎn)之一。本部分以我國南海海域平頦海蛇為研究對(duì)象,分離其毒腺組織,利用M13噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了平頦海蛇毒腺M(fèi)13噬菌體展示文庫。然后以內(nèi)毒素LPS為靶標(biāo)分子,經(jīng)過多輪淘選,篩選出一個(gè)高親和力的噬菌體克隆,通過基因測序、氨基酸序列預(yù)測與性質(zhì)分析等,最終通過化學(xué)合成法獲得了一段功能性多肽,并通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其對(duì)內(nèi)毒素的拮抗效果。本部分主要結(jié)果如下:1.構(gòu)建了高質(zhì)量的平頦海蛇毒腺M(fèi)13噬菌體展示文庫,文庫庫容達(dá)到2.2×109,隨機(jī)測序驗(yàn)證外源插入片段準(zhǔn)確無誤;c-Myc標(biāo)簽檢測結(jié)果表明,外源插入片段在噬菌體外殼表面得到了高效的展示。2.以LPS為靶標(biāo)分子,經(jīng)過4輪固相淘選、陽性克隆測序、氨基酸序列預(yù)測等過程,獲得了一段平頦海蛇毒腺來源的21肽。多肽性質(zhì)分析結(jié)果表明,該多肽富含堿性氨基酸,理論分子量為2523.15,理論等電點(diǎn)為10.76,在中性溶液中攜帶正電荷;該多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋,氨基與羧基端呈現(xiàn)出雙親性結(jié)構(gòu),能夠與帶負(fù)電荷疏水性的LPS特異性結(jié)合。3.通過化學(xué)合成方式成功合成并純化了該21肽,純度超過95%,質(zhì)譜測定實(shí)際分子量與軟件預(yù)測的理論值相符,證明合成的多肽無誤,可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。利用生物膜干涉技術(shù)（BLI）對(duì)該多肽與LPS的結(jié)合力進(jìn)行測定,結(jié)果表明,該多肽與LPS具有較強(qiáng)的結(jié)合能力,結(jié)合方式為“快結(jié)合-慢解離”。內(nèi)毒素中和實(shí)驗(yàn)表明,該海蛇毒腺來源的21肽具有明確的內(nèi)毒素中和效果,因而將其命名為H.curtus Endotoxin-neutralizing Peptide,簡稱Hc-ENP。4.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Hc-ENP具有明確的LPS拮抗效果,在5-10μg/m L濃度下,能夠有效抑制LPS與RAW264.7細(xì)胞的結(jié)合。Western-blot、ELISA、細(xì)胞免疫熒光等結(jié)果顯示,Hc-ENP能通過抑制MAPK、NF-κB炎性信號(hào)通路的激活,從而有效抑制LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生的一系列炎性反應(yīng),包括:炎性因子釋放、炎性相關(guān)酶表達(dá)量升高、活性氧含量增加等,進(jìn)而發(fā)揮抗炎活性。5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Hc-ENP能夠有效抑制LPS刺激機(jī)體引發(fā)的全身性炎性反應(yīng),包括:靶器官炎性細(xì)胞浸潤、血清炎性因子水平升高、器官組織中炎性相關(guān)酶表達(dá)量升高、組織病理改變等。本部分通過構(gòu)建高質(zhì)量海蛇毒腺M(fèi)13噬菌體展示庫來進(jìn)行淘選,從而獲得平頦海蛇毒腺中的特定活性分子。本實(shí)驗(yàn)中我們獲得了一個(gè)平頦海蛇毒腺來源的內(nèi)毒素中和肽—Hc-ENP,其在體內(nèi)外均有明確的LPS拮抗效果,本研究為進(jìn)一步開發(fā)利用海蛇基因資源,探索其開發(fā)應(yīng)用價(jià)值提供了新的途徑。
陳文靜[3]（2020）在《雞柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白3特異親和肽抑制蟲體入侵宿主細(xì)胞研究》文中研究說明雞柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白3（E.tenella microneme protein 3,Et MIC3）是E.tenella的微線體在球蟲入侵宿主細(xì)胞早期階段中分泌于子孢子表面的重要蛋白質(zhì),且能夠與雞盲腸上皮細(xì)胞表面的特定受體分子結(jié)合從而介導(dǎo)整個(gè)入侵過程。由E.tenella引起的球蟲病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害非常大。由于當(dāng)前主要的治療（抗球蟲藥）和預(yù)防（球蟲活苗）球蟲疾病的方法存在易產(chǎn)生耐藥性以及花費(fèi)成本高等缺點(diǎn),因此有研究基于其入侵機(jī)制進(jìn)行抗球蟲疾病的研究,并發(fā)現(xiàn)Et MIC3可作為候選疫苗有效降低球蟲的入侵程度。Et MIC3由七個(gè)串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成（A、B、C1、C2、C3、C4、D）,包括兩端三個(gè)不完全重復(fù)結(jié)構(gòu)域和中間四個(gè)完全重復(fù)結(jié)構(gòu)域（C1、C2、C3、C4段）,在對(duì)各個(gè)區(qū)域進(jìn)行保守性及抗原性分析之后,本研究主要探討了B段和C1段（Et MIC3-BC1）兩個(gè)片段在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中所起到的作用。噬菌體展示技術(shù)是一種新的技術(shù),可以用來鑒別抗原表位及研究抗原和抗體的結(jié)構(gòu),并且能夠篩選出抗原和抗體的模擬肽,在寄生蟲病研究及防治中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過采用噬菌體展示技術(shù)獲得了能與Et MIC3-BC1蛋白特異結(jié)合的親和肽,并研究了目的親和肽在體內(nèi)、外抑制蟲體入侵宿主細(xì)胞的作用。1、原核表達(dá)Et MIC3-BC1蛋白并制備相應(yīng)多克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行了重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建（p ET-30a-Et MIC3-BC1）,并通過異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)將目的蛋白表達(dá)于E.coli（BL21）中。該重組蛋白在經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證之后,大量純化回收,并且進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性。以復(fù)性之后的蛋白作為免疫原對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫,從而制備多克隆抗體,通過Western blot（WB）和ELISA方法對(duì)抗體進(jìn)行檢測。瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了在本實(shí)驗(yàn)中p ET-30a-Et MIC3-BC1重組表達(dá)質(zhì)粒被成功構(gòu)建以及重組蛋白的成功表達(dá);WB和ELISA結(jié)果說明了以Et MIC3-BC1蛋白作為抗原能夠制備生物學(xué)活性（BA）良好的多克隆抗體。2、Et MIC3-BC1重組蛋白親和肽的篩選。按照試劑盒說明,通過噬菌體展示技術(shù),以純化并且復(fù)性之后的重組Et MIC3-BC1蛋白為靶分子于噬菌體十二肽庫中進(jìn)行四輪生物篩選,并在第四輪生物篩選結(jié)束后隨機(jī)地選擇三十個(gè)狀態(tài)良好的噬菌斑進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增、提DNA、測序并推導(dǎo)出其氨基酸序列。結(jié)果顯示,30個(gè)獨(dú)立的噬菌斑共得到8種親和力較高的十二肽序列,合成了其中出現(xiàn)頻率及親和力較高的A肽（AGRLLTPTMSLV）、D肽（DYHDPSLPTLGK）、W肽（WKDVHKAWLLEP）進(jìn)行進(jìn)一步研究。并且通過ELISA、間接ELISA和競爭ELISA法表明這三種多肽對(duì)應(yīng)的噬菌體能夠與Et MIC3-BC1和子孢子蛋白發(fā)生特異性結(jié)合以及抗Et MIC3-BC1多抗可以抑制噬菌體與重組蛋白之間的結(jié)合。3、測定A肽、D肽、W肽體外抵抗E.tenella子孢子入侵MDBK細(xì)胞的水平。采用MTT法測得這三種親和肽作用于MDBK細(xì)胞的最大無毒濃度是125μg/ml。通過Percoll密度梯度離心法進(jìn)行E.tenella子孢子的純化,并且采用CFDA-SE熒光探針對(duì)子孢子進(jìn)行標(biāo)記。通過流式細(xì)胞儀檢測當(dāng)三種多肽濃度分別為25μg/m L,50μg/m L,75μg/m L,100μg/m L,125μg/m L時(shí)抑制子孢子（30萬/孔）入侵MDBK細(xì)胞（1萬/孔）的效率。結(jié)果顯示這三種多肽都能夠抑制子孢子的入侵,并且A肽、D肽的抑制效果都極顯著高于W肽（P<0.01）,A肽的抑制效果極顯著高于D肽（P<0.01）。4、檢測A肽、D肽、W肽相應(yīng)噬菌體在機(jī)體內(nèi)的抗球蟲作用。75只21日齡蛋雞隨機(jī)分成五組（15只/組）:PBS組、A組、D組、W組、E.tenella感染對(duì)照組。21日齡時(shí),PBS組的雞口服無菌PBS,A組、D組、W組、E.tenella感染對(duì)照組的雞口服E.tenella孢子化卵囊（1萬/只）。于攻蟲后的第0-2天,給PBS組與E.tenella感染對(duì)照組口服無菌PBS,A組每天口服1×1012pfu A肽所對(duì)應(yīng)的陽性噬菌體、D組每天口服1×1012pfu D肽所對(duì)應(yīng)的陽性噬菌體、W組每天口服1×1012pfu W肽所對(duì)應(yīng)的陽性噬菌體。感染后第七天取各組糞便,觀察克糞便卵囊排出減少率。于感染后的第八天對(duì)各組雞進(jìn)行剖殺,測定各組雞的體重變化、盲腸病變?cè)u(píng)分、大體病理學(xué)和組織病理學(xué)變化、OPG和ACI等指標(biāo)。結(jié)果表明,A組、D組、W組都能夠抵抗一定程度的球蟲感染,其中A組和D組的各項(xiàng)指標(biāo)與攻蟲對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）且A組優(yōu)于D組,W組與E.tenella感染對(duì)照組相比較差異顯著（P<0.05）。各組的抗球蟲指數(shù)分別為:200（PBS組）、168.74（A組）、161.27（D組）、137.36（W組）、118.21（E.tenella感染對(duì)照組）。5、Atodock分子對(duì)接軟件評(píng)估Et MIC3-BC1蛋白和三種多肽的結(jié)合方式。通過Swiss-model對(duì)Et MIC3-BC1蛋白建立三維模型,用Atodock分析A肽、D肽、W肽分別和Et MIC3-BC1蛋白在空間上的結(jié)合情況。結(jié)果顯示A肽、D肽、W肽與Et MIC3-BC1蛋白之間均存在疏水作用力和氫鍵,且A肽的結(jié)合作用最佳,D肽次之,W肽較弱,表明三種多肽在空間上均能夠與Et MIC3-BC1蛋白結(jié)合。綜上,本實(shí)驗(yàn)用Et MIC3-BC1蛋白所篩選出的親和配體（A肽、D肽、W肽）體內(nèi)、外能夠有效的抑制E.tenella子孢子對(duì)宿主細(xì)胞的入侵,具備一定的抵抗球蟲感染保護(hù)作用。本研究豐富了研制基于Et MIC3的雞球蟲病相關(guān)多肽疫苗的依據(jù)。
楊雷[4]（2020）在《TIM-3單克隆抗體制備及人源化小鼠構(gòu)建》文中指出免疫治療作為繼腫瘤手術(shù)治療、放化療后的一種新的治療方法,主要是通過活化淋巴細(xì)胞激活自身免疫系統(tǒng),促使淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。近些年的腫瘤治療中,通過激活T細(xì)胞免疫治療受到強(qiáng)烈的關(guān)注,免疫檢查點(diǎn)蛋白PD-1特異性單克隆抗體通過阻斷腫瘤免疫逃逸,改善免疫應(yīng)答顯示出較好的腫瘤治療效果,這表明免疫檢查點(diǎn)抑制劑的癌癥免疫療法是有效的治療方法之一。隨著PD-1單抗出現(xiàn)耐藥性,越來越多研究轉(zhuǎn)向聯(lián)合用藥,TIM-3同樣作為T細(xì)胞表面抑制分子之一,通過與其配體Galectin-9結(jié)合抑制Thl細(xì)胞的功能并使其最終凋亡,同時(shí)也調(diào)控Th1和Thl7細(xì)胞的細(xì)胞因子如干擾素（IFN）、白介素（IL2）等分泌,抑制TIM3蛋白活性可增強(qiáng)阻斷PD-1的抗腫瘤作用效果,因此制備TIM3單克隆抗體為進(jìn)一步進(jìn)行針對(duì)性的抗體藥物開發(fā)有重要意義。本研究首先利用昆蟲蛋白表達(dá)系統(tǒng)制備了高純度人TIM3（aa 22-202）胞外結(jié)構(gòu)域蛋白,經(jīng)過對(duì)兔子的三次免疫后,分離兔PBMC細(xì)胞,利用多種抗體標(biāo)記,通過流式分選獲得識(shí)別人源TIM-3蛋白的記憶B細(xì)胞。其次,B細(xì)胞與表達(dá)CD40L的EL4-B5飼養(yǎng)層細(xì)胞在加入IL2、IL21細(xì)胞因子的條件下共培養(yǎng),使B細(xì)胞在體外增殖并獲得足夠檢測的單克隆抗體,利用巢式PCR獲得輕重鏈基因序列片段,真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)兔抗人TIM-3單克隆抗體,并通過ELISA、Western blot、流式細(xì)胞分析等方法鑒定該抗體親和性以及在蛋白和細(xì)胞層面的特異性。最后,利用CRISPR基因編輯技術(shù)構(gòu)建了TIM-3人源化小鼠,為探究TIM3單克隆抗體的治療效果以及功能性研究提供基礎(chǔ)。本研究使用單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)獲得高效價(jià)的人源TIM3單克隆抗體,對(duì)于研發(fā)的單克隆抗體療效評(píng)估同時(shí)構(gòu)建了人源化TIM3胞外區(qū)的模型小鼠與B16黑色素瘤細(xì)胞,用于研究其生物學(xué)活性以及臨床試驗(yàn)研究。對(duì)繼PD-1/PD-L1抗體藥物之后的新免疫檢查點(diǎn)治療藥物的研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)并提供科學(xué)依據(jù)。
郭瑞峰[5]（2021）在《人源化半合成納米抗體文庫的構(gòu)建及CD47納米抗體的研制》文中研究指明納米抗體源自駝?lì)惡王忯~等軟骨魚類動(dòng)物體內(nèi)天然缺失輕鏈的重鏈抗體,由其可變區(qū)VHH克隆而來。作為結(jié)合抗原最小的功能性片段,納米抗體比完整的傳統(tǒng)抗體分子結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性高,分子量僅為其十分之一,具有很強(qiáng)的組織穿透能力,且易于進(jìn)行基因工程改造,因此在各類生物技術(shù)以及醫(yī)學(xué)疾病的診斷和治療等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。而CD47分子作為免疫球蛋白（Ig）超家族的成員在針對(duì)腫瘤分子的免疫識(shí)別中代表著“別吃我”的信號(hào),即,腫瘤等細(xì)胞表面的CD 47分子與巨噬細(xì)胞上的蛋白配體SIRP α結(jié)合后可抑制后者吞噬功能的發(fā)揮,進(jìn)而逃避了免疫監(jiān)視作用;而解除此抑制則可重新喚醒“沉睡中的”巨噬細(xì)胞,對(duì)其進(jìn)行免疫清除。因此,CD47分子也被賦予免疫檢查點(diǎn)的使命,成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的又一個(gè)潛在靶點(diǎn);而能夠阻斷CD47-SIRP α通路的靶向藥物則有望成為繼PD-1、PD-L1阻斷藥后腫瘤免疫治療領(lǐng)域的又一熱點(diǎn)。本研究立足于納米抗體的噬菌體展示技術(shù),首先在人源化半合成納米抗體文庫的構(gòu)建方法方面進(jìn)行探討,嘗試了一種繞過酶切環(huán)節(jié),僅需一步PCR反應(yīng)即可完成VHH抗體庫基因構(gòu)建的策略;隨后以真核表達(dá)的CD47抗原分子為靶標(biāo),經(jīng)過對(duì)抗體庫的若干輪生物淘選來得到VHH噬菌體抗體克隆;再利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)VHH片段進(jìn)行原核分泌表達(dá),并在畢赤酵母中進(jìn)行了初步的表達(dá)嘗試;最后通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)VHH的免疫阻斷活性進(jìn)行了檢測。第一部分在人源化半合成納米抗體文庫的構(gòu)建方法方面進(jìn)行了探討。本章節(jié)采用報(bào)道中性質(zhì)優(yōu)良的cAbBCII10納米抗體序列作為基礎(chǔ)框架,并將其中FR2區(qū)域外的相關(guān)氨基酸殘基在設(shè)計(jì)時(shí)通過替換處理來實(shí)現(xiàn)人源化操作。然后在此框架的基礎(chǔ)上通過長引物PCR法引入CD3區(qū)隨機(jī)序列,并對(duì)此種策略構(gòu)建抗體文庫的效率及可行性進(jìn)行了印證。研究中發(fā)現(xiàn),此法僅需通過一步PCR反應(yīng)即可完成人源化半合成VHH抗體庫基因的拼接構(gòu)建,回收產(chǎn)物連接后即可用于轉(zhuǎn)化,庫容多樣性良好,每批電轉(zhuǎn)操作后平均可達(dá)1.21×108,減少了基因拼接環(huán)節(jié)的工作強(qiáng)度以及回收步驟過多所造成的損失,提高了工作效率。本章節(jié)的研究為納米抗體文庫的構(gòu)建提供了新的思路和技術(shù)路線。第二部分利用真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)生物淘選過程及后繼檢驗(yàn)階段所需的相關(guān)抗原進(jìn)行了制備。本章節(jié)用擴(kuò)增抽提的含有CD47Fc、SIRP α-Fc及CD47his基因的高純度無菌、無內(nèi)毒素真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)293Fv懸浮細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染,成功實(shí)現(xiàn)了三種抗原蛋白的真核表達(dá),親和層析純化后進(jìn)行檢測,所獲得的每種抗原均達(dá)到了毫克級(jí)別,為后繼的淘選及檢測實(shí)驗(yàn)做好鋪墊工作。第三部分進(jìn)行了針對(duì)CD47抗原的生物淘選、單克隆鑒定及親和力測定等方面的研究。本章節(jié)利用VHH納米抗體庫對(duì)CD47固相包被抗原進(jìn)行了4輪的淘選,富集效應(yīng)明顯,第三輪即進(jìn)入到平臺(tái)期。隨后挑選單克隆進(jìn)行檢驗(yàn),陽性克隆測序后通過序列比對(duì)分析得到了五個(gè)針對(duì)CD47胞外區(qū)抗原的VHH納米抗體序列。其中四個(gè)序列高度相似,僅在框架區(qū)有個(gè)別氨基酸殘基上的差異,而第五個(gè)序列則與前四個(gè)差異較大。經(jīng)親和力實(shí)驗(yàn)測得這兩類VHH的Kd值分別為1.5×1010 mol-1和7.5×109 mol-1。本章研究結(jié)果為后繼的VHH納米抗體的表達(dá)做好鋪墊工作。第四部分對(duì)獲得的VHH納米抗體進(jìn)行了表達(dá)、純化及免疫阻斷活性等方面的研究。本章節(jié)通過突變PCR將淘選到的陽性噬菌體展示克隆一步改造成分泌型原核表達(dá)載體,隨后對(duì)VHH納米抗體的可溶性分泌表達(dá)進(jìn)行了分析。研究過程中對(duì)培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度、VHH分泌表達(dá)的分布空間等方面進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)大部分VHH以可溶形式表達(dá),表達(dá)空間分布在兩類VHH間差異較大,滲透休克法進(jìn)行周質(zhì)提取或破菌后取上清是較為優(yōu)選的策略。另外,本章節(jié)還采用了畢赤酵母分泌型表達(dá)載體對(duì)VHH的分泌表達(dá)進(jìn)行了初步的嘗試,見證了在信號(hào)肽的導(dǎo)引下,VHH抗體分子可被分泌至培養(yǎng)基中,表達(dá)量可觀且培養(yǎng)基中雜蛋白背景很少,體現(xiàn)了酵母表達(dá)系統(tǒng)在VHH表達(dá)方面的優(yōu)勢(shì)。本章節(jié)最后對(duì)大腸桿菌分泌表達(dá)的VHH納米抗體進(jìn)行了針對(duì)CD47-SIRP α通路的免疫阻斷實(shí)驗(yàn),顯示出其中一個(gè)VHH序列具有一定的免疫阻斷活性。本章節(jié)的研究為實(shí)現(xiàn)VHH納米抗體在大腸桿菌中的可溶性分泌表達(dá)提供了新的可行的方法和思路。綜上所述,本論文探索了一種較為便捷、高效的人源化半合成VHH納米抗體文庫的構(gòu)建方法,繞開了傳統(tǒng)的動(dòng)物使用環(huán)節(jié),所建庫容多樣性良好,每個(gè)電轉(zhuǎn)批次庫容均可達(dá)到108以上;在制備真核表達(dá)的靶點(diǎn)抗原基礎(chǔ)上,本論文通過噬菌體納米抗體展示庫技術(shù)經(jīng)生物淘選得到了 5個(gè)針對(duì)CD47抗原的的VHH納米抗體序列,經(jīng)親和力分析屬于高親和力抗體;隨后采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)VHH片段進(jìn)行原核分泌表達(dá),對(duì)培養(yǎng)條件及純化策略進(jìn)行了探討并在畢赤酵母中進(jìn)行了初步表達(dá)嘗試;最后通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)VHH的免疫阻斷活性進(jìn)行了檢測,確定了一株具有阻斷活性的VHH納米抗體,為后繼進(jìn)一步的應(yīng)用開發(fā)打下基礎(chǔ)。
劉欣[6]（2019）在《B細(xì)胞成熟抗原特異性單域抗體的篩選制備和鑒定》文中認(rèn)為B細(xì)胞成熟抗原（B-cell maturation antigen,BCMA）是在多發(fā)性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）細(xì)胞和漿細(xì)胞表面上特異性表達(dá)的蛋白。研究靶向BCMA的單域抗體（Single domain antibody,sdAb）,可以特異性MM細(xì)胞表面的結(jié)合BCMA蛋白;sdAb又有高水溶性、低免疫原性、較強(qiáng)的組織滲透力和強(qiáng)穩(wěn)定性的特點(diǎn),將在MM的特異性免疫分析和治療中發(fā)揮作用。本試驗(yàn)中使用BCMA蛋白免疫雙峰駝,獲得重鏈可變區(qū)（VHH）基因庫,將基因庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中,構(gòu)建噬菌體抗體庫進(jìn)行三輪富集、淘篩,選取了 Phage ELISA鑒定出的與BCMA蛋白高結(jié)合活性的重組噬菌體。將VHH基因克隆到原核表達(dá)載體pET-25b-SBP,采用低溫誘導(dǎo)工程菌進(jìn)行可溶性表達(dá),用鎳柱對(duì)破碎菌上清進(jìn)行純化。進(jìn)行ELISA鑒定,鑒定其親和活性,試驗(yàn)研究結(jié)果如下:（1）免疫后測得血清抗體效價(jià)為1:16000,建立BCMA特異性噬菌體抗體庫庫容3.15×106,富集篩選后經(jīng)Phage ELISA檢測陽性重組噬菌體共有52株。（2）將VHH基因克隆入原核表達(dá)載體pET-25b-SBP,菌落PCR及表達(dá)鑒定進(jìn)行高表達(dá)篩選,誘導(dǎo)表達(dá)得到可溶的BCMA特異性sdAb;經(jīng)ELISA試驗(yàn)鑒定,篩選表達(dá)得到的sdAb與BCMA蛋白結(jié)合,并具有一定的親和活性。
魏世娟[7]（2019）在《重組噬菌體對(duì)沙眼衣原體作用及機(jī)制的探索》文中研究說明研究背景沙眼衣原體引起的細(xì)菌性性傳播疾病目前是國內(nèi)外重要的公共衛(wèi)生問題,在其他性傳播疾病漸漸得到的控制的情況下,生殖道沙眼衣原體感染的發(fā)病率卻持續(xù)走高。鑒于目前因沙眼衣原體耐藥導(dǎo)致治療失敗的案例越來越多,抗生素已經(jīng)無法控制它的發(fā)展,我們迫切的需要一個(gè)強(qiáng)有的治療措施以改善沙眼衣原體感染和流行的現(xiàn)況。衣原體噬菌體被公認(rèn)為最有希望解決這一難題的有效措施。研究目的1.擬獲得對(duì)沙眼衣原體有高效抑制或破壞作用的、特異的、安全的重組噬菌體。為臨床上沙眼衣原體感染的精準(zhǔn)治療方法奠定基礎(chǔ)。2.初步探究重組噬菌體對(duì)沙眼衣原體的可能作用機(jī)制。研究方法1.重組M13-RGD-IN5噬菌體對(duì)沙眼衣原體作用及機(jī)制:（1）利用基因工程構(gòu)建重組噬菌體M13-RGD-IN5、M13-RGD、M13-IN5,即將整合素RGD和衣原體噬菌體PhiCPG1的IN5分別插入到M13噬菌體的主要外殼蛋白pVIII和次要外殼蛋白pIII中;（2）純化重組M13噬菌體并用噬菌斑法測試各重組M13噬菌體的滴度;（3）CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測重組M13噬菌體對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒性并篩選出重組噬菌體最適干預(yù)濃度;（4）將不同的重組M13噬菌體作用與沙眼衣原體（CT）和豚鼠結(jié)膜炎衣原體（GPIC）,通過免疫熒光檢測觀察重組噬菌體對(duì)Hela細(xì)胞、沙眼衣原體及豚鼠結(jié)膜炎衣原體的作用;（5）通過共聚焦顯微鏡觀察重組M13-RGD-IN5噬菌體在感染有沙眼衣原體的hela細(xì)胞中的定位;（6）探究透射電子顯微鏡觀察重組M13-RGD-IN5噬菌體感染沙眼衣原體36小時(shí)后,沙眼衣原體在你超微結(jié)構(gòu)上的變化;（7）利用針對(duì)IN5的多克隆抗體檢測重組M13-RGD-IN5對(duì)沙眼衣原體作用的特異性;（8）通過QPCR驗(yàn)證重組噬菌體是否可在沙眼衣原體中增殖。2.重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)沙眼衣原體作用及機(jī)制:（1）利用基因工程構(gòu)建重組pGFP-PhiCPG1質(zhì)粒;（2）利用CaCl2法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入豚鼠結(jié)膜炎衣原體的原體（EB）中;（3）通過傳代擴(kuò)增重組pGFP-PhiCPG1噬菌體,并通過QPCR對(duì)每代重組pGFP-PhiCPG1噬菌體的拷貝數(shù)進(jìn)行定量;（4）純化重組pGFP-PhiCPG1噬菌體,并用QPCR定量;（5）CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒性;（6）將不同濃度的重組pGFP-PhiCPG1噬菌體作用沙眼衣原體和豚鼠結(jié)膜炎衣原體,用免疫熒光檢測觀察重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)衣原體的作用并篩選出最佳干預(yù)濃度;（7）將最適干預(yù)濃度的重組pGFP-PhiCPG1噬菌體作用于沙眼衣原體和豚鼠結(jié)膜炎衣原體后,利用免疫熒光觀察感染后不同時(shí)間段重組噬菌體對(duì)衣原體的作用;（8）透射電子顯微鏡觀察重組噬菌體感染衣原體36小時(shí)后,沙眼衣原體和豚鼠結(jié)膜炎衣原體在超微結(jié)構(gòu)上的變化。研究結(jié)果1.重組M13-RGD-IN5噬菌體:（1）成功構(gòu)建了重組M13-RGD-IN5噬菌體、重組M13-RGD噬菌體、重組M13-IN5噬菌體;（2）根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果,證明重組M13噬菌體的滴度在小于等于10100 pfu/mL時(shí)對(duì)HeLa細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性;（3）RGD的加入使得細(xì)胞的內(nèi)吞作用增強(qiáng)具有劑量依賴性;IN5的加入不影響Hela細(xì)胞對(duì)重組M13-RGD-IN5噬菌體的攝取;（4）重組M13-RGD-IN5噬菌體對(duì)沙眼衣原體的抑制作用具有劑量依賴性并選取109 pfu/ml為最佳干預(yù)濃度;（5）重組噬菌體顯著降低沙眼衣原體和豚鼠結(jié)膜炎衣原體的感染,抑制率分別為69.05%和77.06%;（6）重組M13-RGD-IN5噬菌體,能穿透細(xì)胞粘膜屏障及包涵體膜進(jìn)入到沙眼衣原體在宿主細(xì)胞形成的包涵體中,而這種現(xiàn)象未出現(xiàn)在重組M13-RGD噬菌體干預(yù)沙眼衣原體的過程中;（7）若重組噬菌體在感染沙眼衣原體之前,將其與抗IN5的多克隆抗體共同孵育,則不會(huì)改變沙眼衣原體的感染進(jìn)程;（8）透射電鏡觀察結(jié)果顯示重組M13-RGD-IN5噬菌體影響沙眼衣原體網(wǎng)狀體（RB）向原體（EB）的正常轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生異常增大的網(wǎng)狀體從而抑制EB的產(chǎn)生;（9）QPCR結(jié)果顯示,重組M13-RGD-IN5噬菌體在沙眼衣原體及Hela細(xì)胞中是不增殖的,遵守嚴(yán)格的宿主限定。2.重組pGFP-PhiCPG1噬菌體:（1）成功構(gòu)建出重組pGFP-PhiCPG1噬菌體;（2）pGFP的加入并不影響PhiCPG1在豚鼠結(jié)膜炎衣原體中的自我包裝,感染與增殖過程;（3）重組噬菌體pGFP-PhiCPG1可以感染沙眼衣原體;（4）CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果,證明重組pGFP-PhiCPG1噬菌體的滴度在小于1016v.g/mL時(shí)對(duì)HeLa細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性;（5）重組噬菌體pGFP-PhiCPG1對(duì)沙眼衣原體及GPIC有顯著地抑制作用且有劑量依賴性;（6）重組噬菌體pGFP-PhiCPG1對(duì)沙眼衣原體及GPIC在感染早期無明顯影響,抑制作用主要發(fā)生在衣原體生長周期的中后期,影響RB向EB的正常轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生異常增大的網(wǎng)狀體從而抑制EB的產(chǎn)生。研究結(jié)論1.通過基因工程合成的能穩(wěn)定表達(dá)整合素結(jié)合蛋白R(shí)GD和衣原體噬菌體衣殼蛋白IN5的重組M13-RGD-IN5噬菌體克服了細(xì)胞膜及所作用粘膜的阻礙,對(duì)沙眼衣原體的生長具有明顯的抑制作用,且不影響其自身的蛋白折疊。2.通過基因工程構(gòu)建的重組噬菌體pGFP-PhiCPG1生物學(xué)特性與衣原體噬菌體PhiCPG1極為相似,適用于在實(shí)驗(yàn)研究衣原體噬菌體PhiCPG1;能感染沙眼衣原體并能明顯抑制其生長繁殖。3.重組噬菌體M13-RGD-IN5抑制沙眼衣原體的感染的機(jī)制可能是信號(hào)通路觸發(fā)的破壞作用。重組噬菌體pGFP-PhiCPG1抑制沙眼衣原體的感染的機(jī)制除了噬菌體大量增殖造成的機(jī)械破壞外,可能還存在信號(hào)通路觸發(fā)的某種破壞作用。4.綜合整個(gè)結(jié)果,暗示沙眼衣原體有可能是衣原體噬菌體PhiCPG1的宿主菌之一或者沙眼衣原體可能存在自己的噬菌體而且與噬菌體PhiCPG1的親緣關(guān)系很近,為尋找沙眼衣原體特異性噬菌體提供了方向。
練婷婷[8]（2019）在《M13重組噬菌體的鑒定及其對(duì)沙眼衣原體和豚鼠嗜衣原體的作用》文中研究表明【背景】沙眼衣原體泌尿生殖道感染是國內(nèi)外常見的性傳播疾病,且發(fā)病率逐年上升,近年來已居于性傳播疾病的首位。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),全世界每年大約新發(fā)沙眼衣原體感染約9200萬。大約2/3的沙眼衣原體感染者沒有臨床癥狀,易被忽視,無法得到及時(shí)的診治,引起一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥和后遺癥。衣原體是一種區(qū)別于普通細(xì)菌的,具有特殊生物學(xué)特性的病原體,而臨床上將其作為普通細(xì)菌,給予抗生素治療,效果欠佳。衣原體噬菌體是一種以衣原體為宿主的噬菌體,部分衣原體噬菌體能引起宿主衣原體始體裂解性感染,并依靠簡單的粘附作用傳給下一代原體。利用衣原體噬菌體引起衣原體病變并使之裂解的特點(diǎn),可將其作為生物制劑用于衣原體感染的治療,但目前尚未發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體的噬菌體。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)將純化的豚鼠嗜衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1作用于沙眼衣原體,能明顯抑制體外沙眼衣原體感染,對(duì)Vp1蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其含有七個(gè)插入環(huán),其中一個(gè)較大的插入環(huán)-IN5環(huán)暴露在噬菌體衣殼蛋白表面形成蘑菇樣的突起,推測Vp1蛋白的IN5環(huán)結(jié)構(gòu)可能為最重要的功能區(qū)?！灸康摹刻剿鱉13-IN5重組噬菌體對(duì)E型沙眼衣原體和豚鼠嗜衣原體的作用?！緝?nèi)容】鑒定M13-IN5重組噬菌體IN5環(huán)目的片段;檢測M13-IN5重組噬菌體的效價(jià);研究M13-IN5重組噬菌體IN5環(huán)蛋白的表達(dá);將構(gòu)建成功的M13-IN5重組噬菌體對(duì)沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株（CtE）和豚鼠嗜衣原體（Chlamydiadophila caviae）進(jìn)行干預(yù),利用光鏡觀察CtE在感染36h、48h、60h、72h的變化并檢測各干預(yù)時(shí)間點(diǎn)噬菌體活性,利用免疫熒光顯微鏡觀察豚鼠嗜衣原體在感染20h、24h、28h、32h的變化;利用激光掃描共聚焦顯微鏡精確定位M13-IN5重組噬菌體在Hela細(xì)胞內(nèi)的位置?！痉椒ā坷秒p層平板法檢測重組噬菌體的效價(jià)。DNA提取試劑盒提取噬菌體DNA,進(jìn)行PCR、酶切、測序,驗(yàn)證重組噬菌體。提取噬菌體蛋白,Western Blot檢測重組噬菌體IN5環(huán)蛋白的表達(dá)。利用成功重組的噬菌體干預(yù)CtE,在CtE的培養(yǎng)過程中,加入效價(jià)均為1011PFU/ml的M13噬菌體、M13-IN5重組噬菌體進(jìn)行干預(yù),并設(shè)置CtE對(duì)照組和空白對(duì)照組,在干預(yù)36h、48h、60h、72h,普通光學(xué)顯微鏡下觀察M13-IN5重組噬菌體對(duì)CtE作用;在干預(yù)36h,利用激光掃描共聚焦顯微鏡,觀察M13-IN5重組噬菌體在Hela細(xì)胞內(nèi)的位置;收集噬菌體干預(yù)實(shí)驗(yàn)各時(shí)段的培養(yǎng)基,用雙層平板法檢測噬菌體的效價(jià),判斷重組噬菌體的活力和重組噬菌體在干預(yù)各時(shí)段的存活情況。在豚鼠嗜衣原體的培養(yǎng)過程中,加入效價(jià)均為1011PFU/ml的M13噬菌體、M13-IN5重組噬菌體進(jìn)行干預(yù),并設(shè)置豚鼠嗜衣原體對(duì)照組和空白對(duì)照組,在干預(yù)20h、24h、28h、32h,通過免疫熒光顯微鏡觀察M13-IN5重組噬菌體對(duì)豚鼠嗜衣原體的作用?！窘Y(jié)果】利用DNA重組技術(shù)獲得M13-IN5重組噬菌體,挑取單克隆擴(kuò)增M13-IN5重組噬菌體,通過噬菌斑計(jì)數(shù)得到M13-IN5重組噬菌體滴度,LB平板培養(yǎng)顯示,M13-IN5重組噬菌體噬斑形成單位PFU=3.05×1011/ml,提示M13-IN5重組噬菌體具有生物活力。M13-IN5重組噬菌體在大小約55kDa處有一較濃的蛋白帶,其大小正好與IN5環(huán)和M13噬菌體pIII外殼蛋白的融合蛋白（58.2kDa）大小相當(dāng),M13噬菌體組和大腸桿菌ER2738組在相應(yīng)位置無條帶,這說明重組噬菌體IN5基因能夠正常表達(dá)。激光掃描共聚焦定位顯示,M13-IN5重組噬菌體熒光與CtE包涵體熒光存在重疊。M13-IN5重組噬菌體對(duì)CtE及豚鼠嗜衣原體均有抑制作用;CtE感染36、72 h時(shí),M13-IN5重組噬菌體組和M13噬菌體組的包涵體數(shù)目較CtE對(duì)照組降低（P<0.05）,而且M13-IN5重組噬菌體組包涵體數(shù)目較M13噬菌體組有明顯降低（P<0.05）,而感染48 h、60h時(shí),M13-IN5重組噬菌體組、M13噬菌體組、CtE對(duì)照組包涵體數(shù)目無明顯區(qū)別（P>0.05）;在豚鼠嗜衣原體感染中也出現(xiàn)沙眼衣原體干預(yù)實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果,豚鼠嗜衣原體感染28h、32h,M13-IN5重組噬菌體組和M13噬菌體組的包涵體數(shù)目較豚鼠嗜衣原體對(duì)照組降低（P<0.05）,而且M13-IN5重組噬菌體組包涵體數(shù)目較M13噬菌體組明顯降低（P<0.05）,豚鼠嗜衣原體感染20h、24h,M13-IN5重組噬菌體組、M13噬菌體組、豚鼠嗜衣原體對(duì)照組包涵體數(shù)目無明顯區(qū)別（P>0.05）?！窘Y(jié)論】M13-IN5重組噬菌體具有生物活性,且能夠成功表達(dá)IN5環(huán)蛋白;在體外實(shí)驗(yàn)中,M13-IN5重組噬菌體能進(jìn)入衣原體包涵體內(nèi),且能明顯抑制增殖期的沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株和生長周期晚期的豚鼠嗜衣原體感染。
劉媛[9]（2018）在《基于抗體的擬除蟲菊酯農(nóng)藥代謝物分析和Cry2Aa毒素分子模擬研究》文中研究指明抗體是由脊椎動(dòng)物產(chǎn)生的一種能高親和力、特異性識(shí)別抗原的多功能分子。在植物保護(hù)領(lǐng)域,抗體即可作為農(nóng)藥殘留免疫分析的生物識(shí)別分子,又可用于農(nóng)藥的分子模擬,替代其與靶標(biāo)昆蟲受體結(jié)合,甚至引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)。本研究從抗體的生物識(shí)別和分子模擬兩大功能著手,開展了多種擬除蟲菊酯農(nóng)藥共性代謝產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）免疫分析技術(shù)研究。同時(shí)采用抗獨(dú)特型抗體技術(shù)對(duì)蘇云金芽孢桿菌（Bt）Cry2Aa毒素進(jìn)行分子模擬,并對(duì)其生物活性與原毒素進(jìn)行比較研究,具體取得的結(jié)果如下:（1）3-PBA膠體金免疫層析法的建立試驗(yàn)采用體內(nèi)誘生腹水法制備了 3-PBA單克隆抗體,并用Protein G柱進(jìn)行親和純化。用間接競爭ELISA法測定的3-PBA對(duì)純化抗體的抑制中濃度（I50）為0.63 μg/mL,最低檢測限（110）為0.13μg/mL,線性檢測范圍（I20-I80）在0.19-2.04μg/mL之間。用檸檬酸三鈉還原法制備了 15nm的膠體金顆粒用于純化抗體標(biāo)記,測定的最佳抗體標(biāo)記濃度為48μg/mL。試驗(yàn)以硝酸纖維素膜為載體,組裝了免疫層析試紙,優(yōu)化的檢測線濃度和金標(biāo)抗體噴膜量分別為2 mg/mL和5μL/cm。以檢測線完全抑制為標(biāo)準(zhǔn),免疫層析試紙對(duì)3-PBA的檢測閾值為1μg/mL,檢測時(shí)間為10min。采用免疫層析試紙對(duì)40個(gè)添加了不同濃度3-PBA的水樣進(jìn)行測試,結(jié)果表明假陰性率為2.5%,未觀察到假陽性結(jié)果。該方法有潛力用于水體等環(huán)境樣本中3-PBA的現(xiàn)場快速檢測。（2）3-PBA單鏈抗體的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的一株能識(shí)別3-PBA的鼠雜交瘤細(xì)胞株為模板,提取其總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。采用簡并引物,PCR法擴(kuò)增鼠抗體重鏈可變區(qū)（VH）和κ輕鏈可變區(qū)（Vκ）基因。再用重疊延伸PCR法,將VH、Vκ基因與一個(gè)45 bp的linker進(jìn)行連接?？寺≈羛ET26b（+）載體后,化轉(zhuǎn)E.coli BL21（DE3）。單鏈抗體株小量誘導(dǎo)表達(dá)后,用ELISA法和Western blot驗(yàn)證了對(duì)3-PBA的結(jié)合活性。試驗(yàn)隨后通過ExPASy和IMGT生物信息學(xué)網(wǎng)站對(duì)單鏈抗體的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、等位基因及功能區(qū)進(jìn)行預(yù)測與分析。結(jié)果表明3-PBA單鏈抗體計(jì)算分子量為29905.61 Da,理論等電點(diǎn)為8.95,為親水性、不穩(wěn)定蛋白。單鏈抗體基因全長840bp,VH和Vκ分別為370bp和319bp。與編碼VH和Vκ的可變區(qū)基因片段一致性最高的等位基因分別為Musmus IGHV1-18*01 F或Musmus IGHV1-22*01 F 和 Musmus IGKV4-72*01 F。VH 和 Vκ 的 3 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)）長度分別為8-8-16和5-3-9。相比于胚系基因,單鏈抗體CDR區(qū)的總氨基酸突變率為20%。試驗(yàn)通過SWISS-MODEL軟件對(duì)單鏈抗體同源建模,用Autodock Vina軟件對(duì)單鏈抗體和3-PBA進(jìn)行分子對(duì)接,發(fā)現(xiàn)單鏈抗體與3-PBA之間存在氫鍵、疏水作用、CH-π作用和陽離子-π作用。參與抗原識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)包括 GLY-74,ASN-76,GLU-81,VAL-123,LEU-130,TRP-252 和ARG-83,這些氨基酸均位于IMGT標(biāo)注的抗體CDR區(qū)及其鄰近區(qū)域。本試驗(yàn)首次成功構(gòu)建了能識(shí)別3-PBA的單鏈抗體,為后期表達(dá)和檢測應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。另外試驗(yàn)分析和預(yù)測了參與3-PBA識(shí)別的抗體關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)及其相互作用力,合理的解釋了單鏈抗體與3-PBA的結(jié)合模式,為抗體的進(jìn)一步優(yōu)化和生產(chǎn)提供了重要的參考信息。（3）3-PBA單鏈抗體的表達(dá)、功能分析與檢測應(yīng)用試驗(yàn)考察了溫度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間,對(duì)3-PBA單鏈抗體表達(dá)的影響。結(jié)果表明,16℃的誘導(dǎo)溫度,終濃度0.25 mM IPTG和8h誘導(dǎo)時(shí)間為優(yōu)化的單鏈抗體表達(dá)條件。單鏈抗體大量表達(dá)后,包涵體用鎳離子親和柱進(jìn)行純化,用200 mM的咪唑進(jìn)行洗脫,獲得了電泳純的蛋白,得率為2.68 mg/L,并進(jìn)行尿素溶解和透析復(fù)性。試驗(yàn)對(duì)包被原及抗體工作濃度和甲醇濃度進(jìn)行優(yōu)化后,建立了基于單鏈抗體的3-PBA間接競爭ELISA檢測方法,計(jì)算得到的抗體抑制中濃度（I50）為0.55 μg/mL,方法的線性檢測范圍（I20-I80）在0.15-2.64 μg/mL之間,最低檢測限（110）為0.05μg/mL,3-PBA單鏈抗體的靈敏度比其母本單克隆抗體有所提高。單鏈抗體對(duì)甲氰菊酯、高效氯氰菊酯和氰戊菊酯僅有0.56%-1.15%的交叉反應(yīng),但對(duì)3-苯氧基苯甲醛和3-苯氧基苯甲醇的交叉反應(yīng)率高達(dá)93.22%和87.30%,單鏈抗體也可用于這兩種菊酯代謝物的快速篩查檢測。單鏈抗體在4℃保存的半衰期在14-21天之間,-20℃和-80℃下保存3個(gè)月未發(fā)現(xiàn)結(jié)合信號(hào)下降,具有較好的穩(wěn)定性。通過對(duì)自來水樣的添加回收試驗(yàn),ELISA法的平均回收率在83%-96%之間,平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別在1.78%-8.54%和4.65%-10.56%之間,與HPLC法的相關(guān)性R2為0.9892。該方法有潛力替代色譜法用于水體等環(huán)境樣品中3-PBA的快速篩查檢測。（4）基于鏈替換技術(shù)的Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體的構(gòu)建與篩選通常從非免疫抗體庫中直接篩選抗獨(dú)特型抗體,得到的陽性克隆數(shù)量較少甚至無法獲得。實(shí)驗(yàn)室前期從人源半合成抗體庫（Tomlinson Ⅰ庫）中篩選得到兩株蘇云金芽孢桿菌（Bt）Cry2Aa毒素的抗獨(dú)特型單鏈抗體（B10和F2）。為了獲得更多的抗獨(dú)特型單鏈抗體,本研究以B10、F2為模板,采用鏈替換技術(shù),分別構(gòu)建了庫容為1.4×106和1.2×106的Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體的重鏈和輕鏈替換庫。通過多克隆噬菌體ELISA分析發(fā)現(xiàn),輕鏈替換庫的整體親和力是重鏈替換庫的4.2倍。試驗(yàn)用Cry2Aa多抗為篩選抗原,分別對(duì)重、輕鏈替換庫進(jìn)行了 1輪篩選,篩選陽性率分別為13.6%和57.4%,經(jīng)過測序最終獲得1個(gè)重鏈替換突變體和6個(gè)輕鏈替換突變體。試驗(yàn)采用競爭性噬菌體ELISA測定了突變體與篩選抗原的表觀親和力,其中最佳克隆MUT10的表觀親和力為1.42×106 M-1。競爭抑制試驗(yàn)表明,100 μg/mL的Cry2Aa對(duì)MUT10和Cry2Aa多克隆抗體的結(jié)合最高可產(chǎn)生30.1%抑制,50 μL的MUT10培養(yǎng)上清對(duì)Cry2Aa與其多抗產(chǎn)生了46.7%的抑制。MUT10為部分抑制型抗獨(dú)特型抗體,模擬了 Cry2Aa毒素的部分結(jié)構(gòu)特征。本研究為Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體的生物活性測定提供了基礎(chǔ)材料。（5）Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體對(duì)小菜蛾生物活性的初步分析本研究在前期獲得Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體的基礎(chǔ)上,測試和比較了Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體對(duì)常見鱗翅目靶標(biāo)害蟲小菜蛾的生物活性。試驗(yàn)首先采用ELISA法測定了 Cry2Aa與小菜蛾刷狀緣膜囊泡（BBMV）的結(jié)合曲線,通過Scatchard模型回歸分析,計(jì)算得到的表觀結(jié)合親和力為266.6nmol/L。同時(shí)用ELISA法測定了 9種Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體與小菜蛾BBMV的結(jié)合活性,結(jié)果表明抗獨(dú)特型單鏈抗體MUT10與BBMV存在最高的特異性結(jié)合。試驗(yàn)利用浸葉法測定了 Cry2Aa對(duì)小菜蛾的半數(shù)致死濃度（LC50）為27.90 μg/mL,而107cfu/mLMUT10對(duì)小菜蛾的矯正死亡率為12.8%。試驗(yàn)用Ligand blot分析了 Cry2Aa、MUT10與小菜蛾BBMV的結(jié)合蛋白,并對(duì)245 kDa上方的一條共同結(jié)合條帶進(jìn)行了 LC-MS/MS分析。結(jié)果表明,該條帶酶解后得到ATYSEGPNGSVR片段,通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析,匹配到一個(gè)分子量為332kDa的小菜蛾未鑒定蛋白,其功能注釋為脂質(zhì)運(yùn)載蛋白。本研究為Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體對(duì)小菜蛾作用機(jī)理的闡明提供了有益數(shù)據(jù)。本研究構(gòu)建了多種擬除蟲菊酯農(nóng)藥共性代謝產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸的新型抗體識(shí)別分子,建立了其免疫學(xué)分析方法,獲得了抗體信息學(xué)數(shù)據(jù),闡明了其結(jié)合模式。另外,試驗(yàn)構(gòu)建并篩選了能模擬Cry2Aa毒素部分結(jié)構(gòu)特征的抗獨(dú)特型單鏈抗體,開展了 Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體對(duì)小菜蛾生物活性的比較研究,探索了殺蟲蛋白資源創(chuàng)制的新思路。
祝婧雯[10]（2018）在《基于噬菌體展示技術(shù)篩選高親和力兔源HER2單鏈抗體》文中提出研究目的:獲得兔源HER2抗體的重鏈與輕鏈基因,合成單鏈抗體ScFv,通過噬菌體侵染構(gòu)建完整的噬菌體單鏈抗體庫。分別使用酶標(biāo)板包被抗原與HER2陽性乳腺癌組織切片免疫組化兩種方法篩選高親和力HER2抗體,從特異性抗體庫的富集倍數(shù)與陽性率兩個(gè)方面比較兩種方法篩選效果,探究以組織切片作為固相載體在噬菌體文庫篩選方面的應(yīng)用。研究方法:使用HER2蛋白免疫新西蘭大白兔,提取脾臟總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)兔源簡并引物,以cDNA為模板PCR擴(kuò)增出HER2抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因序列,引入Linker隨機(jī)拼接二者獲得ScFv片段。通過雙酶切及定向克隆技術(shù)獲得pCANTAB5e-ScFv重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞;以輔助噬菌體M13K07侵染轉(zhuǎn)化后的宿主菌TG1,從而構(gòu)建兔抗HER2單鏈抗體噬菌體文庫。分別使用酶標(biāo)板包被抗原與HER2陽性乳腺癌組織切片免疫組化兩種方法,依照“吸附-洗脫-擴(kuò)增”流程進(jìn)行篩選,經(jīng)過5輪篩選獲得終極抗體庫,菌液PCR鑒定陽性克隆,Phage-Elisa鑒定重組抗體親和力。通過Immunoglobulin（IG）及Nucleotide BLAST分析軟件對(duì)所獲得重鏈、輕鏈基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、成功提取脾臟總RNA,VH、VL拼接獲得完整ScFv基因。2、構(gòu)建的兔源HER2單鏈抗體庫庫容為1.68×106,重組率為83.3%。3、使用兩種方法,經(jīng)過5輪淘篩,產(chǎn)率逐漸升高,特異性噬菌體得到了有效富集,酶標(biāo)板作為固相載體篩選的抗體庫特異性增長了約105倍,HER2陽性乳腺癌組織切片作為固相載體篩選的抗體庫特異性增長了 4180倍。4、HER2組織切片篩選出的特異性抗體庫陽性率為60%,也高于酶標(biāo)板篩選出的特異性抗體庫25%的陽性率。對(duì)比富集倍數(shù)及陽性率,組織切片作為固相載體淘篩噬菌體庫效果更好。5、選取兩株反應(yīng)較好的陽性克隆測序,所獲得重鏈可變區(qū)基因與兔源抗體基因同源性為95.4%,輕鏈可變區(qū)基因同源性為91.4%,二者皆屬于V1基因家族,序列結(jié)構(gòu)完整。結(jié)論:成功構(gòu)建大容量的兔源HER2單鏈抗體庫,篩選出親和力較高的特異性抗體,組織切片作為噬菌體展示文庫的固相載體、免疫組化篩選方法可行,且篩選效果比酶標(biāo)板篩選更好。
二、兔抗M13噬菌體酶標(biāo)抗體的制備（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、兔抗M13噬菌體酶標(biāo)抗體的制備（論文提綱范文）
（1）抗非洲豬瘟病毒豬源單鏈抗體噬菌體文庫的構(gòu)建及抗體的篩選（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 非洲豬瘟病毒研究進(jìn)展 |
| 1.1.1 非洲豬瘟疫情 |
| 1.1.2 基因組特征及主要蛋白 |
| 1.1.3 診斷與防控 |
| 1.2 單鏈抗體研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 抗體的結(jié)構(gòu)和功能 |
| 1.2.2 抗體制備技術(shù)的發(fā)展 |
| 1.2.3 單鏈抗體的研發(fā)優(yōu)勢(shì) |
| 1.2.4 單鏈抗體表達(dá)系統(tǒng) |
| 1.3 噬菌體庫展示技術(shù) |
| 1.3.1 噬菌體展示技術(shù)原理 |
| 1.3.2 噬菌體展示系統(tǒng)分類 |
| 1.4 目的及意義 |
| 第二章 豬源單鏈抗體噬菌體文庫的構(gòu)建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.2.1 質(zhì)粒與菌株 |
| 2.2.2 引物 |
| 2.2.3 常用試劑 |
| 2.2.4 實(shí)驗(yàn)溶液配制 |
| 2.2.5 儀器設(shè)備 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.3.1 豬外周血淋巴細(xì)胞分離 |
| 2.3.2 淋巴細(xì)胞總RNA提取 |
| 2.3.3 反轉(zhuǎn)錄 |
| 2.3.4 PCR擴(kuò)增目的基因 |
| 2.3.5 PCR產(chǎn)物的純化與回收 |
| 2.3.6 “T-A”克隆鑒定 |
| 2.3.7 質(zhì)粒提取 |
| 2.3.8 重組載體p HEN-2-ScFv的制備 |
| 2.3.9 感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.3.10 ScFv噬菌體文庫的構(gòu)建 |
| 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.4.1 RNA提取及c DNA合成 |
| 2.4.2 VH、VL基因擴(kuò)增 |
| 2.4.3 VH-linker、linker-VL基因擴(kuò)增 |
| 2.4.4 ScFv基因擴(kuò)增拼接 |
| 2.4.5 ScFv的“T-A”克隆鑒定 |
| 2.4.6 噬菌體文庫的構(gòu)建 |
| 2.5 討論 |
| 第三章 抗ASFV單鏈抗體的篩選及鑒定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.2.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞 |
| 3.2.2 常用試劑 |
| 3.2.3 實(shí)驗(yàn)溶液配制 |
| 3.2.4 儀器設(shè)備 |
| 3.3 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.3.1 抗ASFV特異性文庫的篩選 |
| 3.3.2 蛋白的表達(dá)與純化 |
| 3.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) |
| 3.3.4 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn) |
| 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 3.4.1 噬菌體文庫的篩選 |
| 3.4.2 篩選單克隆初步ELISA檢測 |
| 3.4.3 ScFv抗體蛋白的表達(dá)與優(yōu)化 |
| 3.4.4 ScFv抗體蛋白的純化 |
| 3.4.5 ELISA分析ScFv蛋白反應(yīng)活性 |
| 3.4.6 IFA驗(yàn)證ScFv蛋白反應(yīng)活性 |
| 3.5 討論 |
| 第四章 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 作者簡歷 |
（2）我國優(yōu)勢(shì)種海蛇毒多組學(xué)分析、抗毒血清制備以及毒腺中活性組分淘選（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 前言 |
| 第一部分 我國兩種優(yōu)勢(shì)種海蛇毒多組學(xué)比較分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 討論 |
| 第二部分 抗平頦海蛇毒血清的制備及抗毒效果評(píng)價(jià) |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 討論 |
| 第三部分 平頦海蛇毒腺中活性組分的淘選與效應(yīng)分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 討論 |
| 全文總結(jié) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 文獻(xiàn)綜述 蛇毒中活性組分的研究進(jìn)展 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況 |
| 致謝 |
（3）雞柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白3特異親和肽抑制蟲體入侵宿主細(xì)胞研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 雞球蟲概述 |
| 1.1.1 雞球蟲的種類 |
| 1.1.2 雞球蟲的生活史 |
| 1.1.3 雞球蟲病的臨床危害及入侵機(jī)制 |
| 1.2 雞球蟲抗原蛋白的研究進(jìn)展 |
| 1.2.1 表面抗原 |
| 1.2.2 雞柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白的研究 |
| 1.3 噬菌體展示技術(shù)的研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 噬菌體展示技術(shù)的基本原理 |
| 1.3.2 噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用 |
| 1.4 計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)的原理和相關(guān)應(yīng)用 |
| 1.4.1 同源建模 |
| 1.4.2 分子對(duì)接 |
| 1.5 研究的目的和意義 |
| 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和蟲種 |
| 2.1.2 菌種、載體與細(xì)胞株 |
| 2.1.3 主要試劑 |
| 2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)參照物 |
| 2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法 |
| 2.1.6 儀器設(shè)備 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 p ET-30a-Et MIC3-BC1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 2.2.2 重組質(zhì)粒p ET-30a-Et MIC3-BC1 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.2.3 Et MIC3-BC1 重組蛋白的純化回收及復(fù)性 |
| 2.2.4 多克隆抗血清的制備及其鑒定 |
| 2.2.5 噬菌體隨機(jī)十二肽庫對(duì)Et MIC3-BC1 蛋白親和配體的生物淘選 |
| 2.2.6 結(jié)合克隆的特征鑒定 |
| 2.2.7 親和噬菌體氨基酸序列的推導(dǎo)及合成 |
| 2.2.8 ELISA檢測親和噬菌體與重組Et MIC3-BC1 蛋白及蟲體Et MIC3 蛋白結(jié)合情況 |
| 2.2.9 體外檢測合成多肽抑制E.tenella子孢子入侵細(xì)胞的能力 |
| 2.2.10 體內(nèi)檢測多肽對(duì)應(yīng)陽性噬菌體抗球蟲保護(hù)作用 |
| 2.2.11 利用同源模建和分子對(duì)接分析Et MIC3-BC1與A肽、D肽、W肽的結(jié)合 |
| 2.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 |
| 3 結(jié)果 |
| 3.1 重組質(zhì)粒p ET30a-Et MIC3-BC1 的構(gòu)建 |
| 3.1.1 Et MIC3-BC1 基因的PCR鑒定 |
| 3.1.2 重組質(zhì)粒p ET30a-Et MIC3-BC1 PCR鑒定 |
| 3.1.3 Et MIC3-BC1 重組蛋白的原核表達(dá)與純化 |
| 3.2 Et MIC3-BC1 多克隆抗血清的效價(jià)和特異性測定 |
| 3.3 Et MIC3-BC1 重組蛋白親和配體的生物篩選 |
| 3.3.1 Et MIC3-BC1 重組蛋白對(duì)噬菌體十二肽庫的四輪篩選和滴度測定 |
| 3.3.2 親和噬菌體的ELISA鑒定 |
| 3.3.3 測定親和噬菌體的序列 |
| 3.4 多肽親和力的檢測 |
| 3.4.1 ELISA法檢測親和噬菌體與Et MIC3-BC1 的結(jié)合情況 |
| 3.4.2 Et MIC3-BC1 多抗競爭抑制親和噬菌體與Et MIC3-BC1 重組蛋白的結(jié)合 |
| 3.4.3 ELISA檢測蟲體Et MIC3 蛋白與親和噬菌體的結(jié)合 |
| 3.5 所篩選多肽對(duì)E.tenella子孢子入侵的體外抑制作用 |
| 3.5.1 E.tenella子孢子的純化及其熒光標(biāo)記 |
| 3.5.2 多肽濃度的確定 |
| 3.5.3 Et MC3-BC1 多克隆抗體抑制E.tenella子孢子入侵MDBK細(xì)胞 |
| 3.5.4 多肽對(duì)E.tenella子孢子入侵MDBK細(xì)胞的抑制 |
| 3.6 A、D、W肽體內(nèi)抑制E.tenella子孢子入侵分析 |
| 3.6.1 體重增重變化 |
| 3.6.2 球蟲感染后盲腸病變計(jì)分 |
| 3.6.3 卵囊排出減少率 |
| 3.6.4 抗球蟲指數(shù)(ACI) |
| 3.6.5 盲腸病理學(xué)變化 |
| 3.7 同源建模和分子對(duì)接展示 A、D、W 肽和 Et MIC3-BC1 的結(jié)合 |
| 3.7.1 同源建模 |
| 3.7.2 分子對(duì)接 |
| 4 討論 |
| 4.1 Et MIC3-BC1 蛋白表達(dá) |
| 4.2 抗 EtMIC3-BC1 多克隆抗體的制備及其活性檢測 |
| 4.3 Et MIC3-BC1 親和肽的篩選與鑒定 |
| 4.4 體外評(píng)價(jià)所選親和肽抑制E.tenella子孢子入侵細(xì)胞的能力 |
| 4.5 體內(nèi)評(píng)價(jià)親和噬菌體抑制E.tenella子孢子入侵細(xì)胞的能力 |
| 4.6 利用同源建模以及分子對(duì)接分析 A、D、W 肽與 Et MIC3-BC1 的結(jié)合 |
| 5 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 |
（4）TIM-3單克隆抗體制備及人源化小鼠構(gòu)建（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 緒論 |
| 第一節(jié) 腫瘤治療研究現(xiàn)狀 |
| 1.1 腫瘤免疫治療 |
| 1.2 免疫檢查點(diǎn) |
| 1.3 T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3) |
| 第二節(jié) 單克隆抗體的發(fā)展及應(yīng)用 |
| 2.1 雜交瘤技術(shù)與噬菌體展示技術(shù) |
| 2.2 單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù) |
| 第三節(jié) CRISPR基因編輯技術(shù) |
| 第一章 人源TIM-3(aa22-202)蛋白表達(dá) |
| 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.1 H-TIM3(aa22-202)Bac-to-Bac昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 2.2 Bacmid轉(zhuǎn)染及病毒收獲 |
| 2.3 H-TIM3(aa22-202)蛋白表達(dá)及檢測 |
| 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 |
| 3.1 Bacmid載體構(gòu)建 |
| 3.2 H-TIM3(aa22-202)蛋白蛋白印跡鑒定結(jié)果 |
| 第二章 兔抗人TIM3 單克隆抗體的制備及鑒定 |
| 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 實(shí)驗(yàn)兔蛋白免疫及鑒定 |
| 2.2.2 陽性B細(xì)胞流式分選及培養(yǎng)鑒定 |
| 2.2.3 H-TIM3 單抗表達(dá)載體構(gòu)建及初步篩選 |
| 2.2.4 H-TIM3 單抗初步篩選及純化 |
| 2.2.5 H-TIM3 單抗蛋白層面特異性鑒定 |
| 2.2.6 流式檢測H-TIM3 單抗細(xì)胞表面特異性識(shí)別 |
| 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 動(dòng)物免疫后血清抗體效價(jià)鑒定 |
| 2.3.2 流式分選陽性B細(xì)胞 |
| 2.3.3 B細(xì)胞培養(yǎng)抗體檢測 |
| 2.3.4 單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)調(diào)取 |
| 2.3.5 單克隆抗體蛋白層面特異性鑒定 |
| 2.3.6 H-TIM3 單克隆抗體親和性鑒定 |
| 2.3.7 H-TIM3 單克隆抗體細(xì)胞表面特異識(shí)別 |
| 第三章 人源化TIM3 細(xì)胞/小鼠模型構(gòu)建 |
| 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 |
| 第四章 總結(jié) |
| 附錄1 |
| 附錄2 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果 |
| 致謝 |
| 索引 |
| 個(gè)人簡歷 |
（5）人源化半合成納米抗體文庫的構(gòu)建及CD47納米抗體的研制（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 緒論 |
| 1.1 噬菌體與噬菌體抗體庫展示技術(shù) |
| 1.2 納米抗體 |
| 1.3 CD47分子與配體SIRPα的結(jié)構(gòu)特征及免疫調(diào)節(jié)功能 |
| 1.4 立題依據(jù)與研究內(nèi)容 |
| 第2章 人源化半合成納米抗體文庫的構(gòu)建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 試劑、酶及儀器 |
| 2.2.2 載體、菌種、培養(yǎng)基及溶液 |
| 2.2.3 VHH全長模板及引物設(shè)計(jì) |
| 2.2.4 人源化VHH噬菌體展示庫全長載體的構(gòu)建 |
| 2.2.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳 |
| 2.2.6 PCR產(chǎn)物的膠回收 |
| 2.2.7 回收產(chǎn)物的磷酸化處理 |
| 2.2.8 磷酸化產(chǎn)物的連接 |
| 2.2.9 TG1電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.2.10 TG1感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.11 單克隆的挑取及菌落PCR檢驗(yàn) |
| 2.2.12 測序結(jié)果分析及庫容計(jì)算 |
| 2.2.13 納米抗體文庫的保存 |
| 2.3 結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 VHH噬菌體展示庫全長DNA的線性PCR產(chǎn)物及回收后連接結(jié)果的鑒定 |
| 2.3.2 VHH噬菌體展示庫隨機(jī)克隆測序及氨基酸序列比對(duì)分析 |
| 2.3.3 VHH噬菌體展示庫庫容量的計(jì)算 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第3章 CD47及SIRP α抗原的制備 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 試劑、酶及儀器 |
| 3.2.2 載體、菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基及溶液 |
| 3.2.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的大抽制備 |
| 3.2.4 CD47Fc、CD47his及SIRPα-Fc抗原蛋白在293F細(xì)胞中的瞬轉(zhuǎn)表達(dá) |
| 3.2.5 抗原蛋白的親和層析 |
| 3.2.6 抗原蛋白SDS-PAGE電泳 |
| 3.2.7 抗原蛋白溶液的超濾濃縮 |
| 3.2.8 抗原蛋白濃度測定 |
| 3.3 結(jié)果與討論 |
| 3.3.1 大抽質(zhì)粒濃度的測定 |
| 3.3.2 CD47Fc、SIRPα-Fc及CD47his抗原蛋白的真核表達(dá)及親和純化 |
| 3.3.3 抗原蛋白濃度測定 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第4章 CD47納米抗體的淘選 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 試劑、酶及儀器 |
| 4.2.2 載體、菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基及溶液 |
| 4.2.3 M13K07輔助噬菌體的擴(kuò)增制備 |
| 4.2.4 噬菌體納米抗體庫的包裝制備 |
| 4.2.5 納米抗體的淘選 |
| 4.2.6 抗體庫富集程度的ELISA檢測 |
| 4.2.7 單克隆的ELISA篩選 |
| 4.2.8 陽性克隆測序及序列分析 |
| 4.2.9 陽性克隆噬菌體抗體的包裝 |
| 4.2.10 陽性克隆的親和力測定 |
| 4.3 結(jié)果與討論 |
| 4.3.1 M13K07輔助噬菌體的制備及滴度測定 |
| 4.3.2 噬菌體納米抗體庫的包裝制備 |
| 4.3.3 CD47納米抗體的淘選 |
| 4.3.4 陽性單克隆的篩選 |
| 4.3.5 陽性克隆序列分析 |
| 4.3.6 陽性克隆親和力的測定 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第5章 CD47納米抗體的表達(dá)及免疫阻斷活性檢測 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 試劑、酶及儀器 |
| 5.2.2 載體、菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基及溶液 |
| 5.2.3 大腸桿菌CD47VHH陽性克隆表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 5.2.4 大腸桿菌DH5α與BL21超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 |
| 5.2.5 大腸桿菌系統(tǒng)的原核分泌表達(dá)及周質(zhì)蛋白的滲透休克法提取 |
| 5.2.6 VHH蛋白的鎳柱親和純化 |
| 5.2.7 同源重組法構(gòu)建pPIC9K-CD47VHH-3-5表達(dá)質(zhì)粒 |
| 5.2.8 畢赤酵母重組表達(dá)載體的線性化及回收 |
| 5.2.9 畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 5.2.10 線性載體質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 |
| 5.2.11 G418篩選高表達(dá)菌株 |
| 5.2.12 陽性酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 5.2.13 流式細(xì)胞儀檢測VHH納米抗體的免疫阻斷活性 |
| 5.3 結(jié)果與討論 |
| 5.3.1 大腸桿菌CD47VHH陽性克隆表達(dá)載體的構(gòu)建及BL21表達(dá)菌的轉(zhuǎn)化 |
| 5.3.2 CD47VHH-3-5his在使用不同培養(yǎng)基時(shí)周質(zhì)的表達(dá)及提取情況。 |
| 5.3.3 CD47VHH-3-5his與CD47VHH-3-91his在BL21宿主菌周質(zhì)中的表達(dá) |
| 5.3.4 CD47VHH-3-5his于不同溫度以及培養(yǎng)基中葡萄糖含量時(shí)在BL21中的表達(dá)情況 |
| 5.3.5 CD47VHH-3-5his于不同溫度及培養(yǎng)基葡萄糖含量時(shí)在TG1中的表達(dá)情況 |
| 5.3.6 CD47VHH-3-91his在不同溫度下的表達(dá)情況 |
| 5.3.7 VHH蛋白的親和純化 |
| 5.3.8 畢赤酵母pPIC9K-CD47VHH-3-5質(zhì)粒和空載體的線性化酶切 |
| 5.3.9 轉(zhuǎn)化的GS115-pPIC9K-CD47VHH-3-5在MD和G418平板上的生長情況 |
| 5.3.10 納米抗體CD47VHH-3-5在畢赤酵母GS115中的表達(dá)情況 |
| 5.3.11 流式細(xì)胞儀檢測CD47VHH的免疫阻斷活性 |
| 5.4 本章小結(jié) |
| 第6章 結(jié)論與展望 |
| 6.1 結(jié)論 |
| 6.2 創(chuàng)新點(diǎn) |
| 6.3 展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 博士在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)成果 |
（6）B細(xì)胞成熟抗原特異性單域抗體的篩選制備和鑒定（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略語表 |
| 1 引言 |
| 1.1 B細(xì)胞成熟抗原概述 |
| 1.1.1 B細(xì)胞成熟抗原 |
| 1.1.2 B細(xì)胞成熟抗原的配體 |
| 1.1.3 B細(xì)胞成熟抗原與B細(xì)胞 |
| 1.1.4 B細(xì)胞成熟抗原與多發(fā)性骨髓瘤 |
| 1.2 噬菌體展示技術(shù) |
| 1.2.1 噬菌體 |
| 1.2.2 噬菌體庫的發(fā)展 |
| 1.2.3 噬菌體和噬菌體庫 |
| 1.2.4 噬菌體庫與輔助噬菌體 |
| 1.2.5 陽性克隆篩選 |
| 1.2.6 噬菌體抗體庫 |
| 1.3 單域抗體 |
| 1.4 研究目的及意義 |
| 1.5 研究內(nèi)容 |
| 2 試驗(yàn)一 BCMA蛋白特異性噬菌體抗體庫的構(gòu)建及sdAb的富集與篩選 |
| 2.1 試驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 試驗(yàn)試劑 |
| 2.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 |
| 2.1.3 主要培養(yǎng)基及緩沖液配制方法 |
| 2.1.4 試驗(yàn)儀器和設(shè)備 |
| 2.2 試驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 噬菌體抗體庫的構(gòu)建 |
| 2.2.2 BCMA蛋白特異性sdAb的富集和篩選 |
| 2.3 結(jié)果 |
| 2.3.1 BCMA免疫后血清抗體效價(jià)測定結(jié)果 |
| 2.3.2 前導(dǎo)肽至CH2區(qū)PCR 一輪擴(kuò)增 |
| 2.3.3 VHH PCR二輪擴(kuò)增結(jié)果 |
| 2.3.4 VHH酶切試驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.5 BCMA噬菌體抗體庫庫容、多樣性測定結(jié)果 |
| 2.3.6 噬菌體抗體庫篩選結(jié)果 |
| 2.4 討論 |
| 3 試驗(yàn)二 BCMA特異性單域抗體的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定 |
| 3.1 試驗(yàn)材料及儀器 |
| 3.1.1 試驗(yàn)材料 |
| 3.1.2 試驗(yàn)儀器和設(shè)備 |
| 3.1.3 主要培養(yǎng)基及緩沖液配制方法 |
| 3.2 試驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 3.2.2 重組VHH-pET-25b-SBP蛋白的表達(dá)及純化 |
| 3.2.3 BCMA蛋白特異性sdAb的鑒定 |
| 3.2.4 BCMA蛋白特異性sdAb抗原結(jié)合特性鑒定 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 VHH-pCANTAB5E酶切和pET-25b-SBP質(zhì)粒酶切結(jié)果 |
| 3.3.2 重組質(zhì)粒菌落鑒定結(jié)果 |
| 3.3.3 SDS-PAGE |
| 3.3.4 Western-blot |
| 3.3.5 BCMA蛋白特異性sdAb抗原結(jié)合活性的ELISA鑒定結(jié)果 |
| 3.4 討論 |
| 4 結(jié)論 |
| 致謝 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 作者簡介 |
（7）重組噬菌體對(duì)沙眼衣原體作用及機(jī)制的探索（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 縮略語/符號(hào)說明 |
| 前言 |
| 研究現(xiàn)狀與成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、重組M13噬菌體對(duì)沙眼衣原體作用及機(jī)制的初探 |
| 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 1.1.1 載體、菌株,細(xì)胞株,衣原體株 |
| 1.1.2 試劑耗材 |
| 1.1.3 主要培養(yǎng)基的配制 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.1.5 儀器與耗材 |
| 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.2.1 大腸桿菌ER2738的擴(kuò)增儲(chǔ)備 |
| 1.2.2 感受態(tài)細(xì)胞ER2738的制備 |
| 1.2.3 重組M13噬菌體的構(gòu)建與純化 |
| 1.2.4 Hela細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 1.2.5 沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng) |
| 1.2.6 衣原體GPIC株的培養(yǎng) |
| 1.2.7 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測重組M13噬菌體對(duì)細(xì)胞毒性 |
| 1.2.8 Hela細(xì)胞對(duì)攜帶有RGD的重組M13噬菌體的攝取 |
| 1.2.9 重組M13噬菌體對(duì)沙眼衣原體及Hela細(xì)胞的作用 |
| 1.2.10 重組M13-RGD-IN5噬菌體感染沙眼衣原體后的實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR) |
| 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 1.3.1 重組M13噬菌體的構(gòu)建 |
| 1.3.2 衣原體的增量培養(yǎng)和EB的粗略純化 |
| 1.3.3 重組M13-RGD-IN5噬菌體對(duì)沙眼衣原體和GPIC的作用 |
| 1.3.4 重組M13-RGD-IN5噬菌體在Hela細(xì)胞中是不增殖的 |
| 1.4 討論 |
| 1.5 實(shí)驗(yàn)小結(jié) |
| 二、重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)沙眼衣原體作用及機(jī)制的初探 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 載體、菌株,細(xì)胞株,衣原體株 |
| 2.1.2 試劑耗材 |
| 2.1.3 主要培養(yǎng)基的配制 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 儀器與耗材 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 PUC-Phi CPG1-Kna質(zhì)粒的擴(kuò)增 |
| 2.2.2 重組pGFP-PhiCPG1衣原體噬菌體的構(gòu)建 |
| 2.2.3 Infusion產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.4 pGFP-PhiCPG1單克隆菌落的挑取、擴(kuò)增與質(zhì)粒提取 |
| 2.2.5 重組pGFP-PhiCPG1質(zhì)粒的驗(yàn)證 |
| 2.2.6 Hela細(xì)胞和McCoy細(xì)胞細(xì)胞的培養(yǎng) |
| 2.2.7 沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng)與純化 |
| 2.2.8 衣原體GPIC株的培養(yǎng)與純化 |
| 2.2.9 CaCl2法進(jìn)行重組pGFP-PhiCPG1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 |
| 2.2.10 重組pGFP-PhiCPG1噬菌體的純化 |
| 2.2.11 重組pGFP-PhiCPG1噬菌體的DNA提取 |
| 2.2.12 重組pGFP-PhiCPG1噬菌體的驗(yàn)證 |
| 2.2.13 轉(zhuǎn)化的重組pGFP-PhiCPG1噬菌體隨傳代次數(shù)增加的增殖情況 |
| 2.2.14 純化的重組pGFP-PhiCPG1噬菌體的定量 |
| 2.2.15 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)細(xì)胞的毒性 |
| 2.2.16 重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)沙眼衣原體的作用及機(jī)制的初探 |
| 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.3.1 重組質(zhì)粒pGFP-PhiCPG1的構(gòu)建 |
| 2.3.2 衣原體GPIC增量培養(yǎng)和EB的純化 |
| 2.3.3 重組pGFP-PhiCPG1噬菌體的驗(yàn)證 |
| 2.3.4 重組pGFP-PhiCPG1噬菌體的增殖 |
| 2.3.5 不同濃度的重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)沙眼衣原體及GPIC的作用 |
| 2.3.6 CCK-8 檢測重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)Hela的毒性 |
| 2.3.7 重組pGFP-PhiCPG1噬菌體在衣原體發(fā)育周期的不同階段對(duì)衣原體感染的作用 |
| 2.3.8 透射電子顯微鏡觀察重組pGFP-PhiCPG1噬菌體對(duì)沙眼衣原體的作用 |
| 2.4 討論 |
| 2.5 小結(jié) |
| 全文結(jié)論 |
| 論文創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 發(fā)表論文和參加科研情況說明 |
| 綜述 |
| 綜述參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡歷 |
（8）M13重組噬菌體的鑒定及其對(duì)沙眼衣原體和豚鼠嗜衣原體的作用（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符號(hào)說明 |
| 前言 |
| 研究現(xiàn)狀、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、重組噬菌體鑒定及其效價(jià)檢測 |
| 1.1 對(duì)象和方法 |
| 1.1.1 噬菌體、細(xì)菌、細(xì)胞 |
| 1.1.2 試劑及液體配置 |
| 1.1.3 儀器及耗材 |
| 1.1.4 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 1.2 結(jié)果 |
| 1.2.1 噬菌體滴度測定 |
| 1.2.2 重組噬菌體的鑒定 |
| 1.3 討論 |
| 1.3.1 重組噬菌體展示系統(tǒng)的挑選 |
| 1.3.2 重組噬菌體插入片段的選擇 |
| 1.3.3 重組噬菌體的篩選、擴(kuò)增 |
| 1.4 小結(jié) |
| 二、重組噬菌體對(duì)E型沙眼衣原體和豚鼠嗜衣原體的抑制作用 |
| 2.1 對(duì)象和方法 |
| 2.1.1 菌株、細(xì)胞株、沙眼衣原體、噬菌體 |
| 2.1.2 試劑及液體配置 |
| 2.1.3 儀器與耗材 |
| 2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2 結(jié)果 |
| 2.2.1 沙眼衣原體的純化與定量 |
| 2.2.2 豚鼠嗜衣原體的純化與定量 |
| 2.2.3 豚鼠嗜衣原體EB多克隆抗體效價(jià)和特異性檢測 |
| 2.2.4 噬菌體對(duì)Hela細(xì)胞的毒性作用 |
| 2.2.5 重組噬菌體對(duì)衣原體的作用 |
| 2.2.6 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察重組噬菌體的定位情況 |
| 2.2.7 在干預(yù)不同時(shí)段噬菌體效價(jià)測定 |
| 2.3 討論 |
| 2.3.1 細(xì)胞增殖-毒性檢測 |
| 2.3.2 衣原體EB多克隆抗體制備 |
| 2.3.3 M13-IN5 重組噬菌體在細(xì)胞中的定位 |
| 2.3.4 M13-IN5 重組噬菌體對(duì)沙眼衣原體和豚鼠嗜衣原體作用檢測 |
| 2.4 小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 發(fā)表論文和參加科研情況說明 |
| 綜述 沙眼衣原體持續(xù)感染 |
| 綜述參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 個(gè)人簡歷 |
（9）基于抗體的擬除蟲菊酯農(nóng)藥代謝物分析和Cry2Aa毒素分子模擬研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 縮略詞 |
| 第一章 文獻(xiàn)綜述 |
| 1 天然抗體的結(jié)構(gòu)、類型與多樣性的產(chǎn)生 |
| 1.1 天然抗體的結(jié)構(gòu)與類型 |
| 1.2 天然抗體多樣性的產(chǎn)生 |
| 2 抗體的制備 |
| 2.1 多克隆抗體技術(shù) |
| 2.2 單克隆抗體技術(shù) |
| 2.3 重組抗體技術(shù) |
| 3 抗體在農(nóng)藥殘留免疫分析領(lǐng)域的應(yīng)用 |
| 3.1 農(nóng)藥抗體 |
| 3.2 抗體標(biāo)記物與檢測形式 |
| 4 抗體在抗原分子模擬中的應(yīng)用 |
| 4.1 抗獨(dú)特型抗體的原理與類型 |
| 4.2 抗獨(dú)特型抗體與生物受體 |
| 4.3 抗獨(dú)特型抗體模擬抗原結(jié)合活性及生物活性 |
| 5 選題依據(jù)及研究內(nèi)容 |
| 5.1 3-苯氧基苯甲酸免疫分析技術(shù)研究 |
| 5.2 Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體的構(gòu)建、篩選及其生物活性研究 |
| 5.3 研究內(nèi)容 |
| 第二章 3-苯氧基苯甲酸膠體金免疫層析法的建立 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1試驗(yàn)材料、試劑及儀器 |
| 1.2 腹水的制備與純化 |
| 1.3 純化單抗效價(jià)和抑制中濃度的測定 |
| 1.4 膠體金的制備 |
| 1.5 金標(biāo)抗體的制備 |
| 1.6 檢測線濃度和膠體金噴膜量的優(yōu)化 |
| 1.7 試紙的組裝 |
| 1.8 免疫層析試紙檢測流程、檢測的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)和檢測閾值確定 |
| 1.9 水樣檢測 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 腹水的制備、純化與性能分析 |
| 2.2 膠體金的鑒定與最佳抗體標(biāo)記濃度的確定 |
| 2.3 檢測線濃度和金標(biāo)抗體噴膜量的優(yōu)化 |
| 2.4 免疫層析試紙檢測閾值的確定及水樣的檢測 |
| 3 討論 |
| 3.1 免疫層析法的主要優(yōu)勢(shì) |
| 3.2 免疫層析法的靈敏度與適用性 |
| 3.3 免疫層析法的選擇性 |
| 4 結(jié)論 |
| 第三章 3-苯氧基苯甲酸單鏈抗體的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器 |
| 1.2 總RNA的提取 |
| 1.3 cDNA第一鏈的合成 |
| 1.4 抗體VH和Vκ基因擴(kuò)增及拼接 |
| 1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建與化轉(zhuǎn) |
| 1.6 單鏈抗體的小量表達(dá)與活性驗(yàn)證 |
| 1.7 ELISA |
| 1.8 Western blot |
| 1.9 單鏈抗體的理化性質(zhì)預(yù)測 |
| 1.10 IMGT數(shù)據(jù)庫對(duì)單鏈抗體的序列分析 |
| 1.11 單鏈抗體同源建模與分子對(duì)接 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 總RNA提取 |
| 2.2 VH和Vκ基因的擴(kuò)增、拼接和表達(dá)載體構(gòu)建 |
| 2.3 單鏈抗體在宿主菌中的初步表達(dá)定位和活性驗(yàn)證 |
| 2.4 單鏈抗體的理化性質(zhì)預(yù)測 |
| 2.5 IMGT數(shù)據(jù)庫對(duì)單鏈抗體基因序列分析 |
| 2.6 單鏈抗體同源建模、分子對(duì)接與結(jié)合模式分析 |
| 3 討論 |
| 3.1 單鏈抗體的構(gòu)建方法 |
| 3.2 抗體信息學(xué)數(shù)據(jù)及結(jié)合模式分析 |
| 4 結(jié)論 |
| 第四章 3-苯氧基苯甲酸單鏈抗體的表達(dá)、功能分析與檢測應(yīng)用 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器 |
| 1.2 單鏈抗體表達(dá)溫度的優(yōu)化 |
| 1.3 單鏈抗體表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化 |
| 1.4 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化 |
| 1.5 ELISA和Western blot |
| 1.6 單鏈抗體的純化與復(fù)性 |
| 1.7 包被原和工作濃度的優(yōu)化 |
| 1.8 甲醇對(duì)ELISA體系的影響 |
| 1.9 3-PBA間接競爭ELISA檢測方法的建立 |
| 1.10 交叉反應(yīng)率試驗(yàn) |
| 1.11 添加回收試驗(yàn) |
| 1.12 HPLC法比對(duì) |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 單鏈抗體的誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化 |
| 2.2 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和IPTG濃度的優(yōu)化 |
| 2.3 單鏈抗體大量表達(dá)與純化 |
| 2.4 包被原和抗體工作濃度的優(yōu)化 |
| 2.5 甲醇對(duì)抗體性能的影響 |
| 2.6 間接競爭ELISA法的建立 |
| 2.7 交叉反應(yīng)率的測定 |
| 2.8 單鏈抗體的穩(wěn)定性研究 |
| 2.9 添加回收試驗(yàn)、HPLC法的比對(duì) |
| 3 討論 |
| 3.1 單鏈抗體表達(dá)參數(shù)的優(yōu)化 |
| 3.2 單鏈抗體的功能性分析 |
| 3.3 單鏈抗體的檢測應(yīng)用 |
| 4 結(jié)論 |
| 第五章 基于鏈替換技術(shù)的Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體的構(gòu)建與篩選 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器 |
| 1.2 抗體重、輕鏈基因擴(kuò)增 |
| 1.3 單鏈抗體基因的拼接 |
| 1.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建 |
| 1.5 重、輕鏈替換庫的構(gòu)建 |
| 1.6 多克隆噬菌體ELISA分析 |
| 1.7 重、輕鏈替換庫的篩選 |
| 1.8 陽性克隆鑒定 |
| 1.9 抗獨(dú)特型單鏈抗體可溶性表達(dá)與純化 |
| 1.10 抗獨(dú)特型單鏈抗體的功能性分析 |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 抗體重、輕鏈基因擴(kuò)增及拼接 |
| 2.2 雙酶切與重組質(zhì)粒構(gòu)建 |
| 2.3 重輕鏈替換庫的篩選與鑒定 |
| 2.4 抗獨(dú)特型單鏈抗體的可溶性表達(dá)與活性驗(yàn)證 |
| 2.5 Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體的表觀親和力分析 |
| 2.6 Cry2Aa與抗獨(dú)特型單鏈抗體MUT10的競爭抑制試驗(yàn) |
| 3 討論 |
| 3.1 鏈替換技術(shù)效率分析 |
| 3.2 抗獨(dú)特型單鏈抗體與Cry2Aa毒素的競爭替代作用分析 |
| 4 結(jié)論 |
| 第六章 Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體對(duì)小菜蛾生物活性的初步分析 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器 |
| 1.2 Cry2Aa抗獨(dú)特型單鏈抗體的制備 |
| 1.3 小菜蛾BBMV的提取 |
| 1.4 BBMV結(jié)合分析 |
| 1.5 生物測定 |
| 1.6 SDS-PAGE與Ligand blot分析 |
| 1.7 LC-MS/MS |
| 2 結(jié)果與分析 |
| 2.1 Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體與小菜蛾BBMV的結(jié)合能力分析 |
| 2.2 Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體對(duì)小菜蛾的生物測定 |
| 2.3 Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體與小菜蛾BBMV的Ligand blot分析 |
| 2.4 Cry2Aa及其抗獨(dú)特型單鏈抗體與小菜蛾BBMV共同結(jié)合蛋白條帶的LC-MS/MS分析 |
| 3 討論 |
| 3.1 BBMV結(jié)合能力及殺蟲活性分析 |
| 3.2 中腸結(jié)合蛋白分析 |
| 4 結(jié)論 |
| 全文總結(jié) |
| 論文創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄 |
| 致謝 |
| 攻讀博士學(xué)位期間取得研究成果 |
（10）基于噬菌體展示技術(shù)篩選高親和力兔源HER2單鏈抗體（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗體研究進(jìn)展 |
| 1.1.1 抗體介紹 |
| 1.1.2 抗體結(jié)構(gòu)特點(diǎn) |
| 1.1.3 抗體技術(shù)發(fā)展 |
| 1.1.4 單鏈抗體 |
| 1.2 噬菌體展示技術(shù) |
| 1.2.1 噬菌體展示技術(shù)原理 |
| 1.2.2 噬菌體展示系統(tǒng)類型 |
| 1.2.3 噬菌體展示技術(shù)篩選方法 |
| 1.3 HER2研究進(jìn)展 |
| 1.3.1 HER2介紹 |
| 1.3.2 HER2與乳腺癌 |
| 1.3.3 HER2抗體研究現(xiàn)狀 |
| 1.4 本課題研究內(nèi)容及創(chuàng)新之處 |
| 1.4.1 研究內(nèi)容 |
| 1.4.2 課題特色與創(chuàng)新之處 |
| 第二章 噬菌體展示文庫的構(gòu)建及鑒定 |
| 2.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 2.1.1 動(dòng)物與菌種 |
| 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 2.1.3 主要溶液及試劑配方 |
| 2.1.4 儀器設(shè)備 |
| 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2.2.1 HER2蛋白的合成 |
| 2.2.1.1 HER2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) |
| 2.2.1.2 HER2蛋白的分離純化 |
| 2.2.1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白表達(dá) |
| 2.2.1.4 蛋白復(fù)性與乳化 |
| 2.2.2 免疫實(shí)驗(yàn)用兔 |
| 2.2.2.1 免疫注射 |
| 2.2.2.2 間接競爭Elisa法檢測 |
| 2.2.2.3 免疫組化檢測 |
| 2.2.3 脾臟總RNA提取 |
| 2.2.3.1 脾臟細(xì)胞分離 |
| 2.2.3.2 脾臟總RNA的提取 |
| 2.2.4 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA |
| 2.2.5 引物設(shè)計(jì) |
| 2.2.6 抗體V_H、V_L基因的獲取 |
| 2.2.7 ScFv基因的拼接 |
| 2.2.8 pCANTAB5e質(zhì)粒載體與ScFv基因雙酶切 |
| 2.2.9 pCANTAB5e-ScFv重組質(zhì)粒構(gòu)建 |
| 2.2.10 TG1超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 2.2.11 初級(jí)抗體庫的構(gòu)建 |
| 2.3 結(jié)果與分析 |
| 2.3.1 HER2蛋白的表達(dá)與純化 |
| 2.3.2 免疫血清鑒定 |
| 2.3.3 脾臟總RNA的提取 |
| 2.3.4 抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因的PCR擴(kuò)增 |
| 2.3.5 pCANTAB5e-ScFv重組質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 2.3.6 初級(jí)抗體庫的鑒定 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 噬菌體單鏈抗體庫的富集篩選 |
| 3.1 實(shí)驗(yàn)材料 |
| 3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種 |
| 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 |
| 3.1.3 主要溶液及配方 |
| 3.1.4 儀器設(shè)備 |
| 3.2 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 3.2.1 淘篩前準(zhǔn)備 |
| 3.2.1.1 輔助噬菌體毒種制備 |
| 3.2.1.2 輔助噬菌體滴度測定 |
| 3.2.1.3 噬菌體增殖培養(yǎng) |
| 3.2.1.4 噬菌體沉析 |
| 3.2.2 酶標(biāo)板淘篩 |
| 3.2.3 HER2組織切片免疫組化淘篩 |
| 3.2.4 Phage-ELISA檢測重組抗體 |
| 3.2.5 特異性抗體測序 |
| 3.3 結(jié)果與分析 |
| 3.3.1 輔助噬菌體滴度的測定 |
| 3.3.2 噬菌體ScFv抗體庫的淘篩 |
| 3.3.2.1 噬菌體ScFv抗體庫的富集篩選 |
| 3.3.2.2 噬菌體ScFv終極抗體庫的陽性率 |
| 3.3.3 Phage-ELISA檢測抗體親和力 |
| 3.3.4 抗體可變區(qū)序列分析 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 結(jié)論 |
| 展望 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 致謝 |
| 附錄 |
| 個(gè)人簡歷 |
四、兔抗M13噬菌體酶標(biāo)抗體的制備（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]抗非洲豬瘟病毒豬源單鏈抗體噬菌體文庫的構(gòu)建及抗體的篩選[D]. 王麗娟. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2021(09)
- [2]我國優(yōu)勢(shì)種海蛇毒多組學(xué)分析、抗毒血清制備以及毒腺中活性組分淘選[D]. 王博. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué), 2021(01)
- [3]雞柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白3特異親和肽抑制蟲體入侵宿主細(xì)胞研究[D]. 陳文靜. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2020(04)
- [4]TIM-3單克隆抗體制備及人源化小鼠構(gòu)建[D]. 楊雷. 福建師范大學(xué), 2020(12)
- [5]人源化半合成納米抗體文庫的構(gòu)建及CD47納米抗體的研制[D]. 郭瑞峰. 華東理工大學(xué), 2021(08)
- [6]B細(xì)胞成熟抗原特異性單域抗體的篩選制備和鑒定[D]. 劉欣. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019(01)
- [7]重組噬菌體對(duì)沙眼衣原體作用及機(jī)制的探索[D]. 魏世娟. 天津醫(yī)科大學(xué), 2019(02)
- [8]M13重組噬菌體的鑒定及其對(duì)沙眼衣原體和豚鼠嗜衣原體的作用[D]. 練婷婷. 天津醫(yī)科大學(xué), 2019(02)
- [9]基于抗體的擬除蟲菊酯農(nóng)藥代謝物分析和Cry2Aa毒素分子模擬研究[D]. 劉媛. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018
- [10]基于噬菌體展示技術(shù)篩選高親和力兔源HER2單鏈抗體[D]. 祝婧雯. 福州大學(xué), 2018(03)
標(biāo)簽：噬菌體論文; 抗體論文; 衣原體論文; 海蛇論文; 抗原抗體反應(yīng)論文;