一、IFN-α對大鼠肝纖維化間質膠原酶基因表達的調(diào)控（論文文獻綜述）
婁瑩瑩[1]（2013）在《基于濁毒理論的肝復健方抗大鼠肝纖維化作用及機制研究》文中研究說明肝纖維化（Hepatic fibrosis,HF）是指各種致病因素所引起肝臟內(nèi)細胞外基質（extracellular matrix,ECM）的合成大于降解，致使ECM在肝臟內(nèi)過度沉積，它是大多數(shù)慢性肝病所共有的病理特征，也是慢性肝炎進一步向肝硬化、肝癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。肝纖維化是可被逆轉的階段，如能阻斷和逆轉肝纖維化的發(fā)生，就可阻止嚴重后果的發(fā)生。肝纖維化的形成是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復雜過程，其形成不是靜止的，而是不斷變化的動態(tài)過程。各種細胞因子形成的復雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，不斷影響著肝纖維化的形成和轉歸。從細胞因子及其信號轉導角度研究藥物的作用機制，將不斷深化肝纖維化的治療學研究。瘦素（leptin）與肝纖維化的形成之間有著密切的關系，與瘦素受體結合后，激活相應的信號轉導通路，促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。目前臨床上仍然缺乏確切特效的抗纖維化藥物與方法。中醫(yī)藥具有多層次、多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點的作用特點，在治療肝纖維化方面取得了顯著的成果。李佃貴教授提出濁毒內(nèi)蘊，肝絡瘀滯是肝纖維化的主要病機之一，并從濁毒論治肝纖維化，在此指導下確立肝復健方，取得顯著療效。既往臨床及實驗研究表明，肝復健方具有明顯的阻斷病毒性乙型肝炎慢性化、減輕肝纖維化及保護肝功能的作用。本課題繼續(xù)在腹腔注射豬血清復制免疫性肝纖維化模型的基礎上，觀察肝復健方對大鼠肝組織病理形態(tài)學、肝纖四項、MMP-1、瘦素（leptin）及其受體（OB-Rb）、JAK2、STAT3的表達情況，探討其對瘦素調(diào)控肝纖維化大鼠JAK2/STAT3信號轉導通路的影響，旨在對本方抗HF的藥效和可能的作用機制進一步的研究，為肝纖維化的預防與治療提供理論依據(jù)。本實驗分為以下五部分：第一部分濁毒理論與肝纖維化目的：探討濁毒理論與肝纖維化的關系，明確其在肝纖維化中的重要地位，提出肝纖維化治療的新觀點與新方法。方法：通過溫習、回顧、整理中醫(yī)文獻，并結合臨床實踐經(jīng)驗，提出濁毒理論，提出肝纖維化的新病機，系統(tǒng)總結了肝纖維化濁毒證證治規(guī)律。結果：提出了濁毒理論，明確了濁毒的概念、臨床表現(xiàn)及致病特點。探討了濁毒與肝纖維化的關系，總結出了肝纖維化濁毒證證治規(guī)律，從臨床上驗證了從濁毒治療肝纖維化的可行性。結論：濁毒理論是中醫(yī)學術體系的新的組成部分，是研究濁毒致病的病因、病機、診斷、治療等理法方藥的學科。濁毒與肝纖維化關系密切，是其發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。第二部分肝復健方對肝纖維化大鼠病理形態(tài)學和血清標志物的影響目的：觀察肝復健方對豬血清誘導的肝纖維化大鼠病理形態(tài)學及血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原含量的影響，探討其抗纖維化的作用機制。方法：清潔級SD大鼠60只，雄性，體重200±20g。適應性喂養(yǎng)一周后隨機分為正常對照組（Normal group）、模型組（Model group）、秋水仙堿組（Colchicine）、肝復健方低劑量組（GFJL group）、肝復健方中劑量組（GFJM group）、肝復健方高劑量組（GFJH group）六組，每組10只。每周二、周五上午8點，采用無菌未滅活的豬血清腹腔注射進行造模，連續(xù)8周。造模成功后正常對照組與模型組給予生理鹽水（10ml/kg），日1次灌胃。GFJL組給予含生藥1.4g/ml水煎劑灌胃；GFJM組給予含生藥2.8g/ml水煎劑灌胃；GFJH組給予含生藥4.2g/ml水煎劑灌胃（灌胃液體量為10ml/kg，1次/d）；秋水仙堿組給予0.154mg/kg·d灌胃，均至12周末。實驗期間觀察大鼠的一般情況。12周末采用腹主動脈取血，分離血清，用放射免疫分析法測定各組大鼠血清中HA、LN、PCIII、CIV水平。留取大鼠肝組織，采用蘇木精-伊紅染色（HE染色）和膠原纖維特殊染色法（Masson染色）觀察肝組織病理形態(tài)學改變。結果：1一般情況正常對照組一般情況良好，精神狀態(tài)好，活潑好動，大鼠食欲佳，進食量正常，皮毛光滑，體重逐漸增加。模型組大鼠精神萎靡、不喜活動，進食較正常組少，皮毛雜亂、黯淡無光澤、尿黃，個別大鼠鼻有出血，體重增長變慢。秋水仙堿及中藥治療各組大鼠精神狀態(tài)、活動、進食量尚可，被毛光澤，體重有所增加，無特殊異常狀態(tài)出現(xiàn)。2肝臟大體觀察正常組大鼠肝臟質地較軟，表面光滑，略呈深紅色，有光澤，無任何斑點、突起，邊緣銳利。模型組大鼠肝臟質地硬，表面欠光滑，部分標本表面粗糙，凹凸不平，顏色暗紅，邊緣鈍。秋水仙堿及中藥治療組大鼠肝臟質較脆，表面較光滑，顏色基本正常，基本無斑點、突起等。3肝復健方對肝纖維化大鼠肝組織病理的影響正常組肝小葉結構清晰完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無變性壞死，未見纖維組織增生及炎性細胞浸潤。模型組肝小葉結構破壞，肝細胞索排列紊亂，肝細胞變性，部分肝細胞壞死，伴有中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，纖維組織大量增生，個別動物可見假小葉形成。秋水仙堿組與中藥治療各組肝臟損傷程度均較模型組輕，肝小葉結構破壞減輕，肝臟膠原纖維增生減輕，肝細胞水腫好轉，變性情況明顯改善，炎細胞浸潤減少。肝復健方高劑量組肝臟結構改善最為明顯。4肝復健方對肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV的影響與正常對照組相比，模型組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型對照組相比，12周末各藥物干預組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平下降（P<0.05）。肝復健方高劑量組血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平顯著性降低，優(yōu)于秋水仙堿組、中劑量組及低劑量組（P＜0.05）；秋水仙堿組、肝復健中劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；秋水仙堿組與肝復健方低劑量組比較，血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：肝復健方能夠改善大鼠的一般狀況，顯著降低大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原含量，促進ECM的降解，抑制纖維組織增生，改善肝纖維化大鼠的病理組織結構，恢復肝細胞損傷，達到抗肝纖維化的作用。第三部分肝復健方對肝纖維化大鼠瘦素及瘦素受體表達的影響目的：觀察肝復健方對血清瘦素、肝組織瘦素及瘦素受體的影響，進一步明確瘦素在肝纖維化形成過程中的生物學效應以及化濁解毒法抗肝纖維化的深層作用機制。方法：放射免疫分析法檢測血清瘦素（Leptin）水平，逆轉錄-多聚酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測肝組織瘦素（leptin）及瘦素受體（OB-Rb）的表達。結果：1肝復健方對大鼠血清Leptin水平的影響與正常對照組相比,模型對照組、各藥物組血清瘦素水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與模型對照組相比，秋水仙堿組和肝復健方各劑量組血清瘦素水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各藥物治療組比較，肝復健方高劑量組血清瘦素水平顯著性降低，優(yōu)于秋水仙堿組、中劑量組及低劑量組（P＜0.05），秋水仙堿組與中劑量組比較，無顯著性差異（P﹥0.05）。秋水仙堿組與低劑量組比較，血清瘦素水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2肝復健方對大鼠肝組織Leptin、OB-RbmRNA表達的影響與正常對照組相比，模型對照組、秋水仙堿組和肝復健方各劑量組Leptin、OB-RbmRNA的表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型對照組相比，秋水仙堿組和肝復健方各劑量組Leptin、OB-RbmRNA表達明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各藥物治療組比較，肝復健方高劑量組Leptin、OB-RbmRNA表達顯著性降低，優(yōu)于秋水仙堿組、中劑量組及低劑量組（P＜0.05），秋水仙堿組與中劑量組比較Leptin、OB-RbmRNA的表達有下降趨勢，但均無顯著性差異（P﹥0.05）。秋水仙堿組與低劑量組比較，Leptin、OB-RbmRNA的表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：瘦素是內(nèi)生濁毒的物質基礎之一，肝復健方能夠有效降低肝纖維化模型大鼠瘦素及瘦素受體的表達，減少兩者的結合，進而抑制下游信號轉導通路，從而達到抗肝纖維化的作用。第四部分肝復健方對大鼠肝組織MMP-1表達的影響目的：觀察肝復健方對HF大鼠肝臟MMP-1表達的影響，從分子水平探討肝復健方抗肝纖維化的深層作用機理。方法：逆轉錄-多聚酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測肝組織MMP-1的表達。結果：與正常對照組相比，模型對照組、秋水仙堿組和肝復健方各劑量組MMP-1mRNA的表達均明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型對照組相比，秋水仙堿組和肝復健方各劑量組MMP-1mRNA表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各藥物治療組比較，肝復健方高劑量組MMP-1mRNA的表達顯著性增強，優(yōu)于秋水仙堿組、中劑量組及低劑量組（P＜0.05），秋水仙堿組與中劑量組比較MMP-1mRNA的表達有增強趨勢，但均無顯著性差異（P﹥0.05）。秋水仙堿組與低劑量組比較，MMP-1mRNA的表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：肝復健方可以顯著提高MMP-1mRNA的表達水平，通過抑制HSC合成和分泌瘦素，促進MMP-1的表達，從而使細胞外基質降解，阻礙肝纖維化進程。第五部分肝復健方對肝纖維化大鼠肝組織JAK2/STAT3信號轉導通路的影響目的：觀察肝復健方對HF大鼠肝臟JAK2、STAT3蛋白表達的影響，以進一步探討肝復健方抗肝纖維化的深層作用機理，為臨床防治肝纖維化提供理論依據(jù)方法：Western blot檢測HF大鼠肝組織JAK2、STAT3的表達。結果：1肝復健方對大鼠肝組織JAK2蛋白表達的影響（1）所有實驗組大鼠肝組織中JAK2的表達量均高于正常對照組（P<0.05）。（2）肝復健方各劑量組及秋水仙堿組與模型組相比JAK2的蛋白表達量顯著性降低（P<0.05）。（3）肝復健方中劑量組與秋水仙堿組相比JAK2蛋白表達量均無顯著性差異（P﹥0.05）；秋水仙堿組與肝復健方低劑量組相比JAK2蛋白的表達量有顯著性降低（P<0.05），肝復健方高劑量組與秋水仙堿組相比，JAK2蛋白的表達量有顯著性降低（P<0.05）。（4）肝復健方藥不同劑量組之間比較，高劑量組JAK2蛋白的表達量優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2肝復健方對大鼠肝組織STAT3蛋白表達的影響（1）所有實驗組大鼠肝組織中STAT3的表達量均高于正常對照組（P<0.05）。（2）肝復健方各劑量組及秋水仙堿組與模型組相比STAT3的蛋白表達量有顯著性降低（P<0.05）。（3）肝復健方中劑量組與秋水仙堿組相比STAT3蛋白表達量均無顯著性差異（P﹥0.05）；秋水仙堿組與肝復健方低劑量組相比STAT3蛋白的表達量有顯著性降低（P<0.05），肝復健方高劑量組與秋水仙堿組相比，STAT3蛋白的表達量有顯著性降低（P<0.05）。（4）肝復健方藥不同劑量組之間比較，高劑量組STAT3蛋白的表達量優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：肝復健方能夠下調(diào)肝纖維化大鼠肝組織JAK2、STAT3的表達，進而抑制HSC活化、增殖，降低膠原的表達和分泌，最終起到抗肝纖維化的作用。瘦素調(diào)控的JAK2/STAT3信號轉導通路是肝復健方抗肝纖維化的新的作用途徑和作用靶點。
秦哲[2]（2012）在《黃芪發(fā)酵后主要有效成分變化分析及多糖對大鼠實驗性肝纖維化影響》文中研究說明黃芪是臨床常用中藥，其主要成分黃芪多糖具有提高免疫力、抗病毒、抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、保肝護腎等多種藥效作用。然而，由于生藥黃芪中黃芪多糖提取得率較低而限制了其廣泛應用。前期研究表明，生藥黃芪經(jīng)M-9菌株發(fā)酵后，發(fā)酵產(chǎn)物中粗多糖得率顯著提高。但發(fā)酵黃芪的質量控制，藥效成分的含量變化及其藥理學作用有待研究。因此論文首次開展了發(fā)酵黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量測定，發(fā)酵后黃芪皂苷和多糖的最佳提取工藝條件的優(yōu)化及發(fā)酵黃芪多糖對實驗性大鼠肝纖維化的影響并運用數(shù)字基因表達譜分析其作用機理。為今后發(fā)酵黃芪的藥理學深入研究、開發(fā)利用及益生菌發(fā)酵轉化機理的闡述提供理論依據(jù)。1.高效液相色譜法測定發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量參照2010版《中國藥典》黃芪有效成分含量測定方法，應用高效液相色譜法分別對發(fā)酵黃芪、生藥黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量進行測定，結果為0.049%、0.087%、0.030%和0.040%。含有等量黃芪的發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪甲苷的含量分別為0.063%和0.087%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量分別為0.038%和0.040%。結果提示，發(fā)酵前后毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異不顯著，而發(fā)酵后黃芪甲苷的含量降低了27.6%。這兩種成分的含量變化可為發(fā)酵黃芪產(chǎn)品的質量控制提供參考。2.發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪多糖和皂苷的提取分離及含量測定采用綜合提取黃芪皂苷和黃芪多糖的方法并篩選提取工藝。黃芪皂苷和黃芪多糖最佳提取工藝條件為：稱取一定量黃芪粗粉，用20倍量80%乙醇于80℃回流提取黃芪皂苷，烘干藥渣用于黃芪多糖提取。A.黃芪皂苷提取工藝：醇提液制成浸膏后取適量溶于50倍量純水，上樣于AB-8大孔樹脂柱，經(jīng)80%乙醇洗脫得皂苷富集部位中皂苷含量達81.23%。B.通過比較溫浸法、傳統(tǒng)水煎法、纖維素酶法及飽和生石灰水法，優(yōu)選出溫浸法提取黃芪多糖，提取工藝為：藥渣用20量純水，80℃溫浸提取4.5h，離心，濃縮，Sevag法除蛋白，透析，醇沉，無水乙醇、丙酮、乙醚分別洗滌，烘干，得黃芪粗多糖。C.香草醛-硫酸法測得生藥黃芪浸膏和發(fā)酵黃芪浸膏中皂苷含量分別為16.87%和10.81%，皂苷的提取率分別為0.0654%和0.0558%。苯酚-硫酸法測定多糖含量，發(fā)酵黃芪多糖（FAPS）含量及得率分別為66.59%，4.35%；生藥黃芪多糖（APS）含量及得率分別為36.01%，2.73%。結果提示，黃芪經(jīng)發(fā)酵后多糖含量及得率分別提高84.92%和59.34%，發(fā)酵后皂苷提取率降低17.20%。經(jīng)薄層層析法測定FAPS中主要糖單組分為葡萄糖、甘露糖等，主要多糖組分為FAPS-2-1的糖含量為95.41%，其數(shù)均分子量為1,564,267Da，重均分子量為1,753,456Da。3. FAPS對大鼠實驗性肝纖維化的作用及機制研究采用皮下注射CCl4的方法制備大鼠肝纖維化模型。造模同時給予不同藥物干預，研究FAPS對大鼠肝纖維化的作用。雄性SD大鼠60只，隨機分為6組，發(fā)酵黃芪高劑量組（FAPSH）200mg·kg-1·d-1，發(fā)酵黃芪中劑量組（FAPSM）100mg·kg-1·d-1，發(fā)酵黃芪低劑量組（FAPSL）50mg·kg-1·d-1，秋水仙堿組（Col.）0.2mg·kg-1·d-1，CCl4模型組和對照組給予等體積生理鹽水，持續(xù)8周。結果得出，F(xiàn)APS各劑量組大鼠體重均高于模型組，F(xiàn)APS可顯著降低小鼠血清中的ALT、AST、ALP活性（P<0.01），可顯著降低肝組織中Hyp含量（P<0.05）及血清中HA，LN，CⅣ，PⅢNP的水平，使降低的GSH-Px （P<0.01）、T-AOC （P<0.05）和GST值顯著升高，使異常升高的GSH和MDA含量趨于正常。尤其是FAPSH組各項抗肝纖維化指標均優(yōu)于FAPSM和FAPSL。通過H.E.、Masson染色及透射電鏡觀察大鼠肝組織病理變化發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝細胞脂肪空泡化和纖維化病變明顯，給予不同藥物干預的各組肝組織病理變化有所減輕。結果提示，F(xiàn)APS對CCl4所致大鼠實驗性肝纖維化有一定的修復作用，作用程度與劑量成一定的相關性，F(xiàn)APSH(200mg·kg-1·d-1)與Col.(0.2mg·kg-1·d-1)防治肝纖維化效果相當，其原理可能與其抗氧化作用有關。4.各組大鼠肝組織數(shù)字基因表達譜差異分析應用數(shù)字基因表達譜技術建立對照組、模型組、Col.、FAPSL、FAPSM和FAPSH的肝臟表達譜，初步分析差異基因的表達和功能。結果表明，模型組與對照組表達譜差異基因總共有2324個（表達量上調(diào)基因2162個，下調(diào)基因162個），差異基因通過多個細胞生物學過程中的218個信號通路參與肝纖維化的形成，特別是引起PPAR信號通路、TGF-β信號通路、MAPK信號通路、VEGF信號通路、Jak-STAT信號通路中多個基因表達量表達量下調(diào)。Col.組、FAPSL組、FAPSM組、FAPSH組肝臟表達譜與CC14模型組進行比較，結果表明FAPS可顯著抑制TGF-β、PPAR信號通路多個關鍵基因的上調(diào)而抑制HSCs的活化，特別是SCD-1基因表達量顯著下調(diào)，表明FAPS可以顯著降低肝臟SCD活性，推測FAPS對CCl4引起的肝纖維化的改善作用機制可能為通過抑制SCD活性，削弱單不飽和脂肪酸的生成來減少肝臟脂質蓄積從而抑制HSCs的活化。
張紅[3]（2012）在《軟肝沖劑對免疫性肝纖維化大鼠的實驗研究》文中研究說明目的：研究中藥復方軟肝沖劑治療肝纖維化的作用機理。材料與方法：將95只wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、秋水仙堿組和軟肝沖劑高、中、低劑量組，除空白對照組外，其余組采用豬血清腹腔注射誘導免疫性肝纖維化模型，0.5ml/只,每周2次，連續(xù)5周后改為每周1次，共注射10周。各組于造模后第六周開始灌胃給藥，軟肝沖劑高、中、低劑量組分別按7.5g/kg、5g/kg、2.5g/kg灌胃；秋水仙堿組按0.1mg/kg灌胃；空白對照組和模型組給予0.9%生理鹽水10ml/kg灌胃，日1次，至10周末結束。觀察軟肝沖劑各劑量組大鼠的肝功能指標（AST、ALT、TP、ALB），血清肝纖維化指標（HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C），以及肝細胞超微結構的變化，并用聚合酶鏈反應法檢測TGF-β1mRNA的表達。結果：⑴肝功能指標：與空白對照組相比，模型組血清AST、ALT水平顯著升高，TP、ALB含量明顯降低（@P<0.01）。軟肝沖劑各劑量組和秋水仙堿組血清AST、ALT水平及TP、ALB含量與模型組相比有極顯著性差異（*P<0.01）。軟肝沖劑各劑量組在降低血清AST、ALT水平方面明顯優(yōu)于秋水仙堿組（△P<0.01）。與秋水仙堿組相比，軟肝沖劑高、中劑量組血清TP、ALB含量均有不同程度的上升，差異有統(tǒng)計學意義（△P<0.01或▽P<0.05）。而軟肝沖劑低劑量組TP、ALB含量與秋水仙堿組相比無明顯差異（P>0.05）。⑵肝纖維化指標：模型組血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ含量均明顯高于正常對照組，經(jīng)統(tǒng)計學處理有極顯著性差異（@P<0.01）。軟肝沖劑各劑量組和秋水仙堿組血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ含量與模型組比較均有不同程度的下降，差異顯著（*P<0.01）。軟肝沖劑高、中劑量組在降低血清HA、LN、Ⅳ-C和PCⅢ方面明顯優(yōu)于秋水仙堿組（▲P<0.01）。軟肝沖劑小劑量組血清Ⅳ-C、PCⅢ含量明顯低于秋水仙堿組（△P<0.05或▲P<0.01）；但血清HA和LN的含量高于秋水仙堿組（▲P<0.01或△P<0.05）。與秋水仙堿組和軟肝沖劑中、低劑量組比較，軟肝沖劑高劑量組血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ含量明顯減少，有極顯著性差異（＃P<0.01）。⑶肝細胞超微結構：模型組肝細胞固縮，細胞表面微絨毛明顯減少，細胞間隙增寬；細胞核萎縮，核膜擴張；胞質內(nèi)細胞器數(shù)量明顯減少；線粒體電子密度增強，嵴消失，部分線粒體出現(xiàn)空泡樣改變；粗面內(nèi)質網(wǎng)重度擴張，表面核糖體脫落，糖原顆粒消失，溶酶體較少。秋水仙堿組肝細胞形態(tài)基本正常，有大量線粒體，嵴顯示不清，粗面內(nèi)質網(wǎng)較少，表面核糖體部分脫落，糖原顆粒增多，分散于細胞質中，可見大量大小不等的溶酶體顆粒。軟肝沖劑高劑量組肝細胞形態(tài)完好，相鄰細胞間排列較整齊，細胞器豐富，線粒體體積較小，數(shù)量較多，嵴清晰可見。軟肝沖劑中劑量組肝細胞膜清晰，細胞核及核膜基本正常，細胞器較豐富，線粒體數(shù)量尚可，體積較小，偶見嵴，偶有空泡樣改變。糖原顆粒較少。軟肝沖劑低劑量組肝細胞輕度固縮，胞質內(nèi)細胞器數(shù)量減少，線粒體數(shù)量較多，體積小，嵴不清晰。⑷分子生物學指標：與空白對照組相比，模型組TGF-β1mRNA的表達明顯增加（@P<0.01）。與模型組比較，軟肝沖劑各劑量組和秋水仙堿組的RI指數(shù)均有不同程度的下降，經(jīng)統(tǒng)計學處理有極顯著性差異（*P<0.01）。軟肝沖劑各劑量組TGF-β1mRNA的表達明顯低于秋水仙堿組（△P<0.01）。結論：軟肝沖劑能有效的改善肝功能，抑制膠原合成，抑制TGF-β1mRNA的表達，對肝損傷后的超微結構有明顯的保護作用，該藥可以阻止甚至逆轉肝纖維化進程。
楊欣[4]（2011）在《乙肝轉陰顆粒對化學性肝損傷和慢性肝纖維的保護作用及其機制研究》文中研究說明目的:研究乙肝轉陰顆粒（YGZYDG）對小鼠化學性肝損傷的保護作用及其機制。方法:分別采用四氯化碳（CCl4）皮下注射小鼠和D-半乳糖胺鹽酸鹽（D-GalN）腹腔注射小鼠,建立化學性肝損傷模型。各型肝損傷實驗中,均把昆明種小鼠隨機分為正常對照組（NC）,肝損傷模型組,YGZYDG高（YGZYDGH）、YGZYDG中（YGZYDGM）、YGZYDG低（YGZYDGL）劑量組,陽性對照組。觀察小鼠肝臟重量指數(shù),脾臟重量指數(shù),胸腺重量指數(shù);測定血清ALT、AST、堿性磷酸酶（AKP）活性,總抗氧化能力（T-AOC）以及血清白蛋白（Alb）含量;肝組織丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。HE染色觀察各組小鼠肝細胞損傷程度。結果:與模型組比較,YGZYDG對脾臟重量無明顯影響,能減輕肝臟和胸腺重量;降低血清ALT、AST、AKP活性,肝組織MDA含量;提高T-AOC水平,增加血清Alb含量、肝組織SOD活性（P<0.01或P<0.05）;能夠減輕肝細胞損傷程度。結論:YGZYDG對小鼠化學性肝損傷具有保護作用,其機制可能與其抗氧自由基、抑制脂質過氧化作用有關。目的:研究乙肝轉陰顆粒（YGZYDG）對四氯化碳（Carbon tetra-Chloride, CCl4）所致大鼠肝纖維化的治療作用,并探討其作用機制。方法:Wistar大鼠隨機分成兩組,模型組大鼠采用50% CCl4花生油溶液i.g.造模,共8周,正常組用NS代替。將病理檢查確認肝纖維化形成的Wistar大鼠50只,隨機分成5組,分別給予相應藥物進行干預,每日1次,連續(xù)5周。末次給藥24 h后處死大鼠。（1）采集血清及肝組織,檢測大鼠血清中ALT、AST和肝組織中Hyp、SOD、MDA、GSH-PX的含量。觀察肝臟重量指數(shù),脾臟重量指數(shù),胸腺重量指數(shù);（2）于肝左葉同一部位取肝組織約1 cm×1 cm×l cm大小,固定于4%多聚甲醛溶液,HE染色觀察各組大鼠肝臟纖維程度。（3）以RT-PCR法檢測肝組織中Col-I、TIMP-1、TGF-β1 mRNA的表達。結果:（1）與模型組比較,YGZYDG不同程度的降低肝指數(shù)和胸腺指數(shù)（P<0.01或P<0.05）;但對脾臟重量無明顯影響。（2）與模型組比較,各劑量的乙肝轉陰顆粒及陽性藥能顯著降低大鼠血清中CCl4所致異常升高的ALT和AST（P<0.01）;同時,各劑量的乙肝轉陰顆粒能顯著提高肝組織中異常降低的SOD、GSH-PX含量（P<0.05或P<0.01）,并顯著降低異常升高的Hyp、MDA含量（P<0.05或P<0.01）。（3）HE染色病理結果顯示,與模型組比較,乙肝轉陰顆粒高、中、低劑量及陽性組大鼠肝臟纖維化程度明顯減輕（P<0.05或P<0.01）。（4）YGZYDG各劑量組和陽性藥均可不同程度地下調(diào)TIMP-1、TGF-β1 mRNA的表達（P<0.01）;YGZYDG高、中劑量組和陽性藥可顯著下調(diào)Col-I mRNA的表達（P<0.01）。結論:乙肝轉陰顆粒對大鼠化學性肝損傷具有一定程度的治療作用,其機制可能是清除自由基,抑制脂質過氧化,同時抑制膠原合成與沉積,減少細胞外基質（ECM）的沉積和促進ECM的降解。目的:研究乙肝轉陰顆粒及其含藥血清對HSC-T6增殖以及相關基因的的影響,探討其抗肝纖維化的作用機制。方法體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）,MTT法檢測乙肝轉陰顆粒及其含藥血清對HSC-T6的抑制作用。RT-PCR法測定其對Col-I、TIMP-1及TGF-β1mRNA表達的影響。結果:乙肝轉陰顆粒及其含藥血清可顯著抑制HSC-T6的增殖;YGZYDG各濃度組可顯著下調(diào)細胞Col-I、TIMP-1、TGF-β1mRNA的表達（P<0.01）;YGZYDGS各濃度組可顯著下調(diào)細胞TIMP-1、TGF-β1mRNA的表達（P<0.01）;YGZYDGS高、中濃度組可下調(diào)細胞Col-I mRNA的表達（P<0.05或P<0.01）。結論乙肝轉陰顆粒及其含藥血清可抑制肝星狀細胞增殖,并抑制膠原蛋白的生成、促進ECM的降解,這可能是其抗肝纖維化的作用機制之一。
王紹展[5]（2011）在《苦參堿結構修飾物-19抗大鼠實驗性肝纖維化作用及機制研究》文中進行了進一步梳理【研究背景及目的】肝纖維化（hepatic fibrosis,HF）是指在各種致病因子如炎癥、損傷、藥物、遺傳因素等的作用下,活化的成纖維細胞或肌成纖維細胞（myofibroblasts, MFs）增多,細胞外基質（extracellular matrix, ECM）大量沉積的病理改變。它是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷之后組織修復過程中的代償反應,亦是慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過程。肝纖維化為一動態(tài)過程,屬可逆性病變,因此,阻斷、抑制或逆轉肝纖維化是治療慢性肝病的一個重要目標。既往認為,肝星狀細胞（hepatic stellate cell,HSC）是肌成纖維細胞（myofibroblasts）的最主要來源。但是,晚近研究表明原位間質細胞、上皮細胞及內(nèi)皮細胞,尤其是膽管細胞和肝細胞也被證明可通過上皮細胞間質轉型（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）向肌成纖維細胞轉化,表明肝實質的上皮細胞也參與肝纖維化進程。苦參堿是從中國傳統(tǒng)中藥苦參中提取的一種生物堿,目前的研究發(fā)現(xiàn)其抗炎,免疫調(diào)節(jié),對小鼠急性肝損傷具有保護作用,并能抗大鼠實驗性肝纖維化作用。雖然苦參堿的藥理作用廣泛,但是活性不高,需要對其進行結構改造,得到活性更強、毒性更低的衍生物。再者,苦參堿的藥理作用機制不明確,特別是其靶標蛋白的研究仍是空白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),苦參堿的羰基氧原子被硫原子取代后,其藥理活性大為增強,為此我們對苦參堿進行結構改造,得到40多個苦參堿衍生物。本研究首先對部分苦參堿衍生物進行抗RAW264.7細胞釋放TNF-α作用和抑制NF-кB轉錄活性的篩選,挑選出藥效高,毒性低的苦參堿衍生物-19（M-19）;接著對M-19治療BDL和DMN誘導的大鼠實驗性肝纖維化效果進行評價,并初步探討M-19阻遏EMT進程是其抗肝纖維化的作用機制之一;對M-19抑制TGF-β1誘導原代培養(yǎng)肝細胞、原代培養(yǎng)肝星狀細胞和肝星狀細胞系HSC-T6細胞EMT進程的阻斷,以及對HSC-T6細胞增殖抑制、凋亡誘導作用的研究,闡釋M-19抗肝纖維化的多環(huán)節(jié)機制;通過連續(xù)親和色譜法、競爭親和色譜法結合MALDI-TOF-TOF質譜鑒定等技術,確證Mat及M-19的特異結合蛋白為核糖體蛋白S5（RPS5）。通過免疫組化和Real-time PCR檢測RPS5在纖維化模型大鼠組織中表達變化,以及RPS5在原代肝星狀細胞和HSC-T6細胞EMT中的作用研究,推測Mat及M-19可能通過抑制肝臟細胞RPS5的降解或表達水平的下降,而發(fā)揮抗肝纖維化作用。【實驗方法】一、苦參堿衍生物抗RAW264.7細胞釋放TNF-α和抑制NF-кB轉錄活性篩選（一）采用MTT法測定不同濃度的苦參堿及苦參堿衍生物處理24h,對RAW264.7細胞增殖活性的影響,以比較藥物的細胞毒性作用,并確定安全的藥理作用濃度范圍。（二）分別采用細胞毒結晶紫法和ELISA法對LPS刺激的RAW264.7細胞上清中的TNF-α生物學活性和含量進行測定,比較苦參堿和一系列苦參堿衍生物對RAW264.7細胞釋放TNF-α的抑制作用,篩選出高活性衍生物。（三）采用雙熒光素酶報告基因法,測定苦參堿衍生物對LPS刺激的RAW264.7細胞NF-кB轉錄活性的抑制作用,進一步比較藥物的藥理活性。二、苦參堿及苦參堿衍生物-19抗大鼠實驗性肝纖維化作用研究（一）苦參堿及苦參堿衍生物-19對BDL大鼠肝纖維化的抑制作用將雄性SD大鼠隨機分為7組,假手術組6只,其余各組10只,分設假手術組、膽總管結扎組、苦參堿衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治療組,苦參堿50mg/kg治療組,氧化苦參堿50mg/kg治療組。鈍性分離并結扎膽總管,制備BDL肝纖維化模型。術后3d ,各藥物組灌胃給予相應藥物處理,假手術組和膽總管接扎組灌胃生理鹽水。于接扎后第25d處死大鼠,堿水解法測定各組肝組織羥脯氨酸含量;HE染色觀察纖維化程度,Masson和Sirius red染色以計算ECM含量。Real time RT-PCR及免疫組織化學法測定肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-平滑肌激動蛋白（α-SMA）、鈣粘附蛋白（E-cadherin）、HNF4α和TGF-β1等EMT相關基因的表達。（二）苦參堿及苦參堿衍生物-19對DMN損傷大鼠肝纖維化的抑制作用將雄性SD大鼠隨機分為7組,對照組7只,其余各組每組10只,分設假手術組、膽總管結扎組、苦參堿衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治療組,苦參堿50mg/kg治療組,氧化苦參堿50mg/kg治療組。除空白對照組外,其余各組予1%DMN溶液按照10μg/kg的劑量腹腔注射,每周連續(xù)注射3次,共注射5w,制備DMN誘導的大鼠肝纖維化模型。于DMN注射第5w起各組灌胃給予相應藥物治療,空白對照組和模型對照組灌胃生理鹽水處理。藥物治療3w后處死,觀察指標同BDL模型。三、M-19體外抗肝纖維化作用機制研究（一）M-19對原代肝細胞EMT抑制作用研究分離制備原代培養(yǎng)SD大鼠肝細胞,培養(yǎng)2 d后,換成含有2ng/ml TGF-β1無血清培養(yǎng)基,同時設立空白對照組和M-19: 5 ,10,20 umol/L處理組。刺激48h后,提取細胞總RNA。Real time RT-PCR法檢測肝細胞核因子4α（HNF4α）、上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）等基因mRNA水平。（二）M-19對原代肝星狀細胞EMT抑制作用研究分離制備原代培養(yǎng)SD大鼠肝細胞,培養(yǎng)2 d后,換成含有2ng/ml TGF-β1無血清培養(yǎng)基,同時設立空白對照組和M-19: 5 ,10,20 umol/L處理組。刺激24h后,提取細胞總RNA。Real time RT-PCR法檢測α-SMA、Vimentin和Collagen I等基因mRNA水平。（三）M-19對肝星狀細胞系HSC-T6 EMT抑制作用研究HSC-T6細胞1.5×105/well分于6孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h后,加入2ng/ml TGF-β1刺激24h,同時設立空白對照組、苦參堿衍生物-19: 2.5,5,,10umol/L處理組。收集細胞,提取總RNA,Real time RT-PCR檢測E-cadherin、α-SMA、CollagenI和CollagenIII基因的mRNA水平（四）M-19對肝星狀細胞系HSC-T6增殖抑制作用研究HSC-T6細胞1.5×104/well分于96孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h后,加入終濃度為0.8 , 4 , 10, 20, 40, 100 umol/L M-19,繼續(xù)處理24h或48h。MTT法測定細胞的增殖活性（五）M-19誘導肝星狀細胞系HSC-T6凋亡作用研究HSC-T6細胞1.5×104/well分于6孔細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)24h后,加入終濃度為10,20,40 umol/L的M-19,繼續(xù)處理24h,收集細胞,流式細胞術檢測凋亡率四、MAT和M-19特異結合蛋白的研究（一）連續(xù)親和色譜法和競爭親和色譜法分離苦參堿特異結合蛋白采用苦參堿共價結合樹脂,從RAW264.7細胞和Jurkat細胞裂解液中分離苦參堿的特異結合蛋白;采用MALDI-TOF-TOF質譜鑒定特異結合蛋白的多肽序列,數(shù)據(jù)庫分析特異結合蛋白為核糖體蛋白S5（RPS5）;再通過RPS5的抗體免疫印跡檢測確證。（二）生物素親和素系統(tǒng)分離M-19特異結合蛋白RPS5構建M-19共價結合生物素,與HSC-T6細胞共孵育6h,利用親和素從細胞裂解液中分離M-19特異結合蛋白;通過RPS5的抗體免疫印跡檢測確證（三）M-19與RPS5共定位分析構建M-19共價結合生物素（biotin-M-19）,與HSC-T6細胞共孵育6h,免疫細胞化學特異性雙標biotin-M-19和RPS5,激光共聚焦共定位分析五、RPS5與肝纖維化關系研究（一）RPS5在肝纖維化模型中表達水平變化采用免疫組織化學和Real time RT-PCR技術,檢測BDL和DMN致大鼠肝纖維化模型中RPS5蛋白和基因mRNA水平表達變化（二）RPS5在原代肝星狀細胞活化過程中表達水平變化采用Real time RT-PCR技術,檢測原代分離肝細胞在體外培養(yǎng)自發(fā)活化過程中,RPS5基因mRNA表達水平變化（三）TGF-β1刺激下HSC-T6細胞RPS5表達水平變化采用Western blot檢測TGF-β1刺激HSC-T6細胞1,3,5,7d RPS5蛋白表達水平變化情況（四）RPS5 siRNA對HSC-T6細胞EMT的影響轉染RPS5 siRNA序列si335于HSC-T6細胞,48h后檢測E-cadherin和Vimentin蛋白表達情況【實驗結果】一、苦參堿及其衍生物抗RAW264.7細胞釋放TNF-α和抑制NF-кB轉錄活性研究30μM的苦參堿衍生物-19,24,對RAW細胞增殖沒有抑制作用,且在此濃度時對LPS刺激的RAW264.7細胞釋放TNF-α的抑制率分別為70.0%和83.6%（P<0.001）,效果高于其余藥物。30μM的苦參堿衍生物-19,24處理組RAW264.7細胞NF-кB轉錄活性分別降低為LPS刺激組的48.2% （P=0.002）和52%（ P=0.002）。二、苦參堿及苦參堿衍生物-19抗大鼠實驗性肝纖維化作用研究（一）苦參堿及苦參堿衍生物-19對BDL大鼠肝纖維化的抑制作用M-19 50mg/kg治療組與BDL模型組相比:肝組織羥脯氨酸含量（387.74±59.41μg/g） ,較模型對照組（564.18±104.27μg/g）顯著減少（ P =0.0003）;肝組織膠原面積減少37% （P<0.001）;免疫組織化學檢測顯示TGF-β1、α-SAM和Desmin等蛋白表達顯著下調(diào),HNF4α的蛋白表達顯著上調(diào);Real-time PCR檢測結果表明α-SAM、CollagenIII、TGF-β1等基因mRNA顯著下降（P<0.05）,同時HNF4αmRNA水平顯著上調(diào)（P<0.05）。（二）苦參堿及苦參堿衍生物-19對DMN大鼠肝纖維化的抑制作用M-19 50mg/kg治療組肝組織羥脯氨酸含量（414.97±182.5μg/g） ,較模型對照組（720.3±289.3μg/g）顯著減少（ P =0.021）。膠原面積較模型組減少64.5%（P =0.023）。免疫組織化學結果表明,M-19 50mg/kg治療3w,能顯著下調(diào)TGF-β1、α-SAM和Desmin的表達,同時上調(diào)HNF-4α,E-cadherin的表達。Real-time PCR檢測結果表明M-19 50mg/kg治療組與模型組相比α-SMA水平顯著下降（P =0.013）,而Ecadherin水平顯著上升（P =0.004）。三、M-19體外抗肝纖維化作用機制研究Real-time PCR檢測結果表明:原代肝細胞經(jīng)M-19 20μM處理48h, HNF4α和Ecadherin的mRNA水平分別為（87.8±3.7%）和（91.41±5.4%）,與TGF-β1 2ng/ml誘導組相比（68.3±6.9%, P =0.007 ）和（78.9±6.1%, P =0.006）顯著升高。M-19能劑量依賴性的下調(diào)TGF-β1 2ng/ml誘導原代肝星狀細胞α-SMA（P <0.001）、Vimentin（P =0.021）和CollagenImRNA（P =0.017）水平升高。對于TGF-β1 2ng/ml刺激的HSC-T6細胞,M19-10umol/L處理組能顯著降低α-SMA（P =0.022）和CollagenII（IP<0.001）的mRNA水平,同時上調(diào)E-cadherin mRNA水平（P =0.007）。MTT檢測結果表明M-19可濃度依賴性的抑制HSC-T6增殖,40umol/L的M-19分別處理HSC-T6細胞24h和48h,對細胞的增殖抑制率分別為79%和94.5%。流式細胞術檢測HSC-T6細胞凋亡率發(fā)現(xiàn),M-19 40umol/L處理24h,能誘導21.14%的HSC-T6細胞凋亡。四、MAT和M-19特異結合蛋白的研究采用連續(xù)親和色譜法和競爭色譜法從Jurkat或RAW264.7細胞裂解液中分離出23KD的特異性結合蛋白條帶;MALDI-TOF-TOF質譜鑒定特異結合蛋白的多肽序列片段YLPHSAGR ,LTNSMMMHGR,QAVDVSPLR等,與人核糖體蛋白S5（Ribosomal protein S 5,RPS5）匹配,Western blot檢測結果確證RPS5為23KD處特異結合蛋白條帶。由M-19共價結合生物素分離得到的HSC-T6細胞中特異結合蛋白,經(jīng)Western blot確證同樣為RPS5;免疫細胞化學雙標技術檢測表明,在HSC-T6細胞內(nèi)M-19與RPS5特異性結合。五、RPS5與肝纖維化關系研究免疫組織化學和Real-time PCR檢測結果表明,肝纖維化過程中RPS5表達下調(diào),而M-19治療組能顯著抑制其下調(diào)。原代培養(yǎng)肝星狀細胞自發(fā)活化過程中,RPS5 mRNA水平在第3d就降至64%,之后維持該水平至第7d。免疫印跡檢測結果表明,TGF-β1 2ng/ml刺激7天,HSC-T6細胞RPS5的表達逐漸下調(diào)。轉染RPS5 siRNA 335后,HSC-T6細胞Vimentin蛋白表達上調(diào),同時E-cadherin表達下調(diào)?！窘Y論】一、M-19和M-24對RAW264.7細胞的增殖活性抑制作用較小,對LPS刺激RAW細胞釋放TNF-α抑制作用好于苦參堿及同類苦參堿衍生物,并具有抑制NF-кB轉錄活性作用。二、M-19可抑制BDL或DMN肝纖維化大鼠肝組織EMT進程,降低肝臟ECM沉積,具有抗肝纖維化作用。三、M-19抗肝纖維化作用機制與其抑制肝細胞和肝星狀細胞的EMT進程,抑制肝星狀細胞增殖,誘導肝星狀細胞凋亡有關。四、核糖體蛋白S5是苦參堿和M-19的特異結合蛋白。五、核糖體蛋白S5的降低可促進EMT發(fā)生,導致肝纖維化。
羅大有[6]（2011）在《健脾軟肝方抗肝纖維化機理的研究》文中研究說明肝纖維化是肝細胞受到炎癥刺激及發(fā)生壞死時,肝臟內(nèi)纖維結締組織異常增生的一種慢性、漸進性的病理過程,是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)環(huán)節(jié)。有資料表明,肝硬化病人已占我國內(nèi)科總住院人數(shù)的4.3%-14.2%,其病死亡率在消化系統(tǒng)疾病中占居第二位,僅次于惡性腫瘤。肝纖維化是一種慢性、進行性、彌漫性的肝臟病變,各種肝臟病變長期反復發(fā)作均可以導致肝纖維化的生成。因此,能否延緩、阻斷或逆轉肝纖維化的發(fā)展,具有重大的研究和應用意義。健脾軟肝方為現(xiàn)代組方,是根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論“肝病實脾”的理論并結合科學辯證而生成的。健脾軟肝方的組方中包含了太子參、黃芪、白術、土鱉蟲、枳殼、甘草、等多種中藥,本組方中的各單味藥分別具有補脾益氣燥濕,和中緩急,扶正化邪、活血化瘀、通絡理氣,柔肝調(diào)肝等作用。雖然健脾軟肝方在臨床上得到廣泛的應用,但對健脾軟肝方抗肝纖維化機理的研究相對較少。因此,以此作為本實驗的研究基點。本研究首先通過確定健脾軟肝方對四氯化碳大鼠肝纖維化模型的治療作用,通過測定各藥物組的肝指數(shù),用賴氏法檢測各組間ALT、AST的水平以及HE染色法評價各藥物組和模型組間的肝纖維化程度。隨后在同一模型中,檢測健脾軟肝方對大鼠肝纖維化模型中TGF-β/Smad通路、經(jīng)典WNT通路和PI3K通路中相關因子的表達影響。在TGF-β/Smad通路的研究中,利用RT-PCR法檢測健脾軟肝方各劑量組中大鼠TGF-β1基因的表達水平,利用免疫組化法檢測健脾軟肝方各劑量組對TGF-β受體數(shù)目的影響,以及用western blot法檢測各實驗組中肝組織內(nèi)SMAD3和SMAD7蛋白的表達。而在經(jīng)典WNT通路的研究中,以PCR手段檢測所有相關基因的表達,包括了WNT-3a蛋白、FRZ1和β-catenin,同時也檢測了HNF-4和HNF-6基因的表達水平。在PI3K通路的研究中,主要是利用了RT-PCR法檢測了PDGF和PI3K mRNA的表達水平,放免法檢測各劑量組中大鼠血清的cAMP水平,并利用western blot法檢測TIMP-1和MMP-3蛋白的表達水平。此后,再進一步研究脾臟功能的變化對肝纖維化的影響。利用四氯化碳大鼠肝纖維化脾次切除模型,用流式細胞儀來檢測各藥物組大鼠全血中CD4和CD8細胞亞群比例的變化,以及免疫擴散法檢測大鼠血清中IgG的分泌水平。最后通過體外實驗,在測定健脾軟肝方在大鼠星狀細胞HSC-T6細胞的半數(shù)毒性濃度。其TC50為0.128mg/ml,以此為基礎分別設定三個劑量,分別是TC500. 1mg/ml, TC10 0.025mg/ml和TC0 0.00625mg/ml為實驗藥物濃度。用流式細胞儀以觀察健脾軟肝方對大鼠HSC細胞上TRAIL凋亡受體的影響。在本研究中,利用大鼠肝纖維化模型和體外HSC-T6星狀細胞模型相結合,多種檢測手段并從多個方面對健脾軟肝方的機制進行闡述。通過四氯化碳大鼠肝纖維化模型確定健脾軟肝方對肝纖維化的治療作用。在實驗中發(fā)現(xiàn),與模型組相比,健脾軟肝方高劑量110g·kg-1組和中劑量40g·kg-1組均有較好的抗肝纖維化作用。表現(xiàn)在能夠明顯降低肝纖維化大鼠的肝指數(shù),降低ALT和AST水平并且緩解肝纖維化進程。而低劑量組20g·kg-1組對四氯化碳大鼠肝纖維化的治療作用相對較弱。隨后利用四氯化碳大鼠肝纖維化模型,從多個肝纖維化細胞／因子通路對健脾軟肝方的機制進行研究。發(fā)現(xiàn)健脾軟肝方對肝纖維化的TGF-β/Smad通路、經(jīng)典WNT通路和PI3K通路均有調(diào)節(jié)作用。在TGF-β/Smad通路的研究中發(fā)現(xiàn),健脾軟肝方高劑量組、低劑量和中劑量組對肝纖維化大鼠中的TGF-β1的mRNA有明顯的抑制作用,而且能顯著下調(diào)TGF-β受體數(shù)目,并且能夠上調(diào)SMAD3、下調(diào)SMAD7蛋白的表達,調(diào)節(jié)SMAD3/SMAD7比例。模型組中的TGF-β1受體的陽性比例達到了43%,而健脾軟肝方高劑量組和中劑量組中均少于10%的陽性率,明顯低于模型組。而SMAD3/SMAD7蛋白表達比例在模型組為2.01,而健脾軟肝方高劑量組和中劑量組分別1.08、1.32,低劑量組則為1.63,顯示低劑量組對調(diào)節(jié)SMAD蛋白的作用稍弱。在經(jīng)典WNT通路的相關基因的表達中發(fā)現(xiàn),健脾軟肝方各劑量組對WNT-3α的表達均有抑制作用,但主要還是通過上調(diào)FRZ受體來達到肝纖維化的作用。同時,健脾軟肝方還能直接抑制β-catenin的表達。此外,健脾軟肝方高劑量組和中劑量組對HNF-4和HNF-6都具有誘導其表達的作用,與模型組相比,表達明顯增強。在肝纖維化PI3K通路的研究中,主要以PDGF、PI3K基因的表達和TIMP-1、MMP-3蛋白的表達為切入點。發(fā)現(xiàn)健脾軟肝方能夠明顯抑制PDGF、PI3K基因的轉錄水平,提高機體cAMP合成水平,并能調(diào)節(jié)TIMP-1和MMP-3的比例。在模型組中,肝纖維化的cAMP水平為47.69fmol/μl,高劑量組、中劑量組和低劑量組分別為86.57、76.87和69.88fmol/μl。在本研究中,也結合了中醫(yī)理論“肝病實脾”,結合了大鼠肝纖維化中脾臟功能的異常是否與肝纖維化的進程相關。初步研究證實,在大鼠的肝纖維化模型中,大鼠的脾臟功能會出現(xiàn)紊亂,主要表現(xiàn)在CD細胞亞群的失調(diào),IgG過度增高。顯示在肝纖維化進程中,機體的自身的過度免疫或者脾臟功能的紊亂都對肝纖維化有加重作用。在該研究中,利用了四氯化碳大鼠肝纖維化脾次切除模型作為研究對象。發(fā)現(xiàn)在肝纖維化進程中,對大鼠脾臟進行次切除術能夠明顯降低大鼠過度的自身免疫,并且能夠調(diào)節(jié)CD細胞亞群的比例。而健脾軟肝方高劑量組和中劑量組均能有效調(diào)節(jié)機體的免疫能力,防止機體過度自身免疫所造成的肝損傷。其中模型組中的CD4/CD8僅有0.85,而脾次切除組為2.21,健脾軟肝方高劑量組、中劑量組和低劑量組分別為2.36、2.25和1.82。最后在體外HSC-T6細胞系的研究中,利用流式細胞儀發(fā)現(xiàn)健脾軟肝方在0.1mg/ml對細胞上TRAIL凋亡受體的表達有明顯的誘導作用。與正常HSC-T6細胞組TRAIL的陽性率23.88%相比,健脾軟肝方0.1mg/ml組與0.025mg/ml組的陽性率分別為39.14%、32.72%,分別升高15.26%和8.84%。綜合上述,健脾軟肝方可以通過多種渠道發(fā)揮抗肝纖維化的作用。健脾軟肝方可以影響多種細胞信號通道的,可以從TGF-β/Smad通路、經(jīng)典WNT通路和PI3K通路來抑制肝纖維化的進展。同時對機體的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用,可以提高CD4/CD8細胞亞群的比例,并能減弱在肝纖維化過程中機體自身過度的免疫反應對肝臟造成的損傷。同時在凋亡方面,健脾軟肝方可以直接上調(diào)活化HSC-T6細胞上的TRAIL凋亡受體,使活化的HSC-T6細胞進入程序性死亡階段而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。
駱歡歡[7]（2010）在《苦杏仁苷對HSC活化增殖及其相關細胞因子網(wǎng)絡的作用》文中研究指明肝纖維化是一切慢性肝病共同的病理學基礎,當肝細胞發(fā)生壞死,或受到炎癥刺激時,肝內(nèi)纖維結締組織會大量增生,這一病理過程中較輕而可逆者稱為肝纖維化,重者出現(xiàn)假小葉及結節(jié)形成則稱為肝硬化。其間涉及多種細胞的活化增殖或變性、多種細胞因子功能的表現(xiàn)、大量細胞外基質（ECM）的分泌及細胞凋亡等復雜因素的病理生理過程。各種因素之間相互影響、相互交錯,形成肝纖維化的動態(tài)變化網(wǎng)絡。其中ECM成分合成和降解的失衡是導致肝組織重構、發(fā)生纖維化的直接原因,細胞因子及多肽類生長因子等調(diào)控因子是啟動、調(diào)節(jié)肝纖維化發(fā)展的重要因素,細胞凋亡則是肝纖維化逆轉的重要途徑。肝星狀細胞（HSC）是肝臟中的一種非實質細胞,位于Disse間隙內(nèi),形態(tài)不規(guī)則,胞體呈卵圓形,胞質富含維生素A脂滴,核周部分包埋在鄰近肝細胞的隱窩內(nèi),其對肝臟的ECM產(chǎn)生、生長因子合成、基質重建以及竇孔改變等生理過程均可產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn),多種細胞、細胞因子、ECM和非肽類介質（如乙醇、活性氧等）參與HSC的激活和肝纖維化。當肝臟受到物理化學及生物因素刺激時,HSC失去類維生素A,旺盛增殖,合成和分泌大量的ECM成分,如膠原、蛋白多糖和糖蛋白等,細胞的結構也由星狀轉變?yōu)榫哂邪l(fā)達的粗面內(nèi)質網(wǎng)和高爾基復合體的成纖維細胞樣細胞或肌成纖維細胞（MFB）。桃仁性平,味甘、苦,有小毒,歸心、肝、大腸經(jīng),為常用的活血化瘀中藥,具有活血祛瘀,潤腸通便之效,常用于各種肝病血瘀相關證型的復方治療中。既往研究發(fā)現(xiàn),桃仁提取物可通過增加肝血流量,促進I、Ⅲ和Ⅳ型膠原的降解,阻止Ⅰ、Ⅱ型前膠原的沉積,保護脂質過氧化損傷作用等預防肝纖維化的形成?？嘈尤受諡樘胰侍崛∥镒钪饕⒆畛Ｒ姷乃幚沓煞?國內(nèi)、外目前對其抗肝纖維化的藥理研究較少,其開發(fā)和應用空間有待進一步挖掘。研究目的研究苦杏仁苷對HSC的活化增殖及相關細胞因子網(wǎng)絡的作用,以期揭示苦杏仁苷抗纖維化的分子機制。研究方法1苦杏仁苷對HSC增殖及分泌ECM的影響1.1繪制HSC-T6的自然生長曲線將冷凍的HSC-T6細胞株復蘇,恒溫箱培養(yǎng)至細胞呈單層致密狀,胰蛋白酶消化后傳代,待細胞生長穩(wěn)定后,MTT法繪制HSC-T6的自然生長曲線。1.2苦杏仁苷對HSC-T6增殖的影響細胞培養(yǎng)同前,加入低、中、高各劑量級苦杏仁苷,MTT法檢測細胞生長情況。1.3苦杏仁苷對ECM合成的影響用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA,酶聯(lián)免疫法（ELISA）和放射免疫法（RIA）分別檢測Ⅰ型膠原和透明質酸含量。2苦杏仁苷對相關細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用2.1苦杏仁苷對轉化生長因子（TGF）-β1的影響苦杏仁苷對HSC-T6細胞TGF-β1m RNA的影響用RT-PCR檢測,對HSC-T6細胞TGF-β1蛋白的影響用Western Blot法檢測,對TGF-β1受體的影響采用流式細胞技術檢測?？嘈尤受諏GF-β1的下游效應遞質結締組織生長因子（CTGF）m RNA的影響用RT-PCR檢測。2.2苦杏仁苷對血小板源性生長因子（PDGF）的影響苦杏仁苷對HSC-T6細胞PDGFm RNA的影響用RT-PCR檢測,對HSC-T6細胞PDGF蛋白的影響用Western Blot法檢測,對PDGF受體的影響采用流式細胞技術檢測。苦杏仁苷對胰島素樣生長因子（IGF）m RNA的影響用RT-PCR檢測。2.3苦杏仁苷對血管緊張素（Ang）Ⅱ刺激HSC活化的抑制作用苦杏仁苷對AngⅡ刺激HSC活化Ca2+效應的抑制作用采用激光掃瞄共焦顯微鏡（LSCM）檢測,對AngⅡ刺激HSC活化TGF-β1m RNA的抑制作用用RT-PCR檢測,對AngⅡ刺激HSC活化堿性成纖維生長因子（b FGF）表達的抑制作用用免疫組化法檢測。2.4苦杏仁苷對干擾素（IFN）抑制HSC活化的促進作用苦杏仁苷對IFN抑制HSC活化TGF-β1mRNA的促進作用用RT-PCR檢測。研究結果1苦杏仁苷對HSC增殖及分泌ECM的影響1.1苦杏仁苷對HSC-T6增殖的影響10-6mmol/L1mmol/L不同濃度苦杏仁苷作用的OD值比較,差異均無顯著性意義（P>0.05）。正常組與各苦杏仁苷組比較,差異也無顯著性意義（P>0.05）。在藥物作用第5天時,各苦杏仁苷組的細胞生長曲線均未受到抑制,反而出現(xiàn)刺激促進生長增殖的效果,其OD值與正常組比較,差異均有顯著性意義（P<0.05）。但在其他時間段（第1天、3天、7天）,苦杏仁苷各用藥組的細胞生長曲線與正常組相近,其OD值與正常組比較,差異無顯著性意義（P>0.05）。提示苦杏仁苷對HSC-T6的增殖可能未有抑制作用,也沒有明顯的細胞毒性作用。1.2苦杏仁苷對ECM合成的影響各苦杏仁苷組對Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA均有明顯的抑制作用,與正常組比較,差異有顯著性意義（P<0.05）。均以苦杏仁苷中劑量組最為明顯,苦杏仁苷高劑量組次之,苦杏仁苷低劑量組再次之。提示苦杏仁苷對HSC-T6細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原m RNA表達有明顯的抑制作用,但這種抑制作用不與劑量成正比。作用72h時,苦杏仁苷各劑量組Ⅰ型膠原分泌與正常組比較,差異均有顯著性意義（P<0.05）,但苦杏仁苷各組組間比較,差異無顯著性意義（P>0.05）。提示苦杏仁苷作用72h后對Ⅰ型膠原分泌有明顯抑制作用,但這一作用也不呈現(xiàn)劑量依賴。正常組透明質酸分泌曲線與苦杏仁苷低劑量組稍有重疊,位置較苦杏仁苷高、中劑量組分泌曲線高,提示苦杏仁苷高、中劑量組均有抑制透明質酸分泌的趨勢（P>0.05）,但效果并不顯著。2苦杏仁苷對相關細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用2.1苦杏仁苷對TGF-β1的影響乙醛組對TGF-βm RNA有一定促進作用,但與正常組比較,差異無顯著性意義（P>0.05）。乙醛組對CTGFm RNA也有明顯促進作用,與正常組比較,差異有顯著性意義（P<0.05）。各苦杏仁苷組對TGF-βm RNA、CTGFm RNA則均有非常明顯的抑制作用,與乙醛組比較,差異均有顯著性意義（P<0.05）;各苦杏仁苷組組間比較,TGF-βm RNA差異均有顯著性意義（P<0.05）,CTGFm RNA苦杏仁苷高、中劑量組與低劑量組比較,差異均有顯著性意義（P<0.05）,但苦杏仁苷高、中劑量組組間比較,差異無顯著性意義（P>0.05）。提示苦杏仁苷對乙醛作用下的HSC-T6細胞TGF-βm RNA及CTGF m RNA均有明顯的抑制作用,且這種抑制作用與劑量成正比。乙醛組對TGF-β蛋白表達有明顯促進作用,各苦杏仁苷組對TGF-β蛋白表達,無論在24h還是72h,則均有非常明顯的抑制作用。24h時以苦杏仁苷高劑量組最為明顯,苦杏仁苷中劑量組次之,苦杏仁苷低劑量組再次之;72h時以苦杏仁苷高劑量組最為明顯,苦杏仁苷低劑量組次之,苦杏仁苷中劑量組再次之。提示苦杏仁苷對乙醛作用下的HSC-T6細胞TGF-β蛋白表達有明顯的抑制作用,且這種抑制作用有可能與劑量成正比。正常組TGF-β1受體表達非常微弱,乙醛組對TGF-β1受體表達有明顯促進作用;各苦杏仁苷組對TGF-β1受體表達均有明顯的抑制作用,但苦杏仁苷高、中、低劑量組間不存在遞進關系。提示乙醛可顯著刺激HSC細胞TGF-β1受體表達,苦杏仁苷對乙醛作用下的HSC-T6細胞TGF-β1受體表達有明顯的抑制作用,但這種抑制作用可能并不與劑量成正比。2.2苦杏仁苷對PDGF的影響苦杏仁苷高劑量組對PDGFm RNA、IGFm RNA有較明顯的抑制作用,與正常組比較,差異有顯著性意義（P<0.05）,與苦杏仁苷中、低劑量組比較,差異也有顯著性意義（P<0.05）。但苦杏仁苷中、低劑量組未表現(xiàn)出抑制作用（P>0.05）。提示苦杏仁苷在高劑量對HSC-T6細胞PDGFm RNA和IGFm RNA有明顯的抑制作用,但中、低劑量則無,可能這種抑制作用與劑量有關。各苦杏仁苷組對PDGF蛋白表達,無論在24h、48h還是72h,均有非常明顯的抑制作用,各時間點均以苦杏仁苷高劑量組最為明顯,苦杏仁苷中劑量組次之,苦杏仁苷低劑量組再次之。提示苦杏仁苷對HSC-T6細胞PDGF蛋白表達有明顯的抑制作用,且這種抑制作用有可能與劑量成正比。正常組、各苦杏仁苷組PDGFR-α和PDGFR-β的表達都極其微弱,且均相差無幾。2.3苦杏仁苷對AngⅡ刺激HSC活化的抑制作用LSCM下Ca2+熒光成像的HSC-T6細胞仍可部分表現(xiàn)普通倒置顯微鏡下的形態(tài)學特征,AngⅡ組Ca2+熒光強度非常明顯,清晰可見;正常組強度也較明顯,稍次于AngⅡ組;苦杏仁苷高劑量組強度也較強,稍次于AngⅡ組和正常組,但區(qū)別不甚明顯;苦杏仁苷中、低劑量組強度明顯減弱,并可見大量Ca2+噬斑出現(xiàn)。Ca2+熒光強度相對值的統(tǒng)計分析也反應上述結果。AngⅡ組對TGF-βm RNA有一定促進作用,但與正常組比較,差異無顯著性意義（P>0.05）。各苦杏仁苷組對TGF-βm RNA則均有明顯的抑制作用,與AngⅡ組比較,高、中劑量組差異均有顯著性意義（P<0.05）,而低劑量組僅有抑制趨勢,差異并無顯著性意義（P>0.05）。提示AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6細胞TGF-βm RNA作用,但不甚明顯;而苦杏仁苷對AngⅡ作用下的HSC-T6細胞TGF-βm RNA有明顯的抑制作用,且這種抑制作用與劑量成正比。AngⅡ組、正常組、各苦杏仁苷組均未見b FGF的陽性表達。2.4苦杏仁苷對干擾素IFN抑制HSC活化的促進作用IFN組對TGF-βm RNA有明顯的抑制作用,與正常組比較,差異有顯著性意義（P>0.05）;而苦杏仁苷各劑量組與正常組比較,差異無顯著性意義（P>0.05）?？嘈尤受罩小⒌蛣┝拷M與IFN組比較,差異有顯著性意義（P<0.05）;而苦杏仁苷高劑量組與IFN組比較,差異則無顯著性意義（P>0.05）。提示IFN確實有強烈的抑制TGF-βm RNA效果;但苦杏仁苷對這一效果不但沒有協(xié)同促進作用,反而對這一效果可能有一定的抑制作用。結論1苦杏仁苷對HSC增殖及分泌細胞外基質（ECM）的影響苦杏仁苷對HSC-T6的增殖可能未有抑制作用,且在第5天苦杏仁苷反而明顯刺激HSC-T6的增殖,考慮可能由于苦杏仁苷對HSC-T6有提前生長曲線而促進凋亡的作用。同時,苦杏仁苷對HSC-T6沒有明顯的細胞毒性作用?？嘈尤受諏SC-T6細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達有明顯的抑制作用,但這種抑制作用不與劑量成正比;HSC-T6分泌Ⅰ型膠原作用的研究也印證了上述結果;苦杏仁苷對透明質酸分泌的抑制作用可能存在,但不顯著?？嘈尤受諏SC-T6細胞活化后的分泌功能有抑制作用,此可能是其抗肝纖維化的主要機制之一。2苦杏仁苷對相關細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)作用加入乙醛刺激后的HSC-T6細胞TGF-βmRNA、CTGFmRNA有所增加,表明乙醛可刺激HSC增殖,導致纖維結締組織增生和降解失去平衡,肝臟ECM異常沉積,是酒精性肝纖維化發(fā)生的關鍵因素?？嘈尤受諏GF-βm RNA、CTGFm RNA均有非常明顯的抑制作用,并且呈現(xiàn)劑量依賴模式;且TGF-β、CTGF具有相關系的變化趨勢。苦杏仁苷對TGF-β蛋白及其受體表達均有明顯的抑制作用,其中在蛋白表達的抑制作用方面,與對TGF-βm RNA影響一致的呈現(xiàn)一定的劑量依賴模式。在TGF-β受體的抑制作用方面,效果也較為顯著,但不存在劑量依賴模式?？嘈尤受諏SC-T6細胞TGF-β、CTGF細胞因子的序貫抑制作用,是其參與抗肝纖維化細胞因子網(wǎng)絡的重要切入點?？嘈尤受諏DGF、IGFm RNA均有明顯的抑制作用,這種抑制作用可能與劑量有相關性,且PDGF、IGF具有相關系的變化趨勢?？嘈尤受战M對PDGF蛋白表達的明顯抑制作用也呈現(xiàn)出一定的劑量依賴的模式,與RT-PCR研究結果一致。但在PDGF受體的抑制作用方面,則未見明顯效果?？嘈尤受找部赏ㄟ^影響PDGF及IGF來參與抗肝纖維化細胞因子網(wǎng)絡的調(diào)控。AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6細胞活化Ca的效應,但不甚明顯。這可能與AngⅡ刺激作用有限有關,也可能是由于其他因素導致HSC生物轉化功能下降的原因?？嘈尤受諏ngⅡ作用下的HSC-T6細胞活化Ca2+效應有明顯的抑制作用,可能是由于苦杏仁苷可以阻斷或抑制HSC的AngⅡ信號轉導通路,從而抑制了HSC內(nèi)Ca2+升高的作用,并因此抑制了HSC的活化與增殖。AngⅡ還可能存在一定的刺激HSC-T6細胞TGF-βm RNA表達作用,但不甚明顯,未及前面實驗中的乙醛刺激。同樣,AngⅡ也不能有效刺激b FGF蛋白的表達,也進一步說明了這一結果。而苦杏仁苷對AngⅡ作用下的HSC-T6細胞TGF-βm RNA表達有明顯的抑制作用,且這種抑制作用與劑量成正比,再次證明了前文的研究結果。在肝纖維化發(fā)生發(fā)展的過程中,常伴有腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的異常激活,對病情發(fā)展起著重要的促進作用,故AngⅡ也是肝纖維化細胞因子網(wǎng)絡的重要調(diào)控因子。而本研究證明,苦杏仁苷也可通過這一環(huán)節(jié)來起到抗肝纖維化的作用。IFN-γ對TGF-βm RNA有明顯的抑制作用,但苦杏仁苷對IFN-γ的抗肝纖維化效果不但沒有協(xié)同促進作用,反而可能有一定的抑制作用。
紀輝[8]（2010）在《姜黃素預防性治療肝纖維化的機制》文中研究說明肝纖維化（hepatic fibrosis）是指各種致病因素引起肝臟損害和炎癥,在修復過程中導致肝臟細胞外基質（extracellular matrix,ECM）異常增多和過度沉積的病理過程。肝纖維化是可以逆轉的,對其逆轉因素的研究可為了解肝纖維化進程及其發(fā)生機制提供重要線索。目前對肝纖維化的治療尚無行之有效的方案,因此,肝纖維化防治仍是肝病治療的重點難點。姜黃素（Curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃中提取的一種黃色酸性酚類物質,是姜黃發(fā)揮藥理作用的主要活性成分。目前認為,姜黃素在防治肝纖維化過程中有非常廣闊的應用前景,但對其姜黃素的作用機制及臨床制劑方面的研究還有待進一步深入。本研究通過CCl4致肝損傷并導致肝纖維化的動物模型,并結合體外HSC培養(yǎng),系統(tǒng)探討姜黃素對大鼠實驗性肝纖維化的防治作用,并對其機制作深入探討,為姜黃素的應用提供理論依據(jù)。本研究主要得到以下結論:⑴姜黃素對CCl4所致大鼠肝損傷有保護作用,有利于維持肝臟正常形態(tài),保護肝臟功能;⑵姜黃素體內(nèi)、體外均顯示出抑制肝臟過度表達ECM,從而實現(xiàn)其保護肝臟功能,維系肝臟正常結構的作用;⑶姜黃素可抑制重要的致纖維化因子TGF-β和CTGF mRNA的表達,提示TGF-β和CTGF是姜黃素防治肝纖維化的治療靶點之一;⑷姜黃素可抑制實驗性肝纖維化大鼠肝臟及體外培養(yǎng)HSC EGF的表達,從而抑制HSC增殖并促進其調(diào)亡;⑸MAPK途徑是參與肝纖維化的重要信號轉導途徑之一,姜黃素可干擾其中多種信號蛋白的表達,從而抑制MAPK信號系統(tǒng)的功能,抑制或延緩肝纖維化的進程?？傊?本研究結果顯示,姜黃素對保護肝臟功能、延緩肝纖維化進程有重要作用,但該作用不是通過單一途徑進行的,而是通過包括抑制MAPK信號通路在內(nèi)的多個靶點實現(xiàn)的。
江遠[9]（2009）在《鐵沉積于HSC細胞與肝纖維化相關性研究及復方肝毒清的干預作用》文中研究指明一、目的鐵沉積與肝纖維化的關系密切,其在肝纖維化的發(fā)生、持續(xù)及進展中發(fā)揮著重要作用。本研究以肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)一肝星狀細胞（HSC）活化為切入點,通過建立鐵沉積HSC細胞模型,研究鐵沉積于HSC細胞對HSC細胞α-SMA蛋白表達和Ⅰ型膠原、TGF-β1 mRNA的表達以及對HSC細胞凋亡的影響,開展鐵沉積于HSC細胞對肝纖維化的影響及復方肝毒清干預作用的研究。用二甲基亞硝胺（DMN）建立大鼠肝纖維化模型,以大鼠血清鐵蛋白、轉鐵蛋白及肝組織肝鐵濃度作為大鼠鐵負載的評價指標,并通過普魯士藍和α-SMA雙染色,對HSC細胞鐵沉積進行定位,明確HSC細胞鐵沉積與肝纖維化之間的聯(lián)系;進一步通過研究HSC細胞活化相關因子TGFβ1 mRNA的表達,初步明確鐵沉積于HSC細胞在大鼠肝纖維化中的作用。從組織病理學、細胞學及分子水平開展鐵沉積于HSC細胞與肝纖維化的相關性研究,試圖闡明鐵沉積于HSC細胞促進肝纖維化的發(fā)病機理。體內(nèi)外分別以中藥湯劑復方肝毒清對鐵沉積HSC細胞模型和DMN誘導的肝纖維化大鼠模型進行干預,試圖闡明以扶正利濕解毒為治療原則的復方肝毒清對鐵沉積于HSC細胞促進肝纖維化的影響。二、方法（一）細胞實驗:鐵沉積于HSC細胞對肝纖維化的影響及復方肝毒清的干預作用1.建立鐵沉積HSC細胞模型以HSC-T6細胞為模式細胞系,培養(yǎng)于6孔板,每孔中均置入1.8cm之正方形蓋玻片（無菌處理）,將細胞分為鐵沉積模型組、鐵沉積模型+去鐵銨組、正常對照組共3組,每組重復2孔。根據(jù)細胞毒性實驗,選擇25μM的檸檬酸鐵胺（FAC）作為實驗濃度。待細胞貼壁長滿后鐵沉積模型組中加入FAC;鐵沉積模型+去鐵銨組中分別按照摩爾數(shù)1:1加入FAC和去鐵銨;正常對照組為正常培養(yǎng)的HSC-T6細胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后行普魯士藍染色。2.鐵沉積于HSC細胞對其活化和轉歸的影響及去鐵銨的干預作用HSC-T6細胞分為正常對照組、鐵沉積模型組、50μM去鐵銨組、25μM去鐵銨組。正常對照組為正常培養(yǎng)的HSC-T6細胞,鐵沉積模型組為經(jīng)25μM FAC處理并證實鐵沉積的HSC-T6細胞,50μM去鐵銨組、25μM去鐵銨組為分別經(jīng)50μM和25μM去鐵銨處理的HSC-T6細胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,免疫組化檢測α-SMA的表達;定量PCR法檢測細胞Ⅰ型膠原、TGF-β1 mRNA的表達;TUNEL法檢測HSC-T6細胞的凋亡;電鏡觀察HSC-T6細胞超微結構。3.復方肝毒清對鐵沉積誘導HSC細胞活化和轉歸的干預作用HSC-T6細胞分為正常對照組、鐵沉積模型組、鐵沉積模型+中藥組。正常對照組為正常培養(yǎng)的HSC-T6細胞,鐵沉積模型組為經(jīng)25μM FAC處理并證實鐵沉積的HSC-T6細胞,鐵沉積模型+中藥組為復方肝毒清（按細胞毒性實驗確定的最大無毒濃度）處理的鐵沉積模型組HSC-T6細胞。溫育24小時后,免疫組化檢測α-SMA的表達;定量PCR法檢測HSC-T6細胞TGF-β1 mRNA的表達;TUNEL法檢測HSC-T6細胞的凋亡;電鏡觀察HSC-T6細胞超微結構。（二）動物實驗:鐵沉積于HSC細胞在DMN誘導大鼠肝纖維化中的作用及復方肝毒清的干預機理75只SD大鼠隨機分為空白對照組（12只）、模型組（15只）、模型+去鐵銨組（12只）、模型+秋水仙堿組（12只）、模型+中藥復方肝毒清大劑量組（12只）、模型+中藥復方肝毒清小劑量組（12只）共6組。鐵沉積大鼠肝纖維化模型造模方法為:用生理鹽水配制1:100（V/V）的二甲基亞硝胺（DMN）稀釋溶液,每周前3天對大鼠進行腹腔注射,劑量為10μL DMN/kg體重,共4周,空白對照組腹腔注射生理鹽水。從造模第2周開始,模型+秋水仙堿組按照秋水仙堿0.1mg/kg體重灌胃,1次/日×3周;模型+中藥復方大、小劑量組分別以20g/kg、5g/kg體重灌胃,1次/日×3周。模型組及空白對照組均灌胃生理鹽水10ml/kg,1次/日×3周。從造模第3周開始,模型+去鐵銨組以去鐵銨100mg/kg腹腔注射,3次/周×2周。從開始造模到試驗結束觀察記錄動物死亡情況。實驗結束時摘眼球取血收集血清,并取左前葉肝臟,部分置于Bouin’s固定液中固定,另取50mg左右肝組織洗凈后置于Trizol中并凍存于—70℃待檢,剩余部分—70℃冷凍保存。取肝組織左葉分別行HE染色、Masson染色、普魯士藍染色、普魯士藍和α-SMA雙染色作組織病理學觀察;電鏡觀察肝組織超微結構;ELISA法檢測大鼠血清鐵蛋白、轉鐵蛋白;采用火焰原子吸收光譜法測定大鼠肝組織肝鐵濃度;采用AU400型奧林巴斯全自動生化分析儀測定肝功能、血清鐵和血脂;定量PCR法檢測TGF-β1 mRNA的表達。三、結果（一）細胞實驗:鐵沉積于HSC細胞對肝纖維化的影響及復方肝毒清的干預作用1.建立鐵沉積HSC細胞模型經(jīng)普魯士藍染色后,鏡下HSC細胞核呈紅色,鐵沉積模型組細胞可見藍色鐵顆粒沉積于細胞質中,鐵沉積模型+去鐵銨組細胞質中亦見不同程度藍色鐵顆粒沉積,但較鐵沉積模型組明顯減少。正常對照組細胞未見鐵顆粒沉積。2.鐵沉積于HSC細胞對其活化和轉歸的影響及去鐵銨的干預作用免疫組化結果顯示,鏡下可見正常對照組HSC細胞明顯活化,α-SMA大量表達。鐵沉積模型組HSC細胞α-SMA亦大量表達。而去鐵銨組HSC細胞α-SMA表達較正常對照組和鐵沉積模型組明顯減少,說明細胞活化受到不同程度抑制。HSC細胞Ⅰ型膠原、TGF-β1 mRNA表達結果顯示,與對照組比較,鐵沉積模型組Ⅰ型膠原mRNA表達顯著增強（P＜0.01）,而TGF-β1 mRNA表達無顯著差異（P＞0.05）。50μM去鐵銨和25μM去鐵銨均能下調(diào)Ⅰ型膠原、TGF-β1 mRNA的表達（P＜0.01）,且50μM去鐵銨組優(yōu)于25μM去鐵銨組（P＜0.01）。提示去鐵治療能在轉錄水平抑制Ⅰ型膠原和TGF-β1的分泌。HSC細胞凋亡的病理結果顯示,正常對照組、鐵沉積模型組HSC細胞未見或僅見有較少細胞發(fā)生凋亡。而去鐵銨組HSC細胞則見明顯細胞凋亡,凋亡細胞的細胞核呈棕褐色,并可見凋亡小體。電鏡結果顯示,正常對照組HSC細胞內(nèi)細胞器結構如線粒體、粗面內(nèi)質網(wǎng)形態(tài)正常。鐵沉積模型組出現(xiàn)大批雙核細胞,細胞質中線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器明顯減少。去鐵銨組HSC細胞發(fā)生凋亡,其特點是凋亡細胞形態(tài)變小,核染色體堆積,線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器明顯減少,代之以大量空泡。3.復方肝毒清對鐵沉積誘導HSC細胞活化和轉歸的干預作用免疫組化結果顯示,鐵沉積模型+中藥組HSC細胞α-SMA表達較正常對照組和鐵沉積模型組明顯減少,說明細胞活化受到不同程度抑制。HSC細胞TGF-β1 mRNA表達結果顯示,鐵沉積模型+中藥組TGF-β1 mRNA的表達不同程度下調(diào)（P＜0.05）,提示中藥復方能在轉錄水平抑制TGF-β1的分泌。HSC細胞凋亡的病理結果顯示,鐵沉積模型+中藥組HSC細胞可見明顯細胞凋亡,凋亡細胞的細胞核呈棕褐色,并可見凋亡小體。電鏡結果顯示,鐵沉積模型+中藥組HSC細胞發(fā)生凋亡,其特點是凋亡細胞形態(tài)變小,核染色體堆積,線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器明顯減少,代之以大量空泡。（二）動物實驗:鐵沉積于HSC細胞在DMN誘導大鼠肝纖維化中的作用及復方肝毒清的干預機理1.DMN誘導的肝纖維化大鼠血清鐵蛋白、轉鐵蛋白的變化:對大鼠血清鐵蛋白、轉鐵蛋白的檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組血清鐵蛋白明顯增加（P＜0.05）,模型+去鐵銨組血清鐵蛋白有所減少,但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;而與模型組比較,模型+去鐵銨組血清鐵蛋白明顯減少,有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。就轉鐵蛋白而言,與對照組比較,模型組血清轉鐵蛋白明顯減少（P＜0.01）,模型+去鐵銨組血清鐵蛋白雖有所減少,但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）:與模型組比較,模型+去鐵銨組血清轉鐵蛋白明顯增加,有統(tǒng)計學意義（P=0.01）。結果表明,在鐵沉積大鼠模型中,鐵含量增加伴隨著血清轉鐵蛋白水平減少。2.DMN誘導的肝纖維化大鼠肝組織肝鐵濃度的變化:對大鼠肝組織肝鐵濃度的檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組和模型+去鐵銨組肝鐵濃度明顯增加（P＜0.01或P＜0.05）,而與模型組比較,模型+去鐵銨組肝鐵濃度明顯減少（P＜0.05）。3.DMN誘導的肝纖維化大鼠中鐵沉積于HSC細胞的組織病理學觀察:普魯士藍染色結果顯示,在模型組,深藍色鐵顆粒主要沿小葉間隔分布,且大部分鐵沉積在細胞外;模型+去鐵銨組鐵顆粒分布較模型組有所減少;正常組肝細胞排列整齊,無鐵負載。普魯士藍和α-SMA雙染色結果顯示,與深藍色鐵顆粒分布一致,在壞死區(qū)周圍,可見大量α-SMA表達陽性的HSC細胞,并且鐵顆粒沉積于HSC細胞中。4.去鐵治療和中藥復方對DMN誘導的肝纖維化大鼠肝功能、血清鐵和血脂的影響:大鼠肝功能、血清鐵和血脂的檢測結果發(fā)現(xiàn),模型組ALT明顯升高（P＜0.01）,同時ALB、G水平顯著降低（P＜0.01）。去鐵銨、秋水仙堿、中藥大小劑量均能降低ALT水平,其中,去鐵銨、中藥大小劑量組優(yōu)于秋水仙堿組（P＜0.01或P＜0.05）。就降低AST水平而言,去鐵銨和中藥小劑量組無顯著差異（P＞0.05）,但均優(yōu)于秋水仙堿組（P＜0.01或P＜0.05）。對于提升ALB水平,中藥大劑量組優(yōu)于去鐵銨、秋水仙堿和中藥小劑量組（P＜0.01或P＜0.05）。對于G而言,去鐵銨、秋水仙堿、中藥小劑量均能降低G水平（P＜0.01或P＜0.05）。另外,去鐵銨能顯著降低血清鐵和TG水平（P＜0.01或P＜0.05）,而秋水仙堿和中藥大小劑組均不能降低血清鐵、TG和CHOL（P＞0.05）。5.去鐵治療和中藥復方對DMN誘導的肝纖維化大鼠肝組織病理學的影響:HE染色結果顯示,正常對照組肝臟肝板以中央靜脈為中心呈條索狀,向四周放射樣排列,板間有不規(guī)則肝竇,分布規(guī)律,無膠原纖維存在。模型組肝細胞變性壞死,肝小葉結構破壞,纖維結締組織增生,假小葉形成。在纖維化組織周圍可見出血性壞死,并可見棕褐色顆粒樣物質（鐵）沉積在肝組織中。模型+去鐵銨組、模型+秋水仙堿組、模型+中藥大劑量組、模型+中藥小劑量組肝細胞變性壞死有所減輕,纖維結締組織、假小葉形成均不同程度減少。Masson染色結果顯示,正常組僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見少量膠原纖維。模型組大鼠肝組織膠原增生明顯,大量較厚的纖維間隔,向肝小葉內(nèi)伸展,分割包繞肝組織,形成假小葉。模型+去鐵銨組、模型+秋水仙堿組、模型+中藥大劑量組、模型+中藥小劑量組大鼠纖維組織增生程度明顯減輕,纖維間隔變窄,著色淺,假小葉較少。電鏡下觀察,正常對照組大鼠肝細胞呈多面體,肝細胞內(nèi)細胞器結構如線粒體、粗面內(nèi)質網(wǎng)形態(tài)正常,肝細胞核為圓形或橢圓形,雙層膜完整,核孔清楚。鐵沉積模型組肝細胞內(nèi)可見大量脂滴,Disse腔充滿大量紅細胞,其它肝細胞結構變化包括線粒體空泡化,內(nèi)質網(wǎng)擴張,呈大囊泡。模型+去鐵銨組肝細胞可見脂滴與紅細胞明顯減少,核染色體堆積,細胞形態(tài)變小,線粒體、內(nèi)質網(wǎng)等細胞器明顯減少。模型+秋水仙堿組、模型+中藥大劑量組、模型+中藥小劑量組脂肪變性和出血較鐵沉積模型組不同程度減輕。6.去鐵治療和中藥復方對DMN誘導的肝纖維化大鼠肝組織膠原的影響:對鐵沉積大鼠肝組織膠原的Ridit分析顯示,6組總體平均Ridit值不等或不全相等（χ2=44.2236,v=5,P＜0.01）。進一步進行多樣本兩兩比較的秩和檢驗（采用Nemenyi法）,結果顯示,與對照組比較,模型組、模型+秋水仙堿組、模型+中藥小劑量組膠原沉積顯著增強（P＜0.05）;但與模型組比較,模型+去鐵銨組、模型+中藥小劑量組膠原沉積明顯減少（P＜0.05）;與模型+去鐵銨組比較,模型+秋水仙堿組、模型+中藥大劑量組、模型+中藥小劑量組膠原沉積無顯著差異（P＞0.05）。7.去鐵治療和中藥復方對DMN誘導的肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1 mRNA表達的影響:大鼠肝組織TGF-β1 mRNA的表達結果顯示,與對照組比較,模型組及其它各處理組TGF-β1 mRNA表達顯著增強（P＜0.01）;但與模型組比較,模型+去鐵銨組、模型+秋水仙堿組、模型+中藥小劑量組、模型+中藥大劑量組TGF-β1mRNA表達明顯下降（P＜0.01）;對于下調(diào)TGF-β1 mRNA的表達,去鐵銨、中藥大、小劑量明顯優(yōu)于秋水仙堿（P＜0.01）;其中,模型+中藥大劑量組與模型+中藥小劑量組相比較,無顯著差異（P＞0.05）。四、結論1.細胞實驗:外源性鐵能夠沉積于HSC細胞,誘導HSC細胞活化并促進肝纖維化的持續(xù)進展。去鐵銨能使HSC細胞活化受到不同程度抑制,甚至誘導其轉為靜止或發(fā)生細胞凋亡。復方肝毒清能在體外發(fā)揮抗肝纖維化作用,其機理與其通過抑制TGFβ1的分泌,抑制HSC細胞活化;誘導HSC細胞轉為靜止或發(fā)生細胞凋亡有關。2.動物實驗:在DMN誘導的肝纖維化大鼠中,伴隨著膠原的沉積和肝細胞變性壞死,鐵不僅沉積于肝組織,而且鐵沉積于HSC細胞;用去鐵銨治療后,肝組織鐵沉積明顯減少,肝組織膠原染色程度和肝細胞變性壞死明顯減輕,TGF-β1 mRNA表達下調(diào),提示肝組織鐵沉積是DMN誘導的大鼠肝纖維化形成的促進因素之一,其機制與鐵沉積于HSC細胞并促進HSC細胞活化有關。復方肝毒清能保護肝細胞,改善肝功能;在轉錄水平抑制TGFβ1的分泌,抑制HSC細胞活化;抑制膠原纖維的增生,從而起到抗肝纖維化作用。
李鵬[10]（2008）在《藍玉簪顆粒對肝纖維化的治療作用研究》文中研究表明目的纖維化（fibrosis）可發(fā)生于多種器官,引起器官內(nèi)纖維結締組織增生,實質細胞減少,持續(xù)進展可導致器官結構破壞和功能減退,直至器官衰竭,嚴重影響人類健康。器官纖維化（organ fibrosis）一直是世界醫(yī)學的研究熱點問題之一。糖皮質激素是目前治療肝纖維化的常規(guī)用藥物,但它可以引起嚴重的免疫系統(tǒng)紊亂和骨代謝疾病。目前開展的中藥治療纖維化的研究已初步顯示了中藥在防治各種器官（肺臟、肝臟、心臟等）纖維化方面的良好前景。藍玉簪龍膽是一種藏族常用的治療肺部感染的草藥。我們的研究證實其在博萊霉素誘導的動物肺纖維化治療中,具有對抗和治療肺纖維化的作用,并且不具有糖皮質激素副作用（國家發(fā)明專利申請?zhí)?200510042636.3）。本實驗的目的是用藍玉簪顆粒對二甲基亞硝胺（DMN）誘導的實驗性肝纖維化進行干預,并觀察其對肝纖維化的治療作用,初步探討其作用機理,試圖為臨床肝纖維化的尋找新的藥物。方法（1）30只大鼠隨機分為5組,每組6只:正常對照組、二甲基亞硝胺模型組（DMN組）;藍玉簪龍膽治療組（LYZ組）;強的松治療組（強的松組）;藍玉簪龍膽+強的松治療組（LYZ+強組）。參照JENKINS等介紹的制備DMN誘導大鼠肝纖維化模型的方法。同時正常對照組按2 ml/kg體重劑量腹腔注射生理鹽水,DMN組、LYZ組、強的松組、LYZ+強組按2 ml/kg體重劑量腹腔注射（5 mg/L）DMN溶液,每周連續(xù)注射3 d,共4 wk。其中正常對照組按2 ml/kg體重劑量腹腔注射生理鹽水,其余各組按2 ml/kg體重劑量腹腔注射（5 mg/L）DMN溶液,每周連續(xù)注射3 d,共4 wk,造模同時按分組給與藥物干預。于建模后28d腹主動脈放血處死各組動物,迅速摘取肝臟,右葉肝制成組織勻漿進行生化檢測,左葉肝投入10%甲醛中固定,常規(guī)包埋,切片,進行HE、MASSON染色,光學顯微鏡下觀察觀察纖維化的程度。肝組織勻漿后進行超氧化物歧化酶（SOD）、單胺氧化酶（MAO）活力、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量檢測。血清用于谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）及透明質酸（HA）的測定。（2）42只大鼠隨機分為6組:正常對照組6只;二甲基亞硝胺模型組6只（DMN組）;強的松治療組6只（強的松組）;藍玉簪顆粒高劑量組8只（KL高劑量組）;藍玉簪顆粒中劑量組8只（KL中劑量組）;藍玉簪顆粒低劑量組8只（KL低劑量組）。建立DMN誘導的肝纖維化動物模型,建模當日對各組動物進行治療:正常對照組:每日按體重0.5ml/100g生理鹽水灌胃;二甲基亞硝胺對照組（DMN組）:每日按體重0.5ml/100g生理鹽水灌胃;強的松治療組:將強的松片研成粉末,加蒸餾水配制成0.06%的溶液,參照文獻按6mg/kg進行灌胃;藍玉簪顆粒高劑量組（KL高劑量組）:藍玉簪顆粒由第四軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院藥劑科制作,主要成分為藍玉簪龍膽,輔以三七總苷。每日按4 g生藥?kg體重灌胃;藍玉簪顆粒中劑量組（KL中劑量組）:每日按2 g生藥?kg體重灌胃;藍玉簪顆粒低劑量組（KL低劑量組）:每日按1 g生藥?kg體重灌胃。于建模后28d腹主動脈放血處死各組動物,迅速摘取肝臟,右葉肝制成組織勻漿進行生化檢測,左葉肝投入10%甲醛中固定,常規(guī)包埋,切片,進行HE、MASSON染色,光學顯微鏡下觀察觀察纖維化的程度。肝組織勻漿后進行超氧化物歧化酶（SOD）、單胺氧化酶（MAO）活力、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量檢測。血清用于谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）及透明質酸（HA）的測定。結果:（1）與正常對照組比較,模型對照組血清ALT與HA均明顯增高, （P<0.05）。藍玉簪治療組（LYZ）較模型對照組ALT與HA明顯下降（P<0.05）,強的松治療組與藍玉簪和強的松聯(lián)合用藥治療組與模型對照組相比ALT和HA顯著降低（P<0.05）。DMN組SOD、GSH活力均顯著地低于正常對照組（P<0.05）,MAO活力顯著的高于正常對照組,MDA也高于正常對照組,但沒有顯著差別;強的松組SOD、GSH活力顯著低于正常對照組和LYZ組,與DMN組沒有顯著性差異, MAO、MDA活力顯著地低于DMN對照組（P<0.05）,其中MDA活力也顯著低于正常對照組。（2）與正常對照組比較,模型對照組血清ALT與HA均明顯增高, （P<0.05）。藍玉簪顆粒各治療組較模型對照組ALT與HA明顯下降（P<0.05）,強的松治療組與模型對照組相比ALT和HA顯著降低（P<0.05）。DMN組SOD、GSH活力均顯著地低于正常對照組（P<0.05）,MAO、MDA活力顯著的高于正常對照組,但沒有顯著差別;藍玉簪顆粒高劑量組SOD、GSH活力顯著地高于DMN組（P<0.05）,較正常對照組沒有顯著差別;MAO、MDA活力顯著地低于DMN對照組（P<0.05）,與正常對照組沒有顯著性差異;強的松組SOD、GSH活力顯著低于正常對照組和藍玉簪顆粒組,與DMN組沒有顯著性差異, MAO、MDA活力顯著地低于DMN對照組（P<0.05）,其中MDA活力也顯著低于正常對照組;藍玉簪顆粒治療組較激素組效果明顯,且有一定的劑量依賴性;HE和MASSON染色觀察到肝纖維化程度改善。結論本課題的實驗結果表明,藍玉簪顆粒和強的松均對二甲基亞硝胺誘導的大鼠肝纖維化有一定的預防、治療作用。其中藍玉簪顆?？蓽p輕肝組織中脂質過氧化反應,清除氧自由基并抑制其生成,并削弱炎癥反應,減少炎癥細胞的滲出,在肝纖維化形成的早期發(fā)揮作用,提示其治療作用機理是通過改善氧化與抗氧化平衡,抑制炎癥反應,以達到減輕或抑制肝纖維化的形成。
二、IFN-α對大鼠肝纖維化間質膠原酶基因表達的調(diào)控（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結構并詳細分析其設計過程。在該MMU結構中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結構映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉換過程,TLB結構組織等。該MMU結構將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關信息。
實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關系。
文獻研究法：通過調(diào)查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學理論和實踐的需要提出設計。
定性分析法：對研究對象進行“質”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。
跨學科研究法：運用多學科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。
功能分析法：這是社會科學用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、IFN-α對大鼠肝纖維化間質膠原酶基因表達的調(diào)控（論文提綱范文）
（1）基于濁毒理論的肝復健方抗大鼠肝纖維化作用及機制研究（論文提綱范文）
| 目錄 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文縮寫 |
| 引言 |
| 第一部分 濁毒理論與肝纖維化 |
| 濁毒理論的提出和形成 |
| 濁毒的致病特點 |
| 濁毒證的臨床表現(xiàn) |
| 肝纖維化濁毒證生物學基礎研究 |
| 肝纖維化濁毒證證治規(guī)律研究 |
| 小結 |
| 參考文獻 |
| 第二部分 肝復健方對肝纖維化大鼠病理形態(tài)學和血清標志物的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結果 |
| 附圖 |
| 附表 |
| 討論 |
| 小結 |
| 參考文獻 |
| 第三部分 肝復健方對肝纖維化大鼠瘦素及瘦素受體表達的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結果 |
| 附圖 |
| 附表 |
| 討論 |
| 小結 |
| 參考文獻 |
| 第四部分 肝復健方對肝纖維化大鼠 MMP-1 表達的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結果 |
| 附圖 |
| 附表 |
| 討論 |
| 小結 |
| 參考文獻 |
| 第五部分 肝復健方對肝纖維化大鼠肝組織JAK2/STAT3信號轉導通路的影響 |
| 前言 |
| 材料與方法 |
| 結果 |
| 附圖 |
| 附表 |
| 討論 |
| 小結 |
| 參考文獻 |
| 結論 |
| 綜述一 瘦素與肝纖維化 |
| 參考文獻 |
| 綜述二 肝纖維化中西醫(yī)結合治療進展 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（2）黃芪發(fā)酵后主要有效成分變化分析及多糖對大鼠實驗性肝纖維化影響（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 目錄 |
| 英文縮略詞 |
| 第一章 緒論 |
| 文獻綜述一黃芪多糖藥理學研究進展 |
| 1 黃芪多糖的提取、分離研究進展 |
| 1.1 黃芪多糖的提取 |
| 1.2 黃芪多糖的分離純化 |
| 2 黃芪多糖的成分分析 |
| 2.1 黃芪多糖的含量、純度及分子量測定 |
| 2.2 黃芪多糖的單糖組成、結構分析 |
| 3 黃芪多糖的藥理學研究進展 |
| 3.1 黃芪多糖對免疫系統(tǒng)的作用 |
| 3.2 黃芪多糖對血液及造血系統(tǒng)的影響 |
| 3.3 黃芪多糖對肝臟的作用 |
| 3.4 黃芪多糖對核酸代謝的影響 |
| 3.5 黃芪多糖對抗氧化損傷的作用 |
| 文獻綜述二肝纖維化機制研究進展 |
| 1 ECM 的產(chǎn)生 |
| 1.1 AngⅡ受體介導的信號轉導途徑與 ECM 的產(chǎn)生 |
| 1.2 bFGF 與 ECM 的產(chǎn)生 |
| 2 HSCs 的生物學特性 |
| 2.1 |
| 2.1.1 脂肪細胞因子與 HSCs 的活化 |
| 2.1.2 Jak-STAT 信號轉導途徑與 HSCs 的活化 |
| 2.1.3 TGF-β與 HSCs 的活化 |
| 2.1.4 PDGF 與 HSCs 的活化 |
| 2.1.5 Mef2 與 HSCs 的活化 |
| 2.1.6 HSCs 的激活 |
| 2.1.7 LIM 與 HSCs 的活化 |
| 2.2 對 HSCs 激活起抑制作用的因素 |
| 2.2.1 PPAR 途徑 |
| 2.2.2 TNF-α |
| 2.2.3 RAR/RXR 受體介導的信號轉導途徑 |
| 2.2.4 FXR 介導的信號轉導途徑 |
| 2.2.5 C/EBPs 介導的信號轉導途徑 |
| 2.3 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.1 NF-κB 途徑與 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.2 FXR 與 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.3 內(nèi)生性大麻酚與 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.4 HGF 與 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.5 脂聯(lián)素與 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.6 NK 細胞與 HSCs 的凋亡 |
| 選題意義與研究思路 |
| 第二章 高效液相法測定發(fā)酵黃芪及生藥黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實驗試劑 |
| 2.2 主要儀器與設備 |
| 2.3 樣品及標準品 |
| 2.3.1 樣品 |
| 2.3.2 標準品 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 薄層層析法定性鑒別發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪甲苷及黃芪總皂苷 |
| 2.4.2 高效液相色譜法測定發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪甲苷的含量 |
| 2.4.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 |
| 2.4.2.2 供試品溶液的制備 |
| 2.4.2.3 對照品溶液的制備 |
| 2.3.2.4 線性關系考察 |
| 2.4.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測定 |
| 2.4.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 |
| 2.4.3.2 供試品溶液的制備 |
| 2.4.3.3 對照品溶液的制備 |
| 2.4.3.4 線性關系考察 |
| 3 結果與分析 |
| 3.1 薄層層析法定性鑒別發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪甲苷及黃芪總皂苷 |
| 3.2 黃芪甲苷含量測定結果 |
| 3.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定結果 |
| 4 討論 |
| 第三章 發(fā)酵黃芪和生藥黃芪多糖和皂苷的提取分離 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實驗試劑 |
| 2.2 主要儀器與設備 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪皂苷的提取分離研究 |
| 2.3.1.1 實驗材料的準備 |
| 2.3.1.2 發(fā)酵黃芪與生藥黃芪浸膏化學成分研究 |
| 2.3.1.3 發(fā)酵黃芪與生藥黃芪浸膏收率及黃芪皂苷提取率 |
| 2.3.1.4 大孔吸附樹脂含水量的測定 |
| 2.3.1.5 大孔吸附樹脂對黃芪皂苷的靜態(tài)吸附與解吸實驗 |
| 2.3.1.6 大孔吸附樹脂對黃芪皂苷的動態(tài)吸附實驗 |
| 2.3.1.7 香草醛-硫酸法測定黃芪皂苷含量 |
| 2.3.2 發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪多糖的提取分離及含量測定 |
| 2.3.2.1 實驗材料的準備 |
| 2.3.2.2 不同工藝對發(fā)酵黃芪和生藥黃芪多糖的提取效果的影響 |
| 2.3.2.3 苯酚-硫酸法測定多糖含量 |
| 2.3.3 發(fā)酵黃芪多糖的純化及基本性質研究 |
| 2.3.3.1 發(fā)酵黃芪多糖的柱層析分離 |
| 2.3.3.2 薄層法考察發(fā)酵黃芪多糖中單糖組分 |
| 2.3.3.3 高效凝膠滲透色譜法測定發(fā)酵黃芪多糖主要組分的分子量 |
| 2.4 統(tǒng)計學處理 |
| 3 結果與分析 |
| 3.1 發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪皂苷的提取分離研究 |
| 3.1.1 發(fā)酵黃芪與生藥黃芪浸膏化學成分研究 |
| 3.1.2 發(fā)酵黃芪與生藥黃芪浸膏收率及浸膏中黃芪皂苷提取率 |
| 3.1.3 大孔吸附樹脂含水量的測定結果 |
| 3.1.4 香草醛-硫酸法測定黃芪皂苷含量標準曲線方程 |
| 3.1.5 大孔吸附樹脂對黃芪皂苷的靜態(tài)吸附實驗 |
| 3.1.6 大孔吸附樹脂對黃芪皂苷的動態(tài)吸附實驗 |
| 3.2 發(fā)酵黃芪和生藥黃芪中黃芪多糖的提取分離純化及含量測定 |
| 3.2.1 不同工藝對發(fā)酵黃芪和生藥黃芪多糖的提取效果的影響 |
| 3.2.2 DEAE-52 分離發(fā)酵黃芪多糖 |
| 3.2.3 薄層法鑒別 FAPS-2 和 FAPS-3 中單糖組分 |
| 3.2.4 高效凝膠滲透色譜法(HPGPC-ELSD) 計算葡聚糖標準品的回歸方程 |
| 3.2.5 FAPS-2 的分子量測定 |
| 3.2.6 Sephadex G100 柱層析對 FAPS-2 的洗脫曲線 |
| 3.2.7. FAPS-2-1 的分子量測定 |
| 3.2.8 FAPS、FAPS-2 和 FAPS-2-1 的總糖百分含量 |
| 4 討論 |
| 第四章 FAPS 對實驗性大鼠脂肪性肝纖維化的影響 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實驗試劑 |
| 2.2 主要儀器與設備 |
| 2.3 FAPS 的制備 |
| 2.4 實驗動物分組 |
| 2.5 檢測指標測定 |
| 2.6 統(tǒng)計學處理 |
| 3 結果與分析 |
| 3.1 FAPS 對大鼠體重的影響 |
| 3.2 FAPS 對肝纖維化大鼠血清 ALT、AST 和 ALP 的影響 |
| 3.3 FAPS 對肝纖維化大鼠血清中 PⅢNP、CⅣ、LN、HA 及肝組織中 Hyp 含量的影響 |
| 3.4 FAPS 對肝纖維化大鼠肝組織 T-AOC、GSH、MDA 和蛋白含量的影響 |
| 3.5 FAPS 對肝纖維化大鼠血清 GSH-Px、GST 活性的影響 |
| 3.6 FAPS 對大鼠肝纖維化的組織病理學影響 |
| 3.6.1 H.E.染色 |
| 3.6.2 Masson 染色 |
| 3.6.3 透射電鏡觀察 |
| 4 討論 |
| 第五章 不同組別大鼠肝纖維化的數(shù)字基因表達譜差異分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實驗試劑 |
| 2.2 實驗材料 |
| 2.3 主要儀器與設備 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 大鼠肝臟樣品的采集及送檢 |
| 2.4.2 大鼠肝臟 RNA 的提取方法 |
| 2.4.3 Total RNA 質量檢測 |
| 2.4.4 數(shù)字化基因表達譜測序 |
| 2.4.5 測序結果分析 |
| 2.4.5.1 Clean Tag 的對比統(tǒng)計 |
| 2.4.5.2 差異表達基因的篩選方法 |
| 2.4.5.3 差異基因表達模式聚類分析 |
| 2.4.5.4 Gene Ontology 功能顯著性富集分析 |
| 2.4.5.5 Pathway 顯著性富集分析 |
| 2.4.5.6 文獻挖掘獲得已知肝纖維化相關基因 |
| 3 結果與分析 |
| 3.1 Total RNA 質量檢測 |
| 3.2 測序質量評估 |
| 3.3 測序飽和度分析 |
| 3.4 Clean Tags 分析 |
| 3.4.1 Clean Tags 拷貝數(shù)分布統(tǒng)計 |
| 3.4.2 Clean Tags 與參考基因組比對 |
| 3.4.2.1 參考基因來源 |
| 3.4.2.2 Clean Tags 比對的結果統(tǒng)計 |
| 3.5 差異表達基因的篩選及分析 |
| 3.5.1 差異統(tǒng)計分析 |
| 3.5.2 差異基因聚類分析 |
| 3.5.3 差異基因 GO 功能分析 |
| 3.5.4 差異基因 Pathway 顯著性富集分析 |
| 3.5.6 文獻挖掘獲得已知肝纖維化相關基因 |
| 4 討論 |
| 4.1 DGE 的建立和分析 |
| 4.2 表達差異基因結果分析 |
| 第六章 結論 |
| 6.1 結論 |
| 6.2 有待解決的問題 |
| 附圖 |
| 附圖說明 |
| 參考文獻 |
| 作者簡歷 |
| 導師簡介 |
| 致謝 |
（3）軟肝沖劑對免疫性肝纖維化大鼠的實驗研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文獻綜述 |
| 1.中醫(yī)對肝纖維化的認識 |
| 2.現(xiàn)代醫(yī)學對肝纖維化的認識 |
| 3.中醫(yī)藥治療 |
| 4.西醫(yī)治療 |
| 5.中西醫(yī)結合治療 |
| 6.結語 |
| 1 材料及方法 |
| 2 實驗指標 |
| 3 統(tǒng)計學處理方法 |
| 4 結果 |
| 討論 |
| 結論 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（4）乙肝轉陰顆粒對化學性肝損傷和慢性肝纖維的保護作用及其機制研究（論文提綱范文）
| 中英文縮略詞表 |
| 前言 |
| 第一部分 乙肝轉陰顆粒對小鼠化學性肝損傷的保護作用的研究 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻 |
| 第二部分 體內(nèi)實驗乙肝轉陰顆?？勾笫蟾卫w維化作用及其機制的研究 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 實驗一 乙肝轉陰顆粒對肝纖維化大鼠生化指標及形態(tài)學的影響 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻 |
| 實驗二 乙肝轉陰顆粒對肝纖維化大鼠肝組織相關基因表達的影響 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻 |
| 第三部分 體外實驗乙肝轉陰顆粒及其含藥血清對肝星狀細胞的影響 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 實驗一 乙肝轉陰顆粒及其含藥血清對肝星狀細胞增殖的影響 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻 |
| 實驗二 乙肝轉陰顆粒及其含藥血清對肝星狀細胞相關基因表達的影響 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 結果 |
| 4 討論 |
| 參考文獻 |
| 全文總結 |
| 綜述:肝纖維形成機制研究進展 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
（5）苦參堿結構修飾物-19抗大鼠實驗性肝纖維化作用及機制研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文縮略詞對照表 |
| 前言 |
| 第一部分 苦參堿及其衍生物抗炎活性篩選 |
| 一、材料與方法 |
| 二、試驗結果 |
| 三、 討論 |
| 第二部分 苦參堿衍生物-19 抗實驗性大鼠肝纖維化作用研究 |
| 一、材料與方法 |
| 二 、實驗結果 |
| 三、討論 |
| 第三部分 苦參堿及苦參堿衍生物-19 特異性結合蛋白的研究 |
| 一、材料與方法 |
| 二、 實驗結果 |
| 三、討論 |
| 結論 |
| 論文參考文獻 |
| 綜述 |
| 參考文獻 |
| 在讀期間科研成果 |
| 致謝 |
（6）健脾軟肝方抗肝纖維化機理的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 文獻研究 |
| 1 抗肝纖維化機理研究進展 |
| 1.1 與肝纖維化相關的細胞因子的研究 |
| 1.2 肝纖維化激活通路的研究 |
| 1.3 細胞凋亡途徑 |
| 2 肝纖維化動物模型的研究 |
| 2.1 四氯化碳(CCL4)誘導的肝纖維化模型 |
| 2.2 二甲基亞硝胺(DMN)誘導的肝纖維化模型 |
| 2.3 異種動物血清和蛋白誘導的肝纖維化模型 |
| 2.4 乙醇誘導肝纖維化模型 |
| 2.5 膽管阻塞行肝纖維化模型 |
| 2.6 血吸蟲蟲卵誘發(fā)肝纖維化模型 |
| 3 抗肝纖維化藥物的研究進展 |
| 3.1 國外抗肝纖維化藥物研究進展 |
| 3.2 中醫(yī)藥抗肝纖維化研究進展 |
| 3.3 抗肝纖維化中醫(yī)理論的研究進展 |
| 第2章 實驗研究 |
| 2.1 健脾軟肝方在四氯化碳大鼠肝纖維化模型中的治療作用 |
| 2.1.1 試劑和儀器 |
| 2.1.2 實驗方法和步驟 |
| 2.1.3 實驗結果 |
| 2.2 健脾軟肝方對肝纖維化細胞信號轉導通路的影響 |
| 2.2.1 試劑和儀器 |
| 2.2.2 實驗方法和步驟 |
| 2.2.3 實驗結果 |
| 2.2.4 討論 |
| 2.3 健脾軟肝方對四氯化碳肝纖維化大鼠免疫系統(tǒng)的影響 |
| 2.3.1 試劑和儀器 |
| 2.3.2 實驗方法和步驟 |
| 2.3.3 實驗結果 |
| 2.3.4 討論 |
| 2.4 健脾軟肝方對HSC細胞凋亡調(diào)控的影響 |
| 2.4.1 試劑和儀器 |
| 2.4.2 實驗方法和步驟 |
| 2.4.3 實驗結果 |
| 2.4.4 結論 |
| 2.5 實驗結論 |
| 參考文獻 |
| 附錄一 實驗相關圖表 |
| 附錄二 英文簡縮詞 |
| 致謝 |
（7）苦杏仁苷對HSC活化增殖及其相關細胞因子網(wǎng)絡的作用（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 文獻研究 |
| 第一章 肝星狀細胞 |
| 1 正常狀態(tài)下HSC的功能 |
| 2 持續(xù)激活后HSC的功能 |
| 第二章 肝星狀細胞與肝纖維化 |
| 1 肝纖維化形成的三步激活模式 |
| 2 肝星狀細胞的活化增殖與肝纖維化 |
| 3 肝星狀細胞凋亡與肝纖維化 |
| 第三章 常見活血化瘀中藥抗肝纖維化作用 |
| 1 丹參 |
| 2 赤芍 |
| 3 桃仁 |
| 4 紅花 |
| 5 姜黃 |
| 6 水蛭 |
| 7 虎杖 |
| 8 郁金 |
| 9 川芎 |
| 第四章 桃仁提取物苦杏仁苷抗肝纖維化作用 |
| 1 桃仁的主要化學成分 |
| 2 桃仁提取物的抗肝纖維化作用 |
| 3 桃仁復方的研究 |
| 小結 |
| 第二部分 實驗研究 |
| 第一章 苦杏仁苷對HSC-T6細胞增殖的影響 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 第二章 苦杏仁苷對HSC-T6細胞分泌作用的影響 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 第三章 苦杏仁苷對HSC-T6細胞TGF-β、CTGFm RNA的影響 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 第四章 苦杏仁苷對HSC-T6細胞TGF-β及其受體表達的影響 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 第五章 苦杏仁苷對HSC-T6細胞PDGF、IGFm RNA的影響 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 第六章 苦杏仁苷對HSC-T6細胞PDGF及其受體表達的影響 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 第七章 苦杏仁苷對AngⅡ刺激HSC-T6細胞Ca2+效應的抑制作用 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 第八章苦杏仁苷對AngⅡ刺激HSC-T6細胞活化TGF-βm RNA及分泌b FGF的抑制作用 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 第九章 苦杏仁苷對IFN-γ抑制HSC-T6細胞活化 |
| 1 實驗材料 |
| 2 實驗方法 |
| 3 實驗結果 |
| 4 討論 |
| 結語 |
| 參考文獻 |
| 附錄 |
| 英文縮略詞注解 |
| 致謝 |
| 附件 |
（8）姜黃素預防性治療肝纖維化的機制（論文提綱范文）
| 內(nèi)容提要 |
| 英文縮略詞表 |
| 第1章 肝纖維化研究進展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 肝纖維化的發(fā)生與逆轉 |
| 1.3 HSC 在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用 |
| 1.3.1 HSC 形態(tài)和功能 |
| 1.3.2 持續(xù)激活的HSC 的特性 |
| 1.3.3 視黃醇的丟失 |
| 1.3.4 遷移及化學趨化性 |
| 1.3.5 致肝纖維化作用 |
| 1.3.6 ECM 的降解 |
| 1.3.7 細胞因子的釋放 |
| 1.3.8 活化的HSC 的轉歸 |
| 1.4 HSC 參與肝纖維化過程 |
| 1.4.1 肝星狀細胞活化的啟動階段 |
| 1.4.2 肝星狀細胞活化的持續(xù)階段 |
| 1.4.3 ECM 對HSC 的影響 |
| 1.5 與肝纖維化有關的細胞因子 |
| 1.5.1 PDGF |
| 1.5.2 EGF |
| 1.5.3 胰島素樣生長因子 |
| 1.5.4 FGF |
| 1.5.5 TGF-β |
| 1.5.6 IFN |
| 1.5.7 IL |
| 1.5.8 TNF-α |
| 1.5.9 結締組織生長因子 |
| 第2章 中草藥在肝纖維化治療中的作用及機制 |
| 2.1 苦參素 |
| 2.2 丹酚酸B |
| 2.3 ?；撬?/td> |
| 2.4 水飛薊素 |
| 2.5 三七皂苷 |
| 2.6 姜黃素 |
| 第3章 姜黃素防治肝纖維化作用及機制 |
| 3.1 影響肝星狀細胞活化、增殖及凋亡 |
| 3.2 抑制細胞外基質的產(chǎn)生，促進其降解 |
| 3.3 抗肝損傷作用 |
| 第4章 姜黃素抗大鼠肝纖維化實驗研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 實驗材料 |
| 4.2.2 主要試劑 |
| 4.2.3 主要儀器 |
| 4.2.4 體內(nèi)實驗 |
| 4.2.5 體外實驗 |
| 4.2.6 統(tǒng)計學方法 |
| 4.3 結果 |
| 4.3.1 體內(nèi)實驗 |
| 4.3.2 體外實驗結果 |
| 4.4 討論 |
| 4.4.1 姜黃素對大鼠肝臟結構和功能具有保護作用 |
| 4.4.2 姜黃素抑制大鼠HSC 的增殖并促進其凋亡 |
| 4.4.3 姜黃素對肝纖維化大鼠ECM 代謝的影響 |
| 4.4.4 TGF-β、CTGF 與EGF 參與了姜黃素對肝纖維化的遏制作用 |
| 4.4.5 有絲分裂原活化蛋白激酶家族與實驗性肝纖維化的關系 |
| 4.5 結論 |
| 參考文獻 |
| 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文 |
| 致謝 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 導師及作者簡介 |
（9）鐵沉積于HSC細胞與肝纖維化相關性研究及復方肝毒清的干預作用（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 文獻研究 |
| 一、肝纖維化發(fā)生機理的研究進展 |
| 1 HSC細胞與肝纖維化 |
| 1.1 HSC細胞活化與肝纖維化 |
| 1.2 HSC細胞凋亡與肝纖維化 |
| 2 ECM在HSC細胞活化與轉歸中的作用 |
| 3 鐵沉積與肝纖維化 |
| 3.1 鐵的轉運機制 |
| 3.2 鐵的肝毒性機理 |
| 3.3 鐵沉積與肝纖維化 |
| 二、肝纖維化治療的研究進展 |
| (一) 肝纖維化的西醫(yī)治療研究 |
| (二) 肝纖維化的中醫(yī)治療研究 |
| 實驗研究 |
| 一、細胞實驗:鐵沉積于HSC細胞對肝纖維化的影響及復方肝毒清的干預作用 |
| (一) 建立鐵沉積HSC細胞模型 |
| 1.材料和方法 |
| 2.結果 |
| 3.討論 |
| (二) 鐵沉積于HSC細胞對其活化和轉歸的影響及去鐵銨的干預作用 |
| 1.材料 |
| 2 方法 |
| 3 結果 |
| 4 討論 |
| (三) 復方肝毒清對鐵沉積HSC細胞活化和轉歸的干預作用 |
| 1.材料和方法 |
| 2.結果 |
| 3.討論 |
| 二、動物實驗:鐵沉積于HSC細胞在DMN誘導大鼠肝纖維化中的作用及復方肝毒清的干預機理 |
| 1.材料和方法 |
| 2.結果 |
| 3.討論 |
| 3.1 對肝纖維化動物模型的評價 |
| 3.2 鐵沉積在大鼠肝纖維化中的作用 |
| 3.2.1 對鐵蛋白、轉鐵蛋白及肝鐵濃度的評價 |
| 3.2.2 對TGF β_1的評價 |
| 3.2.3 鐵沉積在大鼠肝纖維化中的作用 |
| 3.3 鐵沉積于HSC細胞對大鼠肝纖維化的影響 |
| 3.4 復方肝毒清防治肝纖維化的作用機理 |
| 3.4.1 復方肝毒清的組方特點 |
| 3.4.2 復方肝毒清組成藥物的現(xiàn)代藥理研究 |
| 3.4.3 復方肝毒清防治肝纖維化的作用機理 |
| 結語 |
| 參考文獻 |
| 附錄 |
| 一、附圖 |
| 二、本文主要縮略詞 |
| 研究生在學期間發(fā)表論文及科研資助項目 |
| 致謝 |
（10）藍玉簪顆粒對肝纖維化的治療作用研究（論文提綱范文）
| 縮略語表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文獻回顧 |
| 實驗研究 |
| 1.藍玉簪龍膽對二甲基亞硝胺誘導的大鼠肝纖維化治療作用的研究 |
| 1.1 試驗材料 |
| 1.2 實驗方法 |
| 1.3 實驗結果 |
| 1.4 討論 |
| 2. 藍玉簪顆粒對大鼠肝纖維化藥理作用的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 結果 |
| 2.4 討論 |
| 小結 |
| 參考文獻 |
| 附錄 |
| 個人簡歷和研究成果 |
| 致謝 |
四、IFN-α對大鼠肝纖維化間質膠原酶基因表達的調(diào)控（論文參考文獻）
- [1]基于濁毒理論的肝復健方抗大鼠肝纖維化作用及機制研究[D]. 婁瑩瑩. 河北醫(yī)科大學, 2013(10)
- [2]黃芪發(fā)酵后主要有效成分變化分析及多糖對大鼠實驗性肝纖維化影響[D]. 秦哲. 甘肅農(nóng)業(yè)大學, 2012(11)
- [3]軟肝沖劑對免疫性肝纖維化大鼠的實驗研究[D]. 張紅. 遼寧中醫(yī)藥大學, 2012(06)
- [4]乙肝轉陰顆粒對化學性肝損傷和慢性肝纖維的保護作用及其機制研究[D]. 楊欣. 廣西醫(yī)科大學, 2011(08)
- [5]苦參堿結構修飾物-19抗大鼠實驗性肝纖維化作用及機制研究[D]. 王紹展. 第二軍醫(yī)大學, 2011(09)
- [6]健脾軟肝方抗肝纖維化機理的研究[D]. 羅大有. 廣州中醫(yī)藥大學, 2011(10)
- [7]苦杏仁苷對HSC活化增殖及其相關細胞因子網(wǎng)絡的作用[D]. 駱歡歡. 廣州中醫(yī)藥大學, 2010(06)
- [8]姜黃素預防性治療肝纖維化的機制[D]. 紀輝. 吉林大學, 2010(08)
- [9]鐵沉積于HSC細胞與肝纖維化相關性研究及復方肝毒清的干預作用[D]. 江遠. 廣州中醫(yī)藥大學, 2009(10)
- [10]藍玉簪顆粒對肝纖維化的治療作用研究[D]. 李鵬. 第四軍醫(yī)大學, 2008(02)