一、抗HCV不同位點(diǎn)核酶細(xì)胞內(nèi)活性的比較（論文文獻(xiàn)綜述）
周穎[1]（2011）在《靶向T細(xì)胞受體CTLA-4的新型核酸干預(yù)分子初步研究》文中研究指明目的:Ribozyme和DNAzyme具有水解mRNA分子的功能,是阻斷基因表達(dá)和抗病毒的重要工具。Ribozyme和DNAzyme研究中有兩個(gè)技術(shù)關(guān)鍵。一個(gè)是Ribozyme和DNAzyme的作用效果問題,Ribozyme和DNAzyme的作用效果與mRNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān),即與作用靶點(diǎn)（target site）的可及性（accessibility）有關(guān);另一個(gè)是Ribozyme和DNAzyme的遞送（delivery）效率問題,高效的遞送是Ribozyme和DNAzyme發(fā)揮作用的前提保證。疾病的基因治療需要安全、高效、靶向性的分子載體。pRNA是從枯草桿菌分離得到的大小在30nm左右的小RNA分子（如圖22）,極易穿過細(xì)胞膜,它既具備核酸的結(jié)構(gòu)特性,也具有類似蛋白質(zhì)的功能,能被設(shè)計(jì)成一種理想的非病毒型載體。pRNA分子載體具有安全、高效的特性,能夠較長時(shí)間的作用于效應(yīng)細(xì)胞,同時(shí)不會(huì)引起免疫反應(yīng)和排斥現(xiàn)象,是基因治療中非常有發(fā)展前景的理想的分子載體[1]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建CTLA4干預(yù)分子pRNA-Ribozyme,旨在重啟T細(xì)胞激活和增殖;為放射性細(xì)胞免疫低下尋求免疫調(diào)節(jié)新方案。方法:首先擴(kuò)增和克隆出CTLA4基因,體外轉(zhuǎn)錄RNA,采用RASS方法篩選CTLA4-mRNA的可及靶點(diǎn)并驗(yàn)證其有效性,然后確定Ribozyme的作用靶點(diǎn),針對(duì)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建制備CTLA4-pRNA-Ribozyme的DNA質(zhì)粒,制備CTLA4-pRNA-Ribozyme分子,在體外分析其切割活性,比較分析其優(yōu)劣。pRNA攜帶效應(yīng)分子Ribozyme具有明確的靶向性、主動(dòng)識(shí)別結(jié)合和剪切基因RNA,但由于100nt以上的RNA分子化學(xué)合成較為困難,本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法通過基因重組構(gòu)建并制備170nt的pRNA-Ribozyme。依據(jù)pRNA序列和Ribozyme分子序列,采用PCR擴(kuò)增和克隆重組,將pRNA-Ribozyme按照順式連接開放式結(jié)構(gòu)、和Ribozyme嵌入pRNA成封閉型內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu),制備DNA質(zhì)粒;再在體外轉(zhuǎn)錄制備pRNA-Ribozyme分子。結(jié)果:從小鼠脾臟擴(kuò)增CTLA-4全基因、構(gòu)建其克隆,采用RASS方法篩選獲得了CTLA-4的mRNA靶點(diǎn),驗(yàn)證了3個(gè)靶點(diǎn)有效;對(duì)有效靶點(diǎn)構(gòu)建了pRNA-Rz分子、及其克隆;同時(shí)采用二種方式體外制備出了pRNA-Ribozyme分子并形成聚合體結(jié)構(gòu)。重組制備的pRNA-Ribozyme通過pRNA載體可以被準(zhǔn)確運(yùn)輸?shù)阶饔冒悬c(diǎn),即主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞、主動(dòng)識(shí)別、主動(dòng)切割mRNA,阻斷CTLA-4基因表達(dá),從而發(fā)揮Ribozyme的功能。體外制備出了特異高效的CTLA4-pRNA-Ribozyme。結(jié)論:獲得小鼠CTLA-4全基因序列、并構(gòu)建了基因克隆,篩選獲得了CTLA-4的mRNA靶點(diǎn)3個(gè)靶點(diǎn)有效;對(duì)有效靶點(diǎn)構(gòu)建了pRNA-Rz分子、及其克隆;體外生物合成制備出了pRNA-Ribozyme順式連接開放式結(jié)構(gòu)、和Ribozyme嵌入pRNA成封閉型內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)pRNA-Ribozyme,并且對(duì)CTLA-4基因表達(dá)的抑制作用體外實(shí)驗(yàn)比較明顯,體外生物合成制備的CTLA4-pRNA-Ribozyme的DNA質(zhì)粒,為在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)提供了基礎(chǔ)。
周穎,毛建平[2]（2010）在《Ribozyme和DNAzyme的基因治療實(shí)驗(yàn)應(yīng)用進(jìn)展》文中研究指明Ribozyme和DNAzyme具有水解mRNA分子的功能,是阻斷基因表達(dá)和抗病毒的重要工具。近年來,Ribozyme和DNAzyme在臨床治療研究中已經(jīng)獲得了長足進(jìn)展,有許多成功的實(shí)例。比較了Ribozyme和DNAzyme的差異和特點(diǎn),總結(jié)了它們?cè)诳共《尽⒖鼓[瘤、治療遺傳病、治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面的臨床前研究、應(yīng)用及進(jìn)展。
?？∑?汪楊[3]（2007）在《病毒性肝炎基因治療研究的現(xiàn)狀》文中研究表明世界大多數(shù)國家人群中乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染率較高且極易慢性化,是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因,嚴(yán)重威脅人們健康,而我國是HBV、HCV感染的高發(fā)區(qū)。雖然近年在病毒性肝炎的抗病毒治療方面取得了令人欣喜的進(jìn)展,但目前臨床上應(yīng)用的抗病毒藥物的不良反應(yīng)較大,且獲得的病毒持續(xù)抑制率并不令人滿意。
劉波[4]（2007）在《CTE-RHA復(fù)合核酶的構(gòu)建及抑制HCV RNA復(fù)制和相應(yīng)蛋白表達(dá)的研究》文中研究說明目的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需的真核表達(dá)載體，特別是人源性tRNA val啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CTE介導(dǎo)的核酶高效表達(dá)載體pPHCV5-CR以及對(duì)應(yīng)的無CTE介導(dǎo)的載體pPHCV5-R；建立HCV Subgenomic Replicon穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)的細(xì)胞株；探討核酶和核酶-CTE復(fù)合物對(duì)丙型肝炎病毒亞基因組的影響，進(jìn)一步探討丙型肝炎治療研究方向。研究方法1、構(gòu)建相應(yīng)的核酶載體合成CTE-DNA，設(shè)計(jì)、構(gòu)建含tRNAval啟動(dòng)子的核酶和帶有CTE的含tRNAval啟動(dòng)子的核酶。2、建立HCV Subgenomic Replicon穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)的細(xì)胞株在脂質(zhì)體lipofectamine TM2000介導(dǎo)下，將含有HCV Subgenes的真核表達(dá)質(zhì)粒pHCV BM4-5導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞系QSR7701中，經(jīng)G418篩選抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立轉(zhuǎn)染克隆細(xì)胞系。用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白印跡法證實(shí)轉(zhuǎn)染成功及其蛋白表達(dá)。3、觀察四種質(zhì)粒pPHCV5-R1、pPHCV5-R2、pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2對(duì)HCV Subgenomic Replicon穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)的細(xì)胞株中HCV RNA和相應(yīng)病毒蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果1、經(jīng)測(cè)序后證實(shí)，成功構(gòu)建相應(yīng)的核酶載體，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。2、經(jīng)RT-PCR和Western Blot證實(shí)，成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCVSubgenomic Replicon和表達(dá)的細(xì)胞株。3、用構(gòu)建的普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和復(fù)合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含HCV亞基因復(fù)制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染QSG7701細(xì)胞株，48小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和WesternBlot，RT-PCR（以β-actin為內(nèi)對(duì)照）結(jié)果顯示：pPHCV5-CR1轉(zhuǎn)染組未見明顯擴(kuò)增目的條帶，pPHCV5-R1轉(zhuǎn)染組可見擴(kuò)增目的條帶，亮度低于未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；pPHCV5-CR2轉(zhuǎn)染組可見擴(kuò)增目的條帶，亮度低于未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，pPHCV5-R2轉(zhuǎn)染組可見擴(kuò)增目的條帶，亮度與未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組接近。這些提示：復(fù)合核酶（帶有CTE）在細(xì)胞內(nèi)的切割靶RNA的效率明顯高于普通核酶。普通核酶難以切割的位點(diǎn)，復(fù)合核酶能進(jìn)行有效的切割；普通核酶能進(jìn)行切割的位點(diǎn)，帶CTE-核酶的切割效率明顯提高。WesternBlot（以β-actin為內(nèi)對(duì)照）結(jié)果顯示：應(yīng)用軟件分析各組細(xì)胞目的蛋白表達(dá)量無明顯差異，可能與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染作用時(shí)間短、蛋白表達(dá)變化不明顯，也可能與實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)少、可用數(shù)據(jù)少或者檢測(cè)方法有關(guān)。結(jié)論新型核酶（帶有CTE）在細(xì)胞內(nèi)的切割靶RNA的效率明顯高于普通核酶。普通核酶難以切割的位點(diǎn)，帶CTE-核酶能進(jìn)行有效的切割；普通核酶能進(jìn)行切割的位點(diǎn)，帶CTE-核酶的切割效率明顯提高。
蘇秀芬[5]（2007）在《小干涉RNA對(duì)丙型肝炎病毒復(fù)制和表達(dá)的抑制作用》文中提出病毒性丙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療丙型肝炎應(yīng)答率大約是70%,但復(fù)發(fā)率較高,部分病人對(duì)治療無應(yīng)答,它們的副作用很大,人們迫切希望找到更有效的治療方法。隨著小干涉RNA（siRNA）技術(shù)的進(jìn)步,應(yīng)用RNA干涉（RNAi）對(duì)一些病毒感染性疾病如HIV感染的治療研究取得一系列成功,把這一技術(shù)用于丙型肝炎的基因治療,是一種值得探索的治療丙型肝炎的手段。本研究構(gòu)建了HCV NS5A真核表達(dá)質(zhì)粒,建立了HCV NS5A在人肝細(xì)胞株HL-7702細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)系統(tǒng),使其成為我們所設(shè)計(jì)的特異性siRNA抑制丙肝病毒復(fù)制的模型。設(shè)計(jì)構(gòu)建針對(duì)HCV NS5A區(qū)中3個(gè)不同靶點(diǎn)的表達(dá)siRNA質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染可表達(dá)HCV NS5A的HL-7702細(xì)胞,檢測(cè)對(duì)HCV NS5A蛋白表達(dá)的影響,并測(cè)定它們的干涉效應(yīng)。結(jié)果表明:特異性siRNA在細(xì)胞內(nèi)顯著抑制HCV的蛋白表達(dá),抑制作用從第4天開始,具有序列特異性和高度選擇性,且對(duì)細(xì)胞無毒性作用。本研究是特異性siRNA首次在細(xì)胞水平上針對(duì)HCV的NS5A復(fù)制子進(jìn)行的研究,目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道,為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床使用提供了重要的理論基礎(chǔ)、技術(shù)路線和實(shí)驗(yàn)方法。
丁艷華[6]（2007）在《古菌組蛋白（HphA）介導(dǎo)小發(fā)夾RNA抑制HCV 5’NCR和C區(qū)表達(dá)的研究》文中研究指明全世界目前己有1.7億HCV感染者,我國普通人群抗-HCV陽性率為3.2%。急性HCV感染者中,大約80%可發(fā)展為慢性持續(xù)感染,其中20%的患者經(jīng)歷20-30年將發(fā)展為肝硬化,1%-5%的患者可進(jìn)展為肝細(xì)胞癌。HCV所導(dǎo)致的終末期肝病是重要的死亡原因之一,也是肝移植的原因。目前慢性丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)治療是干擾素聯(lián)合利巴韋林,但有效率僅僅40%-80%左右,人們?cè)噲D開發(fā)新型、高效的治療藥物來解決這一問題。自RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)以來,已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究,并且已經(jīng)證實(shí)其在細(xì)胞水平能有效抑制HIV、脊髓灰質(zhì)炎病毒、HBV及HCV的復(fù)制和表達(dá)。本文構(gòu)建了三個(gè)靶向（targeting to）HCV 5’NCR和C區(qū)的小發(fā)夾RNA質(zhì)粒表達(dá)載體,與含有HCV 5’NCR和C區(qū)部分基因及熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞HL-7702。通過檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因和Western blot來檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。發(fā)現(xiàn)靶向HCV 5’NCR NCR和靶向C區(qū)的shRNA能明顯抑制HCV 5’NCR和C區(qū)的表達(dá)。目前小干涉RNA進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的主要障礙是缺乏安全有效的轉(zhuǎn)基因載體。我們應(yīng)用了一種非病毒類載體古菌組蛋白（HPhA）作為轉(zhuǎn)基因載體。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HPhA能與DNA結(jié)合,毒性很小,能在血清存在的條件下轉(zhuǎn)染小干涉RNA表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞抑制HCV 5’NCR和C區(qū)的表達(dá)。所以HPhA有潛力發(fā)展為適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因載體。本文首次應(yīng)用HPhA作為轉(zhuǎn)基因載體,為小干涉RNA抗病毒基因治療的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了重要的理論基礎(chǔ)、技術(shù)路線和實(shí)驗(yàn)方法。
牛俊奇,王峰,王美霞,華瑞,溫小玉,田梅梅,鄭錦輝[7]（2006）在《丙型病毒性肝炎基因治療實(shí)驗(yàn)研究》文中指出目的:分別設(shè)計(jì)能特異切割HCV基因組的核酶、U1-嵌合體核酶、10-23脫氧核酶（10-23DNAzyme）及小干涉RNA,以期用于丙型肝炎的基因治療。方法:（1）設(shè)計(jì)合成針對(duì)HCV RNA基因組非編碼區(qū)及核心區(qū)特定位點(diǎn)的三種核酶,克隆入質(zhì)粒載體pGEM并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,對(duì)HCV基因組進(jìn)行體外切割;（2）選擇其中切割效率最高的核酶與U1小核核糖核酸構(gòu)建成嵌合體核酶,觀察在細(xì)胞水平對(duì)HCV RNA的切割效率;（3）設(shè)計(jì)合成針對(duì)HCV 5,-NCR區(qū)不同位點(diǎn)的10-23DNAzyme,觀察不同鎂離子濃度及時(shí)間下對(duì)HCV的切割效率。結(jié)果:核酶及U1小核核糖核酸嵌合體核酶在細(xì)胞水平對(duì)HCV RNA均具有切割活性,二者的切割活性基本相等;核酶的切割位點(diǎn)越靠近起始密碼子則其切割效率越高;針對(duì)HCV基因組設(shè)計(jì)的小干涉RNA在細(xì)胞水平能有效抑HCV的復(fù)制和表達(dá)。結(jié)論:核酶、U1嵌合體核酶、10-23脫氧核酶在細(xì)胞水平中都顯示了較高效的抗HCV作用,作為有前途的基因治療藥物可以進(jìn)一步用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
張巖[8]（2005）在《應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究》文中提出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原體之一。由HBV所引起的乙型肝炎是一種流行久遠(yuǎn)、傳播廣泛、危害嚴(yán)重的傳染性疾病。目前全球慢性HBV感染者超過3億5千萬人。慢性HBV感染導(dǎo)致的肝炎肝硬化和肝癌等終末期肝病,已成為嚴(yán)重危害我國人民生命健康的主要疾病。乙肝疫苗的推廣使用使乙肝免疫預(yù)防取得重大突破,但治療上仍缺乏理想的抗病毒藥物。目前在我國廣泛應(yīng)用的抗HBV藥物主要有兩類,α-干擾素和核苷類藥物。但療效均不理想,仍需探索新型有效的抗HBV的藥物和方法。 HBV的基因組是一個(gè)帶有部分單鏈區(qū)的環(huán)狀雙鏈DNA（dsDNA）分子,具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的特性,其3.5kb前基因組RIgA既是DNA合成的模板,又是指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的模板。HBV基因組高度重疊,因而針對(duì)HBV某一靶位點(diǎn)切割病毒的mRNA和前基因組RNA,可以有效阻斷病毒蛋白質(zhì)合成。在乙型肝炎基因治療的探索中,應(yīng)用反義寡核苷酸、核酶以及脫氧核酶抗HBV的研究曾經(jīng)給人們帶來令人鼓舞的結(jié)果,但終因許多難以克服的問題使深入研究難以繼續(xù)。 近年RNA干擾（RNA interference,RNAi）技術(shù)的出現(xiàn),為各類慢性HBV感染的治療開辟了新的途徑。RNAi是指由雙鏈RNA(double-stranded RNA,
鄧鑫,梁健[9]（2004）在《慢性病毒性肝炎的基因治療研究現(xiàn)狀》文中研究說明
成軍[10]（2004）在《功能基因組學(xué)中的功能缺失研究策略》文中進(jìn)行了進(jìn)一步梳理0 引言在功能基因組學(xué)（functional genomics）研究中,闡明各種蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能是其核心任務(wù),不僅是生物學(xué)的主要研究方向,而且也是醫(yī)學(xué)研究的主要內(nèi)容,畢竟細(xì)胞的功能和表型是由細(xì)胞中的蛋白來主導(dǎo)的,許多疾病都是蛋白結(jié)構(gòu)與功能、表達(dá)水平與調(diào)節(jié)的異常引起的.研究蛋白的功能,常常通過改變蛋白的表達(dá)水平,觀察細(xì)胞的生物學(xué)特性的變化,來研究蛋白相應(yīng)的生物學(xué)功能.這種研究策略包括強(qiáng)制性地升高特定蛋白的表達(dá)水平,也包括蛋白表達(dá)水平的缺失.研究表明,在功能基因組研究中, 功能缺失（loss of function,LOF）策略具有特殊重要地位.
二、抗HCV不同位點(diǎn)核酶細(xì)胞內(nèi)活性的比較（論文開題報(bào)告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡(jiǎn)單簡(jiǎn)介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡(jiǎn)單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準(zhǔn)備的觀點(diǎn)或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡(jiǎn)64位RISC處理器存儲(chǔ)管理單元結(jié)構(gòu)并詳細(xì)分析其設(shè)計(jì)過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個(gè)分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲(chǔ)器并行查找,支持粗粒度為64KB和細(xì)粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級(jí)分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細(xì)論述了四級(jí)頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲(chǔ)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的一個(gè)重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對(duì)象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對(duì)象從而得到有關(guān)信息。
實(shí)驗(yàn)法：通過主支變革、控制研究對(duì)象來發(fā)現(xiàn)與確認(rèn)事物間的因果關(guān)系。
文獻(xiàn)研究法：通過調(diào)查文獻(xiàn)來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實(shí)證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實(shí)踐的需要提出設(shè)計(jì)。
定性分析法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行“質(zhì)”的方面的研究，這個(gè)方法需要計(jì)算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對(duì)研究對(duì)象的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運(yùn)用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對(duì)某一課題進(jìn)行研究。
功能分析法：這是社會(huì)科學(xué)用來分析社會(huì)現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個(gè)方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個(gè)與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、抗HCV不同位點(diǎn)核酶細(xì)胞內(nèi)活性的比較（論文提綱范文）
（1）靶向T細(xì)胞受體CTLA-4的新型核酸干預(yù)分子初步研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠T淋巴細(xì)胞受體CTLA-4基因的克隆 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 器材 |
| 1.1.2 動(dòng)物及質(zhì)粒載體 |
| 1.1.3 生物及化學(xué)試劑 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 總RNA的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR(cDNA第一鏈合成) |
| 1.2.3 CTLA-4擴(kuò)增產(chǎn)物與EZ-T克隆載體的連接和轉(zhuǎn)化 |
| 1.2.4 克隆的菌液PCR及酶切鑒定、測(cè)序及序列比較 |
| 1.2.5 體外轉(zhuǎn)錄制備CTLA4-mRNA |
| 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.1 CTLA-4基因的RT-PCR擴(kuò)增 |
| 2.2 小鼠心臟RT-PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的菌液PCR鑒定 |
| 2.3 陽性克隆菌液PCR產(chǎn)物的酶切鑒定 |
| 2.4 測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果表明獲得的基因?yàn)镃TLA-4基因 |
| 3 討論 |
| 第二部分小鼠T 淋巴細(xì)胞受體CTLA-4基因mRNA的靶點(diǎn)篩選和驗(yàn)證 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 器材 |
| 1.1.2 基因及質(zhì)粒載體 |
| 1.1.3 生物及化學(xué)試劑 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 設(shè)計(jì)合成寡核苷酸文庫 |
| 1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄 |
| 1.2.3 CTLA-4基因RNA的固定 |
| 1.2.4 CTLA-4基因RNA與寡核苷酸文庫雜交 |
| 1.2.5 結(jié)合寡核苷酸文庫序列的擴(kuò)增 |
| 1.2.6 結(jié)合寡核苷酸文庫序列的測(cè)定 |
| 1.2.7 序列比對(duì)和靶點(diǎn)的確認(rèn) |
| 1.2.8 靶點(diǎn)有效性的體外驗(yàn)證 |
| 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.1 基因轉(zhuǎn)錄模板產(chǎn)生 |
| 2.2 體外轉(zhuǎn)錄 |
| 2.3 RASS技術(shù)篩選獲得的寡核苷酸文庫序列 |
| 2.4 RASS獲得的CTLA-4 mRNA結(jié)合文庫序列 |
| 2.5 RASS篩選得到的CTLA-4基因結(jié)構(gòu)靶點(diǎn)和體外驗(yàn)證靶點(diǎn)有效性結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第三部分小鼠T淋巴細(xì)胞受體CTLA-4基因的新型干預(yù)分子pRNA引導(dǎo)型Ribozyme的構(gòu)建和制備 |
| 1 材料與方法 |
| 1.1 試劑及質(zhì)粒載體 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 165 rRNA-Ribozyme的設(shè)計(jì) |
| 1.2.2 pRNA 順式連接開放型165 rRNA-Ribozyme分子的制備 |
| 1.2.3 165 rRNA-Ribozyme嵌入pRNA成自身環(huán)化閉合型分子的制備 |
| 1.2.4 165 rRNA-pRNA-Ribozyme聚合體的形成 |
| 1.2.5 165 rRNA-pRNA-Ribozyme體外對(duì)基因mRNA切割活性分析 |
| 1.2.6 CTLA4-pRNA-Ribozyme的設(shè)計(jì)與制備 |
| 1.2.7 三靶點(diǎn)CTLA4-pRNA-Ribozyme三聚體的設(shè)計(jì)與制備 |
| 1.2.8 CTLA4-pRNA-Ribozyme相關(guān)引物、序列設(shè)計(jì) |
| 1.2.9 CTLA4-pRNA-Ribozyme體外切割活性分析 |
| 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 |
| 2.1 165 rRNA-Ribozyme的設(shè)計(jì) |
| 2.2 165 rRNA-pRNA-Ribozyme順式開放型結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì) |
| 2.3 Ribozyme 嵌入閉合型pRNA-Ribozyme結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與制備 |
| 2.4 設(shè)計(jì)和制備的CTLA4-pRNA-Ribozyme |
| 2.5 CTLA4/165 rRNA-pRNA-Ribozyme聚合體分析 |
| 2.6 CTLA4/165 rRNA-pRNA-Ribozyme體外切割活性分析 |
| 3 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 附錄1 英文縮略詞表 |
| 附錄2 在學(xué)期間研究成果目錄 |
| 附錄3 本人簡(jiǎn)歷 |
| 致謝 |
| 綜述 |
| 參考文獻(xiàn) |
（2）Ribozyme和DNAzyme的基因治療實(shí)驗(yàn)應(yīng)用進(jìn)展（論文提綱范文）
| 1 Ribozyme簡(jiǎn)介 |
| 2 Ribozyme的應(yīng)用 |
| 2.1 抗病毒 |
| 2.1.1 抗HIV和艾滋病治療 |
| 2.1.2 抗HBV和肝炎治療 |
| 2.1.3 抗HPV感染 |
| 2.1.4 抗單純皰疹病毒 |
| 2.2 抗腫瘤 |
| 2.2.1 白血病 |
| 2.2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤 |
| 2.3 治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其他疾病 |
| 2.4 抗移植排斥反應(yīng)的研究進(jìn)展 |
| 3 DNAzyme |
| 4 DNAzyme應(yīng)用 |
| 4.1 抗病毒 |
| 4.1.1 抗HIV |
| 4.1.2 抗HBV |
| 4.1.3 抗人呼吸道合胞病毒 |
| 4.2 抗腫瘤 |
| 4.2.1 抑制平滑肌生長和血管生成 |
| 4.2.2 抑制腫瘤基因bcr/abl的表達(dá) |
| 4.2.3 抑制惡性腫瘤 |
| 5 Ribozyme和DNAzyme臨床應(yīng)用一問題及其前景 |
（4）CTE-RHA復(fù)合核酶的構(gòu)建及抑制HCV RNA復(fù)制和相應(yīng)蛋白表達(dá)的研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英漢縮略詞對(duì)照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第三章 結(jié)果 |
| 3.1 含tRNA~(val)啟動(dòng)子的195位的核酶表達(dá)載體pPHCV5-R1的測(cè)序結(jié)果 |
| 3.2 含tRNA~(val)啟動(dòng)子的150位的核酶表達(dá)載體pPHCV5-R2的測(cè)序結(jié)果 |
| 3.3 以質(zhì)粒pPSV-1為模板，經(jīng)PCR獲取目的基因，能順利擴(kuò)增出大小約173bp的條帶 |
| 3.4 CTE介導(dǎo)的含tRNA~(val)啟動(dòng)子150位的核酶表達(dá)載體pPHCV5-CR2的測(cè)序結(jié)果 |
| 3.5 CTE介導(dǎo)的含tRNA~(val)啟動(dòng)子HCV5-NCR區(qū)195位的核酶表達(dá)載體pPHCV5-CR1的測(cè)序結(jié)果 |
| 3.6 質(zhì)粒1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖片及PCR鑒定結(jié)果 |
| 3.7 目標(biāo)質(zhì)粒P~(BM4-5 HCV)和空白質(zhì)粒P~(RC/CMV)轉(zhuǎn)染QSG7701細(xì)胞形成的陽性克隆圖片 |
| 3.8 細(xì)胞總RNA1%瓊脂糖凝膠電泳 |
| 3.9 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞組RT-PCR鑒定 |
| 3.10 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞組westernBlotting鑒定 |
| 3.11 細(xì)胞總RNA1%瓊脂糖凝膠電泳 |
| 3.12 普通核酶和復(fù)合核酶對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞中HCV RNA的抑制作用 |
| 3.13 普通核酶和新核酶對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的QSG7701細(xì)胞中HCV蛋白表達(dá)的影響 |
| 第四章 討論 |
| 第五章 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 第六章 綜述 |
| 致謝 |
| 攻讀學(xué)位期間主要研究成果 |
（5）小干涉RNA對(duì)丙型肝炎病毒復(fù)制和表達(dá)的抑制作用（論文提綱范文）
| 提要 |
| 英文縮略詞表 |
| 第一章 緒論 |
| 第一節(jié) RNA 干涉在抗病毒治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展 |
| 第二節(jié) 丙型肝炎基因治療的研究進(jìn)展 |
| 第二章 丙型肝炎N55A 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 一、實(shí)驗(yàn)材料 |
| 二、實(shí)驗(yàn)方法 |
| （一） HCV N55A 基因的獲取 |
| （二） 克隆載體pGEM-T/ HCV N55A 的構(gòu)建 |
| （三） 表達(dá)載體pCI-neo/ HCV N55A 的構(gòu)建 |
| 第二節(jié) 結(jié)果 |
| 一、HCV N55A 基因的PCR 結(jié)果 |
| 二、克隆載體pGEM-T/ HCV N55A 的雙酶切結(jié)果 |
| 三、克隆載體pGEM-T/ HCV N55A 的測(cè)序結(jié)果 |
| 四、表達(dá)載體pCI-neo/ HCV N55A 的雙酶切結(jié)果 |
| 第三章 HL-7702 細(xì)胞培養(yǎng)及pCI-neo/ HCV NS5A 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL-7702 細(xì)胞 |
| 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 一、實(shí)驗(yàn)材料 |
| 二、實(shí)驗(yàn)方法 |
| （一） 人肝細(xì)胞株HL-7702 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代與培養(yǎng) |
| （二） 表達(dá)載體pCI-neo/ HCV N55A 轉(zhuǎn)染HL-7702 細(xì)胞 |
| （三） 瞬時(shí)表達(dá) HCV NS5A 蛋白細(xì)胞系的鑒定 |
| 第二節(jié) 結(jié)果 |
| 第四章 HCV N55A 不同位點(diǎn)表達(dá)siRNA 質(zhì)粒的構(gòu)建及對(duì)蛋白表達(dá)的影響 |
| 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 一、實(shí)驗(yàn)材料 |
| 二、實(shí)驗(yàn)方法 |
| （一） 表達(dá)siRNA 質(zhì)粒的制備 |
| （二） 轉(zhuǎn)染條件 |
| （三） 表達(dá)siRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染含HCV N55A 基因的HL-7702 細(xì)胞 |
| 第二節(jié) 結(jié)果 |
| 一、表達(dá)siRNA 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果 |
| 二、表達(dá)siRNA 質(zhì)粒電泳結(jié)果 |
| 三、轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒對(duì)HCV N55A 蛋白表達(dá)的影響 |
| 第五章 討論 |
| 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新點(diǎn) |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀博士期間發(fā)表論文、科研、獲獎(jiǎng)情況 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致謝 |
（6）古菌組蛋白（HphA）介導(dǎo)小發(fā)夾RNA抑制HCV 5’NCR和C區(qū)表達(dá)的研究（論文提綱范文）
| 提要 |
| 英文縮略詞表 |
| 第一篇 緒論 |
| 第一章 慢性丙型肝炎治療進(jìn)展 |
| 一、丙型肝炎病毒分子生物學(xué)特點(diǎn) |
| 二、目前的治療 |
| 三、慢性丙型肝炎治療的發(fā)展方向 |
| 四、正在研究中的新方法 |
| 第二章 RNA 干涉及其在抗病毒治療中的研究進(jìn)展 |
| 一、RNA 干涉的作用機(jī)制、設(shè)計(jì)原則和靶位點(diǎn)的選擇 |
| 二、RNAi 的抗病毒作用研究 |
| 三、RNAi 抗病毒感染的途徑和方法 |
| 四、小干涉RNA 的體內(nèi)導(dǎo)入 |
| 第三章 前言 |
| 第二篇 實(shí)驗(yàn)研究 |
| 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 第一章 shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 第二節(jié) 結(jié)果 |
| 第二章 質(zhì)粒載體表達(dá)的shRNA抑制HCV 5'NCR和C區(qū)的表達(dá) |
| 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法 |
| 第二節(jié) 結(jié)果 |
| 第三章 古菌組蛋白介導(dǎo)的shRNA抑制HCV 5'NCR和C區(qū)表達(dá) |
| 第一節(jié) HphA 與DNA 結(jié)合實(shí)驗(yàn) |
| 第二節(jié) MTT 法檢測(cè)重組蛋白HphA 對(duì)細(xì)胞的毒性 |
| 第三節(jié) 以古菌組蛋白為載體介導(dǎo)的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體抑制HCV 5'NCR和C區(qū)表達(dá) |
| 第三篇 討論 |
| 一、小干涉RNA質(zhì)粒表達(dá)載體 |
| 二、靶位點(diǎn)的選擇 |
| 三、細(xì)胞模型 |
| 四、HCV特異性小干涉RNA的干涉效應(yīng) |
| 五、新型非病毒類載體古菌組蛋白 |
| 六、RNAi技術(shù)在抗HCV基因治療中的應(yīng)用前景 |
| 結(jié)論 |
| 本研究創(chuàng)新點(diǎn)及意義 |
| 1、靶位點(diǎn)選擇 |
| 2、研究體系選擇 |
| 3、新型載體的研究 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻博期間發(fā)表的論文及科研課題 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致謝 |
（8）應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究（論文提綱范文）
| 縮略語表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文獻(xiàn)回顧 |
| 實(shí)驗(yàn)研究 |
| 第一部分 HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第二部分 抗乙型肝炎病毒siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 第三部分 siRNA對(duì)HBV的抑制作用 |
| 1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 |
| 2 結(jié)果 |
| 3 討論 |
| 結(jié)論 |
| 參考文獻(xiàn) |
| 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表和待發(fā)表的文章 |
| 致謝 |
四、抗HCV不同位點(diǎn)核酶細(xì)胞內(nèi)活性的比較（論文參考文獻(xiàn)）
- [1]靶向T細(xì)胞受體CTLA-4的新型核酸干預(yù)分子初步研究[D]. 周穎. 安徽醫(yī)科大學(xué), 2011(10)
- [2]Ribozyme和DNAzyme的基因治療實(shí)驗(yàn)應(yīng)用進(jìn)展[J]. 周穎,毛建平. 中國生物工程雜志, 2010(06)
- [3]病毒性肝炎基因治療研究的現(xiàn)狀[J]. 牛俊奇,汪楊. 內(nèi)科理論與實(shí)踐, 2007(04)
- [4]CTE-RHA復(fù)合核酶的構(gòu)建及抑制HCV RNA復(fù)制和相應(yīng)蛋白表達(dá)的研究[D]. 劉波. 中南大學(xué), 2007(05)
- [5]小干涉RNA對(duì)丙型肝炎病毒復(fù)制和表達(dá)的抑制作用[D]. 蘇秀芬. 吉林大學(xué), 2007(03)
- [6]古菌組蛋白（HphA）介導(dǎo)小發(fā)夾RNA抑制HCV 5’NCR和C區(qū)表達(dá)的研究[D]. 丁艷華. 吉林大學(xué), 2007(03)
- [7]丙型病毒性肝炎基因治療實(shí)驗(yàn)研究[A]. ?？∑?王峰,王美霞,華瑞,溫小玉,田梅梅,鄭錦輝. 增強(qiáng)自主創(chuàng)新能力 促進(jìn)吉林經(jīng)濟(jì)發(fā)展——啟明杯·吉林省第四屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）, 2006
- [8]應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 張巖. 第四軍醫(yī)大學(xué), 2005(06)
- [9]慢性病毒性肝炎的基因治療研究現(xiàn)狀[J]. 鄧鑫,梁健. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2004(11)
- [10]功能基因組學(xué)中的功能缺失研究策略[J]. 成軍. 世界華人消化雜志, 2004(10)
標(biāo)簽：基因治療論文; 質(zhì)粒載體論文; 基因結(jié)構(gòu)論文; 基因合成論文; 科學(xué)論文;