一、酶促生物轉(zhuǎn)化丙酮酸生產(chǎn)的研究（論文文獻綜述）
羅磊[1]（2021）在《級聯(lián)法合成去甲基麻黃素的研究》文中進行了進一步梳理去甲基麻黃素（norephedrine/NE）是一種多功能應(yīng)用的手性胺化合物,廣泛應(yīng)用于化工及醫(yī)藥等領(lǐng)域。其合成路線是有挑戰(zhàn)性的,生物法合成NE具有反應(yīng)條件溫和、綠色高效及產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點,逐漸成為合成NE的熱點,但目前報道的生物法合成NE方法較少,且具有底物載量低,效率低等劣勢。本研究通過級聯(lián)乙醛羥酸合成酶（AHAS I）催化縮合反應(yīng)和胺脫氫酶（BbAmDH）催化還原胺化反應(yīng),以廉價底物苯甲醛、丙酮酸和NH4Cl為原料,構(gòu)建了去甲基麻黃素的生物合成新途徑。具體研究內(nèi)容如下:（1）在麻黃堿脫氫酶（EDH）N端添加Mbp標簽,實現(xiàn)了EDH的可溶性表達,然后成功克隆表達了用于合成去甲基麻黃素前體物質(zhì)L-苯基乙?；状迹↙-Phenylacetylcarbinol/R-PAC）的3個酶,分別為丙酮酸脫羧酶（PDC）、乙醛羥酸合成酶（AHAS I）和麻黃堿脫氫酶（EDH）。通過比較PDC、AHAS I和EDH合成去甲基麻黃素前體物質(zhì)R-PAC的效率,最終選擇AHAS I合成去甲基麻黃素前體物質(zhì)R-PAC。優(yōu)化AHAS I催化縮醛反應(yīng)合成R-PAC的反應(yīng)條件,最終確定其最適合反應(yīng)條件:40 mg·m L-1 E.coli BL21/p ET28a-AHAS I,30℃,p H 7,40 mmol·L-1苯甲醛。（2）通過以胺脫氫酶Gk Am DH序列為模板,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列比對,發(fā)現(xiàn)一株對R-PAC有活力的胺脫氫酶BbAmDH,并引入突變位點N276C,使其對R-PAC活力由3.2 U/mg變?yōu)?.3 U/mg,然后測定了BbAmDH及其突變體的酶學(xué)性質(zhì)。并優(yōu)化了胺脫氫酶(BbAmDHN276C)以R-PAC為底物催化還原胺化反應(yīng)合成去甲基麻黃素（NE）的反應(yīng)條件。最終確定其最適合反應(yīng)條件:40℃、p H 9.5和50 mg·m L-1 E.coli BL21/p ET28a-BbAmDHN276C。（3）以苯甲醛、丙酮酸和NH4Cl為原料分步法合成了去甲基麻黃素,苯甲醛轉(zhuǎn)化率達到99%;NE的產(chǎn)率為83.7%。然后又在一鍋法中合成了去甲基麻黃素,并優(yōu)化了一鍋法的反應(yīng)條件,確定其最適合反應(yīng)條件為40℃、p H 8.5和0.7 mol·L-1 NH4Cl,此時苯甲醛轉(zhuǎn)化率達到83%;NE的產(chǎn)率為67.5%。（4）在一鍋法中,R-PAC濃度始終維持在較低水平,可利用補料策略解決AHAS I的底產(chǎn)物抑制作用。利用流加底物苯甲醛的策略,發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時間延長,流加的苯甲醛逐漸積累,致使反應(yīng)效率下降;然后利用同時流加底物苯甲醛和E.coli BL21/p ET28a-AHAS I細胞的策略,發(fā)現(xiàn)積累的苯甲醛很快被消耗,有效解除了AHAS I的底物和產(chǎn)物抑制作用,使得苯甲醛轉(zhuǎn)化率從83%提高到90%,NE產(chǎn)率從67.5%提高到75%。相比分步法,反應(yīng)12 h,苯甲醛批次反應(yīng)濃度從40 mmol·L-1提高到100 mmol·L-1,NE的時空產(chǎn)率提高2.5倍。
阮小波[2]（2021）在《多酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化L-酪氨酸生產(chǎn)酪醇的研究》文中認為酪醇（tyrosol）是一種具有藥理活性的苯乙醇衍生物,是羥基酪醇和紅景天苷等功能性化合物的前體,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品行業(yè)。傳統(tǒng)的植物提取和化學(xué)合成存在提取收率低、反應(yīng)條件苛刻以及純化工藝復(fù)雜等缺點。生物酶轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)溫和、轉(zhuǎn)化率高、環(huán)境污染小等優(yōu)點,是一種有潛力的酪醇生產(chǎn)方式。本研究通過模擬釀酒酵母Ehrlich pathway設(shè)計了一個級聯(lián)途徑,全細胞催化L-酪氨酸合成酪醇。確定多酶反應(yīng)中的限速酶后,通過模塊化組裝以及對限速酶丙酮酸脫羧酶（PDC）重復(fù)表達,協(xié)調(diào)路徑酶的表達水平,使L-氨基酸脫氨酶（LAAD）、丙酮酸脫羧酶（PDC）、乙醇脫氫酶（ADH）和葡萄糖脫氫酶（GDH）具有良好的協(xié)同性。再將優(yōu)化的重組菌結(jié)合樹脂,通過原位產(chǎn)物分離進一步提高酪醇產(chǎn)量。主要研究內(nèi)容如下:（1）設(shè)計和構(gòu)建級聯(lián)生產(chǎn)酪醇的路徑。首先,基于Ehrlich pathway的轉(zhuǎn)氨、脫羧和還原三步反應(yīng),引出脫氨-脫羧-還原,并為還原反應(yīng)構(gòu)建了輔因子再生系統(tǒng);其次,篩選獲得Proteus mirabilis來源的L-氨基酸脫氨酶（Pm LAAD）、Candida tropicails來源的丙酮酸脫羧酶（Ct PDC）、Saccharomyces cerevisiae來源的乙醇脫氫酶（Sc ADH6）和Bacillus megaterium來源的葡萄糖脫氫酶（Bm GDH）作為級聯(lián)反應(yīng)的路徑酶;然后,體外級聯(lián)催化反應(yīng)檢測到產(chǎn)物酪醇的生成,驗證了該級聯(lián)路徑的可行性;最后,通過測定四酶的動力學(xué)參數(shù),鑒定PDC為該級聯(lián)反應(yīng)的限速酶。（2）多酶級聯(lián)路徑的組裝和優(yōu)化。構(gòu)建Pm LAAD、Ct PDC、Sc ADH6和Bm GDH的共表達菌株,全細胞轉(zhuǎn)化驗證體內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)的可行性。將四酶以雙質(zhì)粒共表達的方式構(gòu)建了一系列共表達菌株,使用4種具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒調(diào)節(jié)四個酶的相對活性,平衡各酶的反應(yīng)速率。比較12株菌株（E.coli 01-12）的酪醇合成能力,最佳酪醇合成菌株E.coli 07在提高底物濃度時出現(xiàn)中間產(chǎn)物對羥基苯丙酮酸（4-HPP）的積累,檢測全細胞中LAAD與PDC的酶活比為1:0.8,體外實驗表明,調(diào)節(jié)兩酶的酶活比達到1:1.5,級聯(lián)體系中各酶催化實現(xiàn)平衡;基于體外優(yōu)化結(jié)果,利用基因重復(fù)表達策略提高PDC表達水平,獲得E.coli 07-2菌株,酶活比例提高到1:1.5。以菌株E.coli 07-2進行發(fā)酵工藝優(yōu)化和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化,30 g·L-1L-酪氨酸為底物時轉(zhuǎn)化率為95.5%。此外,發(fā)現(xiàn)影響產(chǎn)量進一步提高的限制因素為產(chǎn)物抑制,產(chǎn)物濃度達到22 g·L-1能夠完全抑制細胞的轉(zhuǎn)化。（3）產(chǎn)物原位分離法提高酪醇產(chǎn)量。通過比較對產(chǎn)物酪醇和底物L(fēng)-酪氨酸的吸附能力篩得樹脂XAD4,該樹脂對吸附酪醇有較高的特異性;其次,優(yōu)化了樹脂的添加量,其中10%（干重,w/v）的XAD4能夠吸附17.5 g·L-1的酪醇;高濃度乙醇條件下能夠有效解吸樹脂上的酪醇,此外,解吸時長對酪醇的收率也存在影響,使用3倍體積量的無水乙醇兩批次解吸8 h,收率為97.8%;接著,搖瓶轉(zhuǎn)化考察了不同底物濃度對樹脂吸附轉(zhuǎn)化的影響。最終,使用E.coli 07-2結(jié)合樹脂XAD4規(guī)模化制備酪醇,總產(chǎn)量32 h達到35.7 g·L-1,轉(zhuǎn)化率為93.6%。
龔磊[3]（2020）在《化學(xué)—酶法催化生物質(zhì)原料合成β-羥基-α-氨基酸的研究》文中研究表明羥醛縮合反應(yīng)能夠增長碳鏈,并且可以產(chǎn)生支鏈,在有機化學(xué)合成領(lǐng)域具有重要地位,其中β-羥基-α-氨基酸是一類可用于構(gòu)筑多種生物活性天然產(chǎn)物和藥物的重要合成砌塊分子。本文針對蘇氨酸醛縮酶對產(chǎn)物β-羥基-α-氨基酸Cβ位選擇性不高、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低以及綠色可持續(xù)制造的應(yīng)用等問題,通過對羥醛縮合反應(yīng)的調(diào)控與優(yōu)化以及建立以生物質(zhì)為原料的化學(xué)-酶法生產(chǎn)工藝,實現(xiàn)了β-羥基-α-氨基酸的綠色高效合成。具體研究成果如下:（1）開發(fā)了基于2,4-二硝基苯肼（DNPH）的高通量篩選方法用于蘇氨酸醛縮酶（TAs）羥醛縮合活力的測定。以對甲砜基苯甲醛（MSB）為模式底物,在λ=485 nm處有特征吸收峰。對該方法的專屬性、線性范圍、檢測限、加標回收率、穩(wěn)定性、準確度以及對反應(yīng)體系的適用性進行了評估。以來自Alcaligenes xylosoxidans的D-蘇氨酸醛縮酶（Ax DTA）為模板酶,利用新建立的DNPH法應(yīng)用其定點飽和突變文庫的高通量篩選,經(jīng)過初篩和復(fù)篩獲得了2個對MSB活力提高的突變體Ax DTAD321C和Ax DTAN101G,酶活力分別提高了1.5和1.3倍。利用該方法對Ax DTA及其突變體在羥醛縮合反應(yīng)中的催化性能進行了高通量表征,對動力學(xué)參數(shù)、底物譜及反應(yīng)進程進行了評價和分析。突變體Ax DTAD321C的kcat/Km值(0.84 s–1·m M–1)提高了58%。在對于脂肪醛、芳香醛和雜環(huán)醛等19種底物進行研究發(fā)現(xiàn)Ax DTA突變體對醛的接受范圍比親本更大。Ax DTAD321C和Ax DTAN101G催化MSB和甘氨酸的縮合反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率比Ax DTA分別高13.9%和9.1%。因此,DNPH法在TAs的高通量篩選及羥醛縮合反應(yīng)的表征中具有良好的應(yīng)用前景。（2）通過基因挖掘技術(shù)和DNPH法篩選獲得了酶活力和非對映體過量值（de值）較高的來自Achromobacter piechaudii的D-蘇氨酸醛縮酶（Ap DTA）,對其最適p H、最適反應(yīng)溫度、最適p H和溫度穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)進行研究。結(jié)果顯示Ap DTA裂解和縮合活力的最適p H都為8.0,Ap DTA縮合活力最適溫度為30℃。當(dāng)p H 6.0時,Ap DTA裂解活力穩(wěn)定性最好,而p H 8.0時,縮合活力穩(wěn)定性最好。Ap DTA在4–30℃范圍內(nèi)具有較好的熱穩(wěn)定性。磷酸吡哆醛（PLP）和Mn2+是Ap DTA所需的輔因子和金屬離子,其最適添加量均為50μM。Ap DTA的Vmax值為40μmol·min–1·mg–1,Km值為30 m M,kcat值為27 s–1,kcat/Km值為0.9 m M–1·s–1。Ap DTA具有廣泛的底物譜但對于體積較大和長鏈底物沒有活力。在10℃,p H 6.0,加酶量為2 U和以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）為助溶劑的條件下,對5 m M MSB底物進行縮合反應(yīng),獲得最大產(chǎn)率和de值分別為60%和95%。當(dāng)p H 7.0時,Ap DTA水相動力學(xué)拆分D,L-threo-對甲砜基苯絲氨酸（D,L-threo-MSPS）的轉(zhuǎn)化率和對映選擇性分別為45.2%和81%。當(dāng)加入1,2-二氯乙烷和環(huán)己酮作為有機介質(zhì)時,得到50%轉(zhuǎn)化率以及對映選擇性ee%>99%。（3）為了拓展β-羥基-α-氨基酸的合成應(yīng)用以及實現(xiàn)其綠色可持續(xù)制造,以固體廢棄物粉煤灰為載體,合成了一種新型固體酸催化劑SO42–/Sn O2-Al2O3-CFA,并對其進行了SEM、FTIR、XRD、BET、EDAX和NH3-TPD物理表征。當(dāng)反應(yīng)體系為20 g·L–1木糖水解液,2.0 wt%SO42–/Sn O2-Al2O3-CFA,甲苯為有機介質(zhì)（1:1,v:v）,NH4Cl為助劑（100 m M）,在180℃下反應(yīng)攪拌反應(yīng)30 min后糠醛產(chǎn)率最高為84.7%,木糖轉(zhuǎn)化率為93.5%。固體酸催化劑可循環(huán)使用5批次,糠醛產(chǎn)率沒有顯著降低。利用生物質(zhì)糠醛的原位酶法轉(zhuǎn)化生成呋喃絲氨酸（FLSE）,實現(xiàn)了化學(xué)-酶法的級聯(lián)工藝,在p H 8.0,反應(yīng)溫度30℃,50μM PLP且不添加金屬離子的條件下將50 m M糠醛完全轉(zhuǎn)化。因此,該化學(xué)-酶多步反應(yīng)有效實現(xiàn)了從生物質(zhì)到高附加值化學(xué)品的轉(zhuǎn)化,具有潛在的應(yīng)用價值。（4）為了進一步提高生物質(zhì)原料的利用率以及實現(xiàn)過程更經(jīng)濟環(huán)保,開發(fā)了新型磁性固體酸催化劑Fe3O4@MCM-41/SO42–用于玉米芯高效地制備糠醛,對該固體酸進行了SEM、FTIR、XRD、BET、EDAX、VSM和Py-IR表征分析。在100 g·L–1玉米芯,2 wt%Fe3O4@MCM-41/SO42–和180℃條件下,反應(yīng)40 min后得到最高糠醛濃度為72m M;調(diào)節(jié)p H至8.0后直接加入固定化E.coli Pp LTA全細胞(相當(dāng)于20 g·L–1濕細胞)制備手性FLSE,最終產(chǎn)率為73.6%,ee%>99%,de值為20%（threo）。該策略實現(xiàn)了中間物的分離最小化,減少了操作時間并提高了反應(yīng)效率。固體酸預(yù)處理后的玉米芯酶解可得到葡萄糖濃度為45 g·L–1,是未處理的2.5倍,提高了酶解效率和原料利用率。固體酸和固定化全細胞催化劑可簡單地從體系中分離,可重復(fù)再生使用5批次,具有良好的可重復(fù)利用性和穩(wěn)定性。該化學(xué)-酶催化過程提供了從化石燃料轉(zhuǎn)向生物質(zhì)原料的可能性,可應(yīng)用于呋喃衍生物的合成。
李國四[4]（2020）在《生物催化級聯(lián)反應(yīng)制備丙酮酸及L-酪氨酸衍生物》文中研究說明丙酮酸作為重要的原料和中間體,廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。傳統(tǒng)的酒石酸脫水脫羧法生產(chǎn)工藝操作簡單,但存在污染嚴重、產(chǎn)率低、原料消耗大等問題,導(dǎo)致丙酮酸及其衍生產(chǎn)品價格較高。近年來,丙酮酸的生物法制造技術(shù)由于原料成本低、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品安全可靠等優(yōu)點,引起產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注。生物法包括糖質(zhì)原料發(fā)酵法和乳酸的酶催化氧化法兩類。由于細胞內(nèi)與丙酮酸相關(guān)的代謝途徑活躍,限制了丙酮酸發(fā)酵水平的提高,而且由于丙酮酸在水溶液中溶解度大,從成分復(fù)雜的發(fā)酵液中分離丙酮酸成本較高,發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸一直難以大規(guī)模工業(yè)化。以短鏈L-2-羥基酸氧化酶為基礎(chǔ)的生物催化法由于無需添加昂貴的輔酶、催化體系簡單且產(chǎn)品分離純化方便,具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。但是,催化的過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物過氧化氫容易將丙酮酸氧化成乙酸和二氧化碳,導(dǎo)致產(chǎn)率的降低。光學(xué)純L-酪氨酸及其衍生物常被用于合成一些重要的藥物,例如帕金森藥L-多巴和抗腫瘤藥物沙弗拉霉素A等?；瘜W(xué)從頭合成酪氨酸衍生物需要多個步驟,最終產(chǎn)物也是外消旋體,需要進行后期的拆分。酪氨酸酚裂解酶可直接催化丙酮酸、苯酚衍生物和氨生成L-酪氨酸衍生物,是一種極具前景的L-酪氨酸衍生物綠色合成途徑。但是由于供體底物丙酮酸成本較高且不穩(wěn)定,該方法和化學(xué)法相比競爭性仍不顯著。生物催化級聯(lián)反應(yīng)因為具有克服中間產(chǎn)物的毒性和不穩(wěn)定性、降低中間底物和產(chǎn)物分離純化成本以及提高催化效率等優(yōu)點,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于高附加值化學(xué)品的合成。針對上述問題,本論文開發(fā)了兩種催化級聯(lián)反應(yīng)體系:1)將短鏈L-2-羥基酸氧化酶催化的乳酸氧化脫氫反應(yīng)和過氧化氫酶催化的過氧化氫分解反應(yīng)相偶聯(lián),構(gòu)建了能夠?qū)⒘畠r的生物基原料L-乳酸氧化成丙酮酸的大腸桿菌全細胞催化劑。2)將上述體系進一步與酪氨酸酚裂解酶催化的C-C耦合反應(yīng)相偶聯(lián),構(gòu)建了一種包含L-2-羥基酸氧化酶、過氧化氫酶以及酪氨酸酚裂解酶的三酶級聯(lián)反應(yīng)體系,以L-乳酸和苯酚衍生物為出發(fā)底物,一鍋法制備L-酪氨酸衍生物。首先,通過文獻調(diào)研以及基因挖掘克隆了6種短鏈L-2-羥基酸氧化酶以及10種單功能過氧化氫酶,并分別從中篩選出催化活力高且穩(wěn)定性好的來源于Aerococcus viridans 的乳酸氧化酶 AvLOX 以及來源于 Ureibacillus thermospAhaericus的過氧化氫酶UtCAT。其中,AvLOX在大腸桿菌中表達時包涵體比例較高,為了提高酶活,采用降低表達溫度和誘導(dǎo)劑濃度、RBS序列定向進化和共表達分子伴侶的策略增強其可溶性表達。通過降低表達溫度和誘導(dǎo)劑濃度,可溶性提高了3.4倍,酶活提高了48.9%;通過對RBS序列定向進化,成功獲得了有利于AvLOX可溶性表達的RBS突變序列GGGGGC,攜有該突變序列的重組菌E coli-pET28a-T7rbsAvLOX中目標酶的可溶性提高了 1.7倍,酶活提高了62.7%;在此基礎(chǔ)上,進一步共表達分子伴侶GroES-GroEL,可溶性提高了 1.8倍,酶活提高了43.1%,最終AvLOX可溶性由8.5%提高到89.2%,酶活由4.5 U/mL提高到15.6 U/mL。然后,采用UtCAT與AvLOX粗酶液構(gòu)建了胞外的雙酶級聯(lián)反應(yīng)體系,確定了 UtCAT與AvLOX的酶活最優(yōu)配比為300:1,以500 mM L-乳酸為底物收率能夠達到92.3%,是不添加過氧化氫酶時（7.3%）時的12.6倍。為了簡化工藝、提高偶聯(lián)效率和降低成本,將AvLOX與UtCAT在E.coli BL21（DE3）內(nèi)進行共表達,以pET28a-T7rbsAvLOX為質(zhì)粒骨架構(gòu)建了胞內(nèi)雙酶級聯(lián)的全細胞催化劑。采用三種不同的單質(zhì)粒共表達策略,其中共表達菌株五.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT雙酶表達效果最好。為了進一步提高過氧化氫酶酶活,利用RBS計算軟件對UtCAT基因前的RBS序列進行重新設(shè)計,獲得了翻譯起始速率顯著增強的序列RBS3,可使UtCAT酶活提高了 1.8倍,最終共表達菌株E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT 中 UtCAT 和 AvLOX 的酶活分別達到4127.3 U/mL 和 12.6 U/ml（酶活比 328:1）。對 E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT的催化工藝進行了優(yōu)化,獲得的最佳的工藝條件為:反應(yīng)溫度37℃C,體系pH7.0,菌體添加量20 g/L以及0.7 Mpa氧氣壓力,其中氧氣濃度是L-乳酸氧化反應(yīng)的限制因素。在該條件下,500mML-乳酸僅需要1.5h即可被轉(zhuǎn)化,收率達到92.2%。同時,考慮到維持氧氣壓力對設(shè)備有一定要求,在常壓條件下建立了底物分批補料催化工藝,在L-乳酸總濃度為600 mM的反應(yīng)中丙酮酸收率能夠達到90.8%。然后,表達了來源于Symbiobacterium toebii的熱穩(wěn)定型酪氨酸酚裂解酶（Thermophilic tyrosine-phenol lyase,TTPL）并分析了 底物譜,發(fā)現(xiàn) TTPL 可以催化苯酚、以及鄰位時OH和F的2-羥基苯酚和2-氟-苯酚,但是將鄰位取代基換成Cl、Br、CH3以及OCH3后TTPL就喪失了對底物的催化能力。為增強TTPL對不同底物的適應(yīng)性,對其進行理性設(shè)計改造?；谕唇Ｅc分子對接模擬分析,通過定點突變將TTPL中對底物特異性起決定作用的口袋進行擴大,構(gòu)建了10個突變株,從中成功篩選出3個對2-甲基苯酚有較高催化活力的突變株F37V、T126S和M380V。底物特異性研究表明,突變株F37V和M380V表現(xiàn)出更寬的底物譜以及不錯的催化活力。最后,以2-氟-苯酚為模式底物,構(gòu)建了基于AvLOX、UtCAT以及TTPL M380V的三酶級聯(lián)反應(yīng)體系,其最佳的工藝條件為:反應(yīng)溫度40℃,體系pH 8.0,E.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT 與E.coli-pET28a-TTPLM380V 菌體添加比為1:2,濕菌添加總量為25g/L,底物濃度為46mM,該條件下3-氟-L-酪氨酸的收率由83.1%提高到97.1%,ee值>99%。以此為基礎(chǔ),通過改變熱穩(wěn)定性酪氨酸酚裂解酶突變子種類,還可以催化合成5種其它L-酪氨酸衍生物,收率達到81.1-96.3%,ee值均大于99%。采用底物流加補料催化工藝,在0.5 L規(guī)模反應(yīng)中,上述反應(yīng)的底物酚轉(zhuǎn)化率分別達到77.4～94.3%,產(chǎn)物濃度達到48.0～60.4g/L,成功解決了底物抑制、催化劑不穩(wěn)定和收率低等問題,展示出良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
孫小雯[5]（2020）在《基于畢赤酵母底盤的維生素K2（MK-4）細胞工廠構(gòu)建與優(yōu)化》文中提出維生素K2是一類側(cè)鏈長度不同的異戊烯基化甲萘醌產(chǎn)品的總稱,屬于衍生脂質(zhì)。其中四烯甲萘醌（MK-4）在促進凝血和防治骨質(zhì)疏松癥方面具有良好的效果,在臨床上具有較高的應(yīng)用價值。大腸桿菌和畢赤酵母作為兩種成熟高效的蛋白表達系統(tǒng),已被成功地應(yīng)用于多種異源蛋白的表達。本課題組已經(jīng)在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了 MK-1從無到有的生物合成,而側(cè)鏈長度更長的MK-4的生物制造將是我們下一步要實現(xiàn)的目標。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有繁殖迅速、易于高密度發(fā)酵,可以進行蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾,易獲得可溶性活性重組蛋白等優(yōu)點,盡管在畢赤酵母中尚未發(fā)現(xiàn)甲萘醌的生物合成途徑,但這也可以在一定程度上避免復(fù)雜的分支途徑和反饋調(diào)節(jié)機制對重構(gòu)路徑造成的不利影響。因此,為實現(xiàn)MK-4的高效生物制備,本研究運用合成生物學(xué)理念,基于多維度的信息整合,將高效的酶和生物合成途徑整合到大腸桿菌和畢赤酵母底盤細胞中,構(gòu)建以廉價的VK1或VK3為原料的MK-4高效生物制備的細胞工廠,并通過分析其優(yōu)缺點以確定最佳的表達系統(tǒng)。研究工作有效拓展了 VK2生物合成的底盤細胞種類,為VK2等異戊烯基化產(chǎn)品的生物合成途徑構(gòu)建與優(yōu)化提供了新的思路,具有重要的理論和應(yīng)用價值。論文首先從物質(zhì)和能量代謝角度出發(fā)在E.coli中重構(gòu)MK-4代謝途徑,通過MBP促溶標簽實現(xiàn)古細菌來源的SaGGPPS催化的由IPP直接到GGPP的生物合成,在此基礎(chǔ)上通過敲除pgi基因,調(diào)控EMP、PPP和EDP三條葡萄糖分解代謝途徑的分配,強化胞內(nèi)還原力NADPH的合成,使重組菌株胞內(nèi)的MK-4含量達到0.78 mg/L。由于其合成能力未達預(yù)期,同時考慮到菌株穩(wěn)定性和生物安全性等問題,將在畢赤酵母中開展后續(xù)的研究工作。通過對KEGG等數(shù)據(jù)庫信息的整合,利用生物合成途徑設(shè)計軟件BioSynther,以VK3和IPP作為底物對MK-4的生物合成途徑進行理性設(shè)計,并確定催化萘醌骨架與異戊烯基側(cè)鏈聚合反應(yīng)的關(guān)鍵酶HsUBIAD1。為了制定更好的蛋白表達策略,對該蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)以及催化活性中心等進行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析。利用生物信息學(xué)分析的結(jié)果,構(gòu)建產(chǎn)HsUBIAD1蛋白的重組畢赤酵母,并結(jié)合多重篩選機制,獲得高產(chǎn)重組畢赤酵母菌株GGU-23。然后在250 mL的搖瓶水平上,對篩選出的高產(chǎn)菌株GGU-23的基本發(fā)酵過程參數(shù)進行優(yōu)化,并確定了24℃,初始pH 7.0,培養(yǎng)36h的搖瓶發(fā)酵工藝,優(yōu)化后的GGU-23菌株的生物量達到31.0 g/L,較優(yōu)化前提高了 6.9%,蛋白表達量提高了 4.8倍。為了表征HsUBIAD1的酶學(xué)性質(zhì),利用Ni-NTA親和層析柱和重力型去鹽柱從重組GGU-23菌株中獲得純化的HsUBIAD1蛋白,并進行初步的動力學(xué)分析,確定了體外的最佳酶促反應(yīng)體系和條件:初始pH 7.0,31℃,當(dāng)Mg2+參與的條件下,HsUBIAD1蛋白催化底物VK3異戊烯基化反應(yīng)的活性最高,較優(yōu)化前提高了 2.1倍,原因是Mg2+通過與蛋白的活性中心的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生相互作用,改變其內(nèi)部構(gòu)象,使異戊烯基側(cè)鏈與活性中心氨基酸殘基的結(jié)合能力增強,進而促進酶促反應(yīng)的進行。在GGU-23菌株全細胞催化的研究中,發(fā)現(xiàn)其具有催化外源VK1和VK3異戊烯基化反應(yīng)合成MK-4的能力,當(dāng)以VK3作為全細胞催化體系的底物時,胞內(nèi)MK-4的含量達到2.03 mg/L,實現(xiàn)了初代重組畢赤酵母菌株從無到有合成MK-4的突破。為了獲得新一代的細胞工廠,需要對初代細胞工廠的細胞性能進行優(yōu)化,提高其MK-4的合成能力。通過構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達載體,將外源側(cè)鏈合成途徑的關(guān)鍵酶SaGGPPS整合到產(chǎn)MK-4的初代畢赤酵母細胞中,強化側(cè)鏈合成前體GGPP的供給,使全細胞催化體系中MK-4的含量提高了 62.1%;再通過融合表達策略,將SaGGPPS與其上游的PpIDI蛋白進行融合表達,側(cè)鏈合成途徑得到了進一步的優(yōu)化,MK-4的含量達到5.86 mg/L,較之前又提高了78.1%。實現(xiàn)了畢赤酵母菌株（GGU-GrIG）目標產(chǎn)物合成性能從低到高的優(yōu)化。為了進一步挖掘優(yōu)化后的畢赤酵母細胞工廠的應(yīng)用潛力,繼續(xù)對工程菌GGU-GrIG合成MK-4的全細胞催化工藝進行優(yōu)化,摸索出最合適的工藝參數(shù),即在30℃,250 rpm的條件下,從催化反應(yīng)開始起每間隔6 h,向催化體系中添加40 mg/L VK3溶液,連續(xù)培養(yǎng)18 h最有利于MK-4的生物合成。工程菌經(jīng)過優(yōu)化,MK-4產(chǎn)量達到7.55 mg/L,較優(yōu)化前提高了 28.8%,表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和應(yīng)用潛力。
侯正杰[6]（2020）在《大腸桿菌N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化》文中研究說明N-乙酰神經(jīng)氨酸（Neu5Ac）是一種重要的功能性糖衍生物,因其獨特的生理和生化性質(zhì),受到人們越來越多的關(guān)注,在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。為滿足市場需求,迫切需要經(jīng)濟、高效的N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)工藝。微生物發(fā)酵法具有可持續(xù)、低環(huán)境污染、低能源消耗和排放等優(yōu)點,對工程菌進行合理的改造可以實現(xiàn)經(jīng)濟上的可行性以及高產(chǎn)量、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強度的生物轉(zhuǎn)化過程。本研究在實驗室已構(gòu)建的N-乙酰葡萄糖胺生產(chǎn)菌E.coli GLA-0基礎(chǔ)上,采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進行N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化,實現(xiàn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的高效微生物合成。（1）過表達去磷酸化酶基因yqaB,使出發(fā)菌的N-乙酰葡萄糖胺產(chǎn)量在搖瓶水平進一步提升了 13.92%。在此基礎(chǔ)上敲除了nanATEK基因,阻斷了 N-乙酰神經(jīng)氨酸的分解途徑。隨后,對Neu5Ac合成途徑關(guān)鍵酶N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶（AGE）的來源進行了篩選,比較了項圈藻來源的PT7-bA GE和集胞藻來源的PT7-slr1975的催化效果,根據(jù)搖瓶發(fā)酵結(jié)果確定項圈藻來源的PT7-bAGE優(yōu)于集胞藻來源。最后,通過引入腦膜炎奈瑟菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因PT7-neuB,打通了 Neu5Ac的合成途徑,獲得的工程菌NEA-4搖瓶發(fā)酵Neu5Ac產(chǎn)量為3.2 g/L。（2）對Neu5Ac合成途徑的兩個關(guān)鍵酶AGE和NeuB進行了基因表達的優(yōu)化,發(fā)酵結(jié)果顯示PT7-bA GE與PT7-neuB的拷貝數(shù)分別為1、2時,NEA-6菌株的Neu5Ac產(chǎn)量最高,達到4.24 g/L。在此基礎(chǔ)上,引入腦膜炎奈瑟菌的UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶來增加ManNAc的供應(yīng)。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶的引入增加了 GlcNAc和ManNAc的積累,但Neu5Ac的積累量并沒有提升,表明ManNAc的供應(yīng)水平不是限制NEA-6菌株Neu5Ac產(chǎn)量進一步提升的因素。（3）在NEA-6菌株基礎(chǔ)上進一步通過改造增強前體物PEP的供應(yīng)。消除葡萄糖特異性PTS系統(tǒng)并引入運動發(fā)酵假單胞菌的葡萄糖易化蛋白Glf,Neu5Ac積累量為5.31 g/L,較NEA-6提高25.23%,DCW下降13.34%,單位細胞產(chǎn)量提高了 44.6%;過表達磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因pps,Neu5Ac積累量為5.89 g/L,較NEA-6提高39.15%,DCW下降了 31%,單位細胞產(chǎn)量提高了 99.8%;敲除丙酮酸激酶Ⅰ基因pykF,同時過表達PEP羧激酶基因pck,Neu5Ac積累量為5.24 g/L,較NEA-6提高23.58%,DCW下降了 26.24%,單位細胞產(chǎn)量提高了 67.7%。（4）通過敲除蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶基因patZ同時過表達乙酰輔酶A合成酶基因acs以期望達到減弱乙酸積累的目的,同時產(chǎn)生的乙酰輔酶A來供應(yīng)合成GlcNAc的乙?；磻?yīng)以及TCA循環(huán),促進前體物的合成以及細胞生長。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明△patZ::Ptrc-acs減少了發(fā)酵液中乙酸的積累,但是并沒有對生物量的提升以及Neu5Ac的積累產(chǎn)生正向影響。本研究通過對N-乙酰葡萄糖胺生產(chǎn)菌進行合理的改造,最終獲得一株以葡萄糖為底物高效合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的大腸桿菌工程菌E.coli NEA-10;以葡萄糖為單一碳源,經(jīng)搖瓶補料分批發(fā)酵最終發(fā)酵液中N-乙酰神經(jīng)氨酸積累量達到5.89 g/L,單位菌體產(chǎn)率可達到0.5 g/g DCW。
鹿承建[7]（2020）在《重組畢赤酵母全細胞轉(zhuǎn)化L-乳酸合成丙酮酸鈉的工藝研究》文中研究表明丙酮酸是生物體系中重要的有機小分子物質(zhì),是細胞進行氧化功能過程中起關(guān)鍵作用的中間產(chǎn)物,在三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化工、食品工業(yè)、農(nóng)用化學(xué)品和日用工業(yè)品等行業(yè),對其商業(yè)需求不斷增長。目前工業(yè)生產(chǎn)丙酮酸主要采用化學(xué)合成法和發(fā)酵法,但由于化學(xué)合成法和發(fā)酵法存在轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物多、不易分離提取等問題,限制了丙酮酸的工業(yè)化生產(chǎn)。因此,開發(fā)新型全細胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)丙酮酸鈉的工藝,實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),具有重要的經(jīng)濟和社會意義。本課題以高產(chǎn)乙醇酸氧化酶的重組畢赤酵母GS115-GO為出發(fā)菌株,在5L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中通過對接種量、p H、培養(yǎng)溫度、甲醇誘導(dǎo)時間、甲醇濃度、甲醇開始誘導(dǎo)時間等工藝進行優(yōu)化,提高重組畢赤酵母GS115-GO發(fā)酵液的菌體濃度和乙醇酸氧化酶的活力。在接種量15%、p H控制在4.5-5.0、發(fā)酵溫度30℃、培養(yǎng)25h進行0.3-1.5g/L濃度的甲醇誘導(dǎo),誘導(dǎo)30h條件下,重組畢赤酵母GS115-GO在5L發(fā)酵罐上發(fā)酵60h菌體濕重達到241.47g/L,提高了33.8%,乙醇酸氧化酶的活力可達8.9U/g,提高了59.3%。為了進一步研究該菌株的工業(yè)化應(yīng)用價值,我們對重組畢赤酵母GS115-GO種子罐培養(yǎng)基進行優(yōu)化、種子擴大培養(yǎng)和多級發(fā)酵工藝驗證,再按照溶氧一致性原則,進行5T發(fā)酵罐重組畢赤酵母GS115-GO中試放大發(fā)酵60h,重組畢赤酵母GS115-GO的最大菌體濕重可達273.83g/L,比5L發(fā)酵水平提高13.4%,乙醇酸氧化酶活力為9.16U/g,比5L發(fā)酵水平提高2.92%。在重組畢赤酵母GS115-GO轉(zhuǎn)化L-乳酸制備丙酮酸鈉的過程中,首先對重組畢赤酵母GS115-GO的細胞透性化處理工藝進行優(yōu)化,提高細胞的轉(zhuǎn)化效率。最佳透性化處理工藝采用0.06%的苯扎氯銨處理60min。在此基礎(chǔ)上對轉(zhuǎn)化體系的底物L(fēng)-乳酸濃度、細胞濃度、p H、轉(zhuǎn)化溫度等轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化提高丙酮酸鈉產(chǎn)率和L-乳酸轉(zhuǎn)化率。在底物L(fēng)-乳酸濃度為90g/L、重組畢赤酵母細胞濃度80g/L、p H值7.5-8.0,轉(zhuǎn)化溫度15℃條件下,丙酮酸鈉的濃度達187.9g/L,L-乳酸轉(zhuǎn)化率達91.15%,反應(yīng)速率達到2.93g/L/h。針對全細胞生物催化法副產(chǎn)物少、分離純化簡單以及丙酮酸離子不穩(wěn)定的特點,建立丙酮酸鈉的提取純化工藝,并對提取過程中脫色工藝、濃縮冷卻結(jié)晶工藝和醇結(jié)晶工藝進行優(yōu)化,制備的丙酮酸鈉晶體,含量達99.8%,純度達99.7%,收率達72%。本課題采用全細胞生物催化制備丙酮酸鈉,副產(chǎn)物少,轉(zhuǎn)化率高,對環(huán)境的污染小,符合綠色發(fā)展的觀念。采用醇結(jié)晶的方式來提取純化丙酮酸鈉,工藝操作簡單,節(jié)約生產(chǎn)成本。同時為丙酮酸鈉的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),進一步滿足國內(nèi)外市場對丙酮酸鈉產(chǎn)品的需求。
潘多濤[8]（2019）在《克雷伯氏桿菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇過程的代謝分析與優(yōu)化》文中提出生物經(jīng)濟的蓬勃發(fā)展對以生產(chǎn)生物質(zhì)化學(xué)品為代表的生物煉制提出了更高的要求。1,3-丙二醇（1,3-PD）是重要的化工原料,廣泛應(yīng)用于各個行業(yè)。近30年來,生物法發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PD備受人們關(guān)注,其具有綠色環(huán)保、可再生及廢棄物資源化等優(yōu)勢,但相比于傳統(tǒng)的化學(xué)生產(chǎn)方法,仍不具有成本優(yōu)勢,目前亟待解決的問題是甘油轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度仍然不理想。本文針對克雷伯氏桿菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PD的過程,通過數(shù)學(xué)建模分析對其代謝過程進行了深入研究,預(yù)測發(fā)酵過程的動態(tài)行為,并提出優(yōu)化控制策略,主要的研究內(nèi)容如下:首先,將基因組尺度的通量平衡分析與胞外代謝物的動力學(xué)模型結(jié)合,構(gòu)建了基于動態(tài)通量平衡分析的優(yōu)化方法。經(jīng)過計算分析獲得了拓展的代謝途徑,幾個新增的重要節(jié)點包括:在二羥基丙酮（DHA）節(jié)點引入了能為系統(tǒng)提供更多還原當(dāng)量的磷酸戊糖途徑（PPP）;在3-磷酸甘油酸（3PG）節(jié)點存在合成氨基酸的支路;在三羧酸循環(huán)（TCA）中的α-酮戊二酸節(jié)點引入谷氨酸以及其他氨基酸的合成代謝途徑,構(gòu)建了更完整的通路。在此基礎(chǔ)上,重點分析了代謝途徑中關(guān)鍵節(jié)點支路的動態(tài)通量分布與1,3-PD產(chǎn)率的關(guān)系:DHA進入磷酸戊糖途徑的動態(tài)通量變化與1,3-PD產(chǎn)率呈正相關(guān);TCA循環(huán)途徑中通量變化與產(chǎn)率成正相關(guān)。此外,發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)通過α-酮戊二酸和半胱氨酸與其他代謝途徑形成復(fù)雜的耦合關(guān)系,與1,3-PD的產(chǎn)率構(gòu)成相關(guān)性;氨基酸合成代謝途徑中,輔酶四氫葉酸構(gòu)成的反饋循環(huán)會對TCA的通量變化產(chǎn)生干擾。其次,利用整體建模方法克服發(fā)酵過程模型的不確定性,提高了模型的預(yù)測性能。通過靈敏度分析,確定對模型影響較大的參數(shù)作為整體建模的調(diào)節(jié)參數(shù);經(jīng)過對比選定適合的模型誤差閾值,在可適范圍內(nèi)利用均勻采樣方法生成盡可能多的等效參數(shù)集合,在并行計算的基礎(chǔ)上開展整體建模的應(yīng)用。結(jié)果顯示,在連續(xù)發(fā)酵過程中,整體建模的預(yù)測值與實驗測量值的平均相對誤差由原來的11.90%降低為7.95%,顯著優(yōu)于常規(guī)單參數(shù)模擬結(jié)果,表明該方法能夠有效提高模型預(yù)測能力。此外,分別確定了最優(yōu)生產(chǎn)強度和產(chǎn)率以及對應(yīng)的操作條件:在間歇過程中,最大生產(chǎn)強度為37.45 mmol·L-1·h-1、產(chǎn)率為0.70 mol·mol-1,對應(yīng)的初始甘油濃度分別是1020 mmol·L-1和1070 mmol·L-1;在連續(xù)過程中,最大生產(chǎn)強度為93.94 mmol·L-1·h-1,對應(yīng)的最佳操作條件是初始甘油濃度為780 mmol·L-1、稀釋速率為0.23 h-1,而最優(yōu)產(chǎn)率為0.68 mol·mol-1,對應(yīng)的初始甘油濃度為880 mmol·L-1、稀釋速率為 0.09 h-1。最后,通過數(shù)學(xué)函數(shù)連續(xù)性分析深入研究了單罐、雙罐連續(xù)發(fā)酵的多穩(wěn)態(tài)及振蕩特性。在不同的初始甘油濃度或稀釋速率下,系統(tǒng)均會出現(xiàn)多穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象,并通過雙因素分析,得到多穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)的臨界區(qū)域,該區(qū)域內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)是不穩(wěn)定的。之后,采用數(shù)學(xué)規(guī)劃方法對雙罐發(fā)酵過程中的兩級稀釋速率及初始甘油濃度進行了優(yōu)化,得到了最佳操作條件:初始甘油濃度為900 mmol·L-1,#1反應(yīng)器的稀釋速率為0.21 h-1,#2反應(yīng)器的稀釋速率為1.37 h-1。此外,基于反饋控制理論,設(shè)計優(yōu)化了受殘余甘油和產(chǎn)物1,3-PD濃度影響的稀釋速率控制策略,可作為實踐中連續(xù)培養(yǎng)的進料方案?？刂葡♂屗俾士商岣弋a(chǎn)物濃度,同時極大地縮短了系統(tǒng)達到穩(wěn)定所需的時間。在單罐和雙罐發(fā)酵過程中,調(diào)整時間分別從77.82/53.66 h縮短到31.24/22.68 h,可顯著降低發(fā)酵初期階段甘油的損耗,同時提高了生產(chǎn)強度。綜上所述,通過數(shù)學(xué)模擬對克雷伯氏桿菌的甘油代謝途徑的深入分析,克服了模型的不確定性,提高了模型的預(yù)測能力,優(yōu)化控制發(fā)酵過程,這些工作為提高1,3-PD的發(fā)酵生產(chǎn)性能提供了理論指導(dǎo),具有潛在的實踐應(yīng)用價值。
高鳳[9]（2019）在《海棲熱袍菌乙酰羥酸合酶活性檢測新方法的建立及其催化反應(yīng)的研究》文中指出乙酰羥酸合酶（Acetohydroxyacid synthase,AHAS,EC 4.1.3.18）是典型的硫胺素焦磷酸（Thiamine pyrophosphate,ThPP）依賴酶,它是催化生物體內(nèi)異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸這三種支鏈氨基酸（Branched chain amino acids,BCAAs）生物合成的第一步反應(yīng)的限速酶。這三種支鏈氨基酸均屬必需氨基酸,細菌、真菌、植物等可自行合成,而動物及人自身無法完成它們的合成,必須通過食物獲取。因此,乙酰羥酸合酶可作為抗菌素、除草劑等的有效篩選靶標。目前對于嗜極微生物AHAS的研究比較少。我們實驗室保存的重組大腸桿菌中的外源AHAS基因來源于極端嗜熱菌的模式生物--海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）,它的最適生長溫度為80℃。這種出自海洋極端環(huán)境的極端嗜熱菌,從它細胞內(nèi)分離出的酶具有超常的生物學(xué)穩(wěn)定性,可以在極端溫度、pH值、壓力和離子強度下表現(xiàn)出生物學(xué)活性,因此極端嗜熱酶為生物催化和生物轉(zhuǎn)化提供了更多的可能性。本課題主要包括兩方面內(nèi)容的研究:第一,建立了新的AHAS活性檢測方法。我們用柱前衍生-HPLC法通過使用4-硝基鄰苯二胺（4-Nitro-o-phenylenediamine,NPDA）和2,4-二硝基苯肼（2,4-Dinitrophenylhydrazine,DNPH）這兩種已經(jīng)比較成熟的衍生化試劑來分別衍生化和檢測AHAS催化反應(yīng)體系中的底物（α-酮酸類化合物）和產(chǎn)物（包括?-乙?；??-羥基羧酸類化合物、鄰二酮類化合物、偶姻類化合物和醛類化合物等）,并通過量化反應(yīng)過程中底物的消耗及產(chǎn)物的形成來計算酶的活性。相較于已有的比色法和氣相色譜檢測法,新建立的方法不但可以同時檢測底物的剩余量和各種產(chǎn)物的生成量,使得反應(yīng)體系中的化合物的組成更加明晰、準確之外,還克服了比色法無法同時準確檢測雙底物反應(yīng)及氣相色譜法操作繁瑣且無法排除檢測中的干擾問題等缺點。第二,通過利用上述方法并結(jié)合LC-MS測定發(fā)現(xiàn),對于AHAS的兩個天然底物丙酮酸和α-丁酮酸,除了常見的以丙酮酸為供體底物,丙酮酸或α-丁酮酸為受體底物進行催化反應(yīng)這個眾所公知的模式之外,海棲熱袍菌AHAS（TmAHAS）還可以同時以α-丁酮酸為供體底物,丙酮酸或α-丁酮酸為受體底物進行酶促反應(yīng),這種反應(yīng)模式導(dǎo)致該酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物構(gòu)成非常復(fù)雜,除了主產(chǎn)物乙酰乳酸（或稱α-乙?；?α-羥基丙酸,AL）及α-乙酰基-α-羥基丁酸（AHB）外,還包括若干副產(chǎn)物。通過對AHAS催化反應(yīng)的深入分析及查閱文獻,再結(jié)合所建立的柱前衍生-HPLC法與LC-MS測定,成功確定了除了上述兩種主產(chǎn)物以外的九種副產(chǎn)物,它們分別是兩種醛類化合物乙醛和丙醛,三種鄰二酮類化合物2,3-丁二酮、2,3-戊二酮和3,4-己二酮,以及四種偶姻類化合物乙偶姻（或稱3-羥基-2-丁酮）、3-羥基-2-戊酮、2-羥基-3-戊酮和4-羥基-3-己酮。在本研究中,我們首先建立并評價了AHAS酶活性新的檢測方法;其次,利用所建立的方法并結(jié)合LC-MS測定,系統(tǒng)地分析了TmAHAS催化的反應(yīng)中底物的消耗及產(chǎn)物的形成及分布,在此基礎(chǔ)上還探討了TmAHAS催化反應(yīng)的過程以及各產(chǎn)物形成的路徑,這些實驗結(jié)果都為進一步深入研究TmAHAS的催化機理及進一步拓寬其在不對稱有機合成反應(yīng)中的應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)。
汪磊[10]（2019）在《Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1菌株中2-溴硝基苯的代謝機理與相關(guān)應(yīng)用研究》文中指出鹵代硝基苯是一類具有廣泛應(yīng)用的重要化工生產(chǎn)中間體,同時它也是一種有毒物質(zhì),工業(yè)生產(chǎn)中的大量使用,造成含鹵代硝基苯的工業(yè)污水排放日益增加,并在環(huán)境中積累,對生態(tài)和人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。目前已有較多關(guān)于氯代硝基苯生物降解研究報道,但溴代硝基苯的生物降解卻尚未涉及。本研究發(fā)現(xiàn)2-氯硝基苯（2-chloronitrobenzene,2CNB）降解菌株P(guān)seudomonas stutzeri ZWLR2-1,能利用2-溴硝基苯（2-bromonitrobenzene,2BNB）為唯一碳源、氮源和能源生長,并對其代謝途徑中的兩個關(guān)鍵酶進行了研究:采用生物轉(zhuǎn)化法驗證了2BNB代謝過程中的第一個關(guān)鍵酶硝基芳烴雙加氧酶（CnbAaAbAcAd）的功能,其能催化2BNB生成3-溴鄰苯二酚,并釋放出亞硝酸根;通過酶活測定證明了鄰苯二酚1,2-雙加氧酶是2BNB降解過程中的第二個關(guān)鍵酶,該酶由cnbC基因編碼,可以將3-溴鄰苯二酚開環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)?-溴粘糠酸,同時對3-溴鄰苯二酚、3-氯鄰苯二酚、鄰苯二酚以及3-甲基鄰苯二酚都有較高的活性,表明其具有廣泛的底物適應(yīng)性。在研究2BNB降解過程中得到了中間代謝產(chǎn)物2-溴粘糠酸。粘糠酸是一種重要的化工中間原料,而鹵族元素的加入會影響其理化性質(zhì),因此鹵代粘糠酸具有潛在的工業(yè)應(yīng)用前景,然而2-溴粘糠酸目前尚無生物法生產(chǎn)的報道。本研究利用鄰苯二酚1,2-雙加氧酶催化3-溴鄰苯二酚生成2-溴粘糠酸,利用高效液相色譜從酶促反應(yīng)液中分離純化2-溴粘糠酸,并通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用與核磁共振驗證了其正確性。P.stutzeri ZWLR2-1菌株中的硝基芳烴雙加氧酶可以催化2BNB和2CNB生成相應(yīng)的鄰苯二酚,但是對3,4-二氯硝基苯（3,4-dichloronitrobenzene,34DCNB）卻沒有催化活性。研究表明硝基芳烴雙加氧酶系的α亞基在氨基酸序列上具有很高的相似性,少數(shù)氨基酸序列的改變可能會影響其底物譜和催化活性。因此本研究通過對P.stutzeri ZWLR2-1菌株中的硝基芳烴雙加氧酶α亞基中的4個氨基酸進行改變（204位的異亮氨酸變?yōu)榱涟彼?251位甲硫氨酸變?yōu)榻z氨酸;258位天冬氨酸變?yōu)槔i氨酸;350位纈氨酸變?yōu)樘K氨酸）以期待改變此酶的催化活性,使其具備催化34DCNB的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后的雙加氧酶對硝基芳烴化合物的催化活性會減弱,有的甚至喪失活性,但依然沒有催化34DCNB的能力。本研究首次闡述了2BNB的生物降解途徑,P.stutzeri ZWLR2-1菌株在代謝2CNB的同時還能降解2BNB,為溴代硝基苯的生物降解研究提供新思路;同時還首次報道了2-溴粘糠酸的制備純化過程,為以后工業(yè)利用生物酶制備2-溴粘糠酸提供一種可行的理論依據(jù)。
二、酶促生物轉(zhuǎn)化丙酮酸生產(chǎn)的研究（論文開題報告）
（1）論文研究背景及目的
此處內(nèi)容要求：
首先簡單簡介論文所研究問題的基本概念和背景，再而簡單明了地指出論文所要研究解決的具體問題，并提出你的論文準備的觀點或解決方法。
寫法范例：
本文主要提出一款精簡64位RISC處理器存儲管理單元結(jié)構(gòu)并詳細分析其設(shè)計過程。在該MMU結(jié)構(gòu)中,TLB采用叁個分離的TLB,TLB采用基于內(nèi)容查找的相聯(lián)存儲器并行查找,支持粗粒度為64KB和細粒度為4KB兩種頁面大小,采用多級分層頁表結(jié)構(gòu)映射地址空間,并詳細論述了四級頁表轉(zhuǎn)換過程,TLB結(jié)構(gòu)組織等。該MMU結(jié)構(gòu)將作為該處理器存儲系統(tǒng)實現(xiàn)的一個重要組成部分。
（2）本文研究方法
調(diào)查法：該方法是有目的、有系統(tǒng)的搜集有關(guān)研究對象的具體信息。
觀察法：用自己的感官和輔助工具直接觀察研究對象從而得到有關(guān)信息。
實驗法：通過主支變革、控制研究對象來發(fā)現(xiàn)與確認事物間的因果關(guān)系。
文獻研究法：通過調(diào)查文獻來獲得資料，從而全面的、正確的了解掌握研究方法。
實證研究法：依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)理論和實踐的需要提出設(shè)計。
定性分析法：對研究對象進行“質(zhì)”的方面的研究，這個方法需要計算的數(shù)據(jù)較少。
定量分析法：通過具體的數(shù)字，使人們對研究對象的認識進一步精確化。
跨學(xué)科研究法：運用多學(xué)科的理論、方法和成果從整體上對某一課題進行研究。
功能分析法：這是社會科學(xué)用來分析社會現(xiàn)象的一種方法，從某一功能出發(fā)研究多個方面的影響。
模擬法：通過創(chuàng)設(shè)一個與原型相似的模型來間接研究原型某種特性的一種形容方法。
三、酶促生物轉(zhuǎn)化丙酮酸生產(chǎn)的研究（論文提綱范文）
（1）級聯(lián)法合成去甲基麻黃素的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 去甲基麻黃素的概述 |
| 1.2 去甲基麻黃素的合成方法 |
| 1.2.1 抽提法 |
| 1.2.2 化學(xué)合成法 |
| 1.2.3 化學(xué)酶法 |
| 1.2.4 生物酶法 |
| 1.3 合成PAC的酶來源 |
| 1.4 以PAC為底物合成NE的酶來源 |
| 1.5 一鍋法 |
| 1.6 論文的立題意義、主要研究內(nèi)容 |
| 1.6.1 立題意義 |
| 1.6.2 主要研究內(nèi)容 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 實驗材料 |
| 2.1.1 菌株和質(zhì)粒 |
| 2.1.2 主要試劑 |
| 2.1.3 主要儀器 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.1.5 培養(yǎng)基和溶液 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.2.1 酶活力測定方法 |
| 2.2.2 底產(chǎn)物檢測方法 |
| 2.3 實驗方法 |
| 2.3.1 乙醛羥酸合成酶的克隆表達與構(gòu)建 |
| 2.3.2 麻黃堿脫氫酶的克隆表達與構(gòu)建 |
| 2.3.3 PDC、AHAS I和 EDH的誘導(dǎo)表達 |
| 2.3.4 R-PAC的生物轉(zhuǎn)化 |
| 2.3.5 胺脫氫酶突變體的克隆表達與構(gòu)建 |
| 2.3.6 BbAmDH及其突變體的誘導(dǎo)表達 |
| 2.3.7 BbAmDH及其突變體的分離純化 |
| 2.3.8 BbAmDH及其突變體的動力學(xué)參數(shù)和酶學(xué)性質(zhì) |
| 2.3.9 NE的生物轉(zhuǎn)化 |
| 2.3.10 一鍋法合成NE |
| 2.3.11 NE的分離純化與鑒定 |
| 第三章 結(jié)果與討論 |
| 3.1 合成R-PAC的酶的表達 |
| 3.1.1 PDC、EDH和 AHAS I表達菌株的構(gòu)建和表征 |
| 3.1.2 EDH的可溶性表達 |
| 3.2 酶促合成NE的前體物質(zhì)R-PAC |
| 3.2.1 不同酶對合成R-PAC的影響 |
| 3.2.2 反應(yīng)pH對縮合反應(yīng)的影響 |
| 3.2.3 反應(yīng)溫度對縮合反應(yīng)的影響 |
| 3.2.4 AHAS I細胞量對縮合反應(yīng)的影響 |
| 3.2.5 底物苯甲醛濃度對縮合反應(yīng)的影響 |
| 3.2.6 產(chǎn)物R-PAC對縮合反應(yīng)的影響 |
| 3.2.7 R-PAC的生物轉(zhuǎn)化過程曲線 |
| 3.3 胺脫氫酶的克隆表達及酶學(xué)性質(zhì)的研究 |
| 3.3.1 BbAmDH的克隆表達及定向進化 |
| 3.3.2 BbAmDH及其突變體BbAmDH_(N276C)酶學(xué)性質(zhì)的研究 |
| 3.4 胺脫氫酶催化合成NE |
| 3.4.1 反應(yīng)pH對還原胺化反應(yīng)的影響 |
| 3.4.2 反應(yīng)溫度對還原胺化反應(yīng)的影響 |
| 3.4.3 BbAmDH細胞量對還原胺化反應(yīng)的影響 |
| 3.4.4 分步法合成NE的過程曲線 |
| 3.5 一鍋法合成NE的條件優(yōu)化 |
| 3.5.1 反應(yīng)pH對一鍋法合成NE的影響 |
| 3.5.2 NH_4~+濃度對一鍋法合成NE的影響: |
| 3.5.3 一鍋法合成NE |
| 3.5.4 補料策略的應(yīng)用 |
| 3.6 NE的分離純化與鑒定 |
| 3.6.1 NE的分離與純化 |
| 主要結(jié)論與展望 |
| 主要結(jié)論 |
| 展望 |
| 致謝 |
| 參考文獻 |
| 附錄:作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文 |
（2）多酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化L-酪氨酸生產(chǎn)酪醇的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞表 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 芳香醇的研究進展 |
| 1.1.1 芳香醇的理化性質(zhì)及應(yīng)用 |
| 1.1.2 芳香醇的制備方法 |
| 1.2 酪醇合成的研究進展 |
| 1.2.1 化學(xué)法合成酪醇的研究進展 |
| 1.2.2 生物法合成酪醇的研究進展 |
| 1.3 多酶級聯(lián)是合成酪醇的有效方法 |
| 1.3.1 多酶級聯(lián)反應(yīng)及其類型簡介 |
| 1.3.2 多酶級聯(lián)反應(yīng)在芳香醇合成中的應(yīng)用 |
| 1.3.3 多酶級聯(lián)反應(yīng)中的輔酶再生 |
| 1.3.4 多酶級聯(lián)合成酪醇的潛力與挑戰(zhàn) |
| 1.4 立題依據(jù)及研究意義 |
| 1.5 本論文的主要研究內(nèi)容 |
| 第二章 材料與方法 |
| 2.1 實驗材料 |
| 2.1.1 菌株和質(zhì)粒 |
| 2.1.2 培養(yǎng)基與溶液 |
| 2.1.3 酶和試劑 |
| 2.1.4 主要儀器 |
| 2.2 重組菌的構(gòu)建 |
| 2.2.1 DNA基本操作 |
| 2.2.2 單酶重組菌株的構(gòu)建 |
| 2.2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達及純化 |
| 2.2.4 多酶共表達菌株的構(gòu)建 |
| 2.3 重組共表達菌株的生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化能力評價 |
| 2.3.1 菌株的培養(yǎng)及全細胞催化劑的制備 |
| 2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 |
| 2.3.3 全細胞轉(zhuǎn)化酪氨酸生產(chǎn)酪醇的轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 |
| 2.4 分析測定方法 |
| 2.4.1 瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳 |
| 2.4.2 酶活檢測 |
| 2.4.3 L-酪氨酸、酪醇、對羥基苯丙酮酸及對羥基苯乙醛的測定方法 |
| 第三章 結(jié)果與討論 |
| 3.1 級聯(lián)反應(yīng)生產(chǎn)酪醇的路徑設(shè)計和構(gòu)建 |
| 3.1.1 級聯(lián)路徑的設(shè)計 |
| 3.1.2 路徑酶的選擇及單表達載體的構(gòu)建 |
| 3.1.3 目的蛋白的純化 |
| 3.1.4 體外級聯(lián)路徑的驗證 |
| 3.1.5 限速步驟的確定 |
| 3.1.6 小結(jié) |
| 3.2 多酶級聯(lián)生產(chǎn)酪醇路徑的組裝和優(yōu)化 |
| 3.2.1 共表達菌株的構(gòu)建及驗證 |
| 3.2.2 限速步驟的解除 |
| 3.2.3 全細胞轉(zhuǎn)化L-酪氨酸生產(chǎn)酪醇的體系優(yōu)化 |
| 3.2.4 產(chǎn)物對大腸桿菌細胞的抑制 |
| 3.2.5 小結(jié) |
| 3.3 產(chǎn)物原位分離法提高酪醇生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)量 |
| 3.3.1 樹脂篩選 |
| 3.3.2 樹脂XAD4 添加量優(yōu)化 |
| 3.3.3 酪醇的洗脫 |
| 3.3.4 大孔樹脂吸附生物轉(zhuǎn)化合成酪醇 |
| 3.3.5 發(fā)酵罐中生物轉(zhuǎn)化法合成酪醇 |
| 3.3.6 小結(jié) |
| 主要結(jié)論與展望 |
| 致謝 |
| 參考文獻 |
| 附錄:作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文 |
| 附錄：檢測圖譜 |
（3）化學(xué)—酶法催化生物質(zhì)原料合成β-羥基-α-氨基酸的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮略詞 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 生物催化的手性合成 |
| 1.2 手性非天然氨基酸 |
| 1.3 β-羥基-α-氨基酸 |
| 1.3.1 β-羥基-α-氨基酸概述 |
| 1.3.2 β-羥基-α-氨基酸的合成 |
| 1.3.3 β-羥基-α-氨基酸的應(yīng)用 |
| 1.4 醛縮酶 |
| 1.4.1 醛縮酶概述 |
| 1.4.2 醛縮酶的分類 |
| 1.5 蘇氨酸醛縮酶 |
| 1.5.1 蘇氨酸醛縮酶概述 |
| 1.5.2 蘇氨酸醛縮酶的結(jié)構(gòu)與分子催化機制 |
| 1.5.3 蘇氨酸醛縮酶的定向進化 |
| 1.6 木質(zhì)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化高附加值化學(xué)品 |
| 1.6.1 木質(zhì)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用概述 |
| 1.6.2 木質(zhì)生物質(zhì)的化學(xué)法轉(zhuǎn)化 |
| 1.6.3 木質(zhì)生物質(zhì)的酶法轉(zhuǎn)化 |
| 1.6.4 木質(zhì)生物質(zhì)的化學(xué)-酶法轉(zhuǎn)化 |
| 1.7 本課題立題依據(jù)及主要研究內(nèi)容 |
| 1.7.1 研究目的及意義 |
| 1.7.2 主要研究內(nèi)容 |
| 第二章 建立蘇氨酸醛縮酶縮合方向催化活性的高通量篩選方法 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 實驗材料 |
| 2.2.2 實驗儀器 |
| 2.2.3 AxDTA的克隆、表達和純化 |
| 2.2.4 分析方法 |
| 2.2.5 AxDTA最適反應(yīng)pH的測定 |
| 2.2.6 DNPH法確定底物檢測波長 |
| 2.2.7 線性范圍和檢測限 |
| 2.2.8 加標回收率 |
| 2.2.9 顯色穩(wěn)定性 |
| 2.2.10 皮爾遜相關(guān)系數(shù) |
| 2.2.11 定點飽和突變文庫的構(gòu)建 |
| 2.2.12 DNPH法用于96孔板的高通量篩選突變文庫 |
| 2.2.13 AxDTA及其突變體的酶學(xué)表征和催化反應(yīng) |
| 2.3 結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 AxDTA工程菌的構(gòu)建、表達和純化 |
| 2.3.2 AxDTA最適反應(yīng)pH |
| 2.3.3 最大吸收波長的確定 |
| 2.3.4 DNPH法檢測MSB濃度的線性范圍和檢測限 |
| 2.3.5 DNPH法檢測MSB濃度的加標回收率 |
| 2.3.6 DNPH法顯色穩(wěn)定性的驗證 |
| 2.3.7 基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)的DNPH法與HPLC法的相關(guān)性 |
| 2.3.8 AxDTA定點飽和突變文庫的構(gòu)建 |
| 2.3.9 DNPH法高通量篩選AxDTA定點飽和突變文庫 |
| 2.3.10 DNPH法測定AxDTA及其突變體的酶學(xué)性質(zhì) |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 D-蘇氨酸醛縮酶的挖掘、表征及催化合成對甲砜基苯絲氨酸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 實驗材料 |
| 3.2.2 實驗儀器 |
| 3.2.3 基因挖掘 |
| 3.2.4 基因組DNA的提取和鑒定 |
| 3.2.5 工程菌的構(gòu)建、表達和純化 |
| 3.2.6 新型DTA的篩選 |
| 3.2.7 ApDTA生物信息學(xué)分析 |
| 3.2.8 酶學(xué)性質(zhì)的表征 |
| 3.2.9 影響羥醛縮合產(chǎn)率和非對映選擇性的反應(yīng)條件 |
| 3.2.10 動力學(xué)拆分的條件優(yōu)化 |
| 3.2.11 分析方法 |
| 3.3 結(jié)果與討論 |
| 3.3.1 基因挖掘和篩選新型DTA重組酶 |
| 3.3.2 ApDTA生物信息學(xué)分析 |
| 3.3.3 酶學(xué)性質(zhì)表征 |
| 3.3.4 ApDTA催化羥醛縮合反應(yīng)條件的優(yōu)化 |
| 3.3.5 ApDTA催化動力學(xué)拆分反應(yīng)條件的優(yōu)化 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第四章 生物基木糖化學(xué)-酶法合成呋喃絲氨酸的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.2.1 實驗材料 |
| 4.2.2 實驗儀器 |
| 4.2.3 固體酸SO_4~(2-)/SnO_2-Al_2O_3-CFA的制備 |
| 4.2.4 重組大腸桿菌LTA的構(gòu)建、表達和篩選 |
| 4.2.5 SO_4~(2-)/SnO_2-Al_2O_3-CFA催化CS木糖水解液轉(zhuǎn)化為糠醛 |
| 4.2.6 E.coli PpLTA催化糠醛水解液合成FLSE |
| 4.2.7 固體酸催化劑和甲苯的回收再利用 |
| 4.2.8 固體酸催化劑的表征 |
| 4.2.9 分析方法 |
| 4.3 結(jié)果與討論 |
| 4.3.1 固體酸催化劑的制備 |
| 4.3.2 固體酸催化劑的表征 |
| 4.3.3 固體酸催化劑的加載量 |
| 4.3.4 有機溶劑對糠醛產(chǎn)率的影響 |
| 4.3.5 氯化鹽助劑對糠醛產(chǎn)率的影響 |
| 4.3.6 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對糠醛產(chǎn)率的影響 |
| 4.3.7 重組大腸桿菌全細胞催化轉(zhuǎn)化糠醛的條件優(yōu)化 |
| 4.3.8 底物濃度對E.coli PpLTA催化轉(zhuǎn)化糠醛的影響 |
| 4.3.9 固體酸催化劑和甲苯的回收和重復(fù)利用性 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第五章 生物質(zhì)化學(xué)-酶法一鍋合成呋喃絲氨酸的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料與方法 |
| 5.2.1 實驗材料 |
| 5.2.2 實驗儀器 |
| 5.2.3 Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2-)固體酸催化劑的制備 |
| 5.2.4 固體酸Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2-)催化轉(zhuǎn)化玉米芯制備糠醛 |
| 5.2.5 化學(xué)-酶法不對稱合成FLSE |
| 5.2.6 固體酸預(yù)處理玉米芯的酶解糖化 |
| 5.2.7 固體酸催化劑和固定化細胞的循環(huán)再利用 |
| 5.2.8 固體酸催化劑的表征 |
| 5.2.9 分析方法 |
| 5.3 結(jié)果與討論 |
| 5.3.1 各組分催化劑催化效率的評價 |
| 5.3.2 磁性固體酸Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2-)的表征 |
| 5.3.3 固體酸Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2-)催化玉米芯制備糠醛 |
| 5.3.4 底物濃度和細胞濃度對E.coli PpLTA轉(zhuǎn)化生成FLSE的影響 |
| 5.3.5 生物質(zhì)糠醛原料一鍋法合成制備手性FLSE |
| 5.3.6 纖維素酶解固體酸預(yù)處理的玉米芯 |
| 5.3.7 固體酸催化劑和固定化細胞的循環(huán)利用 |
| 5.4 本章小結(jié) |
| 主要結(jié)論與展望 |
| 論文主要創(chuàng)新點 |
| 致謝 |
| 參考文獻 |
| 附錄A:定點飽和突變相關(guān)引物 |
| 附錄B:~1H NMR圖 |
| 附錄C:作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文 |
（4）生物催化級聯(lián)反應(yīng)制備丙酮酸及L-酪氨酸衍生物（論文提綱范文）
| 致謝 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要縮略符號說明 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 丙酮酸 |
| 1.1.1 丙酮酸及其應(yīng)用 |
| 1.1.2 丙酮酸的制備 |
| 1.1.2.1 化學(xué)合成法 |
| 1.1.2.2 生物法 |
| 1.1.3 丙酮酸的穩(wěn)定性 |
| 1.2 L-酪氨酸及其衍生物 |
| 1.2.1 L-酪氨酸及其衍生物概論 |
| 1.2.2 L-酪氨酸及其衍生物的制備 |
| 1.2.2.1 化學(xué)合成法 |
| 1.2.2.2 酶催化法 |
| 1.3 短鏈L-2-羥基酸氧化酶 |
| 1.3.1 短鏈L-2-羥基酸氧化酶簡介 |
| 1.3.2 短鏈L-2-羥基酸氧化酶結(jié)構(gòu)特征與反應(yīng)機制 |
| 1.4 過氧化氫酶 |
| 1.4.1 過氧化氫酶概述 |
| 1.4.2 過氧化氫酶的分類及結(jié)構(gòu)特征 |
| 1.4.3 過氧化氫酶的催化機理 |
| 1.4.4 過氧化氫酶的來源 |
| 1.4.5 過氧化氫酶的應(yīng)用 |
| 1.5 酪氨酸酚裂解酶 |
| 1.5.1 酪氨酸酚裂解酶概述 |
| 1.5.2 酪氨酸酚裂解酶的結(jié)構(gòu)特征 |
| 1.5.3 酪氨酸分裂解酶催化機理 |
| 1.5.4 酪氨酸酚裂解酶的改造 |
| 1.5.5 酪氨酸酚裂解酶的應(yīng)用 |
| 1.6 大腸桿菌表達優(yōu)化 |
| 1.6.1 表達條件 |
| 1.6.2 宿主的選擇 |
| 1.6.3 RBS (Ribosome binding site)序列 |
| 1.6.4 分子伴侶 |
| 1.7 生物催化級聯(lián)反應(yīng) |
| 1.7.1 生物催化級聯(lián)反應(yīng)簡介 |
| 1.7.2 級聯(lián)反應(yīng)在生物催化中的應(yīng)用 |
| 1.7.2.1 輔酶再生 |
| 1.7.2.2 促進反應(yīng)平衡 |
| 1.7.2.3 去除有毒副產(chǎn)物 |
| 1.8 本課題的研究思路與主要內(nèi)容 |
| 第二章 短鏈L-2-羥基酸氧化酶的篩選及可溶性表達研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 實驗儀器 |
| 2.2.2 主要試劑 |
| 2.2.3 培養(yǎng)基與試劑配置 |
| 2.2.4 菌種和質(zhì)粒 |
| 2.2.5 基因的擴增 |
| 2.2.6 表達載體與工程菌構(gòu)建 |
| 2.2.7 重組大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶 |
| 2.2.8 大腸桿菌超聲破碎及SDS-PAGE檢測 |
| 2.2.9 蛋白質(zhì)濃度的測定 |
| 2.2.10 蛋白純化(重力柱法) |
| 2.2.11 酶活測定 |
| 2.2.12 酶學(xué)性質(zhì)研究 |
| 2.2.13 RBS高通量篩選方法 |
| 2.2.14 分子伴侶與AvLOX共表達 |
| 2.3 結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 短鏈L-2-羥基酸氧化酶的篩選 |
| 2.3.2 短鏈L-2-羥基酸氧化酶的熱穩(wěn)定性比較 |
| 2.3.4 乳酸氧化酶AvLOX酶學(xué)性質(zhì)分析 |
| 2.3.4.1 最適溫度與溫度穩(wěn)定性 |
| 2.3.4.2 最適pH與pH穩(wěn)定性 |
| 2.3.5 增強AvLOX可溶性表達 |
| 2.3.5.1 宿主對AvLOX可溶性表達的影響 |
| 2.3.5.2 誘導(dǎo)溫度對AvLOX可溶性表達的影響 |
| 2.3.5.3 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)對AvLOX可溶性表達的影響 |
| 2.3.5.4 核糖體結(jié)合位點(RBS)對表達的影響 |
| 2.3.5.5 分子伴侶對表達的影響 |
| 2.3.5.6 乳酸氧化酶AvLOX可溶性表達前后對比 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 過氧化氫酶的篩選及體外雙酶級聯(lián)體系的構(gòu)建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 實驗儀器 |
| 3.2.2 實驗藥品與試劑 |
| 3.2.3 培養(yǎng)基與試劑配制 |
| 3.2.4 菌株和質(zhì)粒 |
| 3.2.5 過氧化氫酶的克隆 |
| 3.2.6 表達載體與工程菌構(gòu)建 |
| 3.2.7 重組大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶 |
| 3.2.8 大腸桿菌超聲破碎及SDS-PAGE檢測 |
| 3.2.9 蛋白純化(重力柱法) |
| 3.2.10 酶活測定 |
| 3.2.11 半衰期測定 |
| 3.2.12 酶學(xué)性質(zhì)研究 |
| 3.2.13 丙酮酸穩(wěn)定性測試 |
| 3.2.14 雙酶偶聯(lián)體系的構(gòu)建 |
| 3.2.15 分析方法 |
| (1) 液相檢測方法 |
| (2) 反應(yīng)收率計算 |
| 3.3 結(jié)果與討論 |
| 3.3.1 過氧化氫酶酶庫的建立 |
| 3.3.2 過氧化氫酶的篩選 |
| 3.3.3 過氧化氫酶UtCAT的酶學(xué)性質(zhì)分析 |
| 3.3.3.1 過氧化氫酶UtCAT的純化 |
| 3.3.3.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 |
| 3.3.3.3 最適pH與pH穩(wěn)定性 |
| 3.3.3.4 過氧化氫濃度對UtCAT酶活的影響 |
| 3.3.4 丙酮酸的穩(wěn)定性 |
| 3.3.4.1 丙酮酸在過氧化氫溶液中的穩(wěn)定性 |
| 3.3.4.2 丙酮酸在粗酶液中的穩(wěn)定性 |
| 3.3.5 體外雙酶偶聯(lián)體系的構(gòu)建 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第四章 全細胞催化劑的構(gòu)建及在丙酮酸制備中的應(yīng)用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.2.1 實驗儀器 |
| 4.2.2 實驗藥品與試劑 |
| 4.2.3 培養(yǎng)基與試劑配制 |
| 4.2.4 菌種和質(zhì)粒 |
| 4.2.5 乳酸氧化酶和過氧化氫酶酶活測定 |
| 4.2.6 液相檢測 |
| 4.2.7 共表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 4.2.8 RBS序列設(shè)計 |
| 4.2.9 不同共表達菌株的催化效率對比 |
| 4.2.10 全細胞催化制備丙酮酸的優(yōu)化 |
| 4.2.11 1L規(guī)模底物分批補料制備丙酮酸 |
| 4.2.12 丙酮鈉的分離純化 |
| 4.3 結(jié)果與討論 |
| 4.3.1 AvLOX和UtCAT共表達策略 |
| 4.3.2 不同共表達策略下蛋白表達分析和活力測定 |
| 4.3.3 RBS序列優(yōu)化后蛋白表達分析和活力測定 |
| 4.3.4 共表達菌株催化效率評估 |
| 4.3.5 全細胞催化制備丙酮酸工藝優(yōu)化 |
| 4.3.5.5 底物濃度對催化的影響 |
| 4.3.5.6 常壓下底物分批補料反應(yīng) |
| 4.3.6 丙酮酸的分離提純 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第五章 酪氨酸酚裂解酶克隆表達及理性改造 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料與方法 |
| 5.2.1 實驗儀器 |
| 5.2.2 實驗藥品與試劑 |
| 5.2.3 培養(yǎng)基與試劑配制 |
| 5.2.4 菌種和質(zhì)粒 |
| 5.2.5 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 5.2.6 定點突變 |
| 5.2.7 重組大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶 |
| 5.2.8 多序列比對 |
| 5.2.9 同源建模與分子對接 |
| 5.2.10 標準品Rac-4b和d-g化學(xué)酶法合成 |
| 5.2.11 底物特異性研究 |
| 5.2.12 HPLC檢測方法 |
| 5.3 結(jié)果與討論 |
| 5.3.1 酪氨酸酚裂解酶的克隆表達 |
| 5.3.2 酪氨酸酚裂解酶酶學(xué)特性研究 |
| 5.3.2.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性 |
| 5.3.2.2 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 |
| 5.3.2.3 不同銨鹽對酶活的影響 |
| 5.3.2.4 丙酮酸濃度對TTPL酶活的影響 |
| 5.3.2.5 酪氨酸酚裂解酶TTPL底物譜 |
| 5.3.3 基于結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的TTPL理性設(shè)計 |
| 5.3.4 定點突變與活力測定 |
| 5.3.5 不同突變子的底物譜分析 |
| 5.4 本章小結(jié) |
| 第六章 三酶級聯(lián)反應(yīng)合成L-酪氨酸衍生物的工藝研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料與方法 |
| 6.2.1 實驗儀器 |
| 6.2.2 實驗藥品與試劑 |
| 6.2.3 培養(yǎng)基與試劑配制 |
| 6.2.4 菌種和質(zhì)粒 |
| 6.2.5 大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)酶 |
| 6.2.6 多酶體系的反應(yīng)條件優(yōu)化 |
| 6.2.7 離子交換色譜法純化L4a-g |
| 6.2.8 L-4a-g光學(xué)純度測定 |
| 6.2.9 酪氨酸衍生物L(fēng)-4a-g產(chǎn)品鑒定 |
| 6.2.10 乳酸氧化酶、過氧化氫酶和酪氨酸酚裂解酶在苯酚中的穩(wěn)定性 |
| 6.2.11 0.5 L規(guī)模底物流加補料反應(yīng)制備酪氨酸 |
| 6.2.12 L-酪氨酸衍生物的純化 |
| 6.2.13 HPLC檢測方法 |
| 6.3 結(jié)果與討論 |
| 6.3.1 多酶級聯(lián)反應(yīng)催化合成3-氟-L-酪氨酸L4f |
| 6.3.2 AvLOX和TTTLM380V雙酶配比對多酶催化3f的影響 |
| 6.3.3 菌體添加量對催化效率的影響 |
| 6.3.4 提高底物3f濃度的研究 |
| 6.3.5 優(yōu)化前后工藝參數(shù)及指標對比 |
| 6.3.6 兩步級聯(lián)反應(yīng)與一步C-C偶聯(lián)的比較 |
| 6.3.7 一釜式兩步級聯(lián)反應(yīng)合成酪氨酸衍生物L(fēng)-4a-g |
| 6.3.8 0.5 L規(guī)模底物流加補料反應(yīng) |
| 6.3.9 L-酪氨酸衍生物產(chǎn)品的分離純化 |
| 6.4 小結(jié) |
| 第七章 結(jié)論與展望 |
| 7.1 結(jié)論 |
| 7.2 論文的創(chuàng)新點 |
| 7.3 展望 |
| 參考文獻 |
| 附錄 |
| 作者簡歷 |
（5）基于畢赤酵母底盤的維生素K2（MK-4）細胞工廠構(gòu)建與優(yōu)化（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 緒論 |
| 1.1 維生素K |
| 1.1.1 維生素K的發(fā)現(xiàn)歷程 |
| 1.1.2 維生素K的性質(zhì) |
| 1.1.3 維生素K2的功能與應(yīng)用 |
| 1.1.4 維生素K2的生物合成 |
| 1.2 合成生物學(xué)及其應(yīng)用 |
| 1.2.1 合成生物學(xué)的概念 |
| 1.2.2 合成生物學(xué)的研究內(nèi)容 |
| 1.2.3 合成生物學(xué)的應(yīng)用 |
| 1.3 蛋白表達系統(tǒng) |
| 1.3.1 重組蛋白表達系統(tǒng) |
| 1.3.2 畢赤酵母表達系統(tǒng) |
| 1.4 本論文研究的內(nèi)容與意義 |
| 1.4.1 研究意義 |
| 1.4.2 研究內(nèi)容 |
| 第2章 大腸桿菌四烯甲萘醌生物合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 菌種和質(zhì)粒 |
| 2.2.2 主要試劑 |
| 2.2.3 主要儀器設(shè)備 |
| 2.2.4 培養(yǎng)基和溶液 |
| 2.2.5 大腸桿菌MK-4生物合成途徑的構(gòu)建 |
| 2.2.6 利用Red重組系統(tǒng)無痕敲除大腸桿菌pgi基因 |
| 2.2.7 胞內(nèi)產(chǎn)物的提取和檢測 |
| 2.2.8 胞內(nèi)NADPH含量的檢測 |
| 2.3 結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 大腸桿菌MK-4生物合成途徑的構(gòu)建 |
| 2.3.2 大腸桿菌pgi基因缺失菌株的構(gòu)建 |
| 2.4 小結(jié) |
| 第3章 畢赤酵母四烯甲萘醌生物合成途徑的理性設(shè)計 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 理性設(shè)計以VK3和IPP為底物的MK-4生物合成途徑 |
| 3.2.2 MK-4生物合成途徑中關(guān)鍵酶HsUBIAD1的生物信息學(xué)分析 |
| 3.3 結(jié)果與討論 |
| 3.3.1 畢赤酵母MK-4生物合成途徑的理性設(shè)計 |
| 3.3.2 MK-4生物合成途徑中關(guān)鍵酶HsUBIAD1的生物信息學(xué)分析 |
| 3.4 小結(jié) |
| 第4章 畢赤酵母四烯甲萘醌生物合成途徑的構(gòu)建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.2.1 菌種和質(zhì)粒 |
| 4.2.2 主要試劑 |
| 4.2.3 主要儀器設(shè)備 |
| 4.2.4 培養(yǎng)基和溶液 |
| 4.2.5 HsUBIAD1蛋白表達載體的構(gòu)建 |
| 4.2.6 構(gòu)建產(chǎn)HsUBIAD1重組畢赤酵母 |
| 4.2.7 高產(chǎn)HsUBIAD1重組畢赤酵母的篩選 |
| 4.2.8 高產(chǎn)菌株蛋白表達條件的優(yōu)化 |
| 4.3 結(jié)果與討論 |
| 4.3.1 重組HsUBIAD1表達載體的構(gòu)建 |
| 4.3.2 高產(chǎn)HsUBIAD1重組畢赤酵母的篩選 |
| 4.3.3 重組HsUBIAD1蛋白表達條件優(yōu)化 |
| 4.4 小結(jié) |
| 第5章 重組HsUBIAD1蛋白的純化和鑒定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料與方法 |
| 5.2.1 菌種和質(zhì)粒 |
| 5.2.2 主要試劑 |
| 5.2.3 主要儀器設(shè)備 |
| 5.2.4 培養(yǎng)基和溶液 |
| 5.2.5 重組HsUBIAD1蛋白的純化 |
| 5.2.6 重組HsUBIAD1蛋白的酶學(xué)分析 |
| 5.2.7 重組GGU-23菌株全細胞催化反應(yīng) |
| 5.2.8 異戊烯基化產(chǎn)物的提取與檢測 |
| 5.3 結(jié)果與討論 |
| 5.3.1 重組HsUBIAD1蛋白的純化 |
| 5.3.2 重組HsUBIAD1蛋白的催化活性 |
| 5.3.3 異戊烯基化產(chǎn)物的鑒定 |
| 5.4 小結(jié) |
| 第6章 畢赤酵母四烯甲萘醌側(cè)鏈生物合成途徑的優(yōu)化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料與方法 |
| 6.2.1 菌種和質(zhì)粒 |
| 6.2.2 主要試劑 |
| 6.2.3 主要儀器設(shè)備 |
| 6.2.4 培養(yǎng)基和溶液 |
| 6.2.5 構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達載體 |
| 6.2.6 構(gòu)建PpIDI和SaGGPPS融合表達載體 |
| 6.2.7 構(gòu)建GGU-GrG和GGU-GrIG重組畢赤酵母 |
| 6.2.8 篩選GGU-GrG和GGU-GrIG重組畢赤酵母 |
| 6.3 結(jié)果與討論 |
| 6.3.1 構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達載體 |
| 6.3.2 融合表達SaGGPPS和PpIDI強化側(cè)鏈前體的供給 |
| 6.4 小結(jié) |
| 第7章 工程菌全細胞催化合成四烯甲萘醌的工藝優(yōu)化 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料與方法 |
| 7.2.1 菌種和質(zhì)粒 |
| 7.2.2 主要試劑 |
| 7.2.3 培養(yǎng)基和溶液 |
| 7.2.4 全細胞催化工藝的優(yōu)化 |
| 7.3 結(jié)果與討論 |
| 7.3.1 全細胞催化工藝的優(yōu)化 |
| 7.3.2 工程菌的傳代穩(wěn)定性 |
| 7.4 小結(jié) |
| 第8章 總結(jié)與展望 |
| 8.1 總結(jié) |
| 8.2 展望 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的其他研究成果 |
（6）大腸桿菌N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化（論文提綱范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 縮略語表 |
| 1 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 N-乙酰神經(jīng)氨酸的功能與應(yīng)用 |
| 1.2.1 食品領(lǐng)域 |
| 1.2.2 醫(yī)藥領(lǐng)域 |
| 1.3 N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)方法 |
| 1.3.1 天然原料提取法 |
| 1.3.2 多聚物水解法 |
| 1.3.3 化學(xué)法與酶法催化合成 |
| 1.3.4 全細胞生物催化法 |
| 1.3.5 微生物發(fā)酵法 |
| 1.4 N-乙酰神經(jīng)氨酸微生物合成途徑 |
| 1.5 國內(nèi)外相關(guān)研究 |
| 1.5.1 關(guān)鍵酶的研究 |
| 1.5.2 模塊化代謝工程改造 |
| 1.5.3 合成過程中的動態(tài)調(diào)控 |
| 1.5.4 生物傳感器的應(yīng)用 |
| 1.6 本研究的立題背景與研究內(nèi)容 |
| 1.6.1 立題背景 |
| 1.6.2 主要研究內(nèi)容 |
| 2 材料與方法 |
| 2.1 實驗材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 質(zhì)粒 |
| 2.2 主要儀器和試劑 |
| 2.2.1 主要儀器 |
| 2.2.2 主要試劑 |
| 2.2.3 主要溶液 |
| 2.2.4 抗生素與誘導(dǎo)劑 |
| 2.2.5 培養(yǎng)基 |
| 2.3 實驗方法 |
| 2.3.1 質(zhì)粒提取 |
| 2.3.2 基因組提取 |
| 2.3.3 感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化實驗 |
| 2.3.4 基因PCR擴增 |
| 2.3.5 DNA片段提取與純化 |
| 2.3.6 瓊脂糖凝膠電泳 |
| 2.3.7 質(zhì)粒的構(gòu)建 |
| 2.3.8 CRISPR/Cas9基因編輯方法 |
| 2.3.9 工程菌發(fā)酵培養(yǎng)方法 |
| 2.3.10 生物量的測定 |
| 2.3.11 發(fā)酵液中各成分的測定方法 |
| 3 結(jié)果與討論 |
| 3.1 N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑構(gòu)建 |
| 3.1.1 過表達去磷酸化酶基因yqaB |
| 3.1.2 Neu5Ac分解代謝途徑的阻斷 |
| 3.1.3 N-乙酰神經(jīng)氨酸差向異構(gòu)酶的整合與篩選 |
| 3.1.4 N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶的整合 |
| 3.1.5 關(guān)鍵酶AGE與NeuB表達量的優(yōu)化 |
| 3.1.6 過表達UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶基因neuC |
| 3.2 磷酸烯醇式丙酮酸供應(yīng)的增強 |
| 3.2.1 葡萄糖特異性PTS系統(tǒng)的消除 |
| 3.2.2 過表達磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因pps |
| 3.2.3 過表達PEP羧激酶基因pck與丙酮酸激酶Ⅰ基因pykF的敲除 |
| 3.3 副產(chǎn)物的減弱 |
| 3.3.1 patZ基因敲除以及acs基因的過表達 |
| 3.3.2 發(fā)酵驗證patZ基因敲除以及acs基因過表達的影響 |
| 4 結(jié)論 |
| 5 展望 |
| 6 參考文獻 |
| 7 研究生期間所發(fā)表論文情況 |
| 8 致謝 |
（7）重組畢赤酵母全細胞轉(zhuǎn)化L-乳酸合成丙酮酸鈉的工藝研究（論文提綱范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 緒論 |
| 第一節(jié) 丙酮酸 |
| 1.1 丙酮酸的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì) |
| 1.2 丙酮酸(鹽)的用途 |
| 第二節(jié) 丙酮酸的生產(chǎn)方法及生產(chǎn)概況 |
| 2.1 化學(xué)合成法 |
| 2.2 直接發(fā)酵法 |
| 2.3 酶轉(zhuǎn)化法 |
| 第三節(jié) 丙酮酸的提取方法 |
| 3.1 減壓蒸餾法 |
| 3.2 有機溶劑提取法 |
| 3.3 反滲透膜分離法 |
| 3.4 離子交換法 |
| 第四節(jié) 重組畢赤酵母發(fā)酵的關(guān)鍵控制 |
| 4.1 畢赤酵母碳源的影響 |
| 4.2 誘導(dǎo)時間的影響 |
| 4.3 發(fā)酵培養(yǎng)中pH的影響 |
| 第五節(jié) 細胞透性化技術(shù)研究進展 |
| 5.1 細胞透性化技術(shù) |
| 5.2 細胞透性化方法 |
| 5.3 透性化細胞的應(yīng)用 |
| 第六節(jié) 課題的研究內(nèi)容及意義 |
| 6.1 課題研究意義 |
| 6.2 課題研究內(nèi)容 |
| 第一章 重組畢赤酵母5L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝優(yōu)化 |
| 第一節(jié) 引言 |
| 第二節(jié) 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 實驗方法 |
| 第三節(jié) 結(jié)果與分析 |
| 3.1 接種量對重組畢赤酵母生長及乙醇酸氧化酶活力影響 |
| 3.2 pH對重組畢赤酵母生長及乙醇酸氧化酶活力的影響 |
| 3.3 培養(yǎng)溫度對重組畢赤酵母生長及乙醇酸氧化酶活力的影響 |
| 3.4 誘導(dǎo)時間對重組畢赤酵母生長及乙醇酸氧化酶活力的影響 |
| 3.5 甲醇濃度對重組畢赤酵母生長及乙醇酸氧化酶活力的影響 |
| 3.6 開始誘導(dǎo)的時間對重組畢赤酵母生長及乙醇酸氧化酶活力的影響 |
| 3.7 重組畢赤酵母5L發(fā)酵罐菌體生長和發(fā)酵參數(shù)分析 |
| 第四節(jié) 小結(jié)與討論 |
| 第二章 重組畢赤酵母5T發(fā)酵罐中試放大工藝研究 |
| 第一節(jié) 引言 |
| 第二節(jié) 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 實驗方法 |
| 第三節(jié) 結(jié)果與分析 |
| 3.1 三級種子發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 |
| 3.2 三級發(fā)酵工藝對重組畢赤酵母生長和乙醇酸氧化酶活力的影響 |
| 3.3 重組畢赤酵母5T發(fā)酵罐菌體生長和發(fā)酵參數(shù)分析 |
| 第四節(jié) 小結(jié)與討論 |
| 第三章 重組畢赤酵母催化L-乳酸合成丙酮酸鈉的轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化 |
| 第一節(jié) 引言 |
| 第二節(jié) 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 實驗方法 |
| 第三節(jié) 結(jié)果與分析 |
| 3.1 細胞的透性化處理 |
| 3.2 重組畢赤酵母的重復(fù)使用次數(shù)對轉(zhuǎn)化過程的影響 |
| 3.3 底物L(fēng)-乳酸濃度對轉(zhuǎn)化過程的影響 |
| 3.4 細胞濃度對轉(zhuǎn)化過程的影響 |
| 3.5 pH對轉(zhuǎn)化過程的影響 |
| 3.6 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化過程的影響 |
| 3.7 重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化L-乳酸生成丙酮酸鈉轉(zhuǎn)化過程分析 |
| 第四節(jié) 小結(jié)與討論 |
| 第四章 丙酮酸鈉提取純化工藝的優(yōu)化 |
| 第一節(jié) 引言 |
| 第二節(jié) 材料與方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 實驗方法 |
| 第三節(jié) 結(jié)果與分析 |
| 3.1 丙酮酸鈉溶解度的研究 |
| 3.2 丙酮酸鈉發(fā)酵液的脫色工藝研究 |
| 3.3 丙酮酸鈉轉(zhuǎn)化液濃縮冷卻結(jié)晶工藝的研究 |
| 3.4 丙酮酸鈉結(jié)晶工藝的研究 |
| 3.5 丙酮酸鈉分離純化工藝流程 |
| 第四節(jié) 小結(jié)與討論 |
| 第五章 結(jié)論與展望 |
| 5.1 結(jié)論 |
| 5.2 創(chuàng)新點 |
| 5.3 展望 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 個人簡歷 |
（8）克雷伯氏桿菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇過程的代謝分析與優(yōu)化（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符號表 |
| 1 緒論 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 1,3-丙二醇的生產(chǎn) |
| 1.2.1 化學(xué)法 |
| 1.2.2 生物法 |
| 1.2.3 發(fā)酵策略 |
| 1.3 甘油代謝動力學(xué) |
| 1.3.1 系統(tǒng)生物學(xué)概述 |
| 1.3.2 甘油代謝工程 |
| 1.3.3 發(fā)酵過程建模 |
| 1.4 模型分析與優(yōu)化控制 |
| 1.4.1 代謝通量分析 |
| 1.4.2 通量平衡分析 |
| 1.4.3 動態(tài)通量平衡分析 |
| 1.4.4 整體建模 |
| 1.4.5 分支分析 |
| 1.4.6 優(yōu)化控制 |
| 1.5 研究思路 |
| 2 克雷伯氏桿菌發(fā)酵甘油過程的動態(tài)通量平衡分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 代謝途徑拓展總覽 |
| 2.3.1 底物過量條件下的動態(tài)通量分布 |
| 2.3.2 底物限制條件下的動態(tài)通量分布 |
| 2.4 關(guān)鍵節(jié)點通量對代謝的影響 |
| 2.4.1 二羥基丙酮(DHA)節(jié)點通量對代謝的影響 |
| 2.4.2 3-磷酸甘油酸(3PG)節(jié)點通量對代謝的影響 |
| 2.4.3 三羧酸循環(huán)(TCA)通量對代謝的影響 |
| 2.5 TCA中耦合途徑對代謝的影響 |
| 2.5.1 α-酮戊二酸(Akg)的耦合途徑 |
| 2.5.2 半胱氨酸(Cys)的耦合途徑 |
| 2.6 節(jié)點分支通量分配對代謝的影響 |
| 2.7 本章小結(jié) |
| 3 克雷伯氏桿菌發(fā)酵甘油產(chǎn)1,3-丙二醇過程的整體建模優(yōu)化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 模型的來源 |
| 3.2.2 整體建模等效參數(shù)的篩選 |
| 3.2.3 優(yōu)化方法 |
| 3.3 結(jié)果 |
| 3.3.1 參考參數(shù)的來源及特性 |
| 3.3.2 等效參數(shù)集合的篩選 |
| 3.3.3 等效參數(shù)的特性及預(yù)測性能分析 |
| 3.3.4 發(fā)酵過程的優(yōu)化 |
| 3.4 討論 |
| 3.5 本章小結(jié) |
| 4 雙反應(yīng)器串聯(lián)發(fā)酵過程的多穩(wěn)態(tài)分析與優(yōu)化控制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 模型的來源 |
| 4.2.2 穩(wěn)態(tài)參數(shù)分支分析 |
| 4.2.3 操作條件優(yōu)化 |
| 4.2.4 優(yōu)化控制 |
| 4.3 結(jié)果與討論 |
| 4.3.1 單罐發(fā)酵過程的多穩(wěn)態(tài)特性 |
| 4.3.2 單罐發(fā)酵過程的優(yōu)化控制 |
| 4.3.3 雙罐串聯(lián)發(fā)酵過程的多穩(wěn)態(tài)特性 |
| 4.3.4 雙罐串聯(lián)發(fā)酵過程的操作條件優(yōu)化 |
| 4.3.5 雙罐串聯(lián)發(fā)酵過程的優(yōu)化控制 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 5 結(jié)論與展望 |
| 5.1 結(jié)論 |
| 5.2 創(chuàng)新點 |
| 5.3 展望 |
| 參考文獻 |
| 附錄代謝網(wǎng)絡(luò)反應(yīng) |
| 作者簡介 |
| 攻讀博士學(xué)位期間科研項目及科研成果 |
| 致謝 |
（9）海棲熱袍菌乙酰羥酸合酶活性檢測新方法的建立及其催化反應(yīng)的研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文縮略語對照表 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 乙酰羥酸合酶概述 |
| 1.1.1 AHAS的分布 |
| 1.1.2 AHAS的功能和催化機制 |
| 1.2 海棲熱袍菌與AHAS |
| 1.3 AHAS活性研究方法 |
| 1.4 4-硝基鄰苯二胺與2,4-二硝基苯肼 |
| 1.4.1 4-硝基鄰苯二胺 |
| 1.4.2 2,4-二硝基苯肼 |
| 1.4.3 以NPDA及 DNPH為衍生化試劑測定TmAHAS催化反應(yīng)的原理 |
| 1.5 本課題的意義 |
| 第二章 重組TmAHAS的制備 |
| 2.1 材料與儀器 |
| 2.1.1 菌種 |
| 2.1.2 試劑 |
| 2.1.3 儀器 |
| 2.1.4 主要試劑配方 |
| 2.2 實驗方法 |
| 2.2.1 重組工程菌的培養(yǎng)及TmAHAS的誘導(dǎo)表達 |
| 2.2.2 TmAHAS的純化 |
| 2.2.3 SDS-PAGE鑒定TmAHAS |
| 2.2.4 TmAHAS濃度測定 |
| 2.2.5 TmAHAS活性測定 |
| 2.3 實驗結(jié)果及討論 |
| 2.3.1 重組TmAHAS的誘導(dǎo)表達及純化結(jié)果 |
| 2.3.2 蛋白濃度標準曲線及濃度測定結(jié)果 |
| 2.3.3 紫外法測定蛋白活性標準曲線及活性測定結(jié)果 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 重組TmAHAS活性檢測新方法的建立 |
| 3.1 材料與儀器 |
| 3.1.1 試劑 |
| 3.1.2 儀器 |
| 3.1.3 主要試劑配方 |
| 3.2 實驗方法 |
| 3.2.1 確定HPLC檢測最大吸收波長 |
| 3.2.2 優(yōu)化HPLC分離條件 |
| 3.2.3 建立標準曲線 |
| 3.2.4 新方法檢測TmAHAS活性 |
| 3.3 實驗結(jié)果及討論 |
| 3.3.1 確定HPLC檢測最大吸收波長 |
| 3.3.2 HPLC分離條件優(yōu)化 |
| 3.3.3 建立標準曲線 |
| 3.3.4 新方法檢測TmAHAS活性的結(jié)果及與比色法檢測結(jié)果的比較 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第四章 重組TmAHAS催化雙底物反應(yīng)產(chǎn)物組成的分析 |
| 4.1 材料和儀器 |
| 4.1.1 試劑 |
| 4.1.2 儀器 |
| 4.1.3 主要試劑配方 |
| 4.2 實驗方法 |
| 4.2.1 確定HPLC檢測最大吸收波長 |
| 4.2.2 建立標準曲線 |
| 4.2.3 優(yōu)化HPLC分離條件 |
| 4.2.4 酶催化的反應(yīng) |
| 4.2.5 LC-MS檢測 |
| 4.3 結(jié)果與分析 |
| 4.3.1 NPDA衍生物紫外檢測結(jié)果 |
| 4.3.2 建立標準曲線 |
| 4.3.3 HPLC分離條件優(yōu)化 |
| 4.3.4 TmAHAS酶催化的反應(yīng)結(jié)果分析 |
| 4.3.5 LC-MS檢測結(jié)果 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第五章 全文總結(jié) |
| 參考文獻 |
| 附錄 DNPH檢測產(chǎn)物L(fēng)C-MS鑒定結(jié)果圖 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間取得的科研成果 |
| 致謝 |
（10）Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1菌株中2-溴硝基苯的代謝機理與相關(guān)應(yīng)用研究（論文提綱范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 縮寫說明 |
| 第一章 緒論 |
| 1.1 芳烴類化合物概述 |
| 1.1.1 芳烴化合物的代謝 |
| 1.1.2 芳烴化合物的微生物代謝途徑 |
| 1.1.3 芳烴化合物的經(jīng)典中心代謝途徑 |
| 1.2 硝基芳烴化合物代謝 |
| 1.3 鹵代硝基芳烴化合物代謝 |
| 1.4 環(huán)羥化雙加氧酶 |
| 1.4.1 RHOs氧化酶 |
| 1.4.2 硝基芳烴雙加氧酶 |
| 1.5 粘糠酸相關(guān)概述 |
| 1.5.1 粘糠酸簡介 |
| 1.5.2 生物合成法制備粘糠酸 |
| 1.6 本研究的目的、意義及內(nèi)容 |
| 第二章 Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1 菌株中2-溴硝基苯的代謝途徑研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料與方法 |
| 2.2.1 主要實驗儀器 |
| 2.2.2 菌株和質(zhì)粒 |
| 2.2.3 試劑及藥品 |
| 2.2.4 主要培養(yǎng)基及緩沖液 |
| 2.2.5 2-溴硝基苯毒性測定 |
| 2.2.6 降解2BNB菌株的篩選 |
| 2.2.7 P.stutzeri ZWLR2-1 菌株的活化及培養(yǎng)條件 |
| 2.2.8 P.stutzeri ZWLR2-1在2BNB和2CNB生長曲線測定 |
| 2.2.9 亞硝酸根濃度的測定 |
| 2.2.10 全細胞生物轉(zhuǎn)化檢測硝基芳烴雙加氧酶活力 |
| 2.2.11 鄰苯二酚1,2-雙加氧酶基因的克隆與酶的純化 |
| 2.2.12 鄰苯二酚1,2-雙加氧酶活力的檢測 |
| 2.2.13 中間代謝產(chǎn)物的鑒別方法(HPLC,LC-MS) |
| 2.3 實驗結(jié)果與討論 |
| 2.3.1 2-溴硝基苯毒性測定 |
| 2.3.2 2BNB降解菌株的篩選 |
| 2.3.3 P.stutzeri ZWLR2-1 菌株利用2CNB、2BNB以及2FNB的生長情況 |
| 2.3.4 P.stutzeri ZWLR2-1 菌株利用2CNB和2BNB的生長曲線測定 |
| 2.3.5 E.coli DH5α [pUC18cnbAaAbAcAd]生物轉(zhuǎn)化分析 |
| 2.3.6 鄰苯二酚開環(huán)酶(CnbC)的開環(huán)活性測定 |
| 2.4 本章小結(jié) |
| 第三章 利用溴鄰苯二酚1,2-雙加氧酶制備2-溴粘糠酸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料與方法 |
| 3.2.1 主要實驗儀器 |
| 3.2.2 菌株和質(zhì)粒 |
| 3.2.3 主要試劑及藥品 |
| 3.2.4 主要培養(yǎng)基及緩沖液 |
| 3.2.5 2-溴粘糠酸的制備 |
| 3.2.6 利用核磁共振驗證2-溴粘糠酸 |
| 3.2.7 2-溴粘糠酸摩爾吸光系數(shù)的測定 |
| 3.2.8 CnbC催化3-溴鄰苯二酚生成2-溴粘糠酸的效率 |
| 3.3 結(jié)果與討論 |
| 3.3.1 2-溴粘糠酸的LC-MS鑒定結(jié)果 |
| 3.3.2 2-溴粘糠酸的核磁鑒定結(jié)果 |
| 3.3.3 酶促反應(yīng)底物與產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系 |
| 3.4 本章小結(jié) |
| 第四章 硝基芳烴雙加氧酶的基因改造 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料與方法 |
| 4.2.1 主要實驗儀器 |
| 4.2.2 菌株、質(zhì)粒及引物 |
| 4.2.3 主要試劑及藥品 |
| 4.2.4 定點突變 |
| 4.2.5 生物轉(zhuǎn)化 |
| 4.3 結(jié)果與討論 |
| 4.3.1 雙加氧酶氨基酸序列比對 |
| 4.3.2 生物轉(zhuǎn)化測定突變后的雙加氧酶的活力 |
| 4.4 本章小結(jié) |
| 第五章 總結(jié)與展望 |
| 5.1 實驗總結(jié) |
| 5.2 創(chuàng)新點 |
| 5.3 實驗展望 |
| 參考文獻 |
| 致謝 |
| 攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表或錄用的論文 |
四、酶促生物轉(zhuǎn)化丙酮酸生產(chǎn)的研究（論文參考文獻）
- [1]級聯(lián)法合成去甲基麻黃素的研究[D]. 羅磊. 江南大學(xué), 2021(01)
- [2]多酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化L-酪氨酸生產(chǎn)酪醇的研究[D]. 阮小波. 江南大學(xué), 2021(01)
- [3]化學(xué)—酶法催化生物質(zhì)原料合成β-羥基-α-氨基酸的研究[D]. 龔磊. 江南大學(xué), 2020(04)
- [4]生物催化級聯(lián)反應(yīng)制備丙酮酸及L-酪氨酸衍生物[D]. 李國四. 浙江大學(xué), 2020(05)
- [5]基于畢赤酵母底盤的維生素K2（MK-4）細胞工廠構(gòu)建與優(yōu)化[D]. 孫小雯. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué), 2020(01)
- [6]大腸桿菌N-乙酰神經(jīng)氨酸合成途徑的構(gòu)建與優(yōu)化[D]. 侯正杰. 天津科技大學(xué), 2020(08)
- [7]重組畢赤酵母全細胞轉(zhuǎn)化L-乳酸合成丙酮酸鈉的工藝研究[D]. 鹿承建. 福建師范大學(xué), 2020(12)
- [8]克雷伯氏桿菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇過程的代謝分析與優(yōu)化[D]. 潘多濤. 大連理工大學(xué), 2019(06)
- [9]海棲熱袍菌乙酰羥酸合酶活性檢測新方法的建立及其催化反應(yīng)的研究[D]. 高鳳. 西北大學(xué), 2019(01)
- [10]Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1菌株中2-溴硝基苯的代謝機理與相關(guān)應(yīng)用研究[D]. 汪磊. 上海交通大學(xué), 2019(06)
標簽：丙酮酸論文; 生物轉(zhuǎn)化論文; 突變理論論文; 羥基論文; 畢赤酵母論文;